Summary
我们描述了一种通过在人胚胎干细胞（hESC）中引入双等位基因RB1突变来产生人视网膜母细胞瘤（RB）的方法。RB细胞系也可以在培养皿中使用分离的RB成功培养。
Abstract
人类RB是小儿癌症，如果不进行治疗，它是致命的。由于RB起源于锥形前体，在啮齿动物模型中比较少见，同时关于人类与啮齿动物的种间差异，源自人类的疾病模型更有利于揭示人类RB的机制，寻找治疗目标。在此，该协议描述了两个基因编辑的hESC系的产生，分别具有双等位基因RB1点突变（RB1 Mut / Mut）和RB1敲除突变（RB1-/-）。在视网膜发育过程中，观察到RB的形成。RB细胞系也是通过从RB类器官中分离而建立的。总之，通过使用2D和3D组合分化方案将基因编辑的hESC系分化为视网膜类器官，我们已经成功地在培养皿中重建了人类RB并确定了其锥体前体起源。它将为观察视网膜母细胞瘤的发生、增殖和生长以及进一步开发新型治疗剂提供有用的疾病模型。
Introduction
人视网膜母细胞瘤（RB）是一种罕见的致命肿瘤，来源于视网膜视锥细胞前体1，2，3，是儿童期最常见的眼内恶性肿瘤类型4。RB1 基因的纯合失活是 RB5 的起始遗传病变。然而，具有RB1突变的小鼠无法形成视网膜肿瘤2。尽管小鼠肿瘤可以通过Rb1突变和其他基因修饰的组合产生，但它们仍然缺乏人类RB6的特征。由于视网膜类器官分化的发展，可以获得hESC衍生的RB，显示人类RB1的特征。
在过去的十年中，已经建立了许多用于视网膜类器官分化的方案，包括2D7，3D8以及2D和3D9的组合。这里用于生成人类RB的方法是粘附培养物和浮动培养物的合并9。通过将 RB1 突变的hESC分化为视网膜类器官，在第45天左右检测到RB的形成，然后在第60天左右迅速增殖。在第90天，可以分离RBs并生成RB细胞系;此外，RB在第120天包围几乎所有视网膜类器官。
hESC 衍生的 RB 是一种探索 RB 起源、肿瘤发生和治疗的创新模型。在该协议中，详细描述了基因编辑hESC的产生，RB的分化和RB的表征。
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Protocol
本研究经首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。H9 hESCs是从WiCell研究所获得的。
1. RB1 突变hESC的产生
- 用于敲除RB1（KO）的CRISPR / Cas9靶向载体。
- 设计一对sgRNA。对于 RB1的消融，靶向该基因的第一个外显子。正向引物序列为CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG，反向引物序列为AAACCCGAAAAACCCGCCCCACCGC。
注意：对于特定的 RB1 突变，还需要修复的模板。在该协议中， 使用RB1-KO细胞系作为示例。 - 按照制造商的说明，在37°C下用BbsI限制性内切酶（参见 材料表）消化1μgpX330-U6-嵌合BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro30分钟。
- 根据制造商的说明，使用纯化试剂盒纯化消化的质粒。
注意：酶促反应可以使用纯化试剂盒直接净化，无需琼脂糖凝胶（见 材料表）。 - 使用 T4 多核苷酸激酶 （PNK）（材料表）磷酸化和退火每对寡核苷酸，反应包括 1 μL 寡核苷酸1 （100 μM）、1 μL 寡核苷酸 2 （100 μM）、1 μL 10x T4 连接缓冲液、6.5 μL ddH2O 和 0.5 μL T4 PNK。
注意：步骤1.1.1中的正向和反向引物是一对寡核苷酸。使用以下参数在热循环仪中磷酸化和退火寡核苷酸：37°C30分钟;95°C5分钟;以每分钟5°C的速度下降至25°C。 - 通过在室温 （RT） 下将 1 μL 寡核苷酸试剂加入 199 μL 无核酸酶水中，将磷酸化和退火的寡核苷酸稀释 200 倍。
- 设置连接反应并通过混合以下内容在室温下孵育10分钟：步骤1.1.3中的50ng Bbs1消化质粒，步骤1.1.5中的1μL寡核苷酸双链，5μL 2x连接缓冲液，1μL连接酶，并使用无核酸酶水加至10μL。
- 转化连接混合物并对阳性菌落进行测序以进行下一步。
注意：使用 U6 正向或反向引物进行测序。- 在冰上解冻感受态细胞。
- 在 1.5 mL 微量离心管中取 50 μL 感受态细胞。
- 将步骤 1.1.6 中的 1 μL 连接混合物加入感受态细胞中。
- 通过上下移液管三次轻轻混合。
注意：不要涡旋。 - 将混合物放在冰上30分钟。
- 在42°C下热冲击混合物90秒。
- 向试管中加入 950 μL 不含抗生素的室温 Luria-Bertani （LB） 肉汤。
- 将管子置于37°C下以300rpm的振荡器中放置60分钟。
- 提前将LB板（蛋白胨，酪蛋白蛋白胨，氯化钠，琼脂和氨苄西林）加热至37°C。
- 在室温下将 50-100 μL 细胞和连接混合物散布到平板上。
- 将板在37°C孵育过夜。
- 从平板中取出12个菌落，并用氨苄西林将它们转移到LB培养基中。将培养基放在300rpm的摇床上60分钟。
- 使用 1 μL 细菌溶液（来自步骤 1.1.7.12）作为 PCR 模板并选择阳性菌落。
- 通过U6引物对阳性菌落进行测序，在下一步中使用具有设计的sgRNA序列的菌落。
- 使用中型试剂盒提取质粒（参见材料表）。
注意：使用迷你试剂盒的质粒的质量和数量不足以进行以下核转染实验。迷笛或超长套件比迷你套件更合适。
- 设计一对sgRNA。对于 RB1的消融，靶向该基因的第一个外显子。正向引物序列为CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG，反向引物序列为AAACCCGAAAAACCCGCCCCACCGC。
- HESC培养和核细胞移植。
注意：将所有试剂预热至室温。- 将 1 x 10 6 H9 细胞解冻到含有 10 μM Y-27632（ROCK 抑制剂）和 2 mL 新鲜 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基的预包被6 孔板中。
注意：使用前在37°C下用1%生长因子降低的基底膜基质涂覆6孔板至少30分钟。 - 第二天，除去上清液，用 1x Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 冲洗细胞，然后加入 2 mL 新鲜的 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基。
- 在接下来的3-5天内，每天用2mL新鲜的ncEpic-hiPSC / hESC培养基更换培养基，直到细胞生长至约80%汇合。
- 传代一次或两次以调整hESC的状态。
注意：识别hESC状态的最简单方法是形态。 - 在6孔板中培养未分化的H9细胞，直到它们达到80%汇合。
- 在核转染前2小时更换培养基，用2mL新鲜的ncEpic-hiPSC / hESC培养基与10μMY-27632混合，并使用1%生长因子降低基底膜基质预涂12孔板的一个孔。
- 吸出培养基并用 1 mL 预热的 DPBS 冲洗。
- 取出DPBS并与1mL细胞解离酶（参见 材料表）在37°C孵育3.5分钟。
- 向细胞中加入 1 mL 新鲜的 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基并移液两次，使 H9 细胞制成单细胞悬液。
- 取出 100 μL 混合物进行细胞计数，并将其余的转移到 15 mL 离心管中，其中装有另外 2 mL ncEpic-hiPSC/hESC 培养基。
- 以200 x g 离心5分钟。除去上清液，将大约 2 x 106 个细胞重悬到 100 μL 反应体积中。根据制造商的方案，优化细胞、质粒、核子和反应条件的体积。有关本协议中使用的核连接系统，请参阅 材料表 。
注意：通常，在核转过程中不允许有气泡。 - 转染后，将细胞转移到预包被的12孔板中，补充1.5mL ncEpic-hiPSC / hESC培养基和10μMY-27632，然后在37°C，5%CO2 培养箱中培养细胞。
- 每天更换培养基。48小时后，加入2μg/ mL嘌呤霉素用于细胞选择约一周。
注意：许多细胞在前 3 天内死亡。剩余的细胞可能会在嘌呤霉素选择后的下周内增殖并生成集落。在选择周内，确保培养基始终含有 2 μg/mL 嘌呤霉素。 - 在显微镜下手动挑选菌落。
注意：菌落形态与hES菌落相同。在培养基中用 10 μL 白色/正常移液器吸头将菌落切成碎片（每个菌落 2-6 个），并将一个菌落转移到 12 孔板的一个预包被孔中。 - 首先，鉴定RB1突变和脱靶情况（表1），然后多能性表征RB1敲除H9细胞系。
注意：使用PCR和sanger测序检测 RB1 突变和脱靶情况。通过 RT-PCR 和免疫荧光鉴定多能性标志物。
- 将 1 x 10 6 H9 细胞解冻到含有 10 μM Y-27632（ROCK 抑制剂）和 2 mL 新鲜 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基的预包被6 孔板中。
2.人视网膜母细胞瘤的产生
- 维持RB1-KO hESC。
- 在生长因子降低的基底膜基质中培养基因编辑的H9细胞，用2mL ncEpic-hiPSC / hESC培养基包被6孔板，并每天更换培养基。
- 使用EDTA缓冲液在37°C下传代3.5分钟或在室温下5分钟。
注意：EDTA缓冲液是1x DPBS，5 mM EDTA和0.9 mg / mL NaCl的混合物。
- 视网膜细胞分化。
注意：分化前准备培养基I。制备培养基 I，混合 24.5 mL Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）/营养混合物 F-12（F12）-谷氨酰胺 （1x）、24.5 mL 神经元基础培养基、250 μL 100x 补充剂 A、500 μL 50x 补充剂 B、0.1 mM ß-巯基乙醇和 250 μL 100x L-谷氨酰胺。使用前将所有混合物预热至室温。- 将 RB1-KO hESC在6孔板的一个孔中生长至80%汇合。
- 取出培养基并用 1 mL 的 1x DPBS 冲洗细胞。
- 使用1mL分散酶缓冲液（参见 材料表）在37°C下升高细胞集落5分钟。
注意：在显微镜下检查细胞集落。通常，菌落边缘需要 5 分钟才能展开。 - 吸出分散酶缓冲液，并用 1 mL 的 1x DPBS 轻轻冲洗细胞一次。
- 将 1 mL 培养基 I 加入孔中。
- 将菌落切成块（每个菌落 6-9 片），培养基中装有 10 μL 白色/普通移液器吸头。
注意：通常，大约60%-70%的细胞从孔中分离。使用细胞刮刀刮除培养基中剩余的细胞。 - 通过在 15 mL 管中以 200 x g 离心 5 分钟来收获所有细胞。
- 留下约 50 μL 上清液以将细胞分散在培养基中，然后通过轻轻搅拌将细胞与 250 μL 生长因子还原基底膜基质混合。
注意：使用前将生长因子降低的基底膜基质保持在4°C或冰上。如果将其等分并储存在-20°C，则在使用前至少1小时将其置于4°C过夜或至少1小时。 - 将带有悬浮细胞的15mL管保持在37°C培养箱中20分钟。
注意：确保细胞和生长因子还原的基底膜基质形成固化凝胶。 - 将 1 mL 培养基 I 加入 15 mL 管中，然后用 1 mL 移液管轻轻移取固化凝胶 2 至 3 次以分散团块。
- 加入 9 mL 培养基 I 并将细胞悬液转移到 10 cm 细胞培养皿中。
- 将培养皿移至含有5%CO2 的37°C培养箱中，并将日期设置为第0天。
- 在第1天使用显微镜检查细胞。
注意：在培养皿中可以观察到数千个空心囊肿。平均而言，在一块凝胶中观察到3至4个囊肿。 - 在第 5 天更换培养基。将上清液收集到15mL管中，等待囊肿沉降到底部，然后取出培养基并用新鲜的培养基I代替。
注意：如果培养基在第 4 天变黄，请在第 4 天更换培养基，否则在第 5 天更换培养基。将 10 mL 新鲜培养基 I 加入原培养皿中。数百个囊肿已经附着在培养表面;把它们留在那里。 - 将管中的囊肿分散到两个10厘米的培养皿中。
注意：确保培养皿中至少有 300 个囊肿。如果囊肿不汇合，不要将囊肿分成其他菜肴;将它们放回原来的 10 厘米培养皿中。 - 在第7天，大多数囊肿（95%以上）附着在培养皿上，扩散并形成粘附菌落。
注意：早在第3天，就可以观察到粘附的菌落。 - 在第10天，用新鲜的培养基I更换培养基，确保所有囊肿都附着在培养皿上。
- 在下一步之前，通过混合以下内容制备培养基II：36 mL DMEM，12 mL F12，2%补充剂B （v / v），0.1 mM MEM非必需氨基酸溶液（NEAA）。
- 确保在第13-17天之前将细胞分散开来。在第15天执行下一步，当细胞分散但不与邻近的菌落相互作用时。
- 用1mL DPBS冲洗细胞一次，并在37°C下加入1mL分散酶溶液5分钟。
注意：在5分钟内，细胞边缘升高。 - 取出分散酶缓冲液，并用 1 mL 的 1x DPBS 轻轻冲洗培养物。
- 向每个 10 cm 培养皿中加入 10 mL 培养基 II，并在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。
- 贴壁培养物在24小时后自发脱落并组装成视网膜类器官。
注意：许多不形成类器官的细胞将在接下来的 2 天内死亡。 - 分离三天后，从细胞培养皿中收集细胞，并使类器官沉淀在 15 mL 管中。
- 从管中取出上清液，并将类器官转移到装有10mL培养基II的新非粘附培养皿（培养皿）中，持续四天。
- 通过混合 DMEM：3：1 比例 （v/v）、2% 补充剂 B （v/v）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液 （NEAA）、8% 胎牛血清 （FBS） （v/v）、100 μM 牛磺酸和 2 mM 谷氨酰胺混合制备培养基 III。
- 分离一周后，将培养基更改为中III。
- 从这一天起，在培养基III中培养类器官，并每周更新培养基两次。
- 建立RB细胞系。
注意：所有试剂均在室温下预热。- 在第90天，RBs（80%-90%）包含视网膜类器官。因此，选择90天的RB类器官来生成RB细胞系。
- 通过将罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）-1640培养基与10%FBS混合来制备1640培养基。
- 在RPMI-1640培养基的显微镜下用显微手术刀将RB切成碎片（每个RB20-25块）。
- 除去RPMI-1640培养基，并在37°C下用0.25%胰蛋白酶/ EDTA处理碎片10分钟。
- 加入RPMI-1640培养基结束反应，并以200× g 离心5分钟。
- 除去上清液并将细胞重悬于非贴壁培养皿中的1640培养基中。
- RB细胞系是一种浮动培养物。每周更换培养基两次，并在2周内传代RB细胞。
注意：原代RB细胞的增殖速度非常慢。
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Representative Results
RB生成的过程在 图1中阐明，它结合了贴壁和浮动培养物。可以从 RB1-KO hESC中收获人RB，并通过分离RB类器官获得RB细胞系。
在这里，协议提供了不同阶段分化的细节（图2）。在前3天内形成空心球，附着在培养表面上然后膨胀（图2A-E）。从第15天开始，细胞升高并在悬浮中培养（图2F）。分离后的第二天，形成视网膜类器官，并且可以看到明亮的边缘（图2G，黑色箭头）。此外，类器官外的那些细胞可能会在接下来的一周内死亡（图2G，橙色箭头）。在第27天，视囊泡结构很明显，大约90%的类器官显示出这种结构（图2H）;没有这种结构的类器官可以被丢弃。RB的第一次检测发生在第45天，然后在第50天变得可触及（图2I）。当它生长到第90天时，视囊泡结构主要被RB包裹（图2J）。同时，可以将RB分离为RB细胞系以进行进一步培养（图2K）。超过80%的视网膜类器官将在第105天被RB完全包裹（图2L）。与H9来源的视网膜类器官相比，它们高度显示Ki67（增殖标志物）和SYK（癌基因标志物）的表达，这表明RB类器官中的肿瘤发生（图2M，N）。此外，RB类器官中ARR3（锥体前体制造商）和CRX（光感受器前体标记物）的高表达表明它们起源于视锥细胞前体细胞（图2O，P）。
RB生成过程主要经历RB形成前形态变化的三个阶段;在这里，该研究在这些阶段提供了较差和更好的结果（图3）。分化和未分化的hESC（图3A，B）很容易从形态上区分，并且选择未分化的hESC进行RB形成。在第5天，应该生成一个空心球（图3D）而不是固体球体（图3C）。RB来源于视网膜类器官，其显示视囊泡结构（图3F）。在下级类器官中没有会产生RB（图3E）。
图 1：RB 类器官分化的示意图。 第0天-第15天，将细胞在培养基I中进行2D培养，第15天后，将细胞悬浮培养。RB在第45天左右形成。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：RB 生成和表征。 （A-C）早期的程序，hESC升高以形成囊肿。（B）中的黑色箭头表示分散处理后hESC的卷边。（D，E）囊肿附着在板上（D），然后扩张（E）。（F）贴壁细胞升高以形成视网膜类器官。黑色箭头表示分散处理后的卷边。（G，H）早期没有RB的视网膜类器官。（一、日）在第50天（I）和第90天（J）具有RB的视网膜类器官，绿色圆圈证明RB部分。（K）从90天视网膜类器官中分离的RB细胞系。（L）第105天的RB类器官。（周一至平）癌基因标志物（M，N）和感光器标志物（O，P）的免疫荧光图像。在 A-L 中，比例尺 = 200 μm;在 M-P 中，比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：阴性和阳性结果的比较。在第0天（A，B），第5天（C，D）和第30天（E，F）进行分化的下图像和上图像。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
人视网膜母细胞瘤（RB）是由 RB1 失活和Rb蛋白功能障碍引起的。在该协议中， RB1-KO hESC是在培养皿中产生RB的关键步骤。虽然即使使用 RB1-/- hESC，但由于视网膜类器官分化的方法，也有可能没有RB形成10。在该协议中，从贴壁培养到漂浮培养的转移在分化过程中至关重要。囊肿的密度、多能干细胞的类型和增殖速率都是影响脱离时间的变量。当细胞扩增但不与相邻菌落相互作用时，希望分离细胞9。如果菌落相邻，则会导致连续的视网膜类器官，然后降低分化效率。
通过严格遵循这些步骤，收获RB将没有麻烦。然而，该方法只能模拟RB1的双等位基因失活的RB。对于携带杂合RB1突变的遗传性RB患者，它无法模拟杂合RB1突变11的肿瘤发生过程。尽管如此，它仍然是一个最佳的RB模型，因为它目前最接近患者1的实际RB肿瘤发生。它与原代RB3，12具有相同的起源，并克服了小鼠模型的物种差异或永生化癌细胞系3，12，13的简化二维环境。
使用所述方法在源自人类ESC的培养皿中建立人RB，并且与人类原发性RB表现出极大的相似性。因此，为阐明人RB的分子病理学和药物筛选提供了一个理想的平台。
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Disclosures
作者不知道任何可能影响本研究客观性的隶属关系、成员资格、资金或金融控股。
Acknowledgments
我们感谢502团队的所有帮助。这项工作得到了北京市自然科学基金（Z200014）和国家重点研发计划（2017YFA0105300）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
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