Summary
يظهر هنا بروتوكول لزرع نافذة جمجمة مزمنة للتصوير الطولي لخلايا الدماغ في الفئران المستيقظة المقيدة الرأس.
Abstract
لفهم الفسيولوجيا الخلوية للخلايا العصبية والدبقية في الحيوانات التي تتصرف بشكل كامل ، من الضروري تصور مورفولوجيتها وتسجيل نشاطها في الجسم الحي في الفئران التصرف. تصف هذه الورقة طريقة لزرع نافذة جمجمة مزمنة للسماح بالتصوير الطولي لخلايا الدماغ في الفئران المستيقظة المقيدة الرأس. بالاقتران مع الاستراتيجيات الجينية والحقن الفيروسية ، من الممكن تسمية خلايا ومناطق محددة ذات أهمية بعلامات هيكلية أو فسيولوجية. يوضح هذا البروتوكول كيفية الجمع بين الحقن الفيروسية لتسمية الخلايا العصبية بالقرب من الخلايا النجمية المعبرة عن GCaMP6 في القشرة للتصوير المتزامن لكلتا الخليتين من خلال نافذة الجمجمة. يمكن إجراء التصوير متعدد الفوتونات لنفس الخلايا لأيام أو أسابيع أو أشهر في الحيوانات المستيقظة التي تتصرف. يوفر هذا النهج للباحثين طريقة لعرض الديناميكيات الخلوية في الوقت الفعلي ويمكن تطبيقها للإجابة على عدد من الأسئلة في علم الأعصاب.
Introduction
تعد القدرة على إجراء الفحص المجهري الفلوري متعدد الفوتونات في الجسم الحي في قشرة الفئران أمرا بالغ الأهمية لدراسة الإشارات الخلوية والبنية1،2،3،4،5،6،7،8،9 ، وأمراض الأمراض10،11 ، والتطور الخلوي12،13 . مع زرع نوافذ الجمجمة المزمنة ، يكون التصوير الطولي ممكنا ، مما يسمح بالتصوير المتكرر للمناطق القشرية لأيام أو أسابيع أو أشهر13,14 في الحيوانات الحية. يعد الفحص المجهري متعدد الفوتونات مثاليا للتصوير المتكرر في الجسم الحي بسبب تحسين فحص العمق وتقليل الضرر الضوئي المرتبط بليزر الأشعة تحت الحمراء المستخدم. هذا يسمح لدراسة الديناميكيات الجزيئية والخلوية لخلايا معينة في مختلف المناطق القشرية .
تم استخدام المجهر متعدد الفوتونات في التصوير الحي للخلايا العصبية والدبقية في الفئران 15،16،17،18،19،20. يمكن تنفيذ استراتيجيات مختلفة لتسمية أنواع معينة من الخلايا ومجالات الاهتمام. أحد الأساليب الشائعة هو دفع التعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا بطريقة خاصة بالخلية باستخدام نظام إعادة تركيب Cre-Lox. يمكن إجراء ذلك مع الفئران المعدلة وراثيا ، على سبيل المثال ، عبور الفأر tdTomato "floxed" (Ai14) مع فأر يعبر عن Cre-recombinase تحت مروج مثير للاهتمام21. بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق وضع العلامات الخاصة بالخلايا والموقع باستخدام الحقن الفيروسية. هنا ، يتم حقن فيروس يشفر Cre recombinase تحت محرك خاص بالخلية وفيروس يشفر جينا مفلطخا ذا أهمية في منطقة محددة. ثم تعبر أنواع الخلايا المناسبة التي تتلقى كلا الناقلين الفيروسيين عن الجين (الجينات) المطلوب. يمكن أن تكون هذه الجينات علامات هيكلية ، مثل tdTomato، لعرض التغيرات في التشكل الخلوي22 أو مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) ، مثل GCaMP و / أو RCaMP ، لفحص ديناميكيات الكالسيوم23. يمكن تطبيق طرق إعادة التركيب الجيني بشكل فردي أو مجتمعة لتسمية نوع واحد أو أكثر من الخلايا. وهناك نهج ثالث ، لا يتطلب الفئران المعدلة وراثيا أو التركيبات الفيروسية (التي لديها قدرة تعبئة محدودة) ، هو في الرحم الكهربائي من بنى الحمض النووي24. اعتمادا على توقيت الكهربية ، يمكن استهداف أنواع مختلفة من الخلايا 25،26،27.
عند إجراء التصوير متعدد الفوتونات ، يمكن تصوير الفئران أثناء الاستيقاظ أو التخدير. يمكن إجراء تصوير الفئران المستيقظة عن طريق تأمين الماوس عبر لوحة رأس متصلة28. يتم جعل هذا النهج أقل إرهاقا من خلال السماح بحرية الحركة نسبيا للحيوان باستخدام طرق ، مثل كرات الستايروفوم29 العائمة بحرية ، أو أجهزة المشي العائمة بحرية1 ، أو نظام القفص المنزلي الذي يتم رفعه بالهواء حيث يتم تثبيت الفئران بواسطة لوحة رأس متصلة ويسمح لها بالتحرك في غرفة مفتوحة30. لكل من ظروف التصوير هذه ، سيكون من الضروري أولا تعويد الفئران على إعداد التصوير. تصف هذه الورقة إجراء التعود والتصوير باستخدام نظام قفص منزلي يتم رفعه جوا.
يصف هذا البروتوكول زرع نافذة قحفية مزمنة للتصوير الطولي في الجسم الحي في القشرة. هنا ، سنستخدم الفئران التي تعبر بشكل مشروط عن GCaMP6f في الخلايا النجمية لمراقبة ديناميكيات إشارات الكالسيوم. علاوة على ذلك ، تصف هذه الورقة إجراء الحقن الفيروسية باستخدام tdTomato كتسمية للخلايا العصبية. هذا يسمح بتحديد التغيرات في البنية المشبكية العصبية و / أو التوافر كعلامة هيكلية تمكن من التصوير المتكرر لنفس الخلايا النجمية. وخلال البروتوكول، سيتم تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة لضمان أفضل جودة ممكنة للصور التي يتم الحصول عليها من الفحص المجهري متعدد الفوتونات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة من قبل IACUC في المركز الطبي بجامعة نبراسكا.
1. قبل الجراحة
- إعداد الماصات للحقن الفيروسية. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة وشطب الماصة بزاوية 20 درجة. تعقيم الماصات بين عشية وضحاها.
- تحضير قطع جديدة من رغوة هلام معقمة عن طريق تقطيعها إلى مربعات صغيرة. اغمر رغوة الجل في أنبوب ميكروفوج معقم يحتوي على 0.5 مل من المياه المالحة. انقعي رغوة الجل في محلول ملحي لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
- تحضير قطع جديدة من شرائط الإسفنج عن طريق تقطيعها إلى شرائح رقيقة.
- قبل عشرين دقيقة من الجراحة ، حقن الفئران GLAST-CreER / GCaMP6f البالغة من العمر 4-6 أسابيع داخل الصفاق مع 0.2 مجم / كجم ديكساميثازون لمنع تورم الدماغ و 5 ملغ / كغ كاربروفين لتقليل الالتهاب.
ملاحظة: للحث على إعادة تركيب GCaMP6f والتعبير عنه في حوالي 40٪ من الخلايا النجمية ، تم حقن الفئران GLAST-CreER / GCaMP6f ب 100 مجم / كجم تاموكسيفين في 3 أسابيع لمدة 5 أيام متتالية.
2. بدء الجراحة
- بعد 20 دقيقة ، قم بتخدير الفئران بنسبة 3٪ من الأيزوفلوران مع الأكسجين بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة لمدة 1.5 دقيقة تقريبا.
- بمجرد تخديره ، ضع الماوس على إطار مجسمة يجلس على بطانية إعادة تدوير المياه للحفاظ على درجة حرارة الجسم 37 درجة مئوية طوال الجراحة. قم بتثبيت الماوس على الإطار باستخدام مشبك الخطم وقضبان الأذن. تأكد من أن مشبك الخطم وقضبان الأذن مستقرة بما فيه الكفاية بحيث لا يتحرك الرأس أثناء الإجراء ، ولكن ليس ضيقا لدرجة تلف الجمجمة.
- الحفاظ على التخدير مع 1-1.5 ٪ من الايزوفلوران مع الأكسجين بمعدل تدفق 1-2 لتر / دقيقة. لاحظ أن بعض الحيوانات قد تحتاج إلى أكثر أو أقل من الأيسوفلوران للحفاظ على التخدير. راقب تنفس الحيوان وكذلك ردود أفعاله على أصابع القدم والذيل ، واضبط الأيزوفلوران بشكل مناسب.
- ضع مرهم العين على كل عين باستخدام قضيب طرف القطن لمنع العينين من الجفاف أثناء العملية.
- باستخدام أدوات تشذيب القوارض ، احلق الشعر من الرقبة إلى ما بعد العينين مباشرة. توخي الحذر للتأكد من أن شعيرات الحيوان لا يتم تقليمها عن طريق الخطأ.
- نظف المنطقة المحلوقة باستخدام وسادة تحضير واحدة لليود ، تليها وسادة تحضير كحول واحدة.
- باستخدام ملقط الأنسجة المعقمة والمقص الجراحي ، قم بقص وإزالة الجلد من الغرز الأمامية الأمامية للبريجما على طول الطريق الخلفي إلى لامدا.
- بمجرد إزالة الجلد ، أضف ما يقرب من 0.1 مل من 1٪ xylocaine (يدوكائين مع أدرينالين 1: 200000) إلى الجمجمة لتقليل نزيف الجمجمة.
- باستخدام شفرة جراحية معقمة من الفولاذ الكربوني مقاس 11 متصلة بمقبض ، قم بكشط النسيج الضام بلطف من الجمجمة. كن حذرا للغاية عند إزالة النسيج الضام بالقرب من حافة الجمجمة ، لأن أي نسيج متبقي يمكن أن يمنع الالتصاق القوي للزجاج أو لوحة الرأس في وقت لاحق.
- استخدم ملقط الأنسجة المعقمة لإزالة النسيج الضام الفضفاض من الجمجمة.
- باستخدام أدوات قضيب ذات أطراف قطنية معقمة ، قم بتنظيف أي إكسيلوكائين متبقي من الجمجمة.
- بمجرد الانتهاء ، قم بإزالة الشحوم تماما من الجمجمة باستخدام قضيب طرف قطني معقم مغموس في الأسيتون. استخدم الهواء المضغوط لتجفيف الجمجمة على الفور.
3. بضع القحف
- باستخدام علامة نقطة دقيقة ومسطرة ، قم بقياس الحجم المناسب للفتحة في الموقع المطلوب. تأكد من حجم الفتحة من خلال مقارنتها بحجم زجاج الغطاء (قطره 3 أو 5 مم) ؛ تأكد من أن الفتحة أصغر قليلا من حجم زجاج الغطاء.
- باستخدام مثقاب الأسنان ، تتبع تدريجيا الخطوط العريضة للفتحة ، مما يؤدي إلى ترقق العظام. حفر ببطء لمنع الحفر من خلال العظام، وحفر في دوائر متحدة المركز لتسهيل حتى ترقق العظام.
- بعد كل تمريرة متحدة المركز ، أضف قطرة أو قطرتين من المياه المالحة المعقمة إلى المنطقة المحفورة. اسمح للمحلول الملحي بالجلوس لمدة 10 ثوان على الأقل لمنع العظام من ارتفاع درجة الحرارة وإتلاف الجافية الأساسية.
- استخدم قضيب ذو طرف قطني معقم لامتصاص أي محلول ملحي متبقي. نفخ الهواء المضغوط فوق المنطقة للتأكد من أن جميع المياه المالحة المتبقية قد تبخرت قبل استئناف الحفر. افعل ذلك لتفجير حطام العظام المتبقي.
- كرر الخطوات 3.2-3.4 حتى يتم ترقق العظم بشكل كاف لإزالته.
- تأكد من أن العظم ضعيف بشكل كاف لإزالته عن طريق الضغط بلطف على المنطقة المركزية من العظم باستخدام ملقط ناعم للتحقق من أن الجمجمة الرقيقة تتحرك. يجب أن تكون الأوعية الدموية الأساسية مرئية حيث حدث الحفر. لاحظ أن العظم قد يظهر كما لو أنه سيتشقق حيث حدث الترقق.
ملاحظة: التدريب في هذه المرحلة أمر بالغ الأهمية لتحديد متى تم ترقق العظام بشكل مناسب. - قبل محاولة إزالة العظم، تحقق من الماوس للتأكد من أنه مهدئ تماما. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بزيادة صيانة الأيسوفلوران تدريجيا لمنع تورم الدماغ عند إزالة العظام.
- أضف قطعة صغيرة من رغوة الجل المشبعة بالمحلول الملحي إلى الجمجمة الرقيقة. أضف قطرة أو قطرتين إضافيتين من المياه المالحة إلى الجمجمة الرقيقة.
ملاحظة: وجود الكثير من المياه المالحة فوق الجمجمة الرقيقة يساعد على تقليل النزيف وحماية الجافية عند إزالة رفرف العظام. - باستخدام شفرة مدببة مصغرة بزاوية 15 درجة، أدخل الشفرة بعناية في العظم الرقيق واقطعها على طول العظم الرقيق. حافظ على رغوة الجل غارقة في محلول ملحي ، وعلى استعداد لوقف أي نزيف قد يحدث.
- باستخدام الملقط ، ارفع العظام وأزلها بعناية. كن لطيفا قدر الإمكان لتجنب تلف الأنسجة الأساسية والأوعية الدموية. احرص بشدة على عدم إتلاف الأم الجافية.
- بمجرد إزالة رفرف العظام ، أضف قطعة جديدة من رغوة الجل المشبعة بالمحلول الملحي إلى القشرة. أضف بضع قطرات من المحلول الملحي لمنع رغوة الجل من الجفاف ، لأن هذا سيؤدي إلى تلف الأنسجة الكامنة.
4. الحقن الفيروسية
- إجراء الحقن الفيروسية باستخدام جهاز مجسم.
- إعداد AAV1. CaMKII.0.4.Cre (عيار 3 × 1013 نسخة جينوم (GC)/mL) عند 1:5000 بواسطة التخفيفات التسلسلية في المياه المالحة.
- تحضير خليط AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) و AAV1. كاغ. FLEX.tdTomato (عيار 5 × 1012 GC/mL) على قطعة صغيرة من البارافيلم.
- املأ ماصة زجاجية مشطوفة معقمة بحجم طرف 20 ميكرومتر بخليط الفيروس عن طريق وضع الماصة بلطف على المحلول.
- اخفض الماصة بحيث تلامس سطح الدماغ فقط وتستمر في الانخفاض للحصول على 200-300 ميكرومتر إضافي لحقن L2/3. باستخدام نظام توزيع الحقن المجهري داخل الخلايا (انظر جدول المواد) ، حقن الضغط 12-15 مرة على مدى دقيقتين (20 رطل لكل بوصة مربعة ، 9 مللي ثانية مدة النبض). راقب الغضروف المفصلي في قطرة الماصة مع كل حقنة للتأكد من عدم حظر الماصة.
- بمجرد حقنها ، اترك الماصة في الدماغ لمدة 4-5 دقائق لمنع التدفق العكسي. سحب الماصة ببطء.
- كرر الحقن في 2-3 مواقع (حوالي 500 ميكرومتر على حدة).
- تخلص من الماصات الزجاجية المستخدمة ، والبارافيلم ، ونصائح الماصة ، وأنابيب microfuge المستخدمة في التخفيفات التسلسلية لفيروس Cre إلى تبييض بنسبة 10٪.
5. زرع نافذة الجمجمة
- قم بإزالة أي رغوة هلامية ، واستخدم شريطا صغيرا من شرائط الإسفنج لامتصاص أي محلول ملحي متبقي.
- أضف بضع قطرات من المضاد الحيوي enrofloxacin (22.7 ميكروغرام / مل) إلى الفتحة واسمح له بالبقاء هناك لمدة 1 دقيقة. بعد 1 دقيقة ، استخدم قطعة جديدة من شريط الإسفنج لامتصاص أي إنروفلوكساسين متبقي. كرر هذه العملية مرتين أخريين.
- بعد الغسيل الثالث ، أضف بضع قطرات من المياه المالحة إلى الفتحة واتركها تبقى هناك لمدة 1 دقيقة. بعد 1 دقيقة ، استخدم قطعة جديدة من شريط الإسفنج لامتصاص أي محلول ملحي متبقي. كرر عملية الغسيل هذه مرتين أخريين وبعد الغسيل الثالث ، أضف قطرة صغيرة من المحلول الملحي إلى الفتحة.
- ضع زجاج الغطاء فوق الفتحة. استخدم الملقط للتأكد من تدفق الزجاج فوق الفتحة للحصول على صور ذات نوعية جيدة.
- أثناء تثبيت الزجاج بلطف في مكانه ، ضع جل لاصق سيانو أكريليت (جدول المواد) حول محيط الزجاج لإغلاق حواف النافذة على الجمجمة. تأكد من عدم السماح للغراء بالتسرب تحت زجاج الغطاء ، والحفاظ على أكبر قدر ممكن من الغراء بعيدا عن سطح زجاج الغطاء.
- ضع طبقة من الغراء الفائق على الجل اللاصق. أضف طبقة من سائل أسمنت الأسنان فوق الغراء للسماح له بالتصلب.
- خذ صفيحة رأس من نوع المروحية ذات الحجم المناسب وقم بتطبيق طبقة رقيقة من الغراء حول الفتحة المركزية. ضع لوحة الرأس فوق زجاج الغطاء ، واترك الغراء يجف لفترة وجيزة.
- في أنبوب microfuge سعة 1.5 مل ، أضف مسحوق أسمنت الأسنان إلى علامة 0.1 مل على الأنبوب. أضف 7-8 قطرات من المادة اللاصقة الفورية سريعة المعالجة واخلطها. اسحب إلى حقنة سعة 1 مل باستخدام إبرة 19 جم تم قطعها لإنشاء فتحة أكبر.
- حقن الخليط من خلال الثقوب الجانبية لشريط طائرة هليكوبتر حتى يتسرب من كلا الجانبين. ضع خليط الأسمنت / المادة اللاصقة للأسنان على بقية الجمجمة المكشوفة لربط صفيحة الرأس بالجمجمة ، مما يقلل من التحف الحركية أثناء التصوير.
- اترك الخليط حتى يجف في الهواء لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- حقن الماوس مع 0.5 مل من المياه المالحة تحت الجلد للمساعدة في الانتعاش.
6. ما بعد العملية
- قم بإزالة الماوس من الإطار المجسمة وأعده إلى قفصه.
- ضع جزءا من القفص على بطانية إعادة تدوير المياه أو وسادات تسخين هلام الفضاء أو منصات متساوية الحرارة للمساعدة في التعافي.
- تزويد الحيوان بمساعدة صغيرة من الكريات الغذائية والطعام الرطب ، بالإضافة إلى نظامه الغذائي المنتظم ، لمزيد من المساعدة في الانتعاش. أضف حبيبات طعام جديدة وأطعمة رطبة كل يوم بعد الجراحة طوال فترة الشفاء.
- في اليوم التالي للجراحة، حقن الفئران مرة واحدة مع 5 مغ/كغ كاربروفين و 5 مغ/كغ إنروفلوكساسين.
- في الأيام 2-6 ، حقن الفئران مرة واحدة مع 5 ملغ / كغ كاربروفين ومرتين مع 5 ملغ / كغ من الإينروفلوكساسين ، في انتظار موافقة IACUC المحلية. افصل حقن الإينروفلوكساسين بمقدار 8 ساعات على الأقل.
- في الأيام 7-20 ، حقن الفئران يوميا مع 5 ملغ / كغ كاربروفين.
7. التعود على الحيوانات للتصوير
- في اليوم 14 بعد الجراحة ، افحص نافذة الجمجمة للحصول على وضوح بصري. لا تستخدم الفئران ذات النوافذ غير الواضحة أو التالفة (أي تكوين الأوعية الدموية المفرط).
- تحقق من تعبير tdTomato تحت المجهر الفلوري. إذا كان من الممكن تحديد الخلايا المصنفة ، فتابع التعود على الحيوانات.
- اليوم الأول من التعود (التعامل)
- امسك الماوس لبضع دقائق وأعده إلى قفصه بعد المناولة. كرر المعالجة ثلاث مرات مع فاصل زمني مدته 15 دقيقة بين الجلسات.
- بعد التجربة الثالثة ، اعتاد الفأر عن طريق لف الحيوان في قطعة صغيرة من القماش.
- أمسك الماوس ملفوفا بقطعة قماش لمدة 1 دقيقة تقريبا.
- بعد التجربة ، أعد الماوس إلى قفصه. كرر هذه العملية مرتين أخريين، مما يتيح فترة 15 دقيقة بين كل تجربة.
- اليوم الثاني من التعود
- وزن وتسجيل وزن الماوس.
- لف الماوس بقطعة قماش ، وقم بتثبيته عبر لوحة رأسه إلى ذراع تثبيت الرأس في القفص المنزلي الذي يتم رفعه جوا.
- اترك القفص المنزلي معرضا للضوء.
- اسمح للماوس بالبقاء آمنا في قفص المنزل المتنقل لمدة 15 دقيقة.
- بعد التعود ، قم بإزالة الماوس من القفص المنزلي وأوقف تدفق الهواء.
- وزن الماوس وإعادته إلى قفصه. احرص على تضمين الفئران التي لا تفقد أكثر من 10٪ من وزن جسمها فقط. استبعد الفئران التي تفقد أكثر من 10٪ من وزنها خلال أي يوم من أيام التعود من تجارب التصوير.
- اليوم الثالث من التعود وما بعده
- قم بوزن الماوس وتسجيله قبل تثبيته في القفص المنزلي الذي يتم رفعه جوا.
- قم بتثبيت الماوس على القفص المنزلي الذي يتم رفعه جوا.
- قم بتغطية القفص المنزلي بشيء يوفر مساحة داخلية داكنة ، مثل الصندوق ، واسمح للماوس بالبقاء آمنا لمدة 30 دقيقة.
- بعد 30 دقيقة ، اكشف عن القفص المنزلي ، وأزل الماوس ، وأوقف تدفق الهواء.
- وزن وتسجيل وزن الماوس بعد التعود.
- كرر هذه العملية كل يوم ، مما يزيد من مدة تثبيت الماوس في القفص المنزلي بمقدار 15 دقيقة. استمر في هذه العملية حتى يمكن تثبيت الماوس في القفص المنزلي لمدة 1.5 ساعة لأن هذه هي المدة التقريبية لجلسة تصوير ثنائية الفوتون.
- لتعتاد الماوس على الضوضاء ، قم بإجراء بعض جلسات التعود على المجهر لتأقلم الماوس مع أصوات مرايا المسح الضوئي بالليزر. استبعاد الفئران التي تفشل في التعود بشكل كاف (أي الأصوات والتغوط الناجم عن الإجهاد).
8. التصوير متعدد الفوتونات
- ابدأ التصوير بعد 3 أسابيع من الجراحة للسماح بمسح النافذة.
- قم بإجراء التصوير على مجهر متعدد الفوتونات مخصص أو متاح تجاريا ومجهز بليزر Ti:Sapphire . احصل على صور باستخدام هدف الغمر بالماء ذي الفتحة العددية العالية (NA).
ملاحظة: يتم تحقيق التصوير ثنائي القناة باستخدام مرآة ثنائية اللون 565 نانومتر وأنبوبين خارجيين للمضاعف الضوئي. يتم استخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 535/50 للكشف عن انبعاث GCaMP6f ، ويتم استخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 610/75 للكشف عن tdTomato. تم استخدام هدف غمر الماء 25x (1.05 NA) والماسحات الضوئية الرنانة للحصول على الصور الموضحة في الشكل 1 والشكل 2. تتكون كل منطقة ذات أهمية من كومة من الصور مفصولة محوريا بمقدار 1 ميكرومتر. تم جمع كل قسم بصري بسرعة 512 × 512 بكسل ، 0.18 ميكرومتر / بكسل. تم الحصول على صور من منطقة الطرف الأمامي للقشرة الحركية الأولية على النحو الذي تحدده الإحداثيات المجسمة. - اضبط الطول الموجي لليزر على 920 نانومتر (990 نانومتر في حالة استخدام GECI ذي الانزياح الأحمر).
- ضع الماوس على قفص المنزل المتنقل ، وقم بتثبيت اللوحة الأمامية على ذراع تثبيت الرأس.
- أضف بضع قطرات من الماء إلى وسط النافذة.
- باستخدام وضع المجال الواسع للمجهر ، حدد 2-3 مواضع للأوعية الدموية التي يمكن التعرف عليها بسهولة. احفظ صور هذه الأوعية الدموية وسجل إحداثيات X و Y التي تظهر على وحدة التحكم الحركية لنقل التشعبات التي تحمل علامة tdTomato-labels لجلسات التصوير اللاحقة. اضبط إحداثيات X و Y في كل مرة لإعادة محاذاتها مع الصور المحفوظة للأوعية الدموية.
- بمجرد تصوير الأوعية الدموية وتسجيل مواقعها ، حدد المناطق التي تعبر فيها الخلايا العصبية عن tdTomato (الشكل 1). صورة للهياكل المتشابكة (التشعبات والمحاور العصبية) للخلايا العصبية ونشاط GCaMP6f في الخلايا النجمية.
ملاحظة: ستكون التشعبات بمثابة معالم للعودة بشكل موثوق إلى نفس المناطق وتصوير نفس التشعبات والخلايا النجمية على مدار أيام متكررة. لم يلاحظ أي تحول يمكن اكتشافه في مستوى التصوير مع تثبيت الرأس المستقر وبعد التعود على تثبيت الرأس. يتم تصحيح الإزاحة التي تحدث في الاتجاهين X و Y بالحركة. - بعد التصوير ، أعد الماوس إلى قفصه.
ملاحظة: عادة ما يتم الاحتفاظ بالفئران على النطاق لمدة أقصاها 2 ساعة. عندما يستمر التصوير لفترة طويلة ، قد يجف الماء تحت الهدف. يجب إضافة الماء أثناء التجارب. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام هلام الموجات فوق الصوتية بدلا من الماء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن تقييم جودة نافذة الجمجمة من خلال مدى وضوح الهياكل العصبية. في نافذة جيدة ، تكون الأشواك المتغصنة مرئية بوضوح (الشكل 1). مع تخزين البيانات الهيكلية والموضعية ، يمكن تصوير نفس الحيوان بشكل متكرر لأيام أو أسابيع أو أشهر لفحص نفس الخلايا (الشكل 1). تم الحصول على الصور الواردة في الشكل 1 من منطقة الطرف الأمامي للقشرة الحركية الأولية (في نافذة 5 مم). يمكن قياس مجموعة متنوعة من المعلمات ، بما في ذلك كثافة وديناميكيات العمود الفقري الشجيري والبوتونات المحورية لدراسة اللدونة المشبكية الهيكلية. يمكن دراسة نشاط الخلايا النجمية من خلال تحليل الديناميكيات الزمانية المكانية لإشارات الكالسيوم (الشكل 2). اعتمادا على قدرات المجهر (أي الماسحات الضوئية الرنانة ، ومحرك بيزو الذي يتحكم في الهدف) والسؤال التجريبي ، يمكن إجراء التصوير بالفاصل الزمني في مستوى بؤري واحد أو في حجم أو مناطق متعددة لمراقبة نشاط الكالسيوم بتردد الاكتساب المطلوب.
الشكل 1: التصوير المتكرر للتشعبات والخلايا النجمية على مدى أيام. يسمح التشعبات التي تعبر عن tdTomato (أرجواني) بتحديد الخلايا النجمية المعبرة عن GCaMP6f (الأبيض) وتصويرها المتكرر على مقربة منها. يظهر نشاط Ca2+ داخل الخلايا النجمية في نقاط زمنية مختلفة في أيام مختلفة. يمكن تصوير اللدونة الهيكلية المشبكية في وقت واحد. يتم تمييز اثنين من العمود الفقري الجديد الذي ظهر في اليوم 2 بالأسهم. بينما استمر أحد العمود الفقري وكان مرئيا في اليوم 5 (السهم الأزرق) ، تم القضاء على العمود الفقري الآخر (السهم الأخضر). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصوير إشارات الكالسيوم النجمية. صور تظهر نشاط Ca2+ من خلية نجمية تعبر عن GCaMP6f. تظهر اللوحات نشاط Ca2+ المسجل من حجم 4 ميكرومتر في نقاط زمنية مختلفة أثناء الاستحواذ. يمكن ملاحظة إشارات الكالسيوم في العمليات والمجالات الدقيقة خلال فترات الراحة. يمكن ملاحظة حدث عالمي يشمل الخلية بأكملها خلال نوبة الحركة في 188 ثانية. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، قدمنا بروتوكولا لزرع نوافذ الجمجمة المزمنة للتصوير في الجسم الحي للخلايا النجمية القشرية والخلايا العصبية في الفئران المستيقظة والمقيدة الرأس على قفص منزلي يتم رفعه جوا. تم تقديم أمثلة محددة لتطبيق نافذة الجمجمة لتصوير الخلايا النجمية التي تعبر عن GECIs والهياكل العصبية المتشابكة. باستخدام المجهر متعدد الفوتونات ، يمكن تسجيل ديناميكيات إشارات الكالسيوم النجمية والديناميكيات المشبكية الهيكلية بشكل متكرر على مدار أيام.
توفر نافذة الجمجمة المزمنة جودة تصوير بصري جيدة وتسمح بإجراء جلسات تصوير متعددة لنفس الهياكل العصبية والدبقية. كما يتيح هذا النهج إجراء الحقن الفيروسية داخل الجمجمة قبل تغطية بضع القحف بزجاج غطاء.
يجب أن يكون المستخدمون على دراية بعدد من القيود المتكبدة من خلال زرع نوافذ الجمجمة المزمنة. هناك حاجة إلى الخبرة والكثير من الممارسة لتحقيق نافذة عالية الجودة وضمان بقاء الحيوان. علاوة على ذلك ، فإن الجراحة غازية ويمكن أن تؤدي إلى استجابة التهابية. يشمل العلاج الدوائي أثناء الجراحة والتعافي بعد الجراحة الأدوية المضادة للالتهابات والمضادات الحيوية31. قد لا يكون استخدام الأدوية المضادة للالتهابات مناسبا في الدراسات التي تبحث في نماذج الالتهاب العصبي لأن هذه الأدوية قد تؤثر أيضا على الظاهرة قيد الدراسة.
في الآونة الأخيرة ، ثبت أن تكوين الأوعية اللمفاوية السحائية يحدث استجابة لزرع نافذة الجمجمة32. وبالتالي ، قد لا تكون نافذة الجمجمة المزمنة مقبولة للدراسات التي تبحث في الأوعية اللمفاوية السحائية. الأهم من ذلك ، أن فترة الانتظار لمدة 2-3 أسابيع بعد الجراحة ضرورية قبل تجارب التصوير31,33. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عمر الفئران ، وكذلك وقت التعافي بعد العملية ، يحد من القدرة على تصوير الأحداث التنموية المبكرة جدا. في حين يمكن زرع نوافذ الجمجمة في الفئران الأصغر سنا (P15-21)34 ، يجب النظر في الآثار الجانبية المحتملة ، مثل الالتهاب.
كبديل لنافذة الجمجمة المزمنة ، يمكن أيضا إجراء مستحضرات الجمجمة الرقيقة. تؤدي هذه الطريقة إلى ترقق الجمجمة فوق المنطقة ذات الأهمية قبل التصوير. نافذة الجمجمة الرقيقة أقل توغلا وتتغلب على الحاجة إلى إعطاء الأدوية المضادة للالتهابات ، مما يجعلها خيارا في الدراسات التي تحقق في نماذج الالتهاب العصبي والتفاعلات المناعية العصبية. ومع ذلك ، إذا رغبت في التصوير المتكرر ، يجب إعادة ترقق الجمجمة قبل التصوير ، ولا يمكن إعادة ترقق العظام إلا لعدد محدود من المرات قبل أن تتدهور جودة الصورة35.
على الرغم من وصف نسخة معدلة من طريقة الجمجمة الرقيقة المعززة التي لا تتطلب إعادة الترقق36 ، إلا أن سمك الجمجمة غير المنتظم قد يسبب انحرافات كروية ، مما يؤدي إلى تشويه هياكل الفلورسنت37. وبالتالي ، عندما يتم تسجيل القياسات الكمية ، مثل ديناميكيات إشارات الكالسيوم38 أو مستويات البروتينات المشبكية27 ، بدلا من تحديد الهياكل مثل العمود الفقري الشجيري ، توفر نافذة الجمجمة المزمنة إعدادا أكثر استقرارا بصريا وموثوقية. وهكذا ، بالنسبة للتصوير الطولي ، في الجسم الحي ، فإن إدخال نوافذ الجمجمة هو الطريقة المتفوقة لفحص التغييرات نتيجة للعلاج من تعاطي المخدرات39 ، والتدريب على نموذج سلوكي4،25 ، وإعادة تشكيل متشابك في الاضطرابات العصبية11،27.
الإجراء الموصوف يمثل تحديا تقنيا ويوفر حاجزا أمام الحصول على صور عالية الجودة. يجب توخي الحذر الشديد في كل خطوة لضمان بقاء النافذة خالية من العدوى ، وتجنب تلف الأنسجة الكامنة. ويشمل ذلك الكشط اللطيف للنسيج الضام على الجمجمة ، وأخذ فترات راحة كافية لتبريد العظام عند الحفر ، وضمان ترقق موحد لتسهيل إزالة العظام بسهولة ، ومنع تورم الدماغ ، والعناية القصوى بعدم إتلاف الأم الجافية أثناء الجراحة. فقط أفضل مستحضرات النوافذ تظل شفافة بصريا لفترات أطول من التصوير.
في حين يمكن تصوير التغيرات في الهياكل المشبكية في الفئران المخدرة على مدار أيام ، إلا أن هذا لا يفضل عند فحص إشارات الكالسيوم في الخلايا النجمية حيث ثبت أن التخدير يعطل إشارات الكالسيوم في الخلايا النجمية في الجسم الحي40. لإجراء التصوير في الجسم الحي في الفئران المستيقظة والمقيدة الرأس ، من الضروري تعويد الحيوان على ظروف التصوير في القفص المنزلي المتنقل ، أو جهاز المشي العائم الحر ، أو كرة الستايروفوم المرفوعة جوا ، أو أي جهاز آخر. لن يقلل التعود السليم من التوتر أثناء التصوير فحسب ، بل سيعمل أيضا على تقليل القطع الأثرية الحركية أثناء جلسات التصوير.
باختصار ، في الجسم الحي المجهري متعدد الفوتونات من خلال نافذة الجمجمة المزمنة هو أداة مفيدة لدراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية للخلايا في القشرة. باستخدام أصباغ الفلورسنت الخاصة بالخلايا والمراسلين ، من الممكن دراسة المورفولوجيا الخلوية والتفاعلات والنشاط. مع التصوير الطولي الذي تسمح به نوافذ الجمجمة المزمنة ، من الممكن فحص كيفية تغير الهياكل المشبكية وتطورها بمرور الوقت13,14. باستخدام البروتوكول المعروض هنا ، من الممكن فحص ديناميكيات إشارات الكالسيوم في الخلايا النجمية بسبب التحفيز الحسي23,38 ، أو الحركة أو الدهشة 6,41 ، أو المرض 15,42 ، أو غيرها من المعلمات ذات الأهمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
