Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Håndteringsteknikker for å redusere stress hos mus

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62593
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 4, 5, 1,2,3, 1,2
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

Summary

Dette dokumentet beskriver en håndteringsteknikk hos mus, 3D-håndteringsteknikken, som letter rutinemessig håndtering ved å redusere angstlignende atferd og presenterer detaljer om to eksisterende relaterte teknikker (tunnel- og halehåndtering).

Abstract

Laboratoriedyr blir utsatt for flere manipulasjoner av forskere eller dyrepleiere. Stresset dette forårsaker kan ha dype effekter på dyrs velvære og kan også være en forvirrende faktor for eksperimentelle variabler som angsttiltak. Gjennom årene har håndteringsteknikker som minimerer håndteringsrelatert stress blitt utviklet med et spesielt fokus på rotter, og liten oppmerksomhet på mus. Det har imidlertid vist seg at mus kan brukes til manipulasjoner ved hjelp av håndteringsteknikker. Habituating mus til håndtering reduserer stress, letter rutinemessig håndtering, forbedrer dyrets velvære, reduserer datavariabilitet og forbedrer eksperimentell pålitelighet. Til tross for gunstige effekter av håndtering, er hale-pick-up tilnærmingen, som er spesielt stressende, fortsatt mye brukt. Dette papiret gir en detaljert beskrivelse og demonstrasjon av en nyutviklet musehåndteringsteknikk som er ment å minimere dyrets stress under menneskelig interaksjon. Denne manuelle teknikken utføres over 3 dager (3D-håndteringsteknikk) og fokuserer på dyrets evne til å habituate til eksperimentet. Denne studien viser også effekten av tidligere etablerte tunnelhåndteringsteknikker (ved hjelp av en polykarbonattunnel) og hale-pick-up-teknikken. Spesielt studert er deres effekter på angstlignende atferd, ved hjelp av atferdstester (Elevated-Plus Maze and Novelty Suppressed Feeding), frivillig interaksjon med eksperimenter og fysiologisk måling (kortikosteronnivåer). 3D-håndteringsteknikken og tunnelhåndteringsteknikken reduserte angstlignende fenotyper. I det første eksperimentet, ved hjelp av 6 måneder gamle hannmus, forbedret 3D-håndteringsteknikken signifikant eksperimenteringsinteraksjonen. I det andre eksperimentet, ved hjelp av 2,5 måneder gammel kvinne, reduserte det kortikosteronnivået. Som sådan er 3D-håndtering en nyttig tilnærming i scenarier der interaksjon med eksperimentet er nødvendig eller foretrukket, eller der tunnelhåndtering kanskje ikke er mulig under eksperimentet.

Introduction

Mus og rotter er essensielle eiendeler i prekliniske studier1,2 for flere formål, inkludert endokrinale, fysiologiske, farmakologiske eller atferdsstudier2. Fra det økende antallet studier som involverer dyr, oppsto det at ukontrollerte miljøvariabler, inkludert menneskelig interaksjon, påvirker ulike utfall i biomedisinsk forskning3,4,5. Dette er ansvarlig for betydelig variasjon observert på tvers av eksperimenter og forskningslaboratorier4,5, som utgjør en stor advarsel i dyreforskning.

Ulike tilnærminger har blitt implementert med sikte på å begrense virkningen av miljøstressorer og redusere reaktivitet til menneskelig interaksjon. For eksempel, for å begrense virkningen av miljøstressorer, standardisering av boligforhold og automatiserte boligsystemer6,7 er implementert på tvers av laboratorier. Når det gjelder interaksjon med mennesker, hadde ofte brukte tilnærminger for håndtering og transport av dyr liten hensyn til ubehag og stress hos dyr. For eksempel, plukke opp dyr ved halen eller bruke tang8 øker baseline angst9,10,11, reduserer leting9,12 og bidrar sterkt til inter-individuell variasjon i og på tvers av studie13,14. Som et resultat ble andre tilnærminger utviklet, for eksempel kopphåndteringsteknikken, som gjelder for mus og rotter. I denne tilnærmingen blir dyrene "cupped" ut av buret, og holdes av eksperimentene med hendene som danner en kopp9,10,11. Et annet nyttig alternativ til halehåndtering innebærer bruk av en polykarbonattunnel for å overføre mus9,10,15. Denne tilnærmingen eliminerer direkte interaksjon mellom musen og eksperimentet. Både kopp- og tunneltilnærmingene viste effekt i å redusere angstlignende atferd og frykt for eksperimentet som kan overdrives av aversive håndteringsteknikker, for eksempel hale pick up / tail handling9,10.

Derfor viser økende bevis nytten av riktig musehåndtering for å redusere variasjon mellom individer9,11, og forbedre dyrevelferden10. Teknikkene nevnt ovenfor står imidlertid fortsatt overfor begrensninger. Cuphåndteringsteknikken er implementert med tidsplaner fra 10 dager (10 økter over 2 uker16) opp til 15 uker17, noe som er en betydelig tid for anleggspersonell og eksperimenter. I tillegg varierer effektiviteten av kopphåndtering med belastning9, og konvensjonell kopphåndtering i åpne hender kan føre til naive mus eller spesielt hoppende stammer for å hoppe fra hånden9,18. Tunnelhåndtering resulterer i mer konsistente og generelt raskere resultater i gentling19. Tunneler brukes også som hjemmeburberikelse. De hjelper dyr med å håndtere raskt og gir de ekstra fordelene med berikelse. Tunnelhåndtering har imidlertid begrensninger ved overføring av dyr mellom apparater. Interessant nok viste Hurst og West9, og Henderson et al.20 at bruk av mild og kort manuell håndtering for å overføre dyr fra tunnelen til apparatet ikke påvirker deres fenotype.

For å gi et alternativ til eksisterende metoder, med oppnåelig habituation på kort tid, beskriver denne artikkelen en ny teknikk som utvider cuphåndteringsteknikken, og krever derfor ikke noe bestemt utstyr. Denne tilnærmingen bruker milepæler for å måle nivået av komfortmus har med håndteringsprosessen. Det viser effekt ved å redusere musreaktivitet og stress (på atferds- og hormonelle nivåer), letter rutinemessig håndtering og bidrar til å redusere variasjon mellom dyr. Detaljer om denne teknikken er gitt her, og dens effekt ved å redusere angstlignende atferd, forbedre samspillet med eksperimenter og begrense perifer stresshormon (kortikosteron) frigjøring er demonstrert i to separate studier (mannlige og kvinnelige mus), i forhold til tunnelhåndtering (positiv kontroll) og halehåndteringsteknikker (negativ kontroll).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyreforsøk ble godkjent av CAMH dyrepleiekomité og gjennomført i samsvar med Canadian Council on Animal Care retningslinjer.

MERK: Håndteringsmetoden som er beskrevet her, kan brukes i ulike musestammer, inkludert ikke-transgene (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, etc.) og transgene linjer. Den kan også brukes med unge eller gamle mus, og beslag ser at unge voksne (4-6 uker gamle) mus har en tendens til å være litt mer aktive enn voksne eller gamle mus, spesielt på dag 1.

