Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Técnicas de manejo para reducir el estrés en ratones

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62593
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 4, 5, 1,2,3, 1,2
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

Summary

Este artículo describe una técnica de manejo en ratones, la técnica de manejo 3D, que facilita el manejo de rutina al reducir los comportamientos similares a la ansiedad y presenta detalles sobre dos técnicas relacionadas existentes (manejo de túnel y cola).

Abstract

Los animales de laboratorio son sometidos a múltiples manipulaciones por parte de científicos o proveedores de cuidado de animales. El estrés que esto causa puede tener efectos profundos en el bienestar animal y también puede ser un factor de confusión para variables experimentales como las medidas de ansiedad. A lo largo de los años, se han desarrollado técnicas de manejo que minimizan el estrés relacionado con el manejo con un enfoque particular en las ratas y poca atención a los ratones. Sin embargo, se ha demostrado que los ratones pueden habituarse a manipulaciones utilizando técnicas de manipulación. Habituar a los ratones al manejo reduce el estrés, facilita el manejo de rutina, mejora el bienestar animal, disminuye la variabilidad de los datos y mejora la confiabilidad experimental. A pesar de los efectos beneficiosos del manejo, el enfoque de recogida de cola, que es particularmente estresante, todavía se usa ampliamente. Este documento proporciona una descripción detallada y una demostración de una técnica de manejo de ratones recientemente desarrollada destinada a minimizar el estrés experimentado por el animal durante la interacción humana. Esta técnica manual se realiza durante 3 días (técnica de manipulación 3D) y se centra en la capacidad del animal para habituar al experimentador. Este estudio también muestra el efecto de las técnicas de manipulación de túneles previamente establecidas (utilizando un túnel de policarbonato) y la técnica de recogida de cola. Específicamente se estudian sus efectos sobre comportamientos similares a la ansiedad, utilizando pruebas de comportamiento (Laberinto Elevado-Plus y Alimentación Suprimida por Novedad), interacción voluntaria con experimentadores y medición fisiológica (niveles de corticosterona). La técnica de manejo 3D y la técnica de manejo de túneles redujeron los fenotipos similares a la ansiedad. En el primer experimento, utilizando ratones machos de 6 meses de edad, la técnica de manejo 3D mejoró significativamente la interacción del experimentador. En el segundo experimento, utilizando una hembra de 2,5 meses de edad, redujo los niveles de corticosterona. Como tal, el manejo 3D es un enfoque útil en escenarios donde la interacción con el experimentador es requerida o preferida, o donde el manejo del túnel puede no ser posible durante el experimento.

Introduction

Los ratones y las ratas son activos esenciales para los estudios preclínicos1,2 para múltiples propósitos, incluidos los estudios endocrinos, fisiológicos, farmacológicos o conductuales2. A partir del creciente número de estudios con animales, surgió que las variables ambientales no controladas, incluida la interacción humana, influyen en diversos resultados en la investigación biomédica3,4,5. Esto es responsable de la variabilidad significativa observada en los experimentos y laboratorios de investigación4,5, lo que plantea una advertencia importante en la investigación con animales.

Se han implementado varios enfoques con el objetivo de limitar el impacto de los factores estresantes ambientales y reducir la reactividad a la interacción humana. Por ejemplo, para limitar el impacto de los factores estresantes ambientales, la estandarización de las condiciones de la vivienda y los sistemas de viviendaautomatizados 6,7 se han implementado en todos los laboratorios. Con respecto a la interacción con los seres humanos, los enfoques comúnmente utilizados para el manejo y transporte de animales tenían poca consideración por la incomodidad y el estrés de los animales. Por ejemplo, recoger animales por la cola o usar pórceps8 aumenta la ansiedad basal9,10,11,reduce la exploración9,12 y contribuye en gran medida a la variabilidad interindividual dentro y entre los estudios13,14. Como resultado, se desarrollaron otros enfoques, como la técnica de manejo de copas, que es aplicable a ratones y ratas. En este enfoque, los animales son "ahuecarados" fuera de su jaula, y sostenidos por los experimentadores con sus manos formando una taza9,10,11. Otra alternativa útil al manejo de la cola implica el uso de un túnel de policarbonato para transferir ratones9,10,15. Este enfoque elimina la interacción directa entre el ratón y el experimentador. Tanto los enfoques de copa como de túnel mostraron eficacia en la reducción de comportamientos similares a la ansiedad y el miedo al experimentador que pueden ser exagerados por técnicas de manejo aversivo, como el recogimiento de cola / manejo de cola9,10.

Por lo tanto, la creciente evidencia demuestra la utilidad del manejo adecuado del ratón para reducir la variabilidad entre individuos9,11y mejorar el bienestar animal10. Sin embargo, las técnicas mencionadas anteriormente todavía se enfrentan a limitaciones. La técnica de manejo de copas se ha implementado con horarios que van desde 10 días (10 sesiones durante 2 semanas16)hasta 15 semanas17,que es una cantidad considerable de tiempo para el personal de las instalaciones y los experimentadores. Además, la efectividad del manejo de la copa varía según la cepa9 y el manejo convencional de la copa en manos abiertas puede conducir a ratones ingenuos o cepas particularmente saltarines para saltar de la mano9,18. El manejo del túnel da como resultado resultados más consistentes y generalmente más rápidos en el gentling19. Los túneles también se utilizan como enriquecimiento de jaulas domésticas. Ayudan a los animales a habituar a la manipulación rápida y proporcionan los beneficios adicionales del enriquecimiento. El manejo de túneles, sin embargo, tiene limitaciones al transferir animales entre aparatos. Curiosamente, Hurst y West9,y Henderson et al.20 demostraron que el uso de un manejo manual suave y breve para transferir animales del túnel al aparato no afecta su fenotipo.

Para proporcionar una alternativa a los métodos existentes, con habituación alcanzable en un corto período de tiempo, este artículo describe una técnica novedosa que amplía la técnica de manipulación de la copa, por lo tanto, no requiere ningún equipo en particular. Este enfoque utiliza hitos para medir el nivel de comodidad que tienen los ratones con el proceso de manipulación. Muestra eficacia para disminuir la reactividad y el estrés del ratón (a nivel conductual y hormonal), facilita el manejo rutinario y contribuye a reducir la variabilidad entre animales. Los detalles de esta técnica se proporcionan aquí, y su eficacia para reducir los comportamientos similares a la ansiedad, mejorar la interacción con los experimentadores y limitar la liberación periférica de la hormona del estrés (corticosterona) se demuestra en dos estudios separados (ratones machos y hembras), en comparación con el manejo del túnel (control positivo) y las técnicas de manejo de la cola (control negativo).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por el comité de cuidado de animales de CAMH y se llevaron a cabo de conformidad con las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

NOTA: El método de manipulación descrito en este documento se puede utilizar en varias cepas de ratón, incluidas las líneas no transgénicas (C57 / BL6, BalbC, CD1, SV129, etc.) y transgénicas. También se puede usar con ratones jóvenes o viejos, teniendo en cuenta que los ratones adultos jóvenes (4-6 semanas de edad) tienden a ser ligeramente más activos que los ratones adultos o viejos, especialmente en el día 1.

1. Preparación experimental

  1. Antes del inicio del estudio, según las pautasARRIVE 21,asigne aleatoriamente ratones a cada grupo de manejo (Manejo 3D, Manejo de Túnel o Manejo de Cola).
  2. Identificar la sala para realizar el manejo. Se puede realizar en la sala de la vivienda, o en una habitación separada. Si el manejo se realiza en una habitación separada, lo que requiere que los animales se muevan en un carro en movimiento, permita que los animales se habitúen a la nueva habitación durante 20-30 minutos antes del inicio del protocolo de manejo.
  3. Para los animales alojados en grupo, use una jaula temporal para alojar a los ratones después del manejo, antes de reagruparlos a todos en su jaula doméstica inicial. Esto reduce las posibles peleas entre animales antes de la manipulación (particularmente en los machos).
  4. Trabaje en un mostrador (preferiblemente una encimera despejada) o en un gabinete de bioseguridad, con la jaula de la carcasa lejos del animal que se está manipulando. La proximidad a la jaula de la carcasa aumenta el riesgo de saltar. Si los animales están alojados en grupos, saltar del ratón que se maneja en la jaula doméstica puede causar estrés a los compañeros de jaula.
    NOTA: Trabajar en un gabinete de bioseguridad limita el riesgo de que los ratones salten al suelo y puede ser necesario en ciertas instalaciones. Esta técnica se puede utilizar en un gabinete de bioseguridad, asegurándose de realizar siempre todos los pasos dentro del gabinete de bioseguridad y evitando que los ratones caminen sobre los antebrazos del manipulador.

2. DÍA 1: 5 min por ratón

  1. Abra suavemente la jaula y coloque la tapa en el costado, retire los materiales de anidación y otros enriquecimientos, como ruedas o refugios.
  2. Introduzca una mano abierta enguantada en la jaula de la casa, colocando lentamente la mano a lo largo de un lado de la pared de la jaula (la pared más cercana al manipulador, Figura 1A).
    1. No intente levantar inmediatamente el mouse.
  3. Permanezca inmóvil y permita que el animal se habitúe a la presencia de la mano en la jaula durante unos 30 s.
  4. Intente recoger el ratón en la palma de la mano (es decir, evite recoger al animal por la cola).
    1. Si el ratón no se recoge fácilmente después de 3 intentos, guíe el ratón hasta una esquina y una taza con ambas manos.
    2. Mueva suavemente las manos ahuecadas hacia el mouse para tratar de recogerlo.
    3. Si no tiene éxito después de un máximo de 3 intentos con ambas manos, levante el mouse suavemente por la base de su cola y transfiéralo a su antebrazo o mano plana.
  5. Con el ratón en la mano, mantén la mano lo más plana y abierta posible.
    NOTA: Esto proporciona una plataforma plana para que el ratón pise y limita el riesgo de mordeduras.
  6. Sosteniendo la mano abierta y plana con la palma hacia arriba, coloque la otra mano adyacente a la mano que sostiene el mouse y permita que el mouse se mueva libremente de una mano a otra sin ninguna restricción (Figura 1B).
  7. Deje que el ratón explore y se mueva entre las manos durante 1 minuto.
    1. En este punto, los ratones pueden intentar saltar. Coloque las manos de tal manera que si el ratón salta, aterrizará en una encimera en lugar de en el suelo.
    2. Si un ratón parece que se está preparando para saltar (moviéndose hacia el borde de la mano y levantándose sobre las patas traseras), coloque lentamente la otra mano frente a él y trate de guiarlo para que camine sobre esta mano. Evite los movimientos bruscos, ya que aumenta su riesgo de saltar.
    3. Si un ratón salta, intente levantarlo evitando el manejo de la cola y reanude la sesión de manejo. Si el ratón permanece en el suelo o fuera de las manos durante más de 10 s, agregue tiempo adicional a la sesión de manejo para compensar cualquier momento en que el mouse estuviera fuera de las manos.
    4. Toma notas del salto. El número total de saltos se puede utilizar para evaluar la variabilidad potencial entre los animales.
  8. Después de 1 minuto de manipulación con las manos planas, relaje la palma de la mano y coloque ligeramente el mouse en la mano, antes de rodar suavemente el mouse entre las manos(Figura 1C).
    1. Para "rodar", coloque el mouse en la palma de la mano, en una mano plana, perpendicular a los dedos.
    2. Cierre lentamente la mano, colocando los dedos en la parte posterior del mouse.
    3. Coloque la mano libre directamente debajo de la mano que sostiene el mouse.
    4. Gire / gire lentamente la mano con el mouse para transferir suavemente el mouse a la otra mano (giro de 180 °).
    5. Repite esto de un lado a otro entre las manos.
  9. Alternar entre suaves manos y exploración libre en manos abiertas durante 60 s, alternando entre técnicas aproximadamente cada 20 s.
  10. Realizar una "prueba de refugio"(Figura 1D).
    1. Deje que el mouse se mueva hacia el borde de la mano y luego junte las 2 manos.
    2. Muy lentamente, cúberlos para que el ratón quepa dentro de un "refugio" formado por las manos. Deje una abertura para que el ratón pueda escapar si es necesario.
    3. Trate de mantener al ratón en el refugio durante 5-10 s, sin ninguna restricción.
    4. Alterne entre la prueba de refugio, ruede entre manos y exploración libre de manos abiertas durante otros 60 s, asegurándose de realizar el paso de refugio 3 o más veces.
  11. En todos los procedimientos descritos en 2.10, no apresure el proceso. Si el ratón parece estresado (es decir, tentativo para escapar, salta de las manos, evita el contacto con las manos, etc.) al estar confinado dentro de las manos, continúe rodando entre las manos y la exploración libre durante 20 s, y luego vuelva a intentarlo.
  12. Hito: Realice al menos 1 prueba de refugio exitosa de 10 s para completar el Día 1.
    1. Considere una prueba de refugio exitosa cuando el ratón permanezca en las manos. Si el ratón saca la cabeza y regresa al refugio, sigue siendo una prueba exitosa. Si el animal sale por completo del refugio, es un fracaso.
  13. Permita la exploración libre en las manos durante 30 s.
  14. Reemplace suavemente el mouse en su jaula. Si está alojado en grupo, coloque el ratón en la jaula temporal hasta que se manipulen todos los compañeros de jaula. Devuelva a los ratones a su jaula original recogiéndolos en la palma de la mano. No use un recogen de cola.
  15. Limpie la mesa de trabajo de heces y orina potenciales con etanol al 70%.
  16. Enjuague bien los guantes con etanol al 70% (o una solución de limpieza adecuada) o cámbiese los guantes antes de manipular el siguiente ratón (es posible mantener los mismos guantes para los compañeros de jaula).
    NOTA: Se recomienda realizar el manejo con un número razonable de animales para evitar la fatiga del manejador. El manejo de 24 ratones toma alrededor de 2 h y se recomienda no exceder los 24 ratones por manejador. Si es necesario manipular más animales, se recomienda tener varios manipuladores o dividir los procedimientos de manipulación en subgrupos durante varios días.

3. DÍA 2: 3 a 5 min por ratón

  1. Intente levantar el ratón en la palma de la mano. En esta etapa, ya debería ser factible y los ratones no deberían saltar de la mano.
  2. Comience con la palma abierta como en el día 1, lo que permite que el mouse explore libremente durante 20 s.
  3. Luego, haga rodar el mouse entre las manos varias veces (4-5 veces).
  4. Realizar la "prueba de refugio" durante 5 s.
  5. Repita la prueba de refugio varias veces (~ 5-6) durante un período de 2 a 3 minutos.
  6. Durante el mismo período de 2 a 3 minutos, alterne con el rollo entre manos y exploración libre del paso de manos abiertas desde el día 1 para mejorar la habituación.
    1. Toque el ratón en su cabeza y espalda(Figura 1E),5-6 veces. Un signo de habituación es cuando el ratón te permite tocarlo sin intentar escapar.
    2. Realizar un "nose poke": Intenta tocar el hocico del ratón, de 2 a 3 veces(Figura 1F).
      1. Si el ratón intenta morder o muestra signos obvios de estrés al ser tocado, no intente inmediatamente que la nariz vuelva a pinchar. En su lugar, alterne con la exploración de mano plana y el balanceo. La "habituación" se refleja en que el animal no huye o gira la cabeza en casos de contacto humano.
  7. En todos los procedimientos descritos en 3.4-3.6, no apresure el proceso. Si el ratón parece estresado por estar confinado dentro de las manos o no quiere ser tocado, continúe rodando entre manos durante 20-30 s y luego vuelva a intentarlo.
  8. Hitos: Realice al menos 1 golpe de nariz exitoso durante 2-3 s para completar el Día 2.
  9. Detenga esta sesión después de aproximadamente 3 minutos de manejo si el animal reacciona bien al "refugio", "acariciar la cabeza", "empujar la nariz", y si el ratón parece estar dispuesto a explorar las manos sin signos de estrés.
  10. Si el ratón continúa mostrando signos de estrés o no está reaccionando bien a la prueba de "refugio" o "golpe de nariz", continúe la sesión hasta llegar a los 5 minutos como en el Día 1.
  11. Reemplace el mouse en su jaula, limpie la mesa de trabajo y los guantes como en el Día 1.

4. DÍA 3: Alrededor de 3 min por ratón

  1. En el tercer día, proceda a través de los mismos pasos que en el Día 2, durante 2 a 3 minutos.
    1. Levante el ratón en la palma de la mano.
    2. Transfiera y ruede el ratón entre las manos
    3. Realice una prueba de refugio.
    4. Trate de acariciar al ratón en la espalda y la cabeza.
  2. Alterne entre estos pasos durante aproximadamente 1 a 2 min.
  3. Continúe el procedimiento hasta que el ratón esté lo suficientemente relajado como para sentarse en la palma de la mano sin intentar escapar.
  4. Antes del final del día 3, repita la prueba de refugio y la prueba de empuje nasal como una prueba de habituación.
    1. Si ambas pruebas se pueden completar en su primer intento, el proceso de habituación está completo. Continúe manipulando suavemente el mouse durante 30 s a un minuto.
    2. Si el ratón es inicialmente resistente a cualquiera de las pruebas, repita los pasos 4.1-4.3 durante 20-30 s antes de volver a perforar la prueba de nariz y refugio.
    3. Si el ratón permanece resistente a estas pruebas después de 3 min, se puede repetir el tercer día.
  5. Hitos: Realice al menos 2 pruebas de refugio exitosas de 10 s cada una, y 2 pruebas de perforación de nariz exitosas para completar el Día 3 y completar todo el procedimiento de manejo 3D.
  6. Devuelva el ratón a su jaula, limpie la mesa de trabajo y los guantes.

5. Enfoque opcional para que los animales sean sometidos a sujeción para inyección o sonda

NOTA: El día 3, si el animal será restringido con fines experimentales (sonda oral, inyección intraperitoneal, etc.), los ratones pueden ser sometidos a la prueba de pellizco de cuello.

  1. Agarre la nuca entre el pulgar y el índice (Figura 1G).
  2. Levante el ratón 3-5 cm por encima de la mano durante 2-3 s.
    NOTA: Esta es normalmente una posición no natural para ratones adultos, y si los ratones permanecen casi inmóviles, están bien habituados a la manipulación y serán fáciles de restringir con fines experimentales.
  3. Vuelva a colocar el mouse en la mano plana, o si el mouse es reactivo al pellizco del cuello, considere colocarlo en la manga del experimentador, la tapa de la jaula o la encimera.
    NOTA: Si trabaja en un gabinete de bioseguridad, no coloque el mouse en la manga o podría subir y salir del gabinete de bioseguridad. Prefiere colocar el ratón en la encimera dentro del gabinete de bioseguridad.
  4. Deje que el ratón explore libremente la mano del experimentador durante 1 minuto.

6. Enfoque opcional para días adicionales de manipulación

  1. En la eventualidad de una línea de ratón altamente estresada, agregue días adicionales para disminuir la reactividad y el nivel de estrés de los animales, utilizando los métodos descritos en el Día 2/3.
    NOTA: Muchos factores pueden afectar el estrés basal de los animales, incluida la tensión, la presencia de modificación transgénica, la edad, el sexo y las condiciones de alojamiento. Si estos factores no son consistentes entre grupos como los animales envejecidos que se someten a pruebas contra controles jóvenes o los animales transgénicos que se prueban contra controles de tipo salvaje, se recomienda que se utilice el mismo número de días de habituación para cada grupo.

7. Manejo de túneles

NOTA: Esta técnica es aplicable solo a los ratones manejados por túneles. Los túneles son tubos de policarbonato de aproximadamente 13 cm de longitud y 5 cm de diámetro.

  1. Coloque el túnel en la jaula del ratón.
  2. Deje el túnel en la jaula durante 7 días antes de la manipulación.
  3. Abra la jaula y coloque la tapa en el costado.
  4. Guíe suavemente al ratón hacia el túnel de policarbonato (ya en la jaula).
  5. Levante el túnel de la jaula, horizontalmente. Si es necesario, cubra libremente los extremos del túnel para evitar que el animal salte / se caiga del túnel, potencialmente cayendo en su jaula o en el suelo.
  6. Mueva al animal en el túnel lejos de la jaula de la casa y manténgalo alejado de cualquier superficie durante 30 s.
  7. Coloque el túnel de nuevo en la jaula de la casa, permitiendo que el ratón salga del tubo.
  8. Espere 60 s y luego repita los pasos 7.4-7.7 una vez.
  9. Enjuague bien los guantes con etanol al 70% o cámbiese los guantes antes de habituar al siguiente ratón.
  10. Repita este procedimiento durante 10 días consecutivos.

8. Manejo de la cola

NOTA: Esta técnica es aplicable solo a los ratones con mango de cola. Se utiliza para transferir ratones de su jaula a un aparato, y viceversa.

  1. Abra la jaula y coloque la tapa en el costado.
  2. Agarre a los ratones por la base de la cola entre el pulgar y el índice.
  3. Levante el ratón de la jaula.
  4. En 2-3 s, transfiera el ratón al antebrazo opuesto del experimentador mientras mantiene un agarre en la cola para evitar que el ratón cuelgue.
  5. Cuando se requiere el manejo de la cola en la implementación de este experimento (por ejemplo, antes de las extracciones de sangre para la prueba de cortisol), los animales se transfieren al antebrazo del experimentador mediante el manejo de la cola y se mantienen durante 15 s antes de ser devueltos a su jaula.

9. Laberinto Elevado Plus

  1. Configuración de la habitación
    1. Coloque el laberinto en el centro de la habitación, debajo de una cámara digital equipada con una tarjeta de memoria.
    2. Configure la luz de la habitación a ~ 60 Lux usando 2 lámparas de pie colocadas detrás del laberinto.
    3. Apague cualquier iluminación cenital para evitar la luz directa en el laberinto que crea reflejo e interrumpe la detección de los animales en el laberinto.
    4. Una vez que todo el equipo esté configurado, transfiera a los animales a la habitación y déjelos aclimatarse a la configuración de luz y al nuevo entorno durante 30 minutos.
  2. Ensayo
    1. Limpie el laberinto con etanol al 70% para evitar olores de polvo o del animal que fue probado previamente.
    2. Inicie la cámara.
    3. Use un pedazo de papel con la identificación del animal para grabar la identificación en el video, antes de colocar al animal en el laberinto (esto facilitará la identificación adecuada de qué ratón se está filmando en cada video).
    4. Utiliza la técnica de manipulación adecuada a cada animal para trasladarlo al laberinto.
    5. Coloque el ratón en la plataforma central, mirando hacia un brazo abierto.
    6. Permita que el ratón explore el aparato durante 10 minutos, sin ser molestado.
    7. Después de 10 minutos, detenga la cámara.
    8. Recupera el ratón del laberinto y vuelve a ponerlo en su jaula.
    9. Limpie las heces y la orina del laberinto con etanol al 70%.
    10. Una vez que se complete la prueba con todos los ratones, transfiera videos desde la tarjeta de memoria a una computadora para el seguimiento de video.
    11. Utilizando un software automatizado de seguimiento de animales, rastree el número de entradas a los brazos abiertos y cerrados, y el tiempo pasado en brazos abiertos o cerrados (aquí Ethovision XT 14).

10. Experimenter Interaction (derivado de Hurst y West9)

  1. Configuración de la habitación
    1. Coloque una mesa en el centro de la sala de pruebas debajo de una cámara digital equipada con una tarjeta de memoria.
    2. Configure la luz a 50-70 Lux con 4 bombillas colocadas en la esquina de la habitación mirando hacia el techo. Apague la iluminación cenital para evitar la luz directa en el laberinto que crea reflejos e interrumpe la detección de los animales en la arena.
    3. Lleve a los animales a la habitación.
    4. Déjelos aclimatarse a la habitación durante 30 minutos.
  2. Experimento
    1. Coloque la jaula doméstica debajo de la cámara digital.
    2. Retire la tapa.
    3. Retire el material de anidación y otro enriquecimiento que pueda interferir con el seguimiento de los animales.
    4. Inicie la cámara.
    5. Use la tarjeta de la jaula con la identificación del animal para identificar al animal en el video.
    6. Coloque una mano en la jaula de la casa a lo largo de la pared de la jaula en la parte delantera derecha.
      1. Asegúrese de que la cabeza del manipulador no esté bloqueando la cámara para filmar el ratón.
    7. Inicie un temporizador.
    8. Mantenga la mano inmóvil durante 2 minutos y deje que el mouse explore la mano.
    9. Retire la mano de la jaula durante 15 s.
    10. Intente levantar el mouse con las manos ahuecadas y registre si el mouse huye.
    11. Repita el último paso hasta cinco veces, cada 5 segundos, o hasta que el ratón se permita recoger.
    12. Registre el número de intentos necesarios para levantar el ratón.
    13. Devolver el material de anidación y enriquecimiento a la jaula.
    14. Limpie los guantes con etanol al 70% o cámbiese los guantes antes de pasar al siguiente animal.
    15. Después de la prueba, transfiera videos de la tarjeta de memoria a una computadora.
    16. Utilizando un software de seguimiento de video automatizado, divida la jaula en cuatro cuadrantes iguales y registre el tiempo que pasa el mouse en cada cuadrante (aquí, Ethovision XT 14).

11. Novedad Alimentación suprimida

  1. Privación de alimentos
    1. 3 días antes de la prueba, realice un cambio de jaula completo y aloste a los animales (es preferible una sola vivienda para realizar la prueba de jaula en el hogar).
      NOTA: Proporcionar ropa de cama fresca elimina el polvo potencial o los pequeños trozos de comida que se acumulan en la ropa de cama desde el último cambio de jaula.
    2. El día antes de la prueba, pese a todos los animales alrededor de las 6 pm.
    3. Retire toda la comida de la tolva de alimentos y asegúrese de que no haya trozos de comida en la jaula o en la ropa de cama.
  2. Configuración de la habitación
    1. Coloque la cámara NSF sobre una mesa.
    2. Llene la cámara con una capa delgada de ropa de maíz (u otra ropa de cama que sea diferente de la ropa de cama utilizada en la jaula doméstica de los animales).
    3. Coloque la luz a 70 Lux con 4 bombillas colocadas en la esquina de la mesa donde se encuentra la cámara, mirando hacia el techo. Apague las luces de techo para mantener la iluminación baja de la habitación.
    4. Coloque un pellet de chow estándar utilizado en la instalación, en el lado de la cámara frente al experimentador (a ≈10 cm de la pared).
  3. Ensayo
    1. Por la mañana después de la privación de alimentos, lleve a los animales a la habitación 30 minutos antes de la prueba para que se aclimaten a la configuración de luz y al nuevo entorno.
    2. Pesar a todos los animales para medir su pérdida de peso en función del peso medido el día anterior. Los animales deben perder un 8-12% durante la noche para poder realizar la tarea correctamente.
    3. Ordene los animales por pérdida de peso y cribalos a partir del ratón que más perdió hasta el ratón que perdió menos peso.
    4. Asegúrese de que la cámara esté llena de ropa de cama y con un solo pellet.
    5. Coloque al animal en el lado opuesto de la cámara, lejos del pellet de comida.
    6. Inicie el temporizador inmediatamente.
    7. Deje que el ratón explore la cámara durante un tiempo de hasta 12 minutos.
    8. Mida la latencia para acercarse y alimentarse (el animal debe morder y comer) en el pellet de alimento.
      1. Considéralo como un acercamiento cuando el animal se acerca al pellet, lo huele y no muerde.
      2. Defina una mordedura como cuando el animal comienza a consumir el pellet.
    9. Registre la latencia para acercarse y alimentarse del pellet en segundos.
    10. Una vez que el ratón se haya alimentado de la bolita de comida, retire el ratón de la cámara.
    11. Deseche la ropa de cama, pero guarde el pellet que se utilizará para probar la unidad de apetito en la jaula casera del ratón.
    12. Reinicie la cámara para el siguiente animal y continúe con el siguiente animal.
    13. 15 minutos después de completar la prueba en la cámara, deje caer el pellet utilizado durante la prueba, dentro de la jaula doméstica del ratón, contra la pared en la parte delantera de la jaula.
    14. Mida la latencia para alimentarse del pellet cuando el pellet está en la jaula doméstica. Esta es una medida para el impulso del apetito.
      1. Es preferible quitar el material de anidación para asegurarse de que el ratón vea el pellet que se deja caer en su jaula.

12. Recolección de suero y medición de corticosterona

  1. Manipule animales durante 1 minuto utilizando la técnica asignada, 15 minutos antes de la recolección de sangre (esto se puede hacer con animales alojados en grupo o en una sola casa, teniendo en cuenta el riesgo de peleas al reagrupar ratones).
    1. Para los ratones manejados por el túnel, guíelos al túnel, levante el túnel de la jaula durante 1 minuto y reemplace al ratón en su jaula.
    2. Para los ratones con mango de cola, agarre la base de la cola del ratón y retire el ratón de su jaula. Transfiera el ratón a la funda de los experimentadores durante 1 minuto y devuelva el ratón a su jaula mediante el manejo de la cola.
    3. Para ratones con mango 3D, use manos ahuecadas para sacar el mouse de su jaula. Sostenga el ratón en manos ahuecadas durante 1 minuto y devuélvalo a su jaula.
  2. 15 min después de la manipulación, proceda a la extracción de sangre de la vena submandibular22.
  3. Desaliña firmemente el ratón de tal manera que la cabeza del ratón quepa inmovilizada de forma segura.
  4. Localice el sitio de la punción.
    1. Hay un pequeño hoyuelo sin pelo a lo largo de la mandíbula de la cara que se puede usar como punto de referencia para localizar el sitio de la punción. Dibujando una línea entre la base de la mandíbula y este hoyuelo, el sitio de punción se encuentra detrás de este hoyuelo hacia la oreja en aproximadamente 5 mm, justo detrás de la bisagra de la mandíbula.
  5. Sostenga una aguja limpia de 23 G perpendicular al sitio de la punción y use un movimiento de punción firme rápido. La punta de la aguja debe penetrar a una profundidad entre 1-2 mm, la sangre fluirá inmediatamente tan pronto como se perfore la vena.
  6. Recolectar ~ 150 μL de sangre en tubos de recolección recubiertos de EDTA y almacenarlos en hielo.
  7. Aplique una ligera presión con una gasa estéril en el sitio de punción durante 5 s o más para permitir que la sangre se coagule.
  8. Una vez que la sangre se haya coagulado, devuelva al ratón a su jaula de origen.
  9. Centrífuga de sangre a 4 °C 3.500 x g durante 10 min.
  10. Decantar el sobrenadante.
  11. Guarde el sobrenadante a -20 °C para análisis posteriores.
  12. Mida los niveles de corticosterona utilizando un kit ELISA de corticosterona siguiendo el protocolo del fabricante.
  13. Utilice un espectrofotómetro para leer los resultados de ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Se realizaron dos estudios separados con ratones C57BL/6. Los #1 del estudio incluyeron hombres de 6 meses de edad y #2 de estudio incluyeron mujeres de 2,5 meses de edad (N = 36 / estudio) de Jackson Laboratories (Cat #000664). Los ratones llegaron a las instalaciones a la edad de 2 meses. Mientras que las mujeres #2 del Estudio fueron manipuladas y evaluadas dos semanas después de su llegada, el Estudio #1 los hombres solo fueron manipulados y probados a la edad de 6 meses (retraso debido al cierre de la pandemia mundial). Durante este tiempo, un ratón del Estudio #2 murió, antes de comenzar a manejar experimentos. El estudio #1 ratones machos fueron atendidos por personal de la instalación de animales. Todos los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas (7:00 ON, 19:00 OFF), dando acceso a alimentos y agua ad libitum. Su jaula casera estaba llena de periódico reciclado como material de cama, así como material de anidación. Los ratones fueron alojados individualmente, con el fin de limitar el comportamiento agonístico potencial en los machos alojados en grupos durante la sesión de manejo o después de procedimientos como la recolección de sangre o las pruebas de comportamiento. Los ratones fueron aleatorizados en tres grupos: manejo de cola, manejo de túnel y manejo 3D,y manejados en la sala abierta de acuerdo con el diseño de su respectivo grupo(Figura 2). El grupo manejado por el túnel recibió el túnel como un enriquecimiento durante 1 semana antes de la sesión de manejo. Luego se manejaron durante diez (10) días consecutivos, antes de las pruebas de comportamiento. Una semana después de la finalización de las diferentes sesiones de manejo, comenzaron las pruebas de comportamiento. El día 16, los ratones fueron probados en el EPM, y luego en la prueba de interacción del experimentador. Dos días después, los ratones fueron probados en la NSF. Finalmente, el día 24, se extrajo sangre 15 minutos después de una sesión de manipulación de un minuto del mismo tipo que la manipulación inicial.

Para las pruebas de comportamiento, los animales manejados por el túnel fueron transferidos de su jaula al aparato utilizando el túnel tanto como fuera posible. Sin embargo, para el experimento Elevated-Plus Maze, las dimensiones del laberinto dificultaron la eliminación o colocación de animales en el laberinto utilizando el túnel. En este caso, los animales fueron transferidos de los túneles a las manos ahuecadas y transportados al laberinto. Los ratones manejados en 3D se manejaron durante los tres días, simultáneamente con los días 8-10 de manejo del túnel(Figura 2). Los ratones con mango de cola no estaban habituados a la manipulación, sino que se manejaban con la cola durante las interacciones con los experimentadores. Durante el tiempo del estudio, el experimentador realizó el cambio de jaula para garantizar el uso de la técnica de manejo adecuada utilizada para cada grupo.

En la prueba de interacción del experimentador, los animales fueron probados por su disposición a interactuar voluntariamente con el experimentador y la facilidad de manejo en un contexto experimental (Figura 3). ANOVA realizado en el número de intentos de recoger al ratón de la jaula mostró un efecto significativo del enfoque de manejo en el Estudio #1 machos (F(2,31)= 6,36, p = 0,004), y en el Estudio #2 hembras (F(2,33)= 12,21, p = 0,0001). Los análisis post hoc de Scheffe revelaron que el número de intentos necesarios para recoger a los ratones se redujo significativamente tanto en 3D (p = 0,0061 en el estudio #1 machos, y p = 0,0002 en el estudio #2 hembras) como en el manejo del túnel (p = 0,04 en el estudio #1 machos, y p = 0,003 en el estudio #2 hembras), en comparación con el grupo manejado de la cola(Figura 3A). ANOVA realizado sobre el tiempo pasado en el mismo cuadrante que la mano mostró efecto significativo de manejo en el Estudio #1 varones (F(2,31)= 5,38, p = 0,009), y en el Estudio #2 mujeres (F(2,33)= 3,5, p = 0,04; Figura 3B). Los análisis post hoc de Scheffe mostraron que los ratones machos #1 del Estudio manejados con la técnica de manejo 3D pasaron significativamente más tiempo en el mismo cuadrante que la mano del experimentador, en comparación con los ratones manejados con cola (p = 0.012). No hubo diferencias significativas entre los grupos de manejo en el Estudio #2, mujeres de 2,5 meses de edad. El grado de interacción con el experimentador se demuestra aún más por los mapas de calor combinados de los puntos centrales de los ratones(Figura 3C-E). Estos ilustran cómo los ratones machos manejados en 3D del Estudio #1 pasaron más tiempo proximal a la mano, incluidas las áreas cercanas a la mano, mientras que los ratones manejados con la cola tuvieron la menor interacción general con la mano.

Los efectos del manejo en 3D y del túnel se compararon con el manejo de la cola en dos pruebas de comportamientos similares a la ansiedad, la prueba de alimentación suprimida por novedad (NSF) y el laberinto elevado más (EPM). En la prueba NSF, ANOVA realizada sobre la latencia al acercamiento mostró un efecto de la técnica de manipulación utilizada en el Estudio #1 varones (F(2,31)= 3,5, p = 0,04). Los análisis post hoc de Scheffe en el Estudio #1 machos mostraron tendencias de ratones manejados en 3D (p = 0.08) y de ratones manejados por túnel (p = 0.08), con latencia reducida para acercarse en comparación con ratones manejados con cola(Figura 4A). No se observaron efectos en el estudio #2. ANOVA realizado sobre la latencia para acercarse en la jaula doméstica del ratón (datos no mostrados) no mostró ningún efecto de manejo (p=0,88 en el Estudio #1 machos, y p=0,16 en el Estudio #2 hembras). ANOVA realizado sobre el porcentaje de tiempo en los brazos abiertos en el EPM reveló un efecto significativo del manejo en el Estudio #2 mujeres (F(2,33)= 3,5, p = 0,04). No se observaron efectos en el Estudio #1 varones (F(2,31)= 2,1, p = 0,1; Figura 4B). Los análisis post hoc de Scheffe solo revelaron una tendencia hacia un mayor tiempo pasado en los brazos abiertos en ratones manejados por túneles del Estudio #2, en comparación con los ratones manejados con cola (p = 0.07). En cuanto al porcentaje de entradas en los brazos abiertos(Figura 4C),ANOVA no reveló ningún efecto de manejo, ni en el Estudio #1 hombres ni en el Estudio #2 mujeres (F(2,31)= 1,12, p = 0,33; y F(2,33)= 1,3, p = 0,26, respectivamente). Las puntuaciones de comportamiento se resumieron en una puntuación z, como en Guilloux et al.23,informando sobre la posible reducción de los comportamientos similares a la ansiedad en comparación con los ratones con mango de cola(Figura 4D). ANOVA en las puntuaciones z mostró un efecto significativo del manejo en el Estudio #1 hombres (F(2,31)= 5,6, p = 0,008) pero no en el Estudio #2 mujeres (F(2,33)= 1,07, p = 0,35). Los análisis post hoc de Scheffe mostraron que el manejo en 3D y el manejo en túnel disminuyeron significativamente la puntuación z (p = 0.04 y 0.01, respectivamente), en comparación con el manejo de la cola, lo que sugiere que ambos enfoques reducen los comportamientos similares a la ansiedad en el Estudio #1 los hombres.

Los niveles de corticosterona después de la manipulación también se evaluaron 15 minutos después de una breve sesión de manipulación(Figura 5). ANOVA encontró un efecto significativo del manejo en el Estudio #2 mujeres (F(2,33)= 4,44, p = 0,01), pero no en el Estudio #1 hombres (F(1,31)= 0,53, p = 0,59). En el estudio #2 hembras, los análisis post hoc revelaron una disminución significativa en los niveles de corticosterona en ratones del grupo de manejo 3D en comparación con el grupo de manejo de cola (p = 0.02).

Para determinar si las técnicas de manejo tuvieron un impacto significativo en la variabilidad de los datos obtenidos, se aplicó la prueba de Bartlett de homogeneidad de la varianza. Nuestros resultados no encontraron diferencias significativas en la variabilidad en el estudio #2 ratones hembra a través de las mediciones (% tiempo EPM B(2,33)= 4,95, p = 0,087; % Entradas EPM B(2, 33)= 3,68, p = 0,16; NSF B(2, 33)=0,20, p=0,91; CORT B(2, 33)=1,69, p=0,42). Sin embargo, en el Estudio #1 ratones machos, hubo una heterogeneidad significativa de varianza en la prueba NSF (B(2,31)= 8,08, p = 0,0175) y en los niveles medidos de CORT(B (2,32)= 11,63, p = 0,0029), pero no en ninguna de las medidas para EPM (% de tiempo EPM B(2,32)= 1,16, p = 0,56; % Entradas EPM B(2,32)= 2,79, p = 0,25). El uso de la prueba F para comparar dos varianzas mostró que en la prueba NSF la varianza se redujo significativamente para los machos #1 del Estudio tanto por el 3D (F(1,21)= 4,22, p = 0,04) como por las técnicas de manejo del túnel (F(1,22)= 4,01; p = 0,03) en comparación con el manejo de la cola. Para la concentración de CORT después de la manipulación, solo la manipulación 3D redujo significativamente la variabilidad (F(1,20)= 9,65, p = 0,0019) en comparación con la manipulación de la cola.

Figure 1
Figura 1. Imágenes representativas del Procedimiento de Manipulación 3D.  Las imágenes ilustran el procedimiento de manejo 3D. A) Mano en jaula: La mano del experimentador se coloca en la jaula y se mantiene quieta, permitiendo que el ratón se habitúe a la presencia de la mano en la jaula. B) Mano plana: al retirarse por primera vez de la jaula, el ratón se coloca sobre la palma plana de la mano. El ratón puede caminar libremente alrededor de la palma de la mano y moverse entre las manos planas adyacentes. C) Enrollar: Relajar la palma de la mano para formar una "taza" suelta alrededor del ratón. Incline suavemente la taza en la mano opuesta, el mouse debe moverse libremente hacia esta mano, si no guiarla suavemente hacia la otra mano. D) Refugio: coloque el ratón en el borde de la mano y luego junte ambas manos y forme muy lentamente una copa alrededor del ratón. El ratón no debe estar sujeto y se debe dejar una abertura para que el ratón pueda escapar. Sostenga durante ~ 5-10 s y luego ábrala a manos planas. E) Caricias de cabeza / espalda: Mientras el ratón está explorando la palma plana de la mano, acaricie suavemente al ratón en la cabeza y la espalda. Esto habitúa al ratón al acercamiento del experimentador desde arriba. F) Golpe en la nariz: Cuando el ratón parece estar habituado al manejo, intente tocar suavemente el ratón directamente sobre el hocico. Si el ratón no aleja la cabeza queda bien habituado al manejo. G) Es posible realizar un pellizco corto (2-3 s) de cuello el último día, para medir la habituación de los animales en caso de futuras intervenciones que requieran contención. Cuando se habitúan a la manipulación, los ratones permanecen inmóviles durante el pellizco del cuello, mientras que los ratones no habituados intentarán escapar girando su cola para liberarse de la contención. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Diseño Experimental.  Después de su llegada a la instalación, los ratones con mango de cola no recibieron habituación. Los ratones manejados por túneles se habituaron a los túneles en su jaula doméstica durante una semana antes del inicio de la manipulación. Los ratones manejados en túnel se manejaron con la técnica de manejo de túneles durante 10 días (Primer día de manejo = Día 1), mientras que los ratones manejados en 3D se habituaron durante tres días (Día 8-10). Luego, los ratones fueron sometidos al laberinto elevado más (EPM) (Día 16), prueba de interacción del experimentador (Día 19), alimentación suprimida por novedad (Día 21) y una breve sesión de manejo seguida de recolección de suero para la medición de CORT (Día 24). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Impacto de las tres técnicas de manejo en la facilidad de manejo y la voluntad de interactuar con el experimentador. A) Número promedio de intentos de recogida necesarios para sacar un ratón de la jaula. El estudio #1 machos (panel izquierdo, manejo de cola N = 12, manejo de túneles N = 12 y manejo 3D N = 11) y el estudio #2 ratones hembra (panel derecho, N = 12 por grupo) de grupos de túnel y manejados en 3D mostraron una reducción significativa en el número de intentos necesarios para sacarlos de la jaula en comparación con los ratones manipulados con cola. B) Cantidad promedio de tiempo pasado por un animal en el mismo cuadrante de la jaula que la mano del experimentador. El estudio #1 ratones machos manejados con la técnica 3D mostró un aumento significativo en el tiempo pasado en el mismo cuadrante que la mano del experimentador. C-E) Los mapas de calor promedio del punto central del ratón por tiempo renderizados en Ethovision XT 14, demostraron visualmente el aumento de la exploración y la interacción con el experimentador del Estudio #1 ratones machos manejados en 3D. Las barras de error indican SEM. *p<0.05, **p<0.01 en comparación con el grupo Tail Handled. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 4
Figura 4. Impacto de las tres técnicas de manejo en comportamientos similares a la ansiedad. A) Latencia para acercarse y alimentarse del pellet en la novedosa cámara de alimentación suprimida en el Estudio #1 ratones machos (Tail Handling N= 12, Tunnel Handling N=12 y 3D handling N=11) y en el Estudio #2 ratones hembra (N=12/grupo). Los datos del estudio #1 ratones machos en los grupos de manejo 3D y manejo de túneles mostraron una tendencia hacia una reducción significativa de la latencia para acercarse al pellet. B) Medio de % del tiempo pasado en los brazos abiertos del laberinto elevado plus. No hubo diferencias significativas entre los grupos en el estudio #1 los hombres, y una tendencia hacia más tiempo en brazos abiertos por el estudio #2 las mujeres en el grupo de manejo de túneles. C) Entradas en los brazos abiertos: No hubo diferencias significativas entre los grupos en el Estudio #1 los hombres, ni en el Estudio #2 las mujeres. D) Puntuación Z que resume los comportamientos similares a la ansiedad. Utilizando los datos presentados en A, B y C, se calculó una puntuación z utilizando los ratones manejados con cola como referencia. La disminución en la puntuación z sugiere una disminución en los comportamientos similares a la ansiedad medidos por las pruebas NSF y EPM. El estudio #1 ratones machos manejados usando la técnica 3D o túnel mostró un fenotipo reducido similar a la ansiedad en comparación con los ratones manejados por la cola. Las barras de error indican SEM. *p<0.05 comparación con el grupo manejado por la cola. t representa el nivel de tendencia de significación (p<0,1) en comparación con el grupo manejado de la cola. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 5
Figura 5. Niveles de corticosterona después de la manipulación.  El suero se recolectó 15 minutos después de una breve sesión de manejo y luego los niveles de CORT se midieron por ELISA tanto en el estudio #1 macho (tail handling N = 12, tunnel handling N = 12 y 3D handling N = 11) como en el estudio #2 ratones hembra (N = 12 / grupo). El estudio #2 ratones hembra manejados a través de la técnica de manejo 3D mostró niveles reducidos de corticosterona en comparación con los ratones manejados por la cola. ANOVA en el estudio #1 ratones machos no alcanzó significación para las diferencias entre los grupos (p = 0,5). Las barras de error indican SEM. *p<0.05 en comparación con el grupo Tail Handled. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este estudio y desarrollo de métodos se basan en la observación de que las técnicas de manejo en ratones todavía son pasadas por alto por la comunidad científica, y que algunos laboratorios aún son reacios a implementar técnicas de habituación o manejo para reducir el estrés y la reactividad de sus animales antes de los experimentos. Si bien representa un compromiso de tiempo, el manejo de animales proporciona efectos beneficiosos para los animales que pueden contribuir al éxito de los experimentos a realizar y evita que los experimentos tengan que realizarse varias veces debido a la variabilidad de los datos o la sobrerreactividad de los animales. El uso de la técnica de manejo 3D disminuyó los intentos de escape en ratones. También aumentó la interacción con el experimentador y disminuyó los fenotipos similares a la ansiedad en nuestros ratones machos de 6 meses de edad. Además, el manejo en 3D disminuyó la variabilidad de los datos y disminuyó los niveles de corticosterona en ratones hembra de 2,5 meses de edad después de solo 3 días iniciales de manejo. Este enfoque se basa en manipulaciones suaves para habituar al ratón a la manipulación por parte del experimentador, lo que facilita un transporte más suave y una intervención más fácil.

Algo que vale la pena destacar de la técnica de manejo 3D es que la progresión de los métodos de manejo se produce en respuesta a la reactividad del ratón, dependiendo del logro de los hitos descritos anteriormente y en la Tabla 1. Los animales deben haber reducido la reactividad a un paso de manipulación antes de avanzar a los siguientes pasos. Intentar progresar demasiado rápido a los pasos de "refugio" o "golpear la nariz" en animales que no están lo suficientemente habituados probablemente resultaría en un aumento del estrés y potencialmente reduciría la efectividad del procedimiento. Del mismo modo, la reactividad del animal en cada día de manipulación debe ser monitoreada y debe tenerse en cuenta al decidir si se requieren días de manipulación adicionales. Si los animales no responden bien a la prueba del refugio el primer día, no cumplen con los criterios para lograr el primer hito, el primer día de manipulación podría repetirse hasta la finalización del hito. Del mismo modo, si los animales no responden a la prueba de pinchazo en la nariz en el segundo día, el segundo día también se puede repetir. Otra advertencia a tener en cuenta con este enfoque es que el riesgo de que los ratones salten es mayor en el primer día de manipulación, en particular en cepas saltarinas como C57BL6. Seguir las pautas descritas anteriormente debería reducir el riesgo de saltar y proporcionar formas de limitar tales comportamientos. La duración del manejo y la progresión a través de los pasos pueden variar dependiendo de las cepas, particularmente si se trabaja con modelos transgénicos que se sabe que exhiben fenotipos ansiosos.

Varios factores pueden contribuir a reducir la efectividad de la técnica de manejo 3D presentada. Uno de estos factores es el miedo potencial o la vacilación del experimentador, en el caso de que el experimentador no esté familiarizado con el manejo del ratón o tenga miedo de los ratones. Por lo tanto, el efecto en el manejador también es algo a considerar. Sin embargo, el aumento gradual en el nivel de interacción con los ratones permite a los experimentadores novatos desarrollar confianza y mayores habilidades para realizar la técnica de manejo a medida que avanzan en los pasos de manejo. Los pasos / hitos propuestos (las pruebas de refugio y de empuje de la nariz) pueden ayudar a contrarrestar la posible variabilidad humana en los manipuladores novatos, asegurando que los animales alcancen niveles similares de habituación. Se ha informado que el fomento de interacciones positivas entre humanos y animales con animales ha resultado en una mayor calidad de vida y satisfacción por compasión en el personal de cuidado de animales24. Como tal, el gentling de la manipulación presenta beneficios tanto para el manejador como para el animal durante cualquier interacción o intervención general.

Con su impacto en la disminución del número de intentos de recoger al ratón, tanto en machos de 6 meses como en hembras de 2,5 meses, el manejo 3D proporciona una alternativa al manejo en túnel u otras técnicas, facilitando la transferencia de animales de su jaula a un aparato experimental. La técnica de manejo 3D también aumentó la interacción de ratones machos de 6 meses de edad con el experimentador. Esto no se observó en ratones hembra de 2,5 meses de edad, pero los ratones hembra siguieron siendo más fáciles de recoger, en comparación con los ratones con mango de cola. Esto sugiere que la técnica de manejo 3D puede ser más adecuada para experimentos que requieren interacciones directas entre el animal y el experimentador, como el laberinto de agua de Morris (a pesar de los posibles factores de confusión de sexo / edad discutidos más adelante). Otros han desarrollado y utilizado técnicas de manipulación manual, consistentes en recoger a los animales con las manos ahuecadas, sin manipulación adicional10. Si bien estas técnicas mostraron efectos beneficiosos, los datos en la literatura a menudo presentan protocolos de manejo con períodos de habituación superiores a 10 días9,16. Además, el manejo ahuecada sin la interacción refinada proporcionada por el manejo 3D puede no ser adecuado para las cepas saltarnas que continúan saltando y lejos de las manos. Si bien no hicimos una comparación directa en este estudio con el método de la copa, el manejo 3D aborda esto y se basa en movimientos refinados para fomentar la interacción entre el mouse y el manejador. El estudio de Ghosal et al.16 utilizó una técnica de manejo de copas combinada con masaje durante 5 días, y mostró que esta técnica limita el impacto del estrés en los puntos finales metabólicos, destacando la necesidad de movimientos refinados e interacción durante el manejo para una mejor eficacia. Basado en esta técnica de masaje en taza, el manejo 3D utiliza una interacción adicional para habituar a los ratones. Utilizando el enfoque de manejo 3D, los manejadores se aseguran de que todos los ratones alcancen un nivel similar de habituación realizando movimientos estandarizados y adaptando la duración del procedimiento a cada animal según su necesidad (en el presente estudio, todos los ratones pasaron los hitos y terminaron el protocolo de manejo 3D en 3 días). Este enfoque puede considerarse "personalizado" para cada ratón, por lo que todos los animales alcanzan el nivel deseado de habituación en cada día de manipulación. Como se mencionó anteriormente, si los animales no alcanzan los hitos descritos en el protocolo, esta técnica se puede ajustar aumentando el número de días. Esta técnica mostró efectos beneficiosos para reducir la variabilidad entre animales en estudios conductuales y mediciones fisiológicas (niveles de CORT), lo que sugiere que este enfoque podría contribuir a la reducción de la variabilidad intra-estudio y reducir el impacto del error experimental que potencialmente impulsa resultados sesgados en estudios preclínicos.

Los resultados de apoyo sugirieron que los ratones sometidos a manejo en 3D y túnel exhiben una ansiedad reducida en la prueba de alimentación suprimida por novedad, en comparación con los ratones manipulados con cola. Teniendo en cuenta los datos combinados de la NSF y el EPM, ambos enfoques mostraron efectos significativos en la reducción de la ansiedad en ratones machos de 6 meses de edad. Esto replica los hallazgos de que los animales habituados al manejo en túneles habían mejorado el rendimiento en las pruebas de ansiedad9,15 después de más de 10 días de manejo, y demuestra aún más el potencial del manejo 3D para exhibir efectos similares. Esto también mostró que los ratones machos de 6 meses manejados en 3D se acercan e interactúan voluntariamente más con su experimentador que los ratones machos de 6 meses de edad sometidos a manipulación de túneles y colas. Es importante destacar que los ratones hembra de 2,5 meses de edad sometidos a manipulación 3D tenían niveles reducidos de CORT, lo que está de acuerdo con los resultados publicados anteriormente9. Los dos estudios (Estudio #1 en hombres de 6 meses de edad y Estudio #2 en mujeres de 2,5 meses de edad) confirmaron, de dos maneras diferentes, que el manejo tiene un impacto beneficioso en los fenotipos similares a la ansiedad (ya sea en los resultados conductuales en el Estudio #1, o en los niveles de CORT en el Estudio #2).

Un posible factor que contribuye al efecto es el sexo del experimentador, en este caso el hombre. Sorge et al.25 han demostrado que la presencia de experimentadores machos puede conducir a un aumento de la CORT y comportamientos similares a la ansiedad en ratones machos pero no hembras. Esto contrasta con los resultados del presente estudio. La principal diferencia entre este estudio y el estudio de Sorge et al.25 es que el enfoque descrito aquí consiste en habituar a los ratones a la manipulación, fomentando la interacción positiva (no reforzada) con el experimentador, mientras que Sorge et al.25 utilizaron roedores ingenuos que nunca interactuaron con los seres humanos. Uno puede esperar que los ratones ingenuos puedan tener una fuerte reacción contra los experimentadores humanos si no aprenden que el experimentador no representa una amenaza. Sin embargo, el presente estudio solo se realizó con un experimentador masculino, y los estudios futuros deben investigar si tales efectos son reproducibles con una experimentadora femenina. Aunque aislar estos factores está fuera del alcance de este artículo, vale la pena destacar la importancia de identificar tales fuentes de variabilidad al implementar el manejo de la habituación, o en el diseño experimental en general.

El presente estudio también confirmó la eficacia de la técnica de manejo de túneles para reducir los comportamientos similares a la ansiedad y los niveles de CORT en ratones9,10,11. Un beneficio adicional de este enfoque es que el túnel se puede dejar en la jaula como enriquecimiento26, lo que también puede contribuir a una respuesta reducida al estrés / ansiedad, contribuyendo en conjunto a mejorar el bienestar10,11. En este caso, el papel del experimentador es manipular el túnel solamente, con cada animal, durante un minuto. Sin embargo, como lo describen Gouveia et al19,el túnel no necesariamente necesita permanecer en la jaula doméstica y, en cambio, puede presentarse a los animales solo cuando sea necesario transferir al animal, sin causar estrés adicional. Ambos enfoques, el túnel y las técnicas de manejo 3D, ofrecen beneficios que deben ser evaluados por el laboratorio y los experimentadores para determinar qué enfoque es el más adecuado para sus necesidades. En el presente estudio, el túnel se dejó en la jaula, y los efectos que observamos en los comportamientos similares a la ansiedad pueden deberse a una combinación de manejo del túnel y enriquecimiento.

Si bien ambos proporcionan efectos beneficiosos, las técnicas de manejo en 3D y túnel no están exentas de limitaciones. Una limitación compartida es que puede llevar mucho tiempo y ser potencialmente desalentador para las instalaciones de animales implementar tales procedimientos. Sin embargo, los beneficios adicionales son invaluables, mejorando el bienestar animal al reducir el estrés y mejorando la interacción con el experimentador y los proveedores de cuidado animal (como se describe en Spangenberg y Kelling27),y la confiabilidad y reproducibilidad de la investigación. La evidencia de nuestras instalaciones sugiere que esta técnica mejora las interacciones entre los animales y el personal de cría, facilitando el cambio de jaula y el monitoreo de la salud. De otros usuarios en nuestras instalaciones, se informa que la contención y la manipulación general son significativamente más fáciles con ratones manipulados, lo que consdenemos que nuestros hallazgos de que los ratones manejados con la técnica 3D tienen menos probabilidades de huir cuando son recogidos y, en nuestro ejemplo, los machos de 6 meses de edad son más propensos a interactuar con su experimentador. Los estudios de seguimiento podrían cuantificar tales efectos para demostrar aún más la utilidad de la técnica. En conjunto, este enfoque de manejo 3D, así como el enfoque de túnel, contribuye a la regla de las 3R, particularmente al refinar las interacciones rutinarias de los animales para minimizar el estrés en respuesta al manejo. Dada la reducción observada en la variabilidad de los datos, esto también tiene el potencial de reducir el número de animales necesarios para obtener resultados consistentes y refinar el enfoque utilizado para limitar la variabilidad.

Otro punto de discusión basado en los datos presentados es que este estudio se realizó con animales de una sola vivienda. Se prefirió la vivienda única ya que limita los comportamientos agonísticos potenciales (particularmente en ratones machos), que pueden contribuir a la variabilidad interinteal28,29. Para la consistencia entre los grupos, todos los animales fueron alojados en un solo lugar. También es interesante observar que las interacciones positivas entre experimentador y animales en ratas en forma de cosquillas en ratas, pudieron mitigar algunos de los efectos del aislamiento social en ratas de un solo hogar30,31. Es posible que las técnicas de manipulación que implican el contacto directo entre el animal y el experimentador, como la técnica de manipulación en 3D o la técnica de masaje en copa descrita por Ghosal et al.11, puedan tener un efecto similar. Los estudios futuros podrían explorar esta pregunta comparando los efectos de las técnicas de manejo en animales alojados en grupos y en individuales. Estudios anteriores investigaron el impacto de los enfoques de manejo de copas y túneles con ratones en un entorno alojado en grupos, y obtuvieron resultadossimilares 7,8. Esto confirma que es posible utilizar los protocolos de manejo descritos en este documento con animales mantenidos en condiciones de casa única o de casa grupal, teniendo en cuenta la posibilidad de un comportamiento agonístico al sacar a un animal de la jaula y colocarlo de nuevo (particularmente en ratones machos o en líneas de ratón agresivas). En tales casos, se recomienda usar una jaula temporal antes de reagrupar a todos los animales juntos.

Para concluir, el enfoque de manejo 3D propuesto contribuye a reducir la reactividad y el estrés en ratones. También aumenta la confiabilidad de los datos al reducir la variabilidad después de 3 días de manejo. Resultados similares son observables con el manejo del túnel, en nuestro caso después de 10 días de manejo del túnel. En comparación con la técnica de manejo de túneles, la técnica de manejo 3D proporcionó el beneficio de aumentar la interacción con un experimentador en nuestros ratones machos de 6 meses de edad, lo que puede ser crítico en algunos casos. Si la técnica de manejo en 3D o túnel se implementara en todas las instalaciones de animales, eso representaría una mejora importante para la generación de datos y contribuiría en gran medida a la reducción del uso de animales en la investigación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen al Comité de Cuidado Animal de CAMH por apoyar este trabajo, así como a los cuidadores de animales de CAMH que proporcionaron una amplia retroalimentación sobre la utilidad del procedimiento, motivando la ejecución de los experimentos descritos y la presentación del protocolo detallado para otros usuarios. Este trabajo fue financiado en parte por CAMH BreakThrough Challenge, otorgado a TP, y por fondos internos de CAMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
  2. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
  4. Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
  5. Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
  6. Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
  7. Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
  8. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  9. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  10. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
  11. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
  12. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  13. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
  14. Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
  15. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
  16. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  17. Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
  18. Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
  19. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
  20. Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
  21. Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
  22. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  23. Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
  24. LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
  25. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  26. Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
  27. Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures - a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
  28. Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
  29. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  30. Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
  31. Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).

Tags

Comportamiento número 175
Técnicas de manejo para reducir el estrés en ratones
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga,… More

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J. L., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter