Summary
Hier wordt de toepassing van CRISPR-interferentie (CRISPRi) voor specifieke genuitschakeling bij Leptospira-soorten beschreven. Leptospiracellen worden getransformeerd door vervoeging met plasmiden die dCas9 (katalytisch "dode" Cas9) en een single-guide RNA (sgRNA) uitdrukken, verantwoordelijk voor base pairing naar het gewenste genomische doel. Methoden om genuitschakeling te valideren worden gepresenteerd.
Abstract
Leptospirose is een wereldwijde verwaarloosde zoönose, verantwoordelijk voor ten minste 1 miljoen gevallen per jaar en bijna 60 duizend sterfgevallen. De ziekte wordt veroorzaakt door pathogene en virulente bacteriën van het geslacht Leptospira, hetzij door direct contact met de bacterie, hetzij indirect door blootstelling aan besmet water of bodem. Huisdieren en wilde dieren fungeren als reservoirhosts van infectie en werpen leptospiren van gekoloniseerde niertubuli van de nier, via urine, in het milieu. De generatie van mutante stammen van Leptospira is van cruciaal belang om pathogene mechanismen van infectie te evalueren en te begrijpen. CRISPR-interferentie (CRISPRi) is een eenvoudig, betaalbaar en specifiek hulpmiddel gebleken voor genuitschakeling bij pathogene Leptospira. Daarom zullen de methodologische details van het verkrijgen van de plasmideconstructies die zowel dCas9 als guide RNA bevatten, de levering van plasmiden aan Leptospira door vervoeging met de E. coli stam β2163, en transconjugant herstel en evaluatie, worden beschreven. Bovendien maken de onlangs beschreven Hornsby-Alt-Nally (HAN) media de relatief snelle isolatie en selectie van mutante kolonies op agarplaten mogelijk.
Introduction
Leptospirose is een verwaarloosde wereldwijde zoönose veroorzaakt door pathogene en virulente soorten van het geslacht Leptospira. Bij mensen is de ziekte verantwoordelijk voor meer dan een miljoen gevallen en 60.000 sterfgevallen per jaar wereldwijd1,2. Tot nu toe is er geen langdurig en effectief vaccin voor de ziekte. De identificatie van virulentiefactoren en pathogene mechanismen is cruciaal voor de ontwikkeling van betere therapeutische en profylactische strategieën. Daarom is het vermogen om genetische mutaties te genereren en het resulterende fenotype te beoordelen van cruciaal belang voor functionele genomische analyse3.
De constructie van mutanten in pathogene Leptospira werd tot nu toe beschouwd als inherent inefficiënt, arbeidsintensief, kostbaar en moeilijk te implementeren. Dit scenario veranderde drastisch met de toepassing van de recente CRISPR-interferentie (CRISPRi) op saprofytische4 en pathogene5 leptospiren.
Genuitschakeling wordt bereikt door de expressie van twee componenten: een variant van het CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated) enzym Cas9 van Streptococcus pyogenes, katalytisch dood Cas9 (dCas9) genoemd en een single-guide RNA (sgRNA), dat kan worden bewerkt volgens het gewenste doel6,7. dCas9-eiwit, wanneer gebonden aan het sgRNA, wordt door Watson- en Crick-basiskoppeling naar specifieke DNA-doelen geleid, waardoor een sterische verstopping van de verlenging van RNA-polymerase ontstaat, wat resulteert in genuitschakeling als gevolg van de belemmerde gentranscriptie7 (Figuur 1).
Dit manuscript beoogt de constructie van de plasmide te beschrijven voor het uitdrukken van zowel dCas9 als sgRNA, vervoeging tussen donor E. coli β2163 en ontvanger Leptospira cellen, transconjugant herstel, en ten slotte validatie van geselecteerde mutante kolonies.
Protocol
1. Protospacer definitie en plasmide constructie
OPMERKING: In deze sectie wordt de eerste stap beschreven van het selecteren van geschikte protospacers voor het construeren van de sgRNA en verdere ligatie in pMaOri.dCas9 (Figuur 1). Deze protospacer-sequentie bestaat uit een 20 nucleotidensequentie tegen het gewenste doel.
- Verkrijg de nucleotidesequentie van het gen van belang voor demping bij GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Dien het in bij de CHOPCHOP webserver (http://chopchop.cbu.uib.no/), met parameters gedefinieerd voor Streptococcus pyogenes Cas9 en protospacer aangrenzend motief NGG na het selecteren van de "Fasta Target". Definieer de parameters "CRISPR/Cas9" en PAM (protospacer adjacent motif) NGG.
- Selecteer op basis van de verkregen resultaten protospacers met de best mogelijke score (groene pijl), die zich zo dicht mogelijk bij het 5'end van het coderingsgebied bevinden en, belangrijker nog, in de sjabloon (minus) streng zitten, omdat het sgRNA moet koppelen aan de codeerstreng van het gen voor volledige genuitschakeling.
OPMERKING: Het NGG-motief is niet opgenomen in de uiteindelijke sgRNA-reeks. - Gebruik de lipL32 promotor om de enkele guide RNA uit te drukken die een variabele 20 nucleotide sequentie aan het 5' uiteinde en een geconserveerde dCas9 steigersequentie bevat. Voeg de 20-nt-sequentie, protospacer genoemd, samen met de lipL32-promotor (aan het uiteinde van 5' ) en de sgRNA-steiger (3'end) (figuur 1B).
OPMERKING: Gebruik voor een goed gedefinieerde lipL32-promotor de promotorregio die -334 omvat tot de TSS (Transcription Start Site, gebaseerd op Zhukova et al.9). Controleer het aanvullende bestand voor de uiteindelijke sgRNA-cassette. - Genereer de sgRNA cassette via sequentiële PCR5 of laat deze synthetiseren door een commerciële provider.
- Na het verkrijgen van de cassette, ligate het in pMaOri.dCas9 plasmide op de XmaI beperking site aan beide uiteinden (cccggg)4.
- Verteer zowel de sgRNA-cassette als pMaOri.dCas9 plasmide met XmaI-restrictie-enzym en ga verder met ligatie (figuur 1B).
- Voer de kloonstappen uit in de dT auxotrofische E. coli stam π110, vanwege de pMaOri11 (en bij uitbreiding pMaOri.dCas9) oorsprong van replicatie, R6K-gamma.
OPMERKING: Voor een gedetailleerd protocol voor ligatie en kloonselectie, zie eerdere publicaties van Fernandes en Nascimento12. sgRNA-geleide dCas9 bindt zich aan de codeerstreng van het geselecteerde interesse gen en belemmert daarom de verlenging van RNA-polymerase(figuur 1C),wat resulteert in genuitschakeling.
2. Leptospira transformatie door vervoeging
OPMERKING: Een grafisch schema van deze stap is weergegeven in figuur 2. Om HAN media en HAN platen te maken, verwijzen naar Hornsby et al.13 en Fernandes et al.5.
- Kweek pathogene Leptospiracellen bij 29 of 37 °C in HAN-media13 onder agitatie door een verzadigde cultuur in verse HAN te verdunnen om 1:100; typisch, L. interrogans serovar Copenhageni stam Fiocruz L1-130 duurt 4-6 dagen om de juiste celdichtheid te bereiken.
- Zorg ervoor dat culturen een O.D. bereiken van 0,2-0,4 bij 420 nm (2 tot 5 x 108 cellen/ml) voordat ze worden gebruikt voor vervoeging.
OPMERKING: Aangezien HAN-media van kleur veranderen naarmate de celdichtheden toenemen (als gevolg van fenolrood in DMEM-media), centrifugeer (4.000 x g,15 min, kamertemperatuur) 1 ml van de cultuurmedia om leptospiren te verwijderen en supernatant toe te passen als blanco voor het meten van de O.D.
- Zorg ervoor dat culturen een O.D. bereiken van 0,2-0,4 bij 420 nm (2 tot 5 x 108 cellen/ml) voordat ze worden gebruikt voor vervoeging.
- Transformeer de conjugatieve E. coli stam β2163, auxotroof voor Diaminopimelic acid (DAP), met de plasmide pMaOri.dCas9 die de sgRNA cassette bevat. Voor E. colitransformatie, gebruik hitteschokprotocollen of elektroporatie. Voeg transformatie toe met de plasmide pMaOri.dCas9 zonder sgRNA-cassette als besturingselement.
- Meng voor warmteschoktransformatie het plasmide-DNA (100 ng) met chemisch competente E. coli-cellen en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Voer een hitteschok uit bij 42 °C gedurende 90 s en plaats deze gedurende 5 minuten opnieuw op ijs. Herstel de cellen door 1 ml LB-media toe te voegen, incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en ga verder met de beplating.
- Gebruik voor elektroporatie elektrocompetente cellen gemengd met 100 ng plasmide-DNA. Gebruik de volgende parameters voor puls: 1,8 kV, 100 Ω en 25 μF. Herstel de cellen zoals hierboven uitgelegd.
- Plaat de getransformeerde donor E. coli cellen in LB agar medium aangevuld met Diaminopimelic acid (DAP) (0,3 mM) en spectinomycine (40 μg/ml) te selecteren voor plasmiden.
- Selecteer voor vervoeging één kolonie uit elke plaat een dag voor de dag van vervoeging (die wordt bepaald door het monitoren van de O.D. van culturen van leptospiren).
- Selecteer één kolonie E. coli β2163 uit de lege pMaOri.dCas9 en één uit pMaOri.dCas9sgRNA platen. Laat ze 's nachts groeien in 10 ml LB plus DAP en spectinomycine bij 37 °C.
- Verdun de volgende dag de verzadigde culturen 1:100 in 10 ml verse LB plus DAP (neem het antibioticum hier niet op) tot OD420nm van 0,2-0,4. Normaal gesproken duurt het 2-3 uur voordat E. coli deze dichtheden bereikt.
- Monteer in een BSL2 bioveiligheidskap een filterapparaat door een poriegrootte van 25 mm, poriegrootte van 0,1 μm, membraanfilter met gemengde celluloseesters op de bovenkant van de glazen basis te plaatsen. Plaats een glazen trechter van 15 ml aan de bovenkant en houd beide stukken vast met veerklemmen. Sluit het glas aan op een vacuümpomp en voeg de culturen toe aan de trechter voor filtratie.
- Voeg 5 ml Leptospira-cultuur toe aan de trechter. Voeg een volume E. coli toe om de 1:1-verhouding te vormen op basis van de OD420nm-waarden van beide culturen. Schakel de vacuümpomp in en concentreer cellen door filtratie. Haal het na celconcentratie in het membraanfilter voorzichtig op. Zorg ervoor dat het medium door het membraan wordt gefilterd.
OPMERKING: Filtratie duurt 5 tot 10 minuten. - Plaats het filter op een in de handel verkrijgde EMJH-plaat (zie materiaaltabel)aangevuld met DAP (0,3 mM). Zorg ervoor dat de kant van de bacteriën omhoog is. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 29 °C.
OPMERKING: Als HAN of aangevulde in-house EMJH14 platen worden gebruikt, kan E. coli zich verspreiden en de beoogde 1:1-verhouding overwinnen, wat op zijn beurt de vervoegingsefficiëntie kan verminderen5. - Na 24 uur, herstel de filters van de platen en plaats elk afzonderlijk filter in een 50 ml conische buis.
- Gebruik 1 ml vloeibaar HAN-medium om de cellen van het filteroppervlak te verwijderen door uitgebreide pipetten en vortexen.
- Visualiseer de teruggewonnen gemengde bacteriële oplossingen door donkere veldmicroscopie om te controleren op cel levensvatbaarheid en beweeglijkheid, en Leptospira:E. coli proporties.
OPMERKING: In dit stadium zijn equivalente aantallen E. coli en Leptospira te zien. - Verspreid 100-200 μL van deze cultuur over HAN-platen met 0,4% inactief konijnenserum en 40 μg/ml spectinomycine. Incubeer platen bij 37 °C in een CO2-atmosfeer van 3%.
OPMERKING: Normaal gesproken vormen L. interrogans serovar Copenhageni stam Fiocruz L1-130 cellen kolonies in 5-7 dagen op controleplaten en in 8-10 dagen op spectinomycineplaten. In dit stadium zal E. coli niet groeien omdat ze auxotroof zijn voor DAP. - Verdun culturen bij 104 leptospiren/ml en voeg 100 μL toe aan platen zonder antibioticum, voor het monitoren van de leptospirale groei.
3. Kolonieselectie en transconjugante groei en validatie
OPMERKING: Kolonies moeten op dag 10 zichtbaar zijn. Ze zijn echter niet al te gemakkelijk te visualiseren. Normaal gesproken zijn HAN-platen op dit moment een beetje ondoorzichtig vanwege de gedroogde cellen die werden verspreid en Leptospira-kolonies kunnen verschijnen als een transparante halo tegen de witachtige achtergrond. Het wordt aanbevolen om de platen onder verschillende hoeken te bekijken om verschillende lichtinval te bereiken, waardoor de kolonies duidelijker worden. Bij langere incubatietijden kunnen kolonies een dichter uiterlijk krijgen en in dit geval presenteren ze zich als melkachtige halo's tegen een donkere achtergrond.
- Voeg 100 μL vloeibare HAN-media toe aan elke 1,5 ml microbuis om mutanten te herstellen. Neem ten minste 3 kolonies van elke plaat.
- Met behulp van een micropipettip "graaf" de agar om de kolonies uit de platen te halen, omdat leptospirale kolonies ondergronds kunnen zijn.
OPMERKING: Agar zal naar verwachting in dit stadium worden meegenomen. Kolonies moeten worden genomen uit controleplaten die lege pMaOri.dCas9 plasmide bevatten, en platen met leptospiren die plasmiden bevatten die zowel dCas9 als single guide RNA uitdrukken, ontworpen voor het doelgen. - Verdeel de verzamelde kolonie in 100 μL HAN-media in een microbuis van 1,5 ml en homogeniseer krachtig. Zorg in dit stadium voor een maximale onderbreking van de agar-integriteit om cellen vrij te geven. Draai de suspensie 10 s.
- Met behulp van een micropipettip "graaf" de agar om de kolonies uit de platen te halen, omdat leptospirale kolonies ondergronds kunnen zijn.
- Visualiseer de teruggewonnen cellen door middel van een microscopie in het donkere veld bij een vergroting van 200-400x door een druppel van 5 μL op een glazen dia toe te voegen en de monsters onmiddellijk te bedekken met een afdeklip.
- Bevestig de aanwezigheid van levende en levensvatbare leptospiren die uit de kolonies zijn teruggevonden.
- Na visualisatie en bevestiging van levensvatbare leptospiren, overdracht van 100 μL cellen naar vloeibare HAN-media die 40 μg/ml spectinomycine bevatten.
- Evalueer na groei in vloeibare HAN-media de culturen op de aanwezigheid van de plasmide met primer pMaOri2 F (ACGCAATGTATCGATACCGAC) en R (ATAGGTGAAGTAGGCCCACCC), die het gebied herkennen dat de sgRNA-cassette flankeert.
- Verzamel 200 μL cultuur, centrifugeer (4.000 x g, 15 min), gooi het supernatant weg en resuspend de resulterende pellet in 20 μL water.
- Gebruik deze suspensie als sjabloon voor extra PCR, zonder dna-extractie12.
OPMERKING: Cellen met pMaOri.dCas9 geven een amplicon van 281 bp weer, vergeleken met cellen die de plasmiden bevatten met de sgRNA-cassette die een amplicon van 723 bp zal renderen.
- Voor bevestiging van genuitschakeling voert u een immunoblot uit met behulp van celextracten van transconjuganten die alleen pMaOri.dCas9 (negatieve controle) en pMaOri.dCas9sgRNA bevatten.
- Breng het equivalent van 5 x 107 cellen per baan van de natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamidegel aan.
- Elektrotransfereiwitten naar een membraan voor incubatie met geschikte antilichamen. Gebruik naast het antilichaam tegen het doelgen voor demping een ander gen voor de belastingscontrole.
- Bewaar de mutante culturen in HAN-media plus spectinomycine voor het behoud van de plasmide. Als er geen antibiotica op de media worden aangebracht, kan volledige genuitschakeling gedurende ten minste drie passages worden waargenomen5.
Representative Results
Hoewel het CG-gehalte in Leptospira spp. genomen meestal rond de 35% ligt; vrijwel elk gen bevat waarschijnlijk de PAM 5'NGG 3'; dit motief moet in de sjabloonstreng worden overwogen. Na het invoeren van de codeervolgorde van een gen (van begin tot eind codons), op basis van de CHOPCHOP-resultaten, moeten protospacers worden geselecteerd op de min (-, sjabloon) streng. Het is belangrijk om het NGG-motief niet op te nemen in de 20-nt sgRNA protospacer.
Als de vervoeging wordt uitgevoerd met een 1:1 donor:recipient celverhouding, gedurende 24 uur op het oppervlak van EMJH-agarplaten plus DAP, en 200 μL van de herstelde bacteriële suspensie worden verspreid over HAN plus spectinomycine agar-platen, moeten transconjuganten kolonies zichtbaar zijn op ongeveer 8-10 dagen. Verspreiding van dit volume resulteert normaal gesproken in 20-40 kolonies per plaat (figuur 3A). Om te controleren op cel levensvatbaarheid na vervoeging, kunnen cellen worden verspreid op HAN-platen zonder antibioticaselectie. In dit geval kunnen kolonies al na 7 dagen worden waargenomen. HAN platen worden lichtgeel in een CO2 atmosfeer van 3%.
Na koloniepluk en groei in vloeibare media plus spectinomycine kan PCR met hele cellen en pMaOri2 primers worden gebruikt voor een eerste kwaliteitscontrole van de transconjuganten (Figuur 3B). Leptospirale cellen die de controle pMaOri.dCas9 plasmide bevatten, moeten resulteren in een amplicon van 281 bp, terwijl die cellen die het plasmide bevatten voor het uitschakeling, dat wil zeggen, die zowel dCas9 als sgRNA bevatten, moeten resulteren in een amplicon van 723 bp. pMaOri2 F- en R-primers zijn ontworpen om de XmaI-beperkingsplaats te flankeren, de site die wordt gebruikt tijdens sgRNA-cassetteligatie.
Met de bevestiging van plasmide aanwezigheid, cellen kunnen worden geoogst uit de media, twee keer gewassen met PBS, en vervolgens worden gebruikt om een hele cel extract voor immunoblotting te bereiden. Indien het geluiddempen heeft plaatsgevonden, mogen de doeleiwitten, in dit geval LipL32 of zowel LigA als LigB, alleen worden waargenomen in de wilde cellen en in cellen die pMaOri.dCas9 bevatten; zelfs bij hogere blootstellingstijden mogen geen overeenkomstige eiwitten zichtbaar zijn in de cellen die pMaOri.dCas9sgRNA bevatten (figuur 3C).
Als experimenten om leptospirale virulentie na genuitschakeling te beoordelen worden gepland, moeten culturen die worden gebruikt voor vervoeging virulente Leptospiramet een lage passage zijn . Nadat genuitschakeling is bevestigd, kunnen verschillende aliquots worden ingevroren als back-up. Als het gedempte gen een meetbaar fenotype heeft, bijvoorbeeld op basis van eerder werk met recombinante eiwitten, kunnen culturen worden gebruikt voor validatie en, in dit geval, cellen die alleen pMaOri.dCas9 bevatten, kunnen worden opgenomen als een negatieve controle.
Figuur 1: Ontwikkeling van dCas9 en sgRNA die plasmide uitdrukken. (A) Een 20-nt lange protospacer, gevolgd door de S. pyogenes dCas9 PAM 5'-NGG-3', wordt geselecteerd binnen de sjabloonstreng van het doelgen, zodat het daaropvolgende sgRNA Watson- en Crick-basiskoppeling met de overeenkomstige coderingsstreng kan uitvoeren, wat resulteert in volledige genuitschakeling. (B) De sgRNA cassette bestaat uit de lipL32 promotor, 20-nt protospacer en dCas9 steiger. De pMaOri.dCas9 plasmide wordt gebruikt als ruggengraat voor sgRNA cassette ligatie op de XmaI restrictie site. Het resulterende plasmide, pMaOri.dCas9sgRNA genoemd, wordt geleverd aan leptospiren en de expressie van zowel dCas9 als sgRNA is verantwoordelijk voor het uitschakeling van het gen. (C) sgRNA-gerichte dCas9 fungeert als een fysieke barrière voor RNA-polymerase-rek, waardoor de transcriptie wordt belemmerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Schematische weergave van het vervoegingsprotocol. De gewenste Leptospira-soort wordt gekweekt in HAN-media, onder agitatie, tot O.D. van 0,2-0,4 (mid-log fase) bij 420 nm. Een dag voor de vervoeging wordt een kolonie recombinante donor E. coli β2163 met de plasmide van belang geplukt uit LB+DAP+Spc agarplaten, omdat cellen 's nachts worden gekweekt in vloeibare LB met dezelfde suppletie. De volgende dag, verzadigde E. coliculturen worden verdund in LB plus DAP en gekweekt tot O.D. van 0,2-0,4 bij 420 nm. Zowel donor E. coli als ontvanger Leptospira worden met een celverhouding van 1:1 op het oppervlak van een filter van 0,1 μm gemengd door een filtratieapparaat onder negatieve druk. Vervolgens worden filters bovenop de EMJH-agarplaten geplaatst, aangevuld met DAP, en de incubatie verloopt gedurende 24 uur bij 29 °C. Het gebruik van EMJH beperkt de proliferatie van E. coli en het beoogde 1:1-percentage blijft gehandhaafd. Bacteriën worden teruggewonnen uit filters door pipetten met 1 ml HAN-media en suspensussingen worden gevisualiseerd onder darkfield microscopie. Ten slotte wordt 100-200 μL van elke suspensie gezaaid op HAN-agarplaten die 0,4% konijnenserum bevatten en geïncubeerd bij 37 °C in 3% CO2. In dit stadium wordt DAP weggelaten en als gevolg daarvan zal auxotrofische E. coli niet groeien. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten voor de evaluatie vanmutanten. (A) Kolonies van platen die Leptospira bevatten, getransformeerd met lege pMaOri.dCas9 (negatieve controle voor verdere experimenten) en plasmiden pMaOri.dCas9sgRNA (met gericht gen gedempt) worden geplukt, krachtig gehomogeniseerd in vloeibare HAN en gekweekt in vloeibare HAN die spectinomycine bevat. Recombinante cellen kunnen worden gevalideerd door PCR met primers die de XmaI-site flankeren binnen pMaOri.dCas9. (B) In dit geval resulteerden cellen die pMaOri.dCas9 bevatten slechts in een amplicon van 281 bp, terwijl die cellen die het plasmide voor geluiddemping bevatten, die zowel dCas9 als sgRNA bevatten, een amplicon van 723 bp vertoonden. Na bevestiging van de aanwezigheid van de plasmiden werd genuitschakeling gevalideerd door immunoblotanalyse. (C) Incubatie met antilichamen tegen zowel doeleiwit als een beladingscontrole-eiwit wordt aanbevolen; in de representatieve immunoblot worden hele celextracten van transconjuganten die alleen pMaOri.dCas9 bevatten of met sgRNA-cassettes gericht op lipL32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) en zowel LigA- als LigB-genen (pMaOri.dCas9sgRNAligAB) weergegeven. Co-incubatie met anti-LipL32, anti-LigAB en anti-LipL41 (non-target, loading control) bevestigt dat de expressie van LipL32 eiwit wordt afgeschaft in cellen die pMaOri.dCas9sgRNAlipL32 en zowel LigA als LigB bevatten in cellen die pMaOri.dCas9sgRNAligAB bevatten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend bestand: Single guide RNA (sgRNA) cassettesequentie. De sgRNA transcriptie wordt geleid door de constitutieve lipL32 promotor (bold nucleotiden). sgRNA bestaat uit 20 nucleotiden die verwijzen naar de protospacer, verantwoordelijk voor base pairing aan de codeerstreng van het doelgen, en dCas9 scaffold sequence (onderstreepte nucleotiden). Xma I beperking sites (cccggg) zijn opgenomen aan beide uiteinden voor ligatie op pMaOri.dCas9 plasmide. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Na de vroege sequencing van pathogene15,16,17,18 en saprofytische19Leptospira-soorten, werpen gegevensmining van het genoom licht op verschillende aspecten van leptospirale pathogenese. In de meeste gevallen werd de eiwitfunctie onderzocht met behulp van de recombinante tegenhanger van putatieve leptospirale oppervlakte-blootgestelde eiwitten en daaropvolgende speculatie van de inheemse eiwitfunctie20,21,22,23,24,25,26.
De generatie van mutanten en de evaluatie van hun respectieve fenotype zijn belangrijke componenten van functionele genomische analyse. De eerste pogingen om mutanten in Leptospira spp. te genereren werden bereikt door willekeurige transposon mutagenese27,28,29,30; echter, na uitgebreide en moeizame analyse voor het afleiden van de identiteit van verstoorde genen, werd opgemerkt dat slechts 15% van alle genen in L. interrogans serovar Manilae werden verstoord27. Gerichte gen knock-out werd verder bereikt door homologe recombinatie met behulp van zelfmoordplasmiden om een antibioticaresistentiecassette te leveren geflankeerd door homologe armen binnen het gewenste doel31,32.
Door deze technologieën toe te passen, werden verschillende aspecten van leptospirale basisbiologie en virulentie onderzocht31,33,34,35,36,37. De ontwikkeling van de E. coli-Leptospira conjugatieve shuttle vector, pMaOri 11, maakte de levering van componenten voor episomale genuitschakeling mogelijk.
Eerder werd aangetoond dat de door Cas9 geïnduceerde dubbelstrengsbreuk dodelijk is voor Leptospira spp. en als alternatief kan de katalytisch inactieve variant van het enzym, dCas9, worden gebruikt om genuitschakeling te bereiken bij zowel saprofytische als pathogene soorten4,5. Door het gebruik van de plasmide pMaOri.dCas9 als ruggengraat voor sgRNA cassette ligatie, kan specifieke en stabiele genuitschakeling worden verkregen als gevolg van de expressie van zowel dCas9 als sgRNA; dCas9-gebonden sgRNA leidt het eiwit naar het gewenste doel door Watson-Crick base pairing.
Voor volledige genuitschakeling moet de protospacer worden ontworpen op basis van de sjabloonstreng van het gewenste gen, zodat de basiskoppeling van het sgRNA plaatsvindt met de coderingsstreng. Gebaseerd op een gemiddeld C+G-gehalte van 35% in Leptospira spp., zal de PAM 5'-NGG-3' minstens 3 keer per 100 bp voorkomen. Daarom zal vrijwel elk gen in het genoom van Leptospira ten minste één PAM bevatten. Als het motief NGG echter niet wordt gevonden, kan het alternatieve NAG-motief worden geëvalueerd.
Eerdere genuitschakelingstechnieken, zoals zinkvingers en TALE (transcriptieactivatorachtige effectoren), vertrouwden op de constructie van één ander eiwit voor elk doelwit, waardoor deze technieken arbeidsintensief en kostbaarwaren 38. In het geval van CRISPRi is de variabele component de sgRNA, waardoor het noodzakelijk is om alleen de 20 bp aan het einde van 5' te wijzigen. Volledige, stabiele en gerichte genuitschakeling is niet alleen waargenomen bij Leptospira spp.4,5, maar ook bij andere bacteriën8,39,40,41.
De ontwikkeling van HAN media13 bevorderde het herstel van mutanten door de incubatietijd voor kolonievorming drastisch te verkorten en Leptospira te laten groeien bij 37 oC. Tijdens de vervoegingsstap wordt het gebruik ervan echter niet aanbevolen, omdat E. coli zich krachtig kan verspreiden in dit medium en de beoogde 1:1-verhouding tussen donor- en ontvangercellen kan overwinnen. In dit stadium is EMJH plus DAP de betere keuze, omdat E. coli slecht repliceert in deze media. Het is vermeldenswaard dat sommige laboratoria in-house aangevulde EMJH maken, die extra componenten kan bevatten die ook de groei van E. coli-cellen kunnen ondersteunen.
Het hier gepresenteerde vervoegingsprotocol was geoptimaliseerd voor L. interrogans serovar Copenhageni stam Fiocruz L1-130, en het bleek ook effectief te zijn in de transformatie van een recent geïsoleerde pathogene stam uit bodemmonsters5. De eerste pogingen met verschillende serovars van L. borgpetersenii soorten wijzen op lagere vervoegingsefficiënties met het beschreven protocol. Bij het werken met verschillende soorten/serovars van Leptospiramoeten de optimale omstandigheden voor vervoeging dus empirisch worden bepaald, rekening houdend met donor:ontvangercelverhoudingen, initiële celdichtheden, vervoegingsmedia en tijd (24 en 48 uur). Het is redelijk om aan te nemen dat verschillende Leptospira-soorten en serovars zich anders zullen gedragen met verschillende vervoegingsprotocollen.
Hoewel saprofytische Leptospira-kolonies relatief gemakkelijk te visualiseren zijn op platen, kunnen pathogene kolonies moeilijker te observeren zijn. Normaal gesproken, door han media aangevuld met 0,4% konijnenserum en spectinomycine te gebruiken, kunnen transconjugant kolonies worden waargenomen op dag 10. Onze ervaring is dat kolonies in eerste instantie als een transparante halo aan het mediaoppervlak aanwezig zijn. In het videoprotocol worden dichtere kolonies, na 14 dagen groei, getoond omdat de transparante moeilijk te filmen waren. In dit stadium kan het roteren van de plaat om verschillende lichtinval te bereiken en te schakelen tussen witte en donkere achtergronden helpen bij het identificeren van kolonies.
Voor mutantvalidatie biedt immunoblotting een eenvoudige aanpak; aangezien antilichamen echter niet altijd beschikbaar zijn tegen doeleiwitten, kunnen alternatieve strategieën worden gevolgd om genuitschakeling te valideren. Kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR) met behulp van primers voor het doelgen en een constitutieve controle is effectief om genuitschakeling te valideren, aangezien sgRNA-geleide dCas9 verantwoordelijk is voor blokkering van gentranscriptie. Als het doelgen codeert voor een duidelijk gedefinieerde eiwitband in eiwitgels, kan SDS-PAGE demping aantonen, en volgens het lipL32-gen dat5 uitschakeling. Als LPS-biosynthesegenen tot zwijgen worden gebracht, kan LPS-kleuring worden gebruikt; in het geval van dempingsgenen die coderen voor enzymen met goed gedefinieerde substraten, zijn kinetische testen met chromogene substraten geldige strategieën; β-galactosidase silencing in L. biflexa werd gevalideerd door het gebruik van X-gal en ONPG (ortho-Nitrofenyl-β-galactoside) substraten4.
Na bevestiging van genuitschakeling kunnen experimenten worden ontworpen om fenotype verder te evalueren. Bindende assays kunnen worden uitgevoerd in het geval van het dempen van bacteriële adhesines; serum-challenge assays bevestigden de rol van LigA en LigB in serumoverleving weergegeven door pathogene Leptospira5. Mutanten kunnen ook worden gebruikt om dieren te enten om de verzwakking van virulentie te beoordelen; in dit geval moeten dieren die met de mutant zijn ingeënt, worden vergeleken met dieren die alleen besmet zijn met cellen die pMaOri.dCas9 bevatten.
Concluderend beschrijft het huidige protocol de toepassing van CRISPRi voor genuitschakeling bij pathogene Leptospira-soorten met behulp van HAN-media om mutantherstel binnen 10 dagen te vergemakkelijken. Genuitschakeling in combinatie met functionele genomische analyse zal ons begrip van pathogene mechanismen van Leptospiraverbeteren en uiteindelijk leiden tot de ontwikkeling van betere profylactische strategieën voor ziektebestrijding.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
USDA is een aanbieder van gelijke kansen en werkgever. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw. Het Braziliaanse agentschap FAPESP (subsidie 2014/50981-0) heeft dit werk financieel ondersteund; LGVF wordt gefinancierd met een fellowship van FAPESP (2017/06731-8 en 2019/20302-8). De financiers hadden geen rol in studieontwerp, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of manuscriptvoorbereiding. De auteurs bedanken ook Hannah Hill en Alexander Grimes van de USDA Visual Services voor het filmen en bewerken van het videoprotocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane | Millipore | VCWP02500 | Filtration for bacterial conjugation |
| 2,6-Diaminopimelic acid (DAP) | Sigma | D1377 | Growth of auxotrophic E. coli β2163 |
| Agar Noble | BD & Company | 214230 | Used for preparation of solid EMJH and HAN plates |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Used for preparation of solid LB plates |
| Clarity Western ECL substrate | Biorad | 170-5060 | Chemiluminescent substrate |
| dNTP set | Thermo Fisher | 10297-018 | dNTPs for PCR reaction |
| Glass Microanalysis Filter Holder | Millipore | XX1012530 | Filtration for bacterial conjugation |
| Imaging System | Biorad | ChemiDoc MP | Chemiluminescence detection |
| LB broth, Miller | BD & Company | 244620 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD & Company | 279510 | Supplementation of EMJH media |
| Leptospira Medium Base EMJH | BD & Company | 279410 | EMJH medium for Leptospira |
| Mini-PROTEAN TGX Gels 12% | Biorad | 4568043 | Used for polyacrylamide gel eletrophoresis |
| Optical density reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | For optical density measurements of bacterial cultures |
| Phosphate Buffered Saline 7.4 | Sigma | 806552 | Saline solution for washing bacterial pellets |
| Spectinomycin | Sigma | S0692 | Selection of pMaOri backbone plasmids |
| Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher | EP0402 | Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction |
| Thermocycler | Applied Biosystem | GeneAmp PCR System 9700 | Used for PCR reaction cycling |
| Thymidine (dT) | Sigma | T9250 | Growth of auxotrophic E. coli π1 |
| XmaI restriction enzyme | New Englan BioLabs | R0180L | Digestion of plasmids and inserts |
References
- Bharti, A. R., et al. Leptospirosis: A zoonotic disease of global importance. Lancet Infectious Disease. 3 (12), 757-771 (2003).
- Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLoS Neglected Tropical Disease. 9 (9), 0003898 (2015).
- Shapiro, R. S., et al. A CRISPR-Cas9-based gene drive platform for genetic interaction analysis in Candida albicans. Nature Microbiology. 3 (1), 73-82 (2018).
- Fernandes, L. G. V., et al. Gene silencing based on RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9): a new tool for genetic engineering in Leptospira. Science Reports. 9 (1), 1839 (2019).
- Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., Nascimento, A. L. T. O., Nally, J. E. Genetic manipulation of pathogenic Leptospira: CRISPR interference (CRISPRi)-mediated gene silencing and rapid mutant recovery at 37 C. Science Reports. 11 (1), 1768 (2021).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
- Choudhary, E., Thakur, P., Pareek, M., Agarwal, N. Gene silencing by CRISPR interference in mycobacteria. Nature Communication. 6, 6267 (2015).
- Zhukova, A., et al. Genome-wide transcriptional start site mapping and sRNA identification in the pathogen. Frontiers in Cell and Infectious Microbiology. 7, 10 (2017).
- Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPalpha) conjugative machineries, and their cognate Escherichia coli host strains. Research in Microbiology. 156 (2), 245-255 (2005).
- Pappas, C. J., Benaroudj, N., Picardeau, M. A replicative plasmid vector allows efficient complementation of pathogenic Leptospira strains. Applied Environmental Microbiology. 81 (9), 3176-3181 (2015).
- Fernandes, L. G. V., Nascimento, A. L. T. O. Specific gene silencing in Leptospira biflexa by RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9). Methods in Molecular Biology. 2134, 109-122 (2020).
- Hornsby, R. L., Alt, D. P., Nally, J. E. Isolation and propagation of leptospires at 37 °C directly from the mammalian host. Science Reports. 10 (1), 9620 (2020).
- Haake, D. A.
- Nascimento, A. L., et al. Comparative genomics of two Leptospira interrogans serovars reveals novel insights into physiology and pathogenesis. Journal of Bacteriology. 186 (7), 2164-2172 (2004).
- Nascimento, A. L., et al. Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Brazillian Journal of Medical Biology Research. 37 (4), 459-477 (2004).
- Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
- Bulach, D. M., et al. Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (39), 14560-14565 (2006).
- Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLoS One. 3 (2), 1607 (2008).
- Fernandes, L. G., et al. OmpL1 is an extracellular matrix- and plasminogen-interacting protein of Leptospira spp. Infections and Immunity. 80 (10), 3679-3692 (2012).
- Fernandes, L. G., et al. Leptospira spp.: Novel insights into host-pathogen interactions. Veterinary Immunology and Immunopathology. 176, 50-57 (2016).
- Castiblanco-Valencia, M. M., et al. Leptospiral immunoglobulin-like proteins interact with human complement regulators factor H, FHL-1, FHR-1, and C4BP. Journal of Infectious Diseases. 205 (6), 995-1004 (2012).
- Choy, H. A., et al. The multifunctional LigB adhesin binds homeostatic proteins with potential roles in cutaneous infection by pathogenic Leptospira interrogans. PLoS One. 6 (2), 16879 (2011).
- Siqueira, G. H., et al. The recombinant LIC10508 is a plasma fibronectin, plasminogen, fibrinogen and C4BP-binding protein of Leptospira interrogans. Pathogen and Diseases. 74 (2), (2016).
- Teixeira, A. F., et al. Features of two new proteins with OmpA-like domains identified in the genome sequences of Leptospira interrogans. PLoS One. 10 (4), 0122762 (2015).
- Kochi, L. T., et al. The interaction of two novel putative proteins of Leptospira interrogans with E-cadherin, plasminogen and complement components with potential role in bacterial infection. Virulence. 10 (1), 734-753 (2019).
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infections and Immunity. 77 (2), 810-816 (2009).
- Bourhy, P., Louvel, H., Saint Girons, I., Picardeau, M. Random insertional mutagenesis of Leptospira interrogans, the agent of leptospirosis, using a mariner transposon. Journal of Bacteriology. 187 (9), 3255-3258 (2005).
- Pětrošová, H., Picardeau, M. Screening of a Leptospira biflexa mutant library to identify genes involved in ethidium bromide tolerance. Applied Environmental Microbiology. 80 (19), 6091-6103 (2014).
- Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods in Molecular Biology. 859, 169-176 (2012).
- Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: Disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infections and Immunity. 76 (12), 5826-5833 (2008).
- Picardeau, M., Brenot, A., Saint Girons, I. First evidence for gene replacement in Leptospira spp. Inactivation of L. biflexa flaB results in non-motile mutants deficient in endoflagella. Molecular Microbiology. 40 (1), 189-199 (2001).
- King, A. M., et al. High-temperature protein G is an essential virulence factor of Leptospira interrogans. Infections and Immunity. 82 (3), 1123-1131 (2014).
- Lambert, A., et al. FlaA proteins in Leptospira interrogans are essential for motility and virulence but are not required for formation of the flagellum sheath. Infections and Immunity. 80 (6), 2019-2025 (2012).
- Murray, G. L., et al. Leptospira interrogans requires heme oxygenase for disease pathogenesis. Microbes and Infections. 11 (2), 311-314 (2009).
- Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathogens. 3 (7), 97 (2007).
- Sasaki, Y., et al. Leptospiral flagellar sheath protein FcpA interacts with FlaA2 and FlaB1 in Leptospira biflexa. PLoS One. 13 (4), 0194923 (2018).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Cress, B. F., et al. Rapid generation of CRISPR/dCas9-regulated, orthogonally repressible hybrid T7-lac promoters for modular, tuneable control of metabolic pathway fluxes in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (9), 4472-4485 (2016).
- Zhao, C., Shu, X., Sun, B. Construction of a gene knockdown system based on catalytically inactive ("dead") Cas9 (dCas9) in Staphylococcus aureus. Applied Environmental Microbiology. 83 (12), (2017).
- Zhao, Y., et al. CRISPR/dCas9-mediated multiplex gene repression in Streptomyces. Biotechnology Journal. , 1800121 (2018).