1. Eksperimentell forberedelse

  1. Før studiestart, i henhold til ARRIVE-retningslinjene21, tilordner du mus tilfeldig til hver håndteringsgruppe (3D-håndtering, tunnelhåndtering eller halehåndtering).
  2. Identifiser rommet for å utføre håndteringen. Det kan utføres i stuen, eller i et eget rom. Hvis håndteringen utføres i et eget rom, som krever at dyrene flyttes på en bevegelig vogn, la dyrene habituate til det nye rommet i 20-30 min før oppstart av håndteringsprotokollen.
  3. For gruppehusdyr, bruk et midlertidig bur for å huse mus etter håndteringen, før du omgrupperer dem alle i deres første hjemmebur. Dette reduserer potensielle kamper mellom dyr før håndtering (spesielt hos menn).
  4. Arbeid på en teller (helst en ryddet benkeplate) eller i et biosikkerhetsskap, med boligburet borte fra dyret som håndteres. Nærhet til boligburet øker risikoen for hopping. Hvis dyr er gruppehus, kan hopping av musen som håndteres inn i hjemmeburet føre til stress for burkamerater.
    MERK: Arbeid i et biosikkerhetsskap begrenser risikoen for at mus hopper på gulvet, og kan være nødvendig i visse anlegg. Denne teknikken kan brukes i et biosikkerhetsskap, og sørg for å alltid utføre alle trinnene inne i biosikkerhetsskapet, og unngå mus som går på håndterer underarmer.

2. DAG 1: 5 min per mus

  1. Åpne buret forsiktig og legg lokket på siden, fjern hekkematerialer og annen berikelse som løpehjul eller lyskilder.
  2. Innfør en hansket åpen hånd til hjemmeburet, og plasser hånden langsomt langs den ene siden av burveggen (veggen nærmest håndtereren, figur 1A).
    1. Ikke prøv å plukke opp musen umiddelbart.
  3. Forbli immobil og la dyret habituate til tilstedeværelsen av hånden i buret i ca 30 s.
  4. Prøv å plukke opp musen i håndflaten (dvs. unngå å plukke opp dyret ved halen).
    1. Hvis musen ikke lett plukkes opp etter 3 forsøk, guide musen til et hjørne og kopp med begge hender.
    2. Beveg forsiktig de cuppede hendene mot musen for å prøve å plukke den opp.
    3. Hvis det ikke lykkes etter maksimalt 3 forsøk med begge hender, plukk musen forsiktig ved foten av halen, og overfør den til underarmen eller flat hånd.
  5. Hold hånden så flat og åpen som mulig med musen i hånden.
    MERK: Dette gir en flat plattform for musen å gå på, og begrenser risikoen for biter.
  6. Hold hånden åpen og flat med håndflaten opp, plasser den andre hånden ved siden av hånden som holder musen og la musen bevege seg fritt fra hånd til hånd uten begrensninger (Figur 1B).
  7. La musen utforske og bevege seg mellom hender i 1 min.
    1. På dette tidspunktet kan mus prøve å hoppe bort. Plasser hendene slik at hvis musen hopper, vil den lande på en benkeplate i stedet for gulvet.
    2. Hvis en mus ser ut som den forbereder seg på å hoppe (beveger seg mot kanten av hånden og opprustning på bakbenene), plasser sakte den andre hånden foran den og prøv å lede den til å gå på denne hånden. Unngå plutselige bevegelser da det øker risikoen for å hoppe.
    3. Hvis en mus hopper, kan du prøve å plukke den opp for å unngå halehåndtering og gjenoppta håndteringsøkten. Hvis musen forblir på gulvet eller ute av hendene i mer enn 10 s, kan du legge til ekstra tid i håndteringsøkten for å gjøre opp for hver gang musen var ute av hendene.
    4. Ta notater av hoppet. Totalt antall hopp kan brukes til å vurdere potensiell variasjon mellom dyr.
  8. Etter 1 min håndtering med flate hender, slapp av håndflaten, og kopp musen litt i hånden, før du forsiktig ruller musen mellom hendene (Figur 1C).
    1. For å "rulle", plasser musen i håndflaten, på en flat hånd, vinkelrett på fingrene.
    2. Lukk hånden langsomt, plasser fingrene på baksiden av musen.
    3. Plasser den frie hånden rett under hånden som holder musen.
    4. Drei/roter hånden langsomt med musen for å overføre musen forsiktig til den andre hånden (180° flip).
    5. Gjenta dette frem og tilbake mellom hender.
  9. Veksle mellom skånsom rulling mellom hender og fri utforskning på åpne hender i 60 s, vekslende mellom teknikker omtrent hver 20.
  10. Utfør en "lytest" (Figur 1D).
    1. La musen bevege seg til kanten av hånden og deretter bringe de 2 hendene sammen.
    2. Veldig sakte, kopp dem slik at musen passer inn i et "ly" dannet av hendene. La en åpning slik at musen kan unnslippe om nødvendig.
    3. Ta sikte på å holde musen i lyet i 5-10 s, uten selvbeherskelse.
    4. Bytt mellom lytesten, rull mellom hender og fri utforskning av åpne hender i ytterligere 60 s, sørg for å utføre lytrinnet 3 eller flere ganger.
  11. I alle prosedyrer beskrevet i 2.10, ikke haste prosessen. Hvis musen virker stresset (dvs. foreløpig å unnslippe, hopper fra hendene, unngår kontakt med hender etc.) ved å være begrenset inne i hendene, fortsett med å rulle mellom hender og fri utforskning i 20 s, og prøv deretter på nytt.
  12. Milepæl: Utfør minst 1 vellykket lytest på 10 s for ferdigstillelse av dag 1.
    1. Vurder en lytest vellykket når musen forblir i hendene. Hvis musen spretter hodet ut og går tilbake til lyet, er det fortsatt en vellykket test. Hvis dyret helt går ut av lyet, er det en fiasko.
  13. Tillat fri utforskning i hender i 30 s.
  14. Bytt forsiktig musen i buret. Hvis gruppen er plassert, plasser musen i det midlertidige buret til alle burkameratene er håndtert. Returner musene til sitt opprinnelige bur ved å plukke dem opp i håndflaten. Ikke bruk halehenting.
  15. Rengjør benken toppen av potensielle avføring og urin med 70% etanol.
  16. Skyll hanskene grundig med 70% etanol (eller passende rengjøringsløsning) eller bytt hansker før du håndterer neste mus (det er mulig å holde de samme hanskene for burkamerater).
    MERK: Det anbefales å utføre håndteringen med et rimelig antall dyr for å unngå tretthet fra håndtereren. Håndtering av 24 mus tar rundt 2 timer, og det anbefales å ikke overstige 24 mus per håndterer. Hvis flere dyr må håndteres, anbefales det enten å ha flere behandlere, eller å dele håndteringsprosedyrene i undergrupper, over flere dager.

3. DAG 2: 3 til 5 min per mus

  1. Prøv å plukke opp musen i håndflaten. På dette stadiet bør det allerede være mulig, og mus bør ikke hoppe ut av hånden.
  2. Start med håndflaten åpen som på dag 1, slik at musen kan utforske fritt i 20 s.
  3. Rull deretter musen mellom hendene et par ganger (4-5 ganger).
  4. Utfør "lytesten" i 5 s.
  5. Gjenta lytesten flere ganger (~5-6) over en periode på 2 til 3 minutter.
  6. I løpet av den samme perioden på 2 til 3 minutter, bytt med rullen mellom hender og fri utforskning av åpne hender trinn fra dag 1 for å forbedre habituation.
    1. Berør musen på hodet og ryggen (Figur 1E), 5-6 ganger. Et tegn på habituation er når musen lar deg berøre den uten å prøve å unnslippe.
    2. Utfør en "Nose poke": Prøv å berøre snuten på musen, 2 til 3 ganger (Figur 1F).
      1. Hvis musen prøver å bite eller viser åpenbare tegn på stress ved å bli berørt, må du ikke umiddelbart prøve nesen poke igjen. Bytt i stedet med flat håndutforskning og rull. "Habituation" gjenspeiles av at dyret ikke løper bort eller vender hodet i tilfeller av menneskelig kontakt.
  7. I alle prosedyrer beskrevet i 3.4-3.6, ikke rush prosessen. Hvis musen ser stresset ut ved å være begrenset inne i hendene eller ikke vil bli berørt, fortsett med å rulle mellom hendene i 20-30 s og prøv deretter på nytt.
  8. Milepæler: Utfør minst 1 vellykket nesepoke for 2-3 s for ferdigstillelse av dag 2.
  9. Stopp denne økten etter ca 3 min håndtering hvis dyret reagerer godt på "lyet", "hode petting", "nese poke", og hvis musen ser ut til å være villig til å utforske hendene uten tegn på stress.
  10. Hvis musen fortsetter å vise tegn på stress eller ikke reagerer godt på "shelter test" eller "nose poke" testen, fortsett økten til du når 5 min som i dag 1.
  11. Bytt ut musen i buret, rengjør benkeplaten og hansker som i dag 1.

