Summary
本文描述了小鼠的处理技术，即3D处理技术，它通过减少类似焦虑的行为来促进日常处理，并介绍了两种现有相关技术（隧道和尾部处理）的细节。
Abstract
实验室动物受到科学家或动物护理提供者的多次操纵。这种引起的压力会对动物的福祉产生深远的影响，也可以成为焦虑措施等实验变量的混淆因素。多年来，人们开发出能够最大限度地减少处理相关压力的处理技术，尤其侧重于大鼠，而很少关注小鼠。然而，已经表明，老鼠可以习惯使用处理技术操纵。习惯小鼠处理可减轻压力，便于日常处理，改善动物健康，降低数据变异性，提高实验可靠性。尽管处理有有益的效果，但特别紧张的尾部拾取方法仍然被广泛使用。本文详细介绍了新开发的鼠标处理技术，旨在最大限度地减少动物在人际交往中承受的压力。这种手动技术在3天（3D处理技术）中执行，并侧重于动物适应实验者的能力。这项研究还显示了以前建立的隧道处理技术（使用聚碳酸酯隧道）和尾部拾取技术的效果。具体研究的是它们对焦虑行为的影响，使用行为测试（提升加迷宫和新奇抑制喂养），与实验者的自愿互动和生理测量（皮质激素水平）。3D处理技术和隧道处理技术减少了焦虑类表型。在第一个实验中，使用6个月大的雄性小鼠，3D处理技术显著改善了实验者的相互作用。在第二个实验中，使用2.5个月大的女性，它降低了皮质激素水平。因此，在需要或首选与实验者交互或在实验期间可能无法进行隧道处理的情况下，3D 处理是一种有用的方法。
Introduction
小鼠和大鼠是临床前研究的重要资产1，2用于多种目的，包括内分泌、生理、药理学或行为研究2。从越来越多的动物研究中，出现了包括人际交往在内的不受控制的环境变量影响生物医学研究的各种结果。这造成了实验和研究实验室4、5的显著变异性，对动物研究提出了重大警告。
实施了各种方法，目的是限制环境压力源的影响，减少对人类相互作用的反应。例如，为了限制环境压力源的影响，标准化住房条件和自动化住房系统6，7已在实验室实施。关于与人类的互动，通常用来处理和运输动物的方法很少考虑动物的不适和压力。例如，用尾巴或用钳子拾取动物8会增加基线焦虑9，10，11，减少探索9，12，并大大有助于个体间的变异，在研究13，14。因此，还开发了其他方法，例如适用于小鼠和大鼠的杯子处理技术。在这种方法下，动物被"杯"出笼子，由实验者用双手握住，形成一个9、10、11的杯子。另一个有用的尾部处理方法是使用聚碳酸酯隧道将老鼠转移9、10、15。此方法消除了鼠标和实验者之间的直接相互作用。杯子和隧道的方法都显示出有效的减少焦虑的行为和对实验者的恐惧，可以夸大反向处理技术，如尾部拾取/尾部处理9，10。
因此，越来越多的证据表明，适当的老鼠处理有助于减少个体之间的变异性9，11，并改善动物福利10。然而，上述技术仍然面临局限性。杯具处理技术已经实施，时间表从10天（10次超过2周16）到15周17，这是相当长的时间设施工作人员和实验者。此外，杯子处理的有效性因应变9而不同，而传统的杯子处理在张开手中可能导致天真的小鼠或特别跳跃的菌株从手9，18跳。隧道处理结果更一致，一般更快的结果，在绅士19。隧道也被用作家庭笼子浓缩。它们帮助动物习惯于快速处理，并提供丰富的额外好处。然而，隧道处理在设备之间转移动物时有局限性。有趣的是，赫斯特和西9号，亨德森等人20日证明，使用温和而简短的手动处理方式将动物从隧道转移到机器上并不影响它们的表型。
为了提供现有方法的替代方案，在短时间内实现习惯，本文描述了一种新颖的技术，扩展了杯具处理技术，因此不需要特定的设备。此方法使用里程碑来衡量小鼠在处理过程中的舒适程度。它显示了减少小鼠反应和压力（在行为和荷尔蒙水平）的功效，促进日常处理，并有助于减少动物之间的变异性。此处提供了此技术的详细信息，与隧道处理（正控）和尾部处理技术（负控制）相比，在减少焦虑行为、改善与实验者互动和限制外周压力激素（皮质激素）释放方面的功效在两项独立的研究（雄性小鼠和雌性小鼠）中得到了证明。
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Protocol
涉及动物主体的程序已得到CAMH动物护理委员会的批准，并符合加拿大动物护理理事会的准则进行。
注：此处描述的处理方法可用于各种鼠标菌株，包括非转基因（C57/BL6、BalbC、CD1、SV129 等）和转基因线。它也可以与年轻或老老鼠一起使用，指出年轻的成年（4-6周大）小鼠往往比成年或老老鼠稍微活跃一些，尤其是在第一天。
1. 实验准备
- 在研究开始之前，根据EING指南21，随机分配鼠标给每个处理组（3D处理，隧道处理或尾部处理）。
- 确定执行处理的房间。它可以在住房室或单独的房间进行。如果处理是在一个单独的房间进行，这需要动物移动在移动的推车上，允许动物习惯到新的房间20-30分钟之前启动处理协议。
- 对于群居动物，在处理后使用临时笼子将老鼠安置在笼子里，然后将它们全部重新组合在最初的家庭笼子里。这减少了动物在处理前（尤其是雄性动物）之间的潜在战斗。
- 在柜台（最好是清理的台面）或生物安全柜中工作，将住房笼远离动物处理。靠近住宅笼增加了跳跃的风险。如果动物被群居，将老鼠跳入家庭笼子可能会给笼友带来压力。
注：在生物安全柜中工作可限制老鼠跳楼的风险，某些设施可能需要这种风险。该技术可用于生物安全柜，确保始终在生物安全柜内执行所有步骤，并避免小鼠在处理器前臂上行走。
2. 第 1 天：每只鼠标 5 分钟
- 轻轻打开笼子，将盖子放在一边，取出筑巢材料，以及其他浓缩物，如运行轮或庇护所。
- 将戴手套的张开的手引入家庭笼子，慢慢地将手放在笼壁的一侧（离处理者最近的墙壁，图1A）。
- 不要立即尝试拿起鼠标。
- 保持不动，让动物习惯在笼子里的手存在约30s。
- 尝试拿起手掌中的鼠标（即避免用尾巴接动物）。
- 如果鼠标在 3 次尝试后不容易拾起，则用双手将鼠标引导到角落和杯子。
- 轻轻地将杯子手移向鼠标，试图将其拾起。
- 如果两只手最多尝试 3 次后未成功，请用尾巴底部轻轻拾起鼠标，并将其转移到前臂或扁平手上。
- 手握鼠标，保持手尽可能平整和打开。
注：这为鼠标提供了一个平坦的平台，并限制了被咬伤的风险。 - 将手打开并平放在手掌上，将另一只手放在手旁边，手握鼠标，让鼠标在没有任何约束的情况下从手到手自由移动（图1B）。
- 让鼠标在手之间探索和移动 1 分钟。
- 在这一点上，老鼠可能会试图跳走。将手放在位置上，这样，如果鼠标跳跃，鼠标就会落在台面上而不是地板上。
- 如果鼠标看起来像是准备跳跃（朝手的边缘移动，用后腿饲养），慢慢地将另一只手放在它前面，并试图引导它走到这只手上。避免突然移动，因为它增加了他们跳跃的风险。
- 如果鼠标确实会跳转，则尝试拿起鼠标以避免尾部处理并恢复处理会话。如果鼠标停留在地板上或手外超过 10s，请在处理会话中增加额外的时间，以弥补鼠标从手中的任何时间。
- 记下跳跃的记录。跳跃总数可用于评估动物之间潜在的变异性。
- 用平手处理1分钟后，放松手掌，轻轻将鼠标杯在手上，然后轻轻地将鼠标在双手之间滚动（图1C）。
- 要"滚动"，将鼠标放在手掌上，放在平手上，垂直于手指。
- 慢慢地合上手，把手指放在鼠标的背面。
- 将自由手直接放在手下，握住鼠标。
- 慢慢地用鼠标转动/旋转手，轻轻地将鼠标转移到另一只手（180° 翻转）。
- 在手之间来回重复。
- 交替从手之间的温柔滚动和自由探索的开放手为60s，技术之间交替约每20s。
- 执行"庇护测试"（图 1D）。
- 让鼠标移动到手的边缘，然后将两只手放在一起。
- 非常缓慢，杯他们，使鼠标适合在一个"庇护所"由手形成。留开口，以便鼠标在需要时可以逃逸。
- 旨在保持鼠标在庇护所5-10s，没有任何限制。
- 在庇护所测试之间交替，在手之间滚动，并免费探索张开的手为另外60s，一定要执行庇护步骤3或更多次。
- 在 2.10 中描述的所有程序中，不要匆忙处理流程。如果鼠标出现压力（即试探性逃跑，从手中跳下，避免与手接触等），被限制在手内，继续在手之间滚动和自由探索20s，然后重试。
- 里程碑：为完成第 1 天，至少执行 1 次 10s 的住房测试。
- 考虑当鼠标留在手中时成功进行庇护测试。如果鼠标弹出头，回到避难所，它仍然是一个成功的测试。如果动物完全离开避难所，那是个失败。
- 允许在手的30s免费探索。
- 轻轻更换笼子里的鼠标。如果组放置，将鼠标放在临时笼子中，直到处理所有笼子伴侣。将老鼠抱在手掌上，将它们放回原来的笼子里。不要使用尾部拾取。
- 用70%的乙醇清洁潜在粪便和尿液的板凳顶部。
- 在处理下一只鼠标之前，用 70% 乙醇（或适当的清洁液）或更换手套彻底冲洗手套（可以为笼友保留相同的手套）。
注意：建议使用合理数量的动物进行处理，以避免处理程序疲劳。处理24只小鼠大约需要2小时，建议每个处理者不超过24只小鼠。如果需要处理更多的动物，建议要么拥有多个处理程序，要么在多天内将处理程序拆分为子组。
3. 第 2 天：每只鼠标 3 到 5 分钟
- 试图拿起手掌上的鼠标。在这个阶段，它应该是可行的，老鼠不应该跳出手。
- 从第 1 天开始，手掌打开，让鼠标在 20 s 内自由探索。
- 然后，将鼠标在手之间滚动几次（4-5 次）。
- 执行 5s 的"庇护测试"。
- 在 2 到 3 分钟内重复几次（+5-6）的庇护测试。
- 在同一2至3分钟期间，交替与双手之间的滚动和自由探索的开放手步骤从第一天开始，以改善习惯。
- 触摸鼠标的头部和背部（图1E），5-6次。习惯的标志是鼠标允许你触摸它，而无需试图逃脱。
- 执行"鼻子戳"：尝试触摸鼠标的鼻子，2至3次（图1F）。
- 如果鼠标试图咬人或在被触摸时表现出明显的应力迹象，不要立即尝试再次戳鼻子。相反，交替与平手探索和滚动。动物在人类接触时没有逃跑或转过头来，"习惯"反映了这一点。
- 在 3.4-3.6 中描述的所有程序中，不要匆忙处理流程。如果鼠标因被限制在手内或不想被触摸而出现压力，请继续在手之间滚动 20-30s，然后重试。
- 里程碑： 执行至少 1 成功的鼻子戳 2 - 3s 完成第 2 天。
- 停止这个会话后约3分钟的处理，如果动物反应良好，"庇护所"，"头部抚摸"，"鼻子戳"，如果鼠标似乎愿意探索手没有压力的迹象。
- 如果鼠标继续表现出压力迹象或对"庇护测试"或"鼻子戳"测试反应不好，请继续会话，直到第 1 天达到 5 分钟。
- 更换笼子里的老鼠，像第一天一样清洁长凳上衣和手套。
4. 第3天：每只老鼠约3分钟
- 第三天，通过与第 2 天相同的步骤，持续 2 到 3 分钟。
- 拿起手掌上的鼠标。
- 在手之间转移和滚动鼠标
- 执行庇护所测试。
- 试着抚摸老鼠的背部和头部。
- 在这些步骤之间交替约 1 到 2 分钟。
- 继续手术，直到鼠标放松到足以坐在手掌上，而不会试图逃脱。
- 在第3天结束前，重复庇护测试和鼻子戳测试作为习惯测试。
- 如果两次测试都能在第一次尝试时完成，则习惯过程就完整了。继续轻轻地处理鼠标 30 秒到一分钟。
- 如果鼠标最初对任一测试都具有抗药性，则重复步骤 4.1-4.3 为 20-30s，然后再重新进行鼻子戳和庇护测试。
- 如果鼠标在 3 分钟后仍然对这些测试具有抗药性，则第三天可能会重复。
- 里程碑：执行至少 2 次成功的庇护测试，每个 10s，和 2 次成功的鼻子戳测试，以完成第 3 天，并完成整个 3D 处理程序。
- 将鼠标放回笼子，清洁台顶和手套。
5. 动物注射或加法受到约束的可选方法
注：在第3天，如果动物将被限制用于实验目的（口腔咽部、腹内注射等），小鼠可以接受颈部捏合测试。
- 抓住拇指和食指之间的颈部尿布（图1G）。
- 将鼠标举到手上方 3-5 厘米处，以 2-3 s。
注：对于成年小鼠来说，这通常是一个非自然的位置，如果小鼠保持在不动状态附近，它们就习惯于处理，并且很容易被限制用于实验目的。 - 将鼠标放回平手，或者鼠标对颈部捏有反应时，考虑将其放在实验者的袖子、笼盖或台面上
注意：如果在生物安全柜中工作，不要将鼠标放在袖子上，否则鼠标可以向上走，然后退出生物安全柜。最好将鼠标放在生物安全柜内的台面上。 - 让鼠标自由探索实验者的手1分钟。
6. 额外处理天数的可选方法
- 在高压力的鼠标线的可能发生时，使用第 2/3 天中描述的方法，增加额外的天数来降低动物的反应和应力水平。
注：许多因素可以影响动物的基线压力，包括应变，转基因改造的存在，年龄，性别和住房条件。如果这些因素在组之间不一致，例如对年轻对照组进行测试的老年动物或对野生类型对照测试的转基因动物，建议对每组使用相同天数的居住。
7. 隧道处理
注：此技术仅适用于隧道处理的鼠标。隧道是聚碳酸酯管，长约13厘米，直径约5厘米。
- 把隧道放在老鼠的笼子里。
- 在处理前将隧道放在笼子里7天。
- 打开笼子，把盖子放在一边。
- 轻轻引导鼠标进入聚碳酸酯隧道（已在笼子里）。
- 水平地将隧道从笼子中抬起来。如有必要，松散地覆盖隧道的两端，以防止动物跳/掉出隧道，可能回落到笼子或地板上。
- 将隧道中的动物从家庭笼子中移开，并将其从任何表面保持 30s。
- 将隧道放回家庭笼中，让鼠标离开管子。
- 等待 60s， 然后重复步骤 7.4 - 7.7 一次。
- 在习惯下一只老鼠之前，用 70% 乙醇彻底冲洗手套或更换手套。
- 连续 10 天重复此程序。
8. 尾部处理
注：此技术仅适用于尾部处理的小鼠。它被用来将老鼠从笼子转移到仪器，反之亦然。
- 打开笼子，把盖子放在一边。
- 抓住拇指和食指之间的尾巴底部的小鼠。
- 把老鼠从笼子里抬起来。
- 在2-3s，转移鼠标到实验者对面的前臂，同时保持对尾巴的抓地力，以避免鼠标悬空。
- 当实施此实验时需要尾部处理（例如，在抽血进行皮质醇测试之前）时，动物通过尾部处理转移到实验者的前臂，并保持 15s，然后再返回笼子。
9. 提升加迷宫
- 房间设置
- 将迷宫放在房间中间，放在装有存储卡的数码相机下。
- 使用放置在迷宫后面的 2 盏立灯，在 60 Lux 设置房间的灯光。
- 关闭任何头顶照明，以避免在迷宫上直接照明，从而产生反射并干扰迷宫中动物的检测。
- 一旦所有的设备都设置，转移动物到房间，让他们适应灯光设置和新的环境30分钟。
- 测试
- 用70%的乙醇清洁迷宫，防止灰尘或以前测试过的动物的气味。
- 启动相机。
- 在将动物置于迷宫之前，使用一张带有动物 ID 的纸在视频中记录 ID（这将促进正确识别每个视频中正在拍摄的鼠标）。
- 使用适当的处理技术，以每一个动物转移到迷宫。
- 将鼠标放在中央平台上，面对一只张开的手臂。
- 让鼠标探索仪器10分钟，不受干扰。
- 10分钟后，停止摄像头。
- 从迷宫中取回鼠标，放回笼子里。
- 用70%乙醇清洁迷宫中的粪便和尿液。
- 一旦所有鼠标完成测试，将视频从存储卡传输到计算机进行视频跟踪。
- 使用自动动物跟踪软件，跟踪张开和闭合手臂的条目数量，以及张开或闭臂所花费的时间（此处 Ethovision XT 14）。
10. 实验者相互作用（源自赫斯特和西9）
- 房间设置
- 在装有存储卡的数码相机下放置一张桌子在测试室中间。
- 在 50-70 Lux 设置灯，在房间的角落里放置 4 个灯泡，直面天花板。关闭头顶照明，以避免迷宫上产生反射并干扰对竞技场动物的检测的直接照明。
- 把动物带到房间里去。
- 让他们适应房间30分钟。
- 实验
- 将家庭笼子放在数码相机下。
- 取下盖子。
- 去除可能干扰动物追踪的筑巢材料和其他浓缩物。
- 启动相机。
- 使用带有动物 ID 的笼卡在视频中识别动物。
- 沿着右前侧笼子的墙壁将一只手放在主笼子里。
- 确保处理程序的头部不会阻塞摄像机以拍摄鼠标。
- 启动时间器。
- 保持手不动2分钟，让鼠标探索手。
- 将手从笼子中取出 15s。
- 尝试用杯形手拿起鼠标，记录鼠标是否逃跑。
- 重复最后一步长达五次，每5秒，或直到鼠标允许自己被拾起。
- 记录拾取鼠标所需的尝试次数。
- 将筑巢材料和浓缩物送回笼子。
- 清洁手套与70%乙醇或更换手套之前，继续到下一个动物。
- 测试后，将视频从存储卡传输到计算机。
- 使用自动视频跟踪软件，将笼子分成四个相等象限，并记录鼠标在每个象限中花费的时间（这里，Ethovision XT 14）。
11. 新奇的抑制喂养
- 食物匮乏
- 测试前3天，执行完整的笼更换，和单屋动物（单壳更可进行家庭笼测试）。
注：提供新鲜的床上用品可去除自上次笼子更换以来床上积聚的潜在灰尘或少量食物。 - 在测试的前一天，在下午6点左右称量所有动物。
- 从食物漏斗中取出所有食物，并确保笼子或床上没有食物。
- 测试前3天，执行完整的笼更换，和单屋动物（单壳更可进行家庭笼测试）。
- 房间设置
- 将 NSF 室放在桌子上。
- 在房间里装满一层薄薄的玉米床上用品（或其他不同于动物家庭笼中使用的床上用品）。
- 将灯设置在 70 Lux，将 4 个灯泡放置在房间所在的桌子的一角，面朝天花板。关闭顶置灯以保持低房间照明。
- 将设施中使用的一粒标准周放在面向实验者的腔室一侧（距离墙壁≈10厘米）。
- 测试
- 在食物匮乏后的早晨，在测试前30分钟将动物带到房间，让它们适应光线环境和新环境。
- 称重所有动物，以便根据前一天测量的体重测量其体重来测量其体重减轻。动物应该失去8-12%过夜，以便能够正确地执行任务。
- 对每次减肥的动物进行排序，并从体重损失最大的鼠标开始筛选它们，以减轻体重最少的鼠标为开始。
- 确保房间内装满床上用品和单粒颗粒。
- 将动物放在房间的另一边，远离食物颗粒。
- 立即启动时间器。
- 让鼠标探索房间长达 12 分钟。
- 测量接近和喂养（动物必须咬和吃）食物颗粒的延迟。
- 当动物靠近颗粒、闻到颗粒并不咬人时，将其视为一种方法。
- 将咬伤定义为动物开始食用颗粒时。
- 记录延迟，以接近并在几秒钟内以颗粒为食。
- 一旦鼠标以食物颗粒为食，将鼠标从腔室中取出。
- 丢弃床上用品，但保存颗粒，将用于测试食欲驱动器在鼠标家庭笼。
- 为下一个动物重置房间，然后继续下一个动物。
- 在室内完成测试15分钟后，将测试过程中使用的颗粒滴入鼠标的主笼内，靠在笼子前面的墙上。
- 当颗粒在家庭笼子中时，测量以颗粒为食的延迟。这是衡量食欲的指标。
- 最好取出筑巢材料，以确保鼠标看到颗粒掉入笼子中。
12. 血清收集和皮质激素测量
- 使用分配的技术处理动物 1 分钟，在采血前 15 分钟（这可以用群居或单户饲养的动物完成，在重新组合小鼠时记住打架的风险）。
- 对于隧道处理老鼠，引导他们到隧道，从笼子里抬起隧道1分钟，并更换在笼子里的老鼠。
- 对于尾部处理的鼠标，抓住鼠标的尾部底座，将鼠标从笼子中取出。将鼠标转移到实验者套管上1分钟，然后用尾部处理将鼠标放回笼子。
- 对于 3D 处理鼠标，使用杯形手将鼠标从笼子中取出。将鼠标握在杯子手中1分钟，然后放回笼子里。
- 处理15分钟后，从下静脉22进行采血。
- 牢牢地擦洗鼠标，使鼠标头牢固固定。
- 找到穿刺的部位。
- 沿着脸部的可操纵性有一个小无毛酒窝，可以用作定位穿刺部位的地标。在下颚底部和这个酒窝之间画一条线，穿刺部位位于这个酒窝后面，朝向耳朵大约5毫米，就在下颚铰链后面。
- 保持一个干净的23G针垂直于穿刺部位，并使用快速坚定的拉伸运动。针尖应穿透深度在1-2毫米之间，静脉一刺穿，血液就会立即流动。
- 在 EDTA 涂层收集管中收集 150 μL 的血液，并储存在冰上。
- 用无菌纱布垫将轻微压力施加到穿刺现场5s或更多，使血液凝固。
- 一旦血液凝固，老鼠就会回到家里的笼子里。
- 离心血在 4 °C 3，500 x g 10 分钟。
- 装饰超纳特。
- 将超高纳特存储在 -20 °C 以进行下游分析。
- 根据制造商的协议使用皮质激素 ELISA 套件测量皮质激素水平。
- 使用光谱仪读取 ELISA 结果。
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Representative Results
对C57BL/6小鼠进行了两项单独的研究。研究#1包括6个月大的男性，研究#2包括2.5个月大的女性（N=36/研究）从杰克逊实验室（猫#000664）。老鼠在2个月大的时候到达了工厂。虽然研究#2女性在抵达后两周被处理和测试，但研究#1男性只在6个月大时才被处理和测试（由于全球大流行关闭而延迟）。在此期间，一只来自研究#2老鼠在开始处理实验之前死亡。这项研究#1雄性小鼠由动物设施工作人员照顾。所有小鼠都保持在12小时的光/暗周期（7：00 ON，19：00关闭），使获得食物和水 的广告。他们的家笼里装满了回收的报纸作为床上用品，以及筑巢材料。老鼠被单独安置，以限制在处理过程中或在采血或行为测试等手术后，群居雄性的潜在痛苦行为。老鼠被随机分成三组： 尾部处理、隧道处理 和 3D处理，并根据各自组的设计在开放室处理（图2）。隧道处理小组在处理前1周收到隧道作为浓缩。然后，在行为测试之前，他们连续被处理了十（10天）。在完成不同的处理会话一周后，行为测试开始。第16天，在EPM中测试老鼠，然后在实验者互动测试中测试。两天后，老鼠在NSF进行了测试。最后，在第24天，在与初始处理相同的一分钟处理会议后15分钟抽血。
为了进行行为测试，隧道处理动物被尽可能从笼子转移到使用隧道的仪器。然而，对于升高加迷宫实验，迷宫的尺寸使得使用隧道将动物移除或放置在迷宫中变得困难。在这种情况下，动物被从隧道转移到杯手，并运送到迷宫。3D处理小鼠在三天内处理，同时处理隧道处理的第8-10天（图2）。尾部处理小鼠不习惯处理，但在与实验者互动时处理尾巴。在研究期间，实验者进行了笼子更换，以确保使用每组使用的适当处理技术。
在实验者相互作用测试中，动物被测试为愿意自愿与实验者互动，以及在实验环境中的处理方便性（图3）。ANOVA对从笼子里捡起老鼠的尝试次数进行了研究，在研究中显示了处理方法的显著效果，#1雄性研究（F（2，31）=6.36，p=0.004），以及研究#2雌性（F（2，33）=12.21，p=0.0001）。舍夫的事后分析显示，在研究中，#1雄性，取鼠所需的尝试次数显著减少了3D（p=0.0061） 和p=0.0002在研究#2女性）和隧道处理（p=0.04在研究#1男性，p=0.003在研究#2女性），相比尾部处理组（图3A）。ANOVA在与手在同一象限中花费的时间在研究中表现出显著的处理效果，#1男性（F（2，31）=5.38，p=0.009），在研究#2女性（F（2，33）=3.5，p=0.04;图3B）。舍夫的事后分析表明，#1 与尾部处理小鼠（p=0.012）相比，使用3D处理技术处理的雄性小鼠在同一象限中花费的时间明显多于实验鼠的手。研究组之间没有显著差异，#2，2.5个月大的女性。与实验者的相互作用程度通过小鼠中心点的组合热图（图3C-E）进一步证明了这一点。这些都说明了研究#1的3D处理雄性小鼠如何花更多的时间接近手，包括手附近的区域，而尾部处理的小鼠与手的整体互动最少。
在两次类似焦虑行为的测试中，将 3D 和隧道处理的影响与尾部处理、新奇抑制喂养 （NSF） 测试和高架加迷宫 （EPM） 进行了比较。在NSF测试中，ANOVA对接近延迟的处理技术显示了#1男性研究中使用的处理技术（F（2，31）=3.5，p=0.04）。舍夫在研究#1雄性鼠的事后分析显示，3D处理小鼠（p=0.08）和隧道处理小鼠（p=0.08）的趋势，与尾部处理小鼠相比，接近延迟减少（图4A）。研究#2没有观察到任何影响。ANOVA在鼠标家庭笼中接近的延迟（未显示数据）显示没有处理效果（在研究中为男性#1 0.88，在研究#2女性中为p=0.16）。ANOVA在EPM张开双臂的百分比时间显示，在研究#2女性（F（2，33）+3.5，p=0.04）中处理效果显著。研究中未观察到#1男性（F（2，31）+2.1，p=0.1;图4B）。舍夫的事后分析只显示，#2 与尾部处理的小鼠（p=0.07）相比，在隧道处理小鼠的张开手臂上花费的时间有增加的趋势。关于张开双臂的百分比（图4C），ANOVA没有显示处理效果，无论是在研究#1男性，还是在研究#2女性（F（2，31）=1.12，p=0.33;和F（2，33）=1.3，p=0.26，分别）。行为评分被总结为z-评分，如在吉洛等人23，通知可能减少焦虑的行为相比，尾部处理小鼠（图4D）。ANOVA在z-分数上显示了处理在研究#1男性（F（2，31）+5.6，p=0.008）中的重大影响，但在研究#2女性（F（2，33）+1.07，p=0.35）。Scheffe 的事后分析显示，与尾部处理相比，3D 处理和隧道处理显著降低了 z 分数（分别为 p=0.04 和 0.01），这表明这两种方法都减少了研究中#1男性的焦虑行为。
处理后的皮质激素水平也评估15分钟后，一个简短的处理会议（图5）。ANOVA在研究中发现#2女性（F（2，33）+4.44，p=0.01）的处理效果显著，但在研究#1男性（F（1，31）+0.53，p=0.59）中没有发现。在#2女性的研究中，事后分析显示，与尾部处理组（p=0.02）相比，3D处理组小鼠的皮质激素水平显著下降。
为了确定处理技术是否对获得的数据的变异性有显著影响，我们应用了巴特利特的方差同质性测试。我们的研究结果发现，在测量中，雌性小鼠#2变化性没有显著差异（%时间EPM B（2，33）=4.95，p=0.087;%条目EPMB（2，33）=3.68，p=0.16;NSF B（2， 33）+0.20， p=0.91;CORT B（2， 33）+1.69， p=0.42）.然而，在研究#1雄性小鼠中，NSF测试（B（2，31）=8.08，p=0.0175）和测量的CORT水平（B（2，32）=11.63，差异显著。 p=0.0029），但不是在EPM（%时间EPMB（2，32）+1.16，p=0.56;%条目EPMB（2，32）=2.79，p=0.25）。使用 F 测试比较两个方差表明，与尾部处理相比，在 NSF 测试方差中，研究#1男性的 3D （F（1，21）+4.22、p=0.04） 和隧道处理技术 （F（1，22）+4.01;p=0.03） 显著减少。对于处理后的 CORT 浓度，与尾部处理相比，只有 3D 处理显著降低了变异性 （F（1，20）+9.65，p=0.0019） 。
图1。3D 处理程序的代表图像。 这些图像说明了 3D 处理程序。 A） 手放在笼子里：实验者的手被放在笼子里，保持静止，让老鼠习惯于手在笼子里的存在。 B） 平手：第一次从笼子中取出时，鼠标被放置在手的扁平手掌上。鼠标可以自由地在手掌周围行走，并在相邻的扁平手之间移动。 C） 滚动：放松手掌，在鼠标周围形成一个松散的"杯子"。轻轻地将杯子倾斜到另一只手，鼠标应自由移动到此手，如果不轻轻引导它到另一只手。 D）庇护所：将鼠标放在手边，然后将双手放在一起，在鼠标周围慢慢形成杯子。鼠标不应被限制，应留有开口，以便鼠标可能逃脱。保持 +5-10s，然后打开平手。 E） 头部/背部宠物：当鼠标探索手掌平坦时，轻轻抚摸鼠标的头部和背部。这习惯了小鼠从上面接近实验者的方法。 F） 鼻子戳：当鼠标似乎习惯于处理时，尝试轻轻触摸鼠标直接在鼻子上。如果鼠标不移动其头离开，它习惯于处理。 G） 有可能在最后一天进行短 （2-3 s） 颈部捏合，以测量动物的习惯，以防将来需要争论的干预措施。习惯于处理时，小鼠在颈部挤压时保持不动，而非习惯性小鼠则试图通过旋转尾巴来逃避争论。请单击此处查看此图的较大版本。
图2。实验设计。 到达设施后，尾部处理的小鼠没有受到任何习惯。在开始处理之前，处理隧道的老鼠在家中的笼子里习惯了一个星期。隧道处理小鼠采用隧道处理技术处理10天（处理第一天 = 第1天），而3D处理小鼠则习惯3天（第8-10天）。然后，小鼠受到高架加迷宫（EPM）（第16天）、实验者互动测试（第19天）、新奇抑制喂养（第21天）以及随后的简短处理会议，然后进行CORT测量的血清收集（第24天）。请单击此处查看此图的较大版本。
图3。这三种处理技术对易于处理和愿意与实验者互动的影响。 A） 从笼子中取出鼠标所需的拾取尝试的平均次数。研究#1男性（左面板，尾部处理N+12，隧道处理N+12和3D处理N+11）和研究#2雌性（右面板，N=12每组）小鼠从隧道和3D处理组显示，与尾部处理小鼠相比，从笼子中取出它们所需的尝试次数显著减少。 B） 动物在笼子的同一象限中与实验者手的平均时间。研究#1使用3D技术处理的雄性小鼠在与实验者手相同的象限中花费的时间显著增加。 C-E） Ethovision XT 14 中按时间呈现的小鼠中心点的平均热图，直观地演示了与研究实验者#1 3D 处理的雄性小鼠的探索和互动。错误条表示 SEM. *p <0.05，**p<0.01 与尾部处理组相比。请单击此处查看此图的较大版本。
图4。这三种处理技术对焦虑行为的影响。 A） 在研究#1雄性小鼠（尾部处理N=12，隧道处理N=12和3D处理N+11）和研究#2雌性小鼠（N=12/组）中，在新奇抑制喂养室中接近和喂养颗粒的延迟。研究#1 3D处理组和隧道处理组的雄性小鼠的数据表明，接近颗粒的延迟显著减少的趋势。 B） 在高架加迷宫的张开臂上花费的时间百分比的手段。研究组与男性#1组之间没有显著差异，在隧道处理组中，研究#2女性在张开双臂方面的时间增加的趋势。 C） 张开双臂的条目：研究组#1男性之间没有显著差异，研究#2女性之间也没有显著差异。 D） Z 分数总结了焦虑类行为。使用 A、B 和 C 中提供的数据，使用尾部处理的小鼠作为参考计算 z 分数。z 分数的减少表明 NSF 和 EPM 测试测量的焦虑行为减少。研究表明，使用3D或隧道技术处理的雄性小鼠#1与尾部处理的小鼠相比，具有减少焦虑样表型。错误条表示 SEM. *p<0.05 与尾部处理组的比较。 t 表示与尾部处理组相比的趋势意义级别（p <0.1）。请单击此处查看此图的较大版本。
图5。处理后皮质激素水平。 血清在短暂的处理会话后 15 分钟收集，然后由 ELISA 在研究#1雄性（尾部处理 N= 12，隧道处理 N=12 和 3D 处理 N=11）和研究#2雌性小鼠（N=12/组）中测量 CORT 水平。研究表明，通过3D处理技术处理的雌性小鼠#2皮质激素水平比尾部处理的小鼠低。研究中的ANOVA#1雄性小鼠对群体间差异没有达到意义（p=0.5）。错误条表示 SEM. *p <0.05 与尾部处理组相比。请单击此处查看此图的较大版本。
表1。
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Discussion
这项研究和方法开发基于这样一种观察，即科学界仍然忽视老鼠的处理技术，一些实验室仍然不愿意在实验前实施习惯或处理技术，以减轻其动物的压力和反应能力。动物处理在代表时间承诺的同时，为动物提供了有益的效果，可能有助于要进行的实验的成功，并防止由于数据变异或动物反应过度而不得不多次进行实验。使用3D处理技术减少了小鼠的逃生尝试。它还增加了与实验者的互动，并减少了我们6个月大的雄性小鼠的焦虑样表型。此外，3D处理减少数据变异性和减少皮质激素水平在2.5个月大的雌性小鼠后，只有3个初始天的处理。这种方法依赖于温和的操作，使实验者习惯鼠标处理，从而促进更顺畅的传输和更轻松的干预。
从3D处理技术中值得强调的是，处理方法的进度是根据鼠标的反应性而发生的，这取决于上面和 表1中所述里程碑的实现情况。在进入下一步之前，动物应该降低对一个处理步骤的反应。试图过快地向没有充分习惯的动物的"庇护所"或"鼻子戳"步骤迈进，可能会增加压力，并可能降低手术的有效性。同样，应监测动物在处理当天的反应，并在决定是否需要额外的处理天数时予以考虑。如果动物在第一天的庇护所测试中反应不好，不符合达到第一个里程碑的标准，则第一天的处理可能会重复，直到里程碑完成。同样，如果动物在第二天没有对鼻子戳测试做出反应，第二天也可能重复。另一个需要注意的警告是，老鼠在处理的第一天跳楼的风险更大，特别是在像C57BL6这样的跳跃菌株中。遵循上述准则应降低跳跃风险，并提供限制此类行为的方法。处理和通过步骤的进展的持续时间可能因菌株而异，特别是如果与已知表现出焦虑表型的转基因模型配合工作。
有几个因素有助于降低呈现的 3D 处理技术的有效性。其中一个因素是实验者的潜在恐惧或犹豫，如果实验者不熟悉老鼠的处理，或者害怕老鼠。因此，对处理程序的影响也是需要考虑的。然而，与小鼠互动水平的逐渐提高使新手实验者在完成处理步骤时，能够培养信心和更高的处理技巧。建议的步骤/里程碑（庇护所和鼻子戳测试）可以帮助对抗新手处理者中潜在的人类变异性，确保动物达到类似的习惯水平。据报道，促进人与动物的良性互动，使动物护理人员的生活质量和同情心得到提高。因此，在任何一般互动或干预过程中，处理过程中的绅士行为都会给处理者和动物带来好处。
3D处理技术对减少6个月大雄性与2.5个月大雌性取鼠次数的影响，为动物从笼子转移到实验装置提供了替代隧道处理或其他技术的替代方法。3D处理技术还增加了6个月大的雄性小鼠与实验鼠的相互作用。这在2.5个月大的雌性小鼠中没有观察到，但与尾部处理的雌性小鼠相比，雌性小鼠仍然更容易被拾起。这表明，3D处理技术可能更适合需要动物和实验者之间直接相互作用的实验，如莫里斯水迷宫（尽管后来讨论潜在的性别/年龄混淆因素）。另一些人则开发并使用了手动处理技术，包括用杯具手拾起动物，无需额外的操作10。虽然这些技术显示出有益的效果，但文献中的数据往往呈现习惯期超过10天9，16的处理协议。此外，没有 3D 处理提供的精细交互的杯具处理可能不适合继续跳出和远离手的跳跃菌株。虽然我们在这项研究中没有直接比较杯子方法，但 3D 处理解决了这个问题，并依靠精致的移动来促进鼠标和处理程序之间的交互。Ghosal等人的研究使用了一种杯式处理技术，结合按摩5天，并表明该技术限制了压力对代谢端点的影响，突出了在处理过程中需要精致的动作和相互作用，以获得更好的疗效。基于这种杯按摩技术，3D处理使用额外的相互作用来习惯小鼠。使用 3D 处理方法，处理程序通过执行标准化动作和根据每个动物的需要调整程序的持续时间，确保所有小鼠达到类似的习惯水平（在本研究中，所有小鼠都通过了里程碑，并在 3 天内完成了 3D 处理协议）。这种方法可以被认为是"个性化"的每只老鼠，所以所有的动物达到所需的习惯水平，每天处理。如前所述，如果动物没有达到协议中描述的里程碑，则可以通过增加天数来调整此技术。该技术对减少动物在行为研究和生理测量（CORT水平）中的变异性具有有益的作用，表明这种方法有助于减少研究内的变异性，并减少实验错误的影响，从而在临床前研究中产生有偏见的结果。
支持结果表明，与尾部小鼠相比，接受3D和隧道处理的小鼠在新奇的抑制喂养试验中表现出的焦虑减轻。考虑到NSF和EPM的综合数据，这两种方法都显示出了减少6个月大雄性小鼠焦虑的显著效果。这复制了动物习惯于隧道处理的结果，在焦虑测试中，9、15在10天以上的处理后，性能有所提高，并进一步证明了3D处理具有表现出类似效果的潜力。这也表明，3D处理6个月大的雄性小鼠接近并自愿与实验者互动更多，而不是6个月大的雄性小鼠受到隧道和尾部处理。重要的是，2.5个月大的雌性小鼠接受3D处理后，CORT水平有所降低，这与先前公布的结果9一致。这两项研究（研究#1在6个月大的男性和研究#2在2.5个月大的女性）确认，在两种不同的方式，处理有有益的影响焦虑类表型（无论是研究#1的行为结果，或在研究#2 CORT水平）。
造成这种影响的一个可能因素是实验者的性别，在这种情况下是男性。Sorge等人已经证明，男性实验者的存在会导致CORT的增加和焦虑，就像雄性小鼠的行为，而不是雌性小鼠的行为。这与本研究的结果形成鲜明对比。这项研究和Sorge等人的研究 的主要区别在于，这里描述的方法包括通过培养与实验者积极（非强化）的互动来习惯老鼠的处理，而Sorge等人则使用从未 与人类互动的天真啮齿动物。人们可以预料，天真的小鼠如果不得知实验者并不构成威胁，就会对人体实验者产生强烈反应。然而，本研究只对男性实验者进行，未来的研究应该调查这种效果是否可与女性实验者重复。虽然隔离这些因素不在本文的范围之外，但值得强调的是，在实施处理习惯时或在更普遍的实验设计中，确定这些变异性来源的重要性。
本研究还确认了隧道处理技术在减少9、10、11小鼠焦虑行为和CORT水平方面所起的功效。这种方法的另一个好处是，隧道可以留在笼子里作为浓缩26，这也可能有助于减少压力/焦虑反应，共有助于改善福利10，11。在这种情况下，实验者的作用是只对每只动物操纵隧道一分钟。然而，正如Gouveia等人19所描述的，隧道并不一定需要留在家庭笼子里，而是只有在需要转移动物时才能呈现给动物，而不会造成额外的压力。这两种方法，隧道和3D处理技术，都提供了应由实验室和实验者评估的好处，以确定哪种方法最适合他们的需要。在本研究中，隧道被留在笼子里，我们观察到的对焦虑行为的影响可能是由于隧道处理和丰富性相结合的结果。
虽然两者都提供了有益的效果，但 3D 和隧道处理技术并非没有限制。一个共同的限制是，动物设施实施这种程序可能很费时，而且可能令人沮丧。然而，增加的好处是无价的，通过减轻压力和改善与实验者和动物护理提供者的互动（如斯潘根贝格和凯林27）改善动物福利，以及研究的可靠性和可重复性。从我们的设施的证据表明，这项技术改善了动物和饲养人员之间的互动，促进笼子的变化和健康监测。从我们设施中的其他用户来看，使用处理小鼠的争用和整体操作要容易得多，这与我们的发现一致，即使用 3D 技术处理的小鼠在被拾起时不太可能逃跑，以我们为例，6 个月大的雄性更容易与实验者互动。后续研究可以量化这些效果，以进一步证明该技术的有用性。总之，这种 3D 处理方法以及隧道处理方法有助于 3R 规则，特别是通过改进常规动物互动，以最大限度地减少处理时的压力。鉴于观察到的数据变异性减少，这也有可能减少获得一致结果所需的动物数量，并改进用于限制变异性的方法。
根据所提供的数据进行的另一个讨论点是，这项研究是在动物被单一安置的情况下进行的。单一住房是首选，因为它限制潜在的痛苦行为（特别是在雄性小鼠），可以促进个体间的变异性28，29。为了群体之间的一致性，所有的动物都是单一的。同样有趣的是，积极的实验者与动物的相互作用，在老鼠发痒的形式，能够减轻社会隔离的一些影响，在单户大鼠30，31。涉及动物和实验者之间直接接触的处理技术，如3D处理技术或Ghosal等人描述的杯按摩技术，也可能产生类似的效果。未来的研究可以通过比较单体和群居动物的处理技术的影响来探讨这个问题。以往的研究调查了在群居环境中与老鼠的杯子和隧道处理方法的影响，并取得了类似的结果7，8。这证实了有可能使用本文所述的处理协议与在单户或组屋条件下饲养的动物，记住在将一只动物从笼子中取出并放回笼子时出现痛苦行为的可能性（特别是在雄性小鼠中，或在攻击性小鼠的线条中）。在这种情况下，建议在将所有动物重新组合在一起之前使用临时笼子。
最后，建议的3D处理方法有助于降低小鼠的反应和压力。它还通过在 3 天的处理后降低变异性来提高数据可靠性。在经过10天的隧道处理后，隧道处理也可观察到类似的结果。与隧道处理技术相比，3D处理技术提供了增加与6个月大雄性小鼠实验者互动的好处，在某些情况下，这种互动可能至关重要。如果在所有动物设施中实施3D或隧道处理技术，这将对数据生成产生一个重大改进，并将大大有助于减少动物在研究中的使用。
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Disclosures
作者没有利益冲突可以披露。
Acknowledgments
作者感谢CAMH动物护理委员会支持这项工作，以及CAMH的动物护理人员，他们提供了关于程序有用性的广泛反馈，激励了上述实验的执行，并为其他用户提交了详细的协议。这项工作部分由授予TP的CAMH突破挑战和CAMH的内部资金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. | BD | 2546-CABD305145 | Needles for Blood collection |
| BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk | BD | 367841 | EDTA Coated tubes for blood collection |
| Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding | Bed-O-Cobs | BEDO1/4 | Novel bedding for novelty suppressed feeding |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5424 R | For centrifugation of blood. |
| Corticosterone ELISA Kit | Arbor Assays | K003-H1W | |
| Digital Camera | Panasonic | HC-V770 | Camera to record EPM/Experimenter interactions |
| Elevated Plus Maze | Home Made | n/a | Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor |
| Ethanol | Medstore House Brand | 39753-P016-EA95 | Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning |
| Ethovision XT 15 | Noldus | n/a | Automated animal tracking software |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Memory Card | Kingstone Technology | SDA3/64GB | For video recording and file transfer |
| Novelty Suppressed Feeding Chamber | Home Made | n/a | Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall . |
| Parlycarbonate tubes | Home Made | n/a | 13 cm in length and 5cm in diameter |
| Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding | Purina | n/a | Standard Bedding |
| Spectrophotometer | Biotek | Epoch Microplate Reader |
References
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
- Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
- Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
- Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
- Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
- Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
- Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
- Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
- Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
- Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
- Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
- LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
- Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
- Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures - a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
- Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
- Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
- Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
- Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).