4. DAG 3: Rundt 3 min per mus

  1. På den tredje dagen, fortsett gjennom de samme trinnene som i dag 2, i 2 til 3 min.
    1. Plukk opp musen i håndflaten.
    2. Overfør og rull musen mellom hender
    3. Utfør en lytest.
    4. Prøv å klappe musen på ryggen og hodet.
  2. Veksle mellom disse trinnene i ca. 1 til 2 min.
  3. Fortsett prosedyren til musen er avslappet nok til å sitte i håndflaten uten å forsøke å unnslippe.
  4. Før slutten av dag 3, gjenta ly test og nese poke test som en test av habituation.
    1. Hvis begge testene kan fullføres ved første forsøk, er habituation-prosessen fullført. Fortsett forsiktig å håndtere musen i 30 s til et minutt.
    2. Hvis musen i utgangspunktet er motstandsdyktig mot en av testene, gjentar du trinn 4.1-4.3 i 20-30 s før du prøver nesepinnen og lytesten på nytt.
    3. Hvis musen forblir motstandsdyktig mot disse testene etter 3 min, kan den tredje dagen gjentas.
  5. Milepæler: Utfør minst 2 vellykkede lytester på 10 s hver, og 2 vellykkede nesepoketest for fullføring av dag 3, og fullføring av hele 3D-håndteringsprosedyren.
  6. Returner musen til buret, rengjør benkeplaten og hanskene.

5. Valgfri tilnærming for dyr som skal utsettes for selvbeherskelse for injeksjon eller gavage

MERK: På dag 3, hvis dyret vil bli begrenset til eksperimentelle formål (oral gavage, intraperitoneal injeksjon, etc.), kan musene bli utsatt for nakkeklemmetesten.

  1. Ta tak i nakken mellom tommelen og pekefingeren (Figur 1G).
  2. Løft musen 3-5 cm over hånden i 2-3 s.
    MERK: Dette er normalt en ikke-naturlig posisjon for voksne mus, og hvis musene forblir nær immobile, er de godt vant til håndtering og vil være enkle å begrense for eksperimentelle formål.
  3. Plasser musen tilbake i den flate hånden, eller hvis musen er reaktiv mot nakkeklemmen, bør du vurdere å plassere den på eksperimentets erme, burlokk eller benkeplate
    MERK: Hvis du arbeider i et biosikkerhetsskap, må du ikke plassere musen på hylsen, ellers kan den gå opp og ut av biosikkerhetsskapet. Foretrekker å plassere musen på benken inne i biosikkerhetsskapet.
  4. La musen fritt utforske eksperimentets hånd i 1 min.

6. Valgfri tilnærming for ytterligere dager med håndtering

  1. I en svært stresset muselinje legger du til flere dager for å redusere dyrenes reaktivitet og stressnivå ved hjelp av metodene beskrevet i dag 2/3.
    MERK: Mange faktorer kan påvirke grunnspenningen til dyrene, inkludert belastning, tilstedeværelse av transgen modifikasjon, alder, kjønn og boligforhold. Hvis disse faktorene ikke er konsistente mellom grupper som eldre dyr som testes mot unge kontroller eller transgene dyr som testes mot ville typekontroller, anbefales det at samme antall dager med habituation brukes for hver gruppe.

7. Tunnelhåndtering

MERK: Denne teknikken gjelder bare for de tunnelhåndterte musene. Tunneler er polykarbonatrør ca 13 cm i lengde og 5 cm i diameter.

  1. Plasser tunnelen i musens bur.
  2. La tunnelen stå i buret i 7 dager før håndtering.
  3. Åpne buret og legg lokket på siden.
  4. Før musen forsiktig inn i polykarbonattunnelen (allerede i buret).
  5. Løft tunnelen fra buret, horisontalt. Om nødvendig løst dekke endene av tunnelen for å hindre dyret i å hoppe / falle ut av tunnelen, potensielt falle tilbake i buret eller på gulvet.
  6. Flytt dyret i tunnelen bort fra hjemmeburet og hold det bort fra noen overflater i 30 s.
  7. Plasser tunnelen tilbake i hjemmeburet, slik at musen kan gå ut av røret.
  8. Vent i 60 s, og gjenta deretter trinn 7.4-7.7 en gang.
  9. Skyll hanskene grundig med 70% etanol eller bytt hansker før du bruker neste mus.
  10. Gjenta denne prosedyren i 10 påfølgende dager.

8. Håndtering av hale

MERK: Denne teknikken gjelder bare for tail-handled mus. Den brukes til å overføre mus fra buret til et apparat, og omvendt.

  1. Åpne buret og legg lokket på siden.
  2. Ta tak i musene ved foten av halen mellom tommel og pekefinger.
  3. Løft musen fra buret.
  4. I 2-3 s, overfør musen til eksperimentets motsatte underarm samtidig som du opprettholder et grep på halen for å unngå at musen dingler.
  5. Når halehåndtering er nødvendig i gjennomføringen av dette eksperimentet (f.eks. før blod trekker for kortisoltesting) overføres dyr til eksperimentets underarm ved halehåndtering og holdes i 15 s før de returneres til buret.

9. Forhøyet pluss labyrint

  1. Oppsett av rom
    1. Plasser labyrinten midt i rommet, under et digitalt kamera utstyrt med et minnekort.
    2. Sett opp lyset på rommet på ~ 60 Lux ved hjelp av 2 stående lamper plassert bak labyrinten.
    3. Slå av overheadbelysning for å unngå direkte lys på labyrinten som skaper refleksjon og forstyrrer påvisning av dyrene i labyrinten.
    4. Når alt utstyret er satt opp, overfør dyrene til rommet og la dem akklimatisere seg til lysinnstillingene og det nye miljøet i 30 minutter.
  2. Testing
    1. Rengjør labyrinten med 70% etanol for å forhindre lukt fra støv eller fra dyret som ble testet tidligere.
    2. Start kameraet.
    3. Bruk et stykke papir med dyre-ID-en for å registrere ID-en på videoen, før du plasserer dyret i labyrinten (dette vil lette riktig identifisering av hvilken mus som blir filmet på hver video).
    4. Bruk riktig håndteringsteknikk til hvert dyr for å overføre den til labyrinten.
    5. Plasser musen på den sentrale plattformen, vendt mot en åpen arm.
    6. La musen utforske apparatet i 10 min, uforstyrret.
    7. Etter 10 minutter stopper du kameraet.
    8. Hent musen fra labyrinten og legg den tilbake i buret.
    9. Rengjør avføring og urin fra labyrinten med 70% etanol.
    10. Når testingen er fullført med alle mus, kan du overføre videoer fra minnekortet til en datamaskin for videosporing.
    11. Bruk automatisert dyresporingsprogramvare, spor antall oppføringer til de åpne og lukkede armene, og tiden som brukes i åpne eller lukkede armer (her Ethovision XT 14).

10. Experimenter Interaction (avledet fra Hurst og West9)

  1. Oppsett av rom
    1. Plasser et bord midt i testrommet under et digitalt kamera utstyrt med et minnekort.
    2. Sett opp lyset på 50-70 Lux med 4 lyspærer plassert i hjørnet av rommet som vender opp mot taket. Slå av overheadbelysning for å unngå direkte lys på labyrinten som skaper refleksjon og forstyrrer deteksjonen av dyrene i arenaen.
    3. Ta med dyrene til rommet.
    4. La dem akklimatisere seg til rommet i 30 minutter.
  2. Eksperiment
    1. Plasser hjemmeburet under det digitale kameraet.
    2. Ta av lokket.
    3. Fjern hekkemateriale og annen berikelse som kan forstyrre sporing av dyr.
    4. Start kameraet.
    5. Bruk burkortet med dyre-ID-en for å identifisere dyret på videoen.
    6. Legg en hånd i hjemmeburet langs veggen av buret foran til høyre.
      1. Forsikre deg om at håndtererens hode ikke blokkerer kameraet for å filme musen.
    7. Start en tidtaker.
    8. Hold hånden immobile i 2 minutter, og la musen utforske hånden.
    9. Fjern hånden fra buret i 15 s.
    10. Prøv å plukke opp musen ved hjelp av cupped hender og registrere om musen flykter.
    11. Gjenta det siste trinnet opptil fem ganger, hvert 5.
    12. Registrer antall forsøk som kreves for å hente musen.
    13. Returner hekkemateriale og berikelse til buret.
    14. Rengjør hansker med 70% etanol eller bytt hansker før du går videre til neste dyr.
    15. Etter testing, overfør videoer fra minnekortet til en datamaskin.
    16. Bruk automatisert videosporingsprogramvare, del buret i fire like kvadranter og registrer tiden musen bruker i hver kvadrant (her Ethovision XT 14).

11. Nyhet undertrykt fôring

  1. Matmangel
    1. 3 dager før testen, utfør en full burendring, og enkelthus dyrene (enkelthus er å foretrekke å utføre hjemmeburtestingen).
      MERK: Å gi ferskt sengetøy fjerner potensielt støv eller små biter av mat som akkumuleres i sengetøyet siden forrige burskifte.
    2. Dagen før testing, veie alle dyr rundt 18:00.
    3. Fjern all mat fra matbeholderen, og sørg for at det ikke er noen stykker mat i buret eller i sengetøyet.
  2. Oppsett av rom
    1. Plasser NSF-kammeret på et bord.
    2. Fyll kammeret med et tynt lag med mais sengetøy (eller annet sengetøy som er forskjellig fra sengetøy som brukes i dyrs hjemmebur).
    3. Sett opp lyset på 70 Lux med 4 lyspærer plassert i hjørnet av bordet der kammeret står, vendt opp mot taket. Slå av overhead-lys for å opprettholde dårlig rombelysning.
    4. Plasser en pellets av standard chow som brukes i anlegget, på siden av kammeret vendt mot eksperimentet (≈10 cm fra veggen).
  3. Testing
    1. Om morgenen etter matmangel, ta dyrene til rommet 30 minutter før testing for å la dem akklimatisere seg til lysinnstillingene og det nye miljøet.
    2. Vei alle dyr for å måle vekttapet basert på vekten målt dagen før. Dyr bør miste 8-12% over natten for å kunne utføre oppgaven riktig.
    3. Sorter dyrene per vekttap, og screen dem fra musen som mistet mest til musen som mistet minst vekt.
    4. Pass på at kammeret er fylt med sengetøy og med en enkelt pellets.
    5. Plasser dyret på motsatt side av kammeret, vekk fra matpellet.
    6. Start tidtakeren umiddelbart.
    7. La musen utforske kammeret i opptil 12 minutter.
    8. Mål ventetiden for å nærme seg og mate (dyret må bite og spise) på matpellet.
      1. Se på det som en tilnærming når dyret kommer nær pellet, lukter det og biter ikke.
      2. Definer en bit som når dyret begynner å konsumere pelletsen.
    9. Registrer ventetiden for å nærme seg og mate på pelletsen på få sekunder.
    10. Når musen har matet på matpelleten, fjern musen fra kammeret.
    11. Kast sengetøyet, men lagre pelletsen som skal brukes til å teste appetittdrift i musens hjemmebur.
    12. Tilbakestill kammeret for neste dyr og fortsett med neste dyr.
    13. 15 min etter at testen er fullført i kammeret, slipp pelletsen som brukes under testen, inne i musens hjemmebur, mot veggen foran på buret.
    14. Mål ventetiden for å mate på pelletsen når pelletsen er i hjemmeburet. Dette er et mål for appetitt stasjonen.
      1. Det er å foretrekke å fjerne hekkematerialet for å sikre at musen ser pellet slippes i buret.

12. Serumoppsamling og kortikosteronmåling

  1. Håndter dyr i 1 min ved hjelp av den tildelte teknikken, 15 min før blodinnsamling (dette kan gjøres med gruppehus eller enkelthusdyr, husk risikoen for kamper når du omgrupperer mus).
    1. For tunnelen håndterte mus, før dem til tunnelen, løft tunnelen fra buret i 1 min, og erstatt musen i buret.
    2. For hale håndterte mus, ta tak i musens halebase og fjern musen fra buret. Overfør musen til eksperimenteringshylsen i 1 min, og returner musen til buret ved halehåndtering.
    3. For 3D-håndterte mus, bruk cupped hender for å fjerne musen fra buret. Hold musen i cupped hender i 1 min, og returner den til buret.
  2. 15 min etter håndtering, fortsett med blodoppsamling fra den submandribulære venen22.
  3. Skru musen fast slik at musens hode er sikkert immobilisert.
  4. Finn punkteringsstedet.
    1. Det er en liten hårløs dimple langs mandibelen i ansiktet som kan brukes som et landemerke for å finne punkteringsstedet. Tegning av en linje mellom bunnen av kjeven og dette dimple punkteringsstedet ligger bak denne dimple mot øret med omtrent 5 mm, like bak kjevens hengsel.
  5. Hold en ren 23 G nål vinkelrett på punkteringsstedet og bruk en rask fast lancingbevegelse. Spissen av nålen skal trenge inn i en dybde mellom 1-2 mm, blodet vil strømme umiddelbart så snart venen er punktert.
  6. Samle ~150 μL blod i EDTA belagte oppsamlingsrør og oppbevar på is.
  7. Påfør litt trykk med en steril gasbindpute på punkteringsstedet i 5 s eller mer for å la blodet koagulere.
  8. Når blodet har koagulert, returner musen til hjemmeburet.
  9. Sentrifuger blod ved 4 °C 3500 x g i 10 min.
  10. Dekanter supernatanten.
  11. Oppbevar supernatanten ved -20 °C for nedstrømsanalyser.
  12. Mål kortikosteronnivåer ved hjelp av et kortikosteron ELISA-sett etter produsentens protokoll.
  13. Bruk et spektrofotometer til å lese ELISA-resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To separate studier ble utført med C57BL/6 mus. Studie #1 inkluderte 6 måneder gamle menn og studie #2 inkluderte 2,5 måneder gamle kvinner (N = 36 / studie) fra Jackson Laboratories (Cat #000664). Mus ankom anlegget i en alder av 2 måneder. Mens Studie #2 kvinner ble håndtert og testet to uker etter ankomst, Studie #1 menn ble bare håndtert og testet i en alder av 6 måneder (forsinkelse på grunn av global pandemi nedleggelse). I løpet av denne tiden døde en mus fra Study #2, før han begynte å håndtere eksperimenter. Studien #1 mannlige mus ble tatt vare på av dyreavdelingens ansatte. Alle mus ble opprettholdt på en 12 timers lys / mørk syklus (7:00 PÅ, 19:00 AV), gitt tilgang til mat og vann ad libitum. Deres hjemmebur var fylt med resirkulert avis som sengetøy, samt hekkemateriale. Mus ble plassert individuelt, for å begrense potensiell agonistisk oppførsel hos gruppehus menn under håndteringsøkten eller etter prosedyrer som blodinnsamling eller atferdstesting. Mus ble randomisert i tre grupper: halehåndtering, tunnelhåndtering og 3D-håndtering, og håndtert i det åpne rommet i henhold til utformingen av deres respektive gruppe (figur 2). Den tunnelhåndterte gruppen mottok tunnelen som en berikelse i 1 uke før håndteringen. De ble deretter håndtert i ti (10) påfølgende dager, før atferdstesting. En uke etter at de forskjellige håndteringsøktene var fullført, startet atferdstestingen. På dag 16 ble mus testet i EPM, og deretter i eksperimentets interaksjonstest. To dager senere ble mus testet i NSF. Til slutt, på dag 24, ble blod trukket 15 min etter en ett-minutters håndteringsøkt av samme type som den første håndteringen.

For atferdstesting ble tunnelhåndterte dyr overført fra buret til apparatet ved hjelp av tunnelen så mye som mulig. Men for Elevated-Plus Maze-eksperimentet gjorde dimensjonene til labyrinten det vanskelig å fjerne eller plassere dyr i labyrinten ved hjelp av tunnelen. I dette tilfellet ble dyr overført fra tunneler til cupped hender, og transportert til labyrinten. 3D-håndterte mus ble håndtert i løpet av de tre dagene, samtidig med dagene 8-10 i tunnelhåndtering (figur 2). Halehåndterte mus var ikke vant til håndtering, men ble hale håndtert under interaksjoner med eksperimenter. I løpet av studietiden ble det utført burendring av eksperimentet for å sikre bruk av riktig håndteringsteknikk som brukes for hver gruppe.

I eksperimentinteraksjonstesten ble dyrene testet for sin vilje til frivillig å samhandle med eksperimentet og enkel håndtering i eksperimentell sammenheng (figur 3). ANOVA utført på antall forsøk på å plukke opp musen fra buret viste en betydelig effekt av håndteringsmetoden i Studie #1 menn (F(2,31)=6,36, p = 0,004), og i studie #2 kvinner (F(2,33)= 12,21, p = 0,0001). Scheffes post hoc-analyser viste at antall forsøk på å plukke opp musene ble betydelig redusert med både 3D (p = 0,0061 i studie #1 menn, og p= 0,0002 i studie #2 kvinner) og tunnelhåndtering (p = 0,04 i studie #1 menn, og p = 0,003 i studie #2 kvinner), sammenlignet med halehåndtert gruppe (Figur 3A). ANOVA utførte på tiden brukt i samme kvadrant som hånden viste signifikant effekt av håndtering i studie #1 menn (F(2,31)=5,38, p = 0,009), og i studie #2 kvinner (F(2,33)= 3,5, p = 0,04; Figur 3B). Scheffes post hoc-analyser viste at Study #1 mannlige mus håndtert med 3D-håndteringsteknikken brukte betydelig mer tid i samme kvadrant enn eksperimentets hånd, sammenlignet med halehåndterte mus (p = 0,012). Det var ingen signifikante forskjeller mellom håndteringsgrupper i studie #2, 2,5 måneder gamle kvinner. Graden av interaksjon med eksperimentet er ytterligere demonstrert av de kombinerte varmekartene til musenes midtpunkter (Figur 3C-E). Disse illustrerer hvordan de 3D-håndterte hannmusene fra Study #1 brukte mer tid proksimalt på hånden, inkludert områder nær hånden, mens halehåndterte mus hadde minst generell interaksjon med hånden.

Effektene av 3D- og tunnelhåndteringen ble sammenlignet med halehåndtering i to tester av angstlignende atferd, den nyhet undertrykte fôringstesten (NSF) og den forhøyede pluss labyrinten (EPM). I NSF-testen viste ANOVA på ventetiden for tilnærming en effekt av håndteringsteknikk som brukes i Studie #1 menn (F(2,31)=3,5, p = 0,04). Scheffes post hoc-analyser i Studie #1 menn viste trender fra 3D-håndterte mus (p = 0,08), og fra de tunnelhåndterte musene (p = 0,08), med redusert ventetid for tilnærming sammenlignet med halehåndterte mus (figur 4A). Ingen effekter ble observert i studie #2. ANOVA utført på ventetiden for å nærme seg i musens hjemmebur (data ikke vist) viste ingen effekt av håndtering (p = 0,88 i studie #1 menn, og p = 0,16 i studie #2 kvinner). ANOVA utført på prosenttiden i de åpne armene i EPM viste en betydelig effekt av håndtering i studie #2 kvinner (F(2,33)=3,5, p = 0,04). Ingen effekter ble observert i studie #1 menn(F (2,31)=2,1, p= 0,1; Figur 4B). Scheffes post hoc-analyser viste bare en trend mot økt tid brukt i de åpne armene i tunnelhåndterte mus fra Study #2, sammenlignet med halehåndterte mus (p = 0,07). Når det gjelder prosentoppføringene i de åpne armene (figur 4C), viste ANOVA ingen effekt av håndtering, verken i Studie #1 menn eller i Studie #2 kvinner (F(2,31)=1,12, p = 0,33; og F(2,33)=1,3, p = 0,26, henholdsvis). Atferdspoeng ble oppsummert i en z-score, som i Guilloux et al.23, informere om potensiell reduksjon av angstlignende atferd sammenlignet med halehåndterte mus (Figur 4D). ANOVA på z-skårene viste en signifikant effekt av håndtering i studie #1 menn (F(2,31)=5,6, p = 0,008), men ikke i studie #2 kvinner (F(2,33)= 1,07, p = 0,35). Scheffes post hoc-analyser viste at 3D-håndtering og tunnelhåndtering reduserte z-skåren betydelig (henholdsvis p = 0,04 og 0,01), sammenlignet med halehåndtering, noe som tyder på at begge tilnærmingene reduserer angstlignende atferd i studie #1 menn.

Kortikosteronnivåer etter håndtering ble også vurdert 15 minutter etter en kort håndteringsøkt (figur 5). ANOVA fant en signifikant effekt av håndtering i studie #2 kvinner (F(2,33)=4,44, p = 0,01), men ikke i studie #1 menn (F(1,31)= 0,53, p = 0,59). I studie #2 kvinner viste post hoc-analyser en signifikant reduksjon i kortikosteronnivåer hos mus fra 3D-håndteringsgruppen sammenlignet med halehåndteringsgruppen (p = 0,02).

For å finne ut om håndteringsteknikkene hadde en betydelig innvirkning på variasjonen av oppnådde data, brukte vi Bartletts test av varians homogenitet. Våre resultater fant ingen signifikant forskjell i variasjon i studien #2 kvinnelige mus på tvers av målinger (% tid EPM B(2,33)= 4,95, p = 0,087; % oppføringer EPM B(2, 33)= 3,68, p = 0,16; NSF B(2, 33)=0,20, p=0,91; CORT B(2, 33)=1,69, p=0,42). I studie #1 hannmus var det imidlertid en signifikant heterogenitet av varians i NSF-testen (B(2,31)=8,08, p = 0,0175) og målte CORT-nivåer (B(2,32)=11,63, p=0,0029), men ikke i noen av målene for EPM (% tid EPM B(2,32)=1,16, p = 0,56; % Oppføringer EPM B(2,32)=2,79, p = 0,25). Bruk av F-testen til å sammenligne to varianser viste at i NSF-testvariasjonen ble signifikant redusert for Studie #1 menn med både 3D (F(1,21)=4,22, p = 0,04) og tunnelhåndteringsteknikker (F(1,22)=4,01;p = 0,03) i forhold til halehåndtering. For konsentrasjonen av CORT etter håndtering reduserte kun 3D-håndtering signifikant variasjonen (F(1,20)=9,65, p = 0,0019) sammenlignet med halehåndtering.

Figure 1
Figur 1. Representative bilder av 3D-håndteringsprosedyren.  Bildene illustrerer 3D-håndteringsprosedyren. A) Hånd i bur: Eksperimentets hånd er plassert i buret og holdt stille, slik at musen kan habituate til tilstedeværelsen av hånden i buret. B) Flat hånd: Ved første fjerning fra buret er musen plassert på den flate håndflaten. Musen kan fritt gå rundt håndflaten og bevege seg mellom tilstøtende flate hender. C) Rull: Slapp av håndflaten for å danne en løs "kopp" rundt musen. Vipp koppen forsiktig inn i motsatt hånd, musen skal bevege seg fritt til denne hånden, hvis ikke forsiktig føre den inn i den andre hånden. D) Shelter: Plasser musen på kanten av hånden og ta deretter begge hendene sammen og veldig sakte danne kopp rundt musen. Musen bør ikke begrenses, og en åpning skal stå slik at musen kan unnslippe. Hold i ~5-10 s og åpne deretter for flate hender. E) Hode/bak-petting: Mens musen utforsker den flate håndflaten, klapper du forsiktig musen på hodet og ryggen. Dette vaner musen til tilnærmingen til eksperimentet ovenfra. F) Nese Poke: Når musen ser ut til å være vant til å håndtere, prøv å berøre musen forsiktig direkte på snuten. Hvis musen ikke beveger hodet bort, er det godt vant til å håndtere. G) Det er mulig å utføre en kort (2-3 s) nakkeklemme på den siste dagen, for å måle dyrs habituation i tilfelle fremtidige inngrep som krever strid. Når det er vanlig å håndtere, forblir mus immobile under nakkeklemmen, mens ikke-beboede mus vil prøve å unnslippe ved å rotere halen for å bli frigjort fra striden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Eksperimentell utforming.  Etter ankomst i anlegget fikk halehåndtert mus ingen habituation. Tunnelhåndterte mus ble habituated til tunnelene i deres hjemmebur i en uke før starten av håndteringen. Tunnelhåndterte mus ble håndtert med tunnelhåndteringsteknikken i 10 dager (Første håndteringsdag = dag 1), mens 3D-håndterte mus ble habituated i tre dager (Dag 8-10). Mus ble deretter utsatt for den forhøyede pluss labyrinten (EPM) (dag 16), eksperimenterinteraksjonstest (dag 19), nyhet undertrykt fôring (dag 21) og en kort håndteringsøkt etterfulgt av serumsamling for CORT-måling (dag 24). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Effekten av de tre håndteringsteknikkene på enkel håndtering og vilje til å samhandle med eksperimenter. A) Gjennomsnittlig antall plukkeforsøk som kreves for å fjerne en mus fra buret. Study #1 Male (venstre panel, Tail Handling N = 12, Tunnel Handling N = 12 og 3D-håndtering N = 11) og Study #2 kvinnelige (høyre panel, N = 12 per gruppe) mus fra både tunnel- og 3D-håndterte grupper viste en betydelig reduksjon i antall forsøk på å fjerne dem fra buret sammenlignet med halehåndterte mus. B) Gjennomsnittlig tid brukt av et dyr i samme kvadrant av buret som eksperimentets hånd. Studie #1 mannlige musene som ble håndtert med 3D-teknikken viste en betydelig økning i tid brukt i samme kvadrant som eksperimentets hånd. C-E) Gjennomsnittlige varmekart over musesenter-punkt for tid gjengitt i Ethovision XT 14, demonstrerte visuelt økt utforskning og interaksjon med eksperimenter av studien #1 3D-håndterte hannmus. Feilfelt indikerer SEM. *p<0,05, **p<0,01 sammenlignet med gruppen Håndtert hale. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 4
Figur 4. Virkningen av de tre håndteringsteknikkene på angstlignende atferd. A) Latens for å nærme seg og mate på pellets i nyheten undertrykt fôringskammer i Studie #1 mannlige mus (Tail Handling N = 12, Tunnel Handling N = 12 og 3D håndtering N = 11) og i Studie #2 kvinnelige mus (N = 12 / gruppe). Data fra studien #1 mannlige mus i 3D-håndterings- og tunnelhåndteringsgruppene viste en trend mot betydelig reduksjon av latens for å nærme seg pelletsen. B) Midler på % av tiden brukt i de åpne armene på den forhøyede pluss labyrinten. Det var ingen signifikante forskjeller mellom gruppene i studie #1 menn, og en trend mot mer tid i åpne armer ved å studere #2 kvinner i tunnelhåndteringsgruppen. C) Innlegg i de åpne armene: Det var ingen signifikante forskjeller mellom gruppene i Studie #1 menn, og heller ikke i Studie #2 kvinner. D) Z-skår som oppsummerer angstlignende atferd. Ved hjelp av dataene som presenteres i A, B og C, ble en z-score beregnet ved hjelp av tail-handled mus som referanse. Reduksjon i z-skår antyder en nedgang i angstlignende atferd målt ved NSF- og EPM-testene. Studie #1 mannlige musene som ble håndtert ved hjelp av 3D- eller tunnelteknikken viste en redusert angstlignende fenotype sammenlignet med tail-handled mus. Feilfelt indikerer SEM. *p<0,05 sammenlignet med gruppen håndtert av hale. t viser trending nivå av betydning (p<0.1) sammenlignet med hale håndtert gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 5
Figur 5. Nivåer av kortikosteron etter håndtering.  Serum ble samlet inn 15 min etter en kort håndteringsøkt, og deretter ble CORT-nivåene målt ved ELISA i både Studie #1 mann (Tail Handling N= 12, TunnelHåndtering N = 12 og 3D-håndtering N = 11) og i Studie #2 kvinnelige mus (N = 12 / gruppe). Studie #2 kvinnelige mus håndtert via 3D-håndteringsteknikken viste redusert kortikosteronnivå sammenlignet med mus som håndteres av halen. ANOVA i studie #1 mannlige mus nådde ikke betydning for forskjeller mellom grupper (p = 0,5). Feilfelt indikerer SEM. *p<0,05 sammenlignet med tail handled-gruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Table 1
Tabell 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne studien og metodeutviklingen er basert på observasjonen om at håndteringsteknikker hos mus fortsatt blir oversett av det vitenskapelige samfunnet, og at noen laboratorier fortsatt er motvillige til å implementere habituation eller håndteringsteknikker for å redusere stress og reaktivitet av dyrene sine før eksperimenter. Mens det representerer en tidsforpliktelse, gir dyrehåndtering gunstige effekter på dyrene som kan bidra til suksessen til forsøkene som skal utføres og forhindrer eksperimenter i å måtte utføres flere ganger på grunn av datavariabilitet eller overreaktivitet av dyr. Bruken av 3D-håndteringsteknikken reduserte rømningsforsøk hos mus. Det økte også samspillet med eksperimentet og reduserte angstlignende fenotyper i våre 6 måneder gamle hannmus. Videre reduserte 3D-håndtering datavariabiliteten og reduserte kortikosteronnivåer hos 2,5 måneder gamle hunnmus etter bare 3 første dager med håndtering. Denne tilnærmingen er avhengig av milde manipulasjoner for å habituate musen til håndtering av eksperimentatoren som letter jevnere transport og enklere inngrep.

Noe som er verdt å understreke fra 3D-håndteringsteknikken er at progresjonen av håndteringsmetoder oppstår som svar på musens reaktivitet, avhengig av oppnåelsen av milepælene beskrevet ovenfor og i tabell 1. Dyr bør ha redusert reaktivitet til ett håndteringstrinn før de går videre til de neste trinnene. Forsøk på å utvikle seg for raskt til "ly" eller "nese-poke" trinn på dyr som ikke er tilstrekkelig habituated, vil sannsynligvis føre til økt stress og potensielt redusere effektiviteten av prosedyren. På samme måte bør dyrets reaktivitet på hver håndteringsdag overvåkes og bør vurderes når du bestemmer om det er nødvendig med flere håndteringsdager. Hvis dyr ikke reagerer godt på lytesten den første dagen, ikke oppfyller kriteriene for å oppnå den første milepælen, kan den første håndteringsdagen gjentas til milepælen er fullført. På samme måte, hvis dyr ikke svarer på nesepoketesten på den andre dagen, kan den andre dagen også gjentas. En annen advarsel å merke seg med denne tilnærmingen er at risikoen for at mus hopper bort er større på den første dagen av håndtering, spesielt i hoppende stammer som C57BL6. Å følge retningslinjene beskrevet ovenfor bør redusere risikoen for hopping, og gi måter å begrense slik atferd på. Varigheten av håndteringen og progresjonen gjennom trinnene kan variere avhengig av belastningene, spesielt hvis du arbeider med transgene modeller som er kjent for å vise engstelige fenotyper.

Flere faktorer kan bidra til å redusere effektiviteten av den presenterte 3D-håndteringsteknikken. En slik faktor er den potensielle frykten eller nølingen fra eksperimentet, i tilfelle eksperimentet ikke er kjent med musehåndtering, eller å være redd for mus. Derfor er effekten på håndtereren også noe å vurdere. Den gradvise økningen i samhandlingsnivået med musene gjør det imidlertid mulig for nybegynnere å utvikle selvtillit og større ferdigheter til å utføre håndteringsteknikken når de går gjennom håndteringstrinnene. De foreslåtte trinnene / milepælene (ly- og nesepoketestene) kan bidra til å motvirke potensiell menneskelig variasjon hos nybegynnere, og sikre at dyrene når lignende nivåer av habituation. Det har blitt rapportert at å fremme positive menneske-dyr interaksjoner med dyr hadde resultert i større livskvalitet og medfølelse tilfredsstillelse i dyrepleiepersonell24. Som sådan gir gentling fra håndtering fordeler for både håndtereren og dyret under enhver generell interaksjon eller intervensjon.

Med sin innvirkning på å redusere antall forsøk på å plukke opp musen, hos både 6 måneder gamle menn og 2,5 måneder gamle kvinner, gir 3D-håndtering et alternativ til tunnelhåndtering eller andre teknikker, noe som letter enklere overføring av dyr fra buret til eksperimentelt apparat. 3D-håndteringsteknikken økte også samspillet mellom 6 måneder gamle hannmus med eksperimentet. Dette ble ikke observert hos 2,5 måneder gamle kvinnelige mus, men kvinnelige mus forble lettere å plukke opp, sammenlignet med halehåndterte mus. Dette antyder at 3D-håndteringsteknikken kan være mer egnet for eksperimenter som krever direkte interaksjoner mellom dyret og eksperimentet, for eksempel Morris vann labyrint (til tross for potensielle sex / alder forvirrende faktorer diskutert senere). Andre har utviklet og brukt manuelle håndteringsteknikker, bestående av å plukke opp dyrene med cupped hender, uten ytterligeremanipulasjon 10. Selv om disse teknikkene viste gunstige effekter, presenterer data i litteraturen ofte håndteringsprotokoller med habituation perioder over 10 dager9,16. I tillegg kan det hende at cupped-håndtering uten den raffinerte interaksjonen fra 3D-håndtering ikke er egnet for hoppende stammer som fortsetter å hoppe ut og bort fra hendene. Selv om vi ikke gjorde en direkte sammenligning i denne studien med koppmetoden, adresserer 3D-håndtering dette og er avhengig av raffinerte trekk for å fremme interaksjon mellom musen og håndtereren. Studien av Ghosal et al.16 brukte en kopphåndteringsteknikk kombinert med massasje i 5 dager, og viste at denne teknikken begrenser effekten av stress på metabolske endepunkter, og fremhever behovet for raffinerte bevegelser og interaksjon under håndtering for bedre effekt. Basert på denne koppmassasjeteknikken bruker 3D-håndtering ekstra interaksjon for å habituate mus. Ved hjelp av 3D-håndteringsmetoden sikrer håndterere at alle mus når et lignende nivå av habituation ved å utføre standardiserte bevegelser og ved å tilpasse varigheten av prosedyren til hvert dyr avhengig av behovet (i den nåværende studien passerte alle mus milepælene og fullførte 3D-håndteringsprotokollen på 3 dager). Denne tilnærmingen kan betraktes som "personlig" til hver mus, slik at alle dyr når ønsket nivå av habituation på hver dag med håndtering. Som nevnt tidligere, hvis dyr ikke når milepælene som er beskrevet i protokollen, kan denne teknikken justeres ved å øke antall dager. Denne teknikken viste gunstige effekter for å redusere variasjon mellom dyr i atferdsstudier og fysiologisk måling (CORT-nivåer), noe som tyder på at denne tilnærmingen kan bidra til reduksjon av variasjon i intrastudie og redusere effekten av eksperimentell feil som potensielt driver partiske resultater i prekliniske studier.

Støttende resultater antydet at mus utsatt for 3D- og tunnelhåndtering viser redusert angst i nyheten undertrykt fôringstest, sammenlignet med halehåndterte mus. Tatt i betraktning kombinerte data fra NSF og EPM, viste begge tilnærmingene betydelige effekter for å redusere angst hos 6 måneder gamle mannlige mus. Dette gjenskaper funnene om at dyr som er vant til tunnelhåndtering hadde forbedret ytelsen i tester for angst9,15 etter 10+ dager med håndtering, og ytterligere demonstrere potensialet i 3D-håndtering for å vise lignende effekter. Dette viste også at 3D-håndterte 6 måneder gamle mannlige mus nærmer seg og frivillig samhandler mer med sin eksperimenterer enn 6 måneder gamle mannlige mus utsatt for tunnel- og halehåndtering. Viktigst, 2,5 måneder gamle kvinnelige mus utsatt for 3D-håndtering hadde reduserte nivåer av CORT, som er i samsvar med tidligere publiserte resultater9. De to studiene (Studie #1 hos 6 måneder gamle menn og Studie #2 hos 2,5 måneder gamle kvinner) bekreftet, på to forskjellige måter at håndteringen har gunstig innvirkning på angstlignende fenotyper (enten på atferdsmessige resultater i studie #1, eller på CORT-nivåer i studie #2).

En mulig medvirkende faktor til effekten er eksperimentets kjønn, i dette tilfellet mann. Det har blitt vist av Sorge et al.25 at tilstedeværelsen av mannlige eksperimenter kan føre til en økning i CORT og angst som atferd hos mannlige, men ikke kvinnelige mus. Dette står i kontrast til resultater fra denne studien. Den største forskjellen mellom denne studien og studien fra Sorge et al.25 er at tilnærmingen som er beskrevet her består i å habituating musene til håndtering, ved å fremme positiv (ikke-forsterket) interaksjon med eksperimentet, mens Sorge et al.25 brukte naive gnagere som aldri samhandlet med mennesker. Man kan forvente at naive mus kan ha en sterk reaksjon mot menneskelige eksperimenter hvis de ikke lærer at eksperimentet ikke representerer en trussel. Imidlertid ble den nåværende studien bare utført med en mannlig eksperimenterer, og fremtidige studier bør undersøke om slike effekter er reproduserbare med en kvinnelig eksperimenterer. Selv om det å isolere disse faktorene er utenfor dette papirets omfang, er det verdt å fremheve viktigheten av å identifisere slike kilder til variasjon når man implementerer håndtering av habituation, eller i eksperimentell design mer generelt.

Den nåværende studien bekreftet også effekten av tunnelhåndteringsteknikken for å redusere angstlignende atferd og CORT-nivåer hos mus9,10,11. En ekstra fordel med denne tilnærmingen er at tunnelen kan bli liggende i merden som berikelse26, noe som også kan bidra til redusert stress / angstrespons, som til sammen bidrar til forbedret velferd10,11. I dette tilfellet er eksperimentets rolle å manipulere tunnelen bare, med hvert dyr, i ett minutt. Men som beskrevet av Gouveia et al19, trenger tunnelen ikke nødvendigvis å forbli i hjemmeburet og kan i stedet bare presenteres for dyrene når det er nødvendig for å overføre dyret, uten å forårsake ekstra stress. Begge tilnærmingene, tunnel- og 3D-håndteringsteknikkene, gir fordeler som bør vurderes av laboratoriet og eksperimentene for å avgjøre hvilken tilnærming som passer best for deres behov. I den nåværende studien ble tunnelen igjen i buret, og effektene vi observerte på angstlignende atferd kan skyldes en kombinasjon av tunnelhåndtering og berikelse.

Begge gir gunstige effekter, men 3D- og tunnelhåndteringsteknikkene er ikke uten begrensninger. En felles begrensning er at det kan være tidkrevende og potensielt nedslående for dyrefasiliteter å gjennomføre slike prosedyrer. De ekstra fordelene er imidlertid uvurderlige, forbedrer dyrevelferden ved å redusere stress og forbedre samspillet med eksperimenter og dyrepleieleverandører (som beskrevet i Spangenberg og Kelling27), og forskningspålitelighet og reproduserbarhet. Bevis fra anlegget vårt tyder på at denne teknikken forbedrer samspillet mellom dyr og husdyrhold, noe som letter burendring og helseovervåking. Fra andre brukere i vårt anlegg rapporteres strid og generell manipulasjon som betydelig enklere med håndterte mus, i samsvar med våre funn om at mus som håndteres med 3D-teknikken, er mindre sannsynlig å flykte når de blir plukket opp, og i vårt eksempel er 6 måneder gamle menn mer tilbøyelige til å samhandle med sin eksperimentering. Oppfølgingsstudier kan kvantifisere slike effekter for å demonstrere videre nytten av teknikken. Til sammen bidrar denne 3D-håndteringsmetoden, så vel som tunneltilnærmingen, til 3R-regelen, spesielt ved å raffinere rutinemessige dyreinteraksjoner for å minimere stresset som respons på håndtering. Gitt den observerte reduksjonen i variasjon av data, har dette også potensial til å redusere antall dyr som trengs for å oppnå konsistente resultater og raffinere tilnærmingen som brukes til å begrense variasjon.

Et annet diskusjonspunkt basert på dataene som presenteres er at denne studien ble utført med dyr som var en-housed. Enkelthus ble foretrukket da det begrenser den potensielle agonistiske oppførselen (spesielt hos mannlige mus), som kan bidra til inter-individuell variasjon28,29. For konsistens mellom grupper ble alle dyr enkelthus. Det er også interessant å merke seg at positive eksperimenter-dyr interaksjoner hos rotter i form av rotte kiling, var i stand til å redusere noen av effektene av sosial isolasjon i enkelthus rotter30,31. Det er mulig at håndteringsteknikker som involverer direkte kontakt mellom dyr og eksperimenter, for eksempel 3D-håndteringsteknikken eller koppmassasjeteknikken beskrevet av Ghosal et al.11, kan ha en lignende effekt. Fremtidige studier kan utforske dette spørsmålet ved å sammenligne effekten av håndteringsteknikker hos enkelt- og gruppehusdyr. Tidligere studier undersøkte virkningen av kopp- og tunnelhåndteringsmetoder med mus i gruppehus, og oppnådde lignende resultater7,8. Dette bekrefter at det er mulig å bruke håndteringsprotokollene beskrevet heri med dyr holdt i en-hus eller gruppehusforhold, med tanke på muligheten for agonistisk oppførsel når du tar ett dyr ut av buret og plasserer det tilbake i (spesielt hos mannlige mus, eller i aggressive muselinjer). I slike tilfeller anbefales det å bruke et midlertidig bur før du omgrupperer alle dyrene sammen.

For å konkludere bidrar den foreslåtte 3D-håndteringsmetoden til å redusere reaktivitet og stress hos mus. Det øker også datapåliteligheten ved å redusere variasjonen etter 3 dagers håndtering. Lignende resultater er observerbare med tunnelhåndteringen, i vårt tilfelle etter 10 dager med tunnelhåndtering. Sammenlignet med tunnelhåndteringsteknikken ga 3D-håndteringsteknikken fordelen av å øke samspillet med en eksperimentering i våre 6 måneder gamle mannlige mus, noe som i noen tilfeller kan være kritisk. Dersom 3D- eller tunnelhåndteringsteknikken skulle implementeres i alle dyreanlegg som skulle utgjøre en stor forbedring for datagenerering og i stor grad ville bidra til reduksjon av dyrebruk i forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Animal Care Committee of CAMH for å støtte dette arbeidet, samt dyrepleierne til CAMH som ga omfattende tilbakemeldinger på nytten av prosedyren, motiverte utførelsen av de beskrevne eksperimentene og innlevering av den detaljerte protokollen for andre brukere. Dette arbeidet ble delvis finansiert av CAMH BreakThrough Challenge, tildelt TP, og av interne midler fra CAMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
  2. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
  4. Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
  5. Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
  6. Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
  7. Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
  8. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  9. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  10. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
  11. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
  12. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  13. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
  14. Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
  15. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
  16. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  17. Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
  18. Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
  19. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
  20. Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
  21. Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
  22. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  23. Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
  24. LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
  25. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  26. Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
  27. Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures - a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
  28. Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
  29. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  30. Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
  31. Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).

Tags

Oppførsel utgave 175
Håndteringsteknikker for å redusere stress hos mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga,… More

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J. L., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter