Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

जागते चूहों में वीवो इमेजिंग में दोहराया के लिए एक कपाल खिड़की का आरोपण

Published: June 22, 2021 doi: 10.3791/62633
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurological Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

यहां प्रस्तुत किया गया है जागते हुए, सिर-संयमित चूहों में मस्तिष्क कोशिकाओं के अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए एक पुरानी कपाल खिड़की के आरोपण के लिए एक प्रोटोकॉल है।

Abstract

जानवरों के व्यवहार में न्यूरॉन्स और ग्लिया के सेलुलर फिजियोलॉजी को पूरी तरह से समझने के लिए, उनकी आकृति विज्ञान की कल्पना करना और चूहों के व्यवहार में विवो में उनकी गतिविधि को रिकॉर्ड करना आवश्यक है। यह पेपर जागने, सिर-संयमित चूहों में मस्तिष्क कोशिकाओं के अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए एक पुरानी कपाल खिड़की के आरोपण के लिए एक विधि का वर्णन करता है। आनुवांशिक रणनीतियों और वायरल इंजेक्शन के साथ संयोजन में, संरचनात्मक या शारीरिक मार्करों के साथ विशिष्ट कोशिकाओं और रुचि के क्षेत्रों को लेबल करना संभव है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एक कपाल खिड़की के माध्यम से दोनों कोशिकाओं की एक साथ इमेजिंग के लिए कॉर्टेक्स में GCaMP6-व्यक्त एस्ट्रोसाइट्स के आसपास के क्षेत्र में न्यूरॉन्स को लेबल करने के लिए वायरल इंजेक्शन को कैसे संयोजित किया जाए। एक ही कोशिकाओं की मल्टीफोटॉन इमेजिंग को जागने, जानवरों के व्यवहार में दिनों, हफ्तों या महीनों के लिए किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को वास्तविक समय में सेलुलर गतिशीलता को देखने के लिए एक विधि प्रदान करता है और तंत्रिका विज्ञान में कई सवालों के जवाब देने के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

चूहों के प्रांतस्था में विवो मल्टीफोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में प्रदर्शन करने की क्षमता सेलुलर सिग्नलिंग और संरचना 1,2,3,4,5,6,7,8,9, रोग विकृति 10,11, और सेलुलर विकास 12,13 के अध्ययन के लिए सर्वोपरि है . क्रोनिक कपाल खिड़कियों के आरोपण के साथ, अनुदैर्ध्य इमेजिंग संभव है, जो जीवित जानवरों में दिनों, हफ्तों या महीनोंके लिए कॉर्टिकल क्षेत्रों की बार-बार इमेजिंग की अनुमति देता है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी विवो में के लिए आदर्श है, बेहतर गहराई की जांच के कारण बार-बार इमेजिंग और उपयोग किए जाने वाले अवरक्त लेजर से जुड़े कम फोटोडैमेज। यह विभिन्न कॉर्टिकल क्षेत्रों में विशिष्ट कोशिकाओं के आणविक और सेलुलर गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देता है।

मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग चूहों में न्यूरोनल और ग्लियाल कोशिकाओं के विवो इमेजिंग में15,16,17,18,19,20 के लिए किया गया है। विशेष सेल प्रकारों और रुचि के क्षेत्रों को लेबल करने के लिए विभिन्न रणनीतियों को लागू किया जा सकता है। एक आम दृष्टिकोण क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करके एक सेल-विशिष्ट तरीके से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को चलाना है। यह आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के साथ किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, tdTomato "floxed" माउस (Ai14) को पार करना एक माउस के साथ ब्याज21 के प्रमोटर के तहत क्रे-रिकॉम्बिनेज को व्यक्त करता है। वैकल्पिक रूप से, सेल- और साइट-विशिष्ट लेबलिंग को वायरल इंजेक्शन के साथ प्राप्त किया जा सकता है। यहां, एक वायरस एन्कोडिंग क्रे रीकॉम्बिनेज एक सेल-विशिष्ट प्रोमोटर के तहत और एक वायरस एन्कोडिंग ब्याज के एक floxed जीन को एक परिभाषित क्षेत्र में इंजेक्ट किया जाता है। दोनों वायरल वैक्टर प्राप्त करने वाले उपयुक्त सेल प्रकार तब वांछित जीन (ओं) को व्यक्त करेंगे। ये जीन संरचनात्मक मार्कर हो सकते हैं, जैसे कि टीडीटोमेटो, सेलुलर आकृति विज्ञान22 या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों (जीईसीआई) में परिवर्तन को देखने के लिए, जैसे कि जीसीएएमपी और / या आरसीएएमपी, कैल्शियम गतिशीलता23 की जांच करने के लिए। आनुवांशिक पुनर्संयोजन के तरीकों को व्यक्तिगत रूप से या एक या अधिक सेल प्रकारों को लेबल करने के लिए संयोजन में लागू किया जा सकता है। एक तीसरा दृष्टिकोण, ट्रांसजेनिक चूहों या वायरल निर्माणों (जिसमें सीमित पैकेजिंग क्षमता है) की आवश्यकता नहीं है, डीएनए निर्माणों के गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में है। इलेक्ट्रोपोरेशन के समय के आधार पर, विभिन्न सेलप्रकारों को 25,26,27 लक्षित किया जा सकता है।

मल्टीफोटॉन इमेजिंग करते समय, चूहों को जागते समय या एनेस्थेटिक करते समय चित्रित किया जा सकता है। जागृत चूहों की इमेजिंग एक संलग्न सिर प्लेट28 के माध्यम से माउस को सुरक्षित करके की जा सकती है। इस दृष्टिकोण को तरीकों का उपयोग करके जानवर के अपेक्षाकृत मुक्त आंदोलन की अनुमति देकर कम तनावपूर्ण बनाया जाता है, जैसे कि फ्री-फ्लोटिंग, एयर-समर्थित स्टायरोफोम बॉल्स29, फ्री-फ्लोटिंगट्रेडमिल्स 1, या एक एयर-लिफ्टेड होम केज सिस्टम जहां चूहों को एक संलग्न हेड प्लेट द्वारा बांधा जाता है और एक खुले कक्ष30 में स्थानांतरित करने की अनुमति दी जाती है। इन इमेजिंग स्थितियों में से प्रत्येक के लिए, पहले इमेजिंग सेटअप के लिए चूहों को आदत डालना आवश्यक होगा। यह पेपर हवा से उठाए गए घर के पिंजरे की प्रणाली का उपयोग करके आदत और इमेजिंग प्रक्रिया का वर्णन करता है।

यह प्रोटोकॉल कॉर्टेक्स में विवो इमेजिंग में अनुदैर्ध्य के लिए एक पुरानी कपाल खिड़की के आरोपण का वर्णन करता है। यहां, हम चूहों का उपयोग करेंगे जो कैल्शियम सिग्नलिंग गतिशीलता की निगरानी करने के लिए एस्ट्रोसाइट्स में GCaMP6f को सशर्त रूप से व्यक्त करते हैं। इसके अलावा, यह पेपर न्यूरॉन्स के लिए एक लेबल के रूप में टीडीटोमेटो का उपयोग करके वायरल इंजेक्शन के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है। यह न्यूरोनल सिनैप्टिक संरचना में परिवर्तन और / या एक संरचनात्मक मार्कर के रूप में उपलब्धता के निर्धारण की अनुमति देता है जो एक ही एस्ट्रोसाइट की बार-बार इमेजिंग को सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल के दौरान, मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी से प्राप्त छवियों की सर्वोत्तम संभव गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डाला जाएगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों को नेब्रास्का मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय में आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।

1. सर्जरी से पहले

  1. वायरल इंजेक्शन के लिए पिपेट्स तैयार करें। एक पिपेट खींचने का उपयोग करके बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं को खींचें और 20 ° कोण पर पिपेट को बेवेल करें। रात भर पिपेट्स को निष्फल करें।
  2. बाँझ जेल फोम के ताजा टुकड़े उन्हें छोटे वर्गों में काटकर तैयार करें। जेल फोम को एक बाँझ माइक्रोफ्यूज ट्यूब में डुबोएं जिसमें 0.5 मिलीलीटर खारा होता है। उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए खारा में जेल फोम भिगोएं।
  3. स्पंज स्ट्रिप्स के ताजे टुकड़े पतली स्ट्रिप्स में काटकर तैयार करें।
  4. सर्जरी से बीस मिनट पहले, मस्तिष्क की सूजन को रोकने के लिए 4-6-सप्ताह पुराने GLAST-CreER / GCaMP6f चूहों को 0.2 मिलीग्राम / किग्रा डेक्सामेथासोन के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें और सूजन को कम करने के लिए 5 मिलीग्राम / किलोग्राम कार्प्रोफेन।
    नोट: एस्ट्रोसाइट्स के लगभग 40% में GCaMP6f के पुनर्संयोजन और अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, GLAST-CreER / GCaMP6f चूहों को लगातार 5 दिनों के लिए 3 सप्ताह में 100 मिलीग्राम / किलोग्राम टैमोक्सीफेन के साथ इंजेक्ट किया गया था।

2. सर्जरी की शुरुआत

  1. 20 मिनट के बाद, लगभग 1.5 मिनट के लिए 1 एल / मिनट की प्रवाह दर पर ऑक्सीजन के साथ 3% आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटिकाइज़ करें।
  2. एक बार anesthetized, माउस को एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर रखें जो सर्जरी के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए पानी के पुन: परिसंचारी कंबल पर बैठता है। थूथन क्लैंप और कान सलाखों का उपयोग कर फ्रेम के लिए माउस को सुरक्षित करें। सुनिश्चित करें कि थूथन क्लैंप और कान की सलाखों पर्याप्त रूप से स्थिर हैं कि प्रक्रिया के दौरान सिर नहीं चलेगा, लेकिन इतना तंग नहीं है कि खोपड़ी क्षतिग्रस्त हो जाए।
  3. 1-2 एल / मिनट की प्रवाह दर पर ऑक्सीजन के साथ 1-1.5% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें। ध्यान दें कि कुछ जानवरों को बेहोश करने की क्रिया को बनाए रखने के लिए कम या ज्यादा आइसोफ्लुरेन की आवश्यकता हो सकती है। जानवर की साँस लेने के साथ-साथ पैर की अंगुली और पूंछ के लिए इसकी सजगता की निगरानी करें, और आइसोफ्लुरेन को उचित रूप से समायोजित करें।
  4. प्रक्रिया के दौरान आंखों को सूखने से रोकने के लिए एक कपास टिप एप्लिकेटर का उपयोग करके प्रत्येक आंख पर आंख मरहम लागू करें।
  5. कृंतक ट्रिमर्स का उपयोग करके, गर्दन से बालों को सिर्फ आंखों के पीछे शेव करें। यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरतें कि जानवर की मूंछें गलती से छंटनी नहीं की जाती हैं।
  6. एक आयोडीन प्रेप पैड के साथ मुंडा क्षेत्र को साफ करें, इसके बाद एक अल्कोहल प्रेप पैड।
  7. बाँझ ऊतक संदंश और सर्जिकल कैंची का उपयोग करते हुए, काटें और ललाट टांके पूर्वकाल से त्वचा को ब्रैग्मा तक लेम्ब्डा के पीछे सभी तरह से हटा दें।
  8. एक बार त्वचा को हटा दिए जाने के बाद, खोपड़ी के रक्तस्राव को कम करने के लिए खोपड़ी में लगभग 0.1 मिलीलीटर 1% xylocaine (एपिनेफ्रीन 1: 200,000 के साथ लिडोकेन) जोड़ें।
  9. एक बाँझ आकार का उपयोग करके 11 कार्बन स्टील सर्जिकल ब्लेड एक हैंडल से जुड़ा हुआ है, धीरे से खोपड़ी से संयोजी ऊतक को खरोंच। खोपड़ी के किनारे के पास संयोजी ऊतक को हटाते समय अतिरिक्त देखभाल करें, क्योंकि कोई भी शेष ऊतक बाद में कांच या हेड प्लेट के मजबूत आसंजन को रोक सकता है।
  10. खोपड़ी से ढीले संयोजी ऊतक को हटाने के लिए बाँझ ऊतक संदंश का उपयोग करें।
  11. बाँझ कपास टिप applicators का उपयोग कर, खोपड़ी से किसी भी शेष xylocaine बंद साफ.
  12. एक बार पूरा हो जाने के बाद, एसीटोन में डूबे हुए एक बाँझ कपास टिप एप्लिकेटर का उपयोग करके खोपड़ी को अच्छी तरह से डीग्रीज़ करें। खोपड़ी को तुरंत उड़ाने-सुखाने के लिए संपीड़ित हवा का उपयोग करें।

3. क्रैनियोटॉमी

  1. एक ठीक-बिंदु मार्कर और एक शासक का उपयोग करके, वांछित स्थान पर उद्घाटन के लिए उपयुक्त आकार को मापें। कवर ग्लास (व्यास में 3 या 5 मिमी) के आकार की तुलना करके उद्घाटन के आकार की पुष्टि करें; सुनिश्चित करें कि उद्घाटन कवर ग्लास के आकार से थोड़ा छोटा है।
  2. एक दंत ड्रिल का उपयोग करके, धीरे-धीरे उद्घाटन की रूपरेखा का पता लगाएं, हड्डी को पतला करें। हड्डी के माध्यम से ड्रिलिंग को रोकने के लिए धीरे-धीरे ड्रिल करें, और हड्डी को पतला करने की सुविधा के लिए संकेंद्रित हलकों में ड्रिल करें।
  3. प्रत्येक संकेंद्रित पास के बाद, ड्रिल किए गए क्षेत्र में बाँझ खारा की एक बूंद या दो जोड़ें। हड्डी को ओवरहीटिंग और अंतर्निहित ड्यूरा को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए खारा को कम से कम 10 सेकंड तक बैठने की अनुमति दें।
  4. किसी भी शेष खारा अवशोषित करने के लिए एक बाँझ कपास टिप applicator का उपयोग करें। क्षेत्र पर संपीड़ित हवा को उड़ाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ड्रिलिंग को फिर से शुरू करने से पहले सभी शेष लवण वाष्पित हो गए हैं। अस्थि मलबे को उड़ाने के लिए ऐसा करें जो शेष रहता है।
  5. चरण 3.2-3.4 को दोहराएं जब तक कि हड्डी को हटाने के लिए पर्याप्त रूप से पतला न किया जाए।
  6. सुनिश्चित करें कि हड्डी को हटाने के लिए पर्याप्त रूप से पतला किया जाता है, धीरे से ठीक संदंश के साथ हड्डी के केंद्रीय क्षेत्र पर धक्का देकर यह जांचने के लिए कि पतली खोपड़ी चलती है। अंतर्निहित वास्कुलचर दिखाई देना चाहिए जहां ड्रिलिंग हुई थी। ध्यान दें कि हड्डी दिखाई दे सकती है जैसे कि यह दरार हो जाएगी जहां पतला हुआ था।
    नोट: इस स्तर पर प्रशिक्षण यह पहचानने के लिए महत्वपूर्ण है कि हड्डी को उचित रूप से पतला किया गया है।
  7. हड्डी को हटाने का प्रयास करने से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए माउस की जांच करें कि यह पूरी तरह से बेहोश है। यदि नहीं, तो हड्डी को हटाते समय मस्तिष्क की सूजन को रोकने के लिए धीरे-धीरे आइसोफ्लुरेन रखरखाव बढ़ाएं।
  8. पतली खोपड़ी के लिए खारा में संतृप्त जेल फोम का एक छोटा सा टुकड़ा जोड़ें। पतली खोपड़ी में खारा की एक या दो अतिरिक्त बूँदें जोड़ें।
    नोट: पतली खोपड़ी पर बहुत सारे खारा होने से रक्तस्राव को कम करने और हड्डी के फ्लैप को हटाते समय ड्यूरा की रक्षा करने में मदद मिलती है।
  9. एक लघु 15 ° नुकीले ब्लेड का उपयोग करते हुए, ब्लेड को बारीक हड्डी में सावधानीपूर्वक डालें और पतली हड्डी के साथ काटें। जेल फोम को खारा में भिगोकर रखें, किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए तैयार रहें जो हो सकता है।
  10. संदंश का उपयोग करके, सावधानी से उठाएं और हड्डी को हटा दें। अंतर्निहित ऊतक और वास्कुलचर को नुकसान से बचने के लिए जितना संभव हो उतना कोमल रहें। अत्यधिक ध्यान रखें कि ड्यूरा मेटर को नुकसान न पहुंचे।
  11. एक बार हड्डी फ्लैप को हटा दिया जाता है, तो कॉर्टेक्स में खारा में संतृप्त जेल फोम का एक ताजा टुकड़ा जोड़ें। जेल फोम को सूखने से रोकने के लिए खारा की कुछ बूंदें जोड़ें, क्योंकि इससे अंतर्निहित ऊतक को नुकसान होगा।

4. वायरल इंजेक्शन

  1. एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण का उपयोग करके वायरल इंजेक्शन निष्पादित करें।
    1. AAV1 तैयार करें। CaMKII.0.4.Cre (3 × 1013 जीनोम प्रतियां (जीसी)/ एमएल) का टिटर 1:5,000 पर खारा में सीरियल dilutions द्वारा।
    2. AAV1 का मिश्रण तैयार करें। CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) और AAV1. सीएजी। FLEX.tdTomato (5 × 1012 GC / mL का टिटर) पैराफिल्म के एक छोटे से टुकड़े पर।
    3. धीरे से समाधान पर पिपेट रखकर वायरस मिश्रण के साथ 20 μm की एक टिप आकार के साथ एक बाँझ beveled ग्लास पिपेट भरें।
    4. पिपेट को कम करें ताकि यह सिर्फ मस्तिष्क की सतह को छू सके और एल 2 /3 इंजेक्शन के लिए अतिरिक्त 200-300 μm के लिए कम करना जारी रखे। एक इंट्रासेल्युलर माइक्रोइंजेक्शन डिस्पेंस सिस्टम का उपयोग करना ( सामग्री की तालिका देखें), 2 मिनट (20 साई, 9 एमएस पल्स अवधि) से अधिक 12-15 बार दबाव-इंजेक्ट करें। प्रत्येक इंजेक्शन के साथ पिपेट ड्रॉप में मेनिस्कस का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पिपेट अवरुद्ध नहीं है।
    5. एक बार इंजेक्शन लगाने के बाद, बैकफ्लो को रोकने के लिए 4-5 मिनट के लिए मस्तिष्क में पिपेट छोड़ दें। धीरे-धीरे पिपेट को वापस ले लें।
    6. 2-3 साइटों पर इंजेक्शन को दोहराएं (लगभग 500 μm अलग)।
    7. 10% ब्लीच में क्रे वायरस के सीरियल dilutions के लिए इस्तेमाल किया ग्लास पिपेट्स, parafilm, पिपेट युक्तियाँ, और microfuge ट्यूबों का उपयोग किया त्यागें।

5. कपाल खिड़की का आरोपण

  1. किसी भी जेल फोम को हटा दें, और किसी भी शेष खारा को सोखने के लिए स्पंज स्ट्रिप्स की एक छोटी सी पट्टी का उपयोग करें।
  2. उद्घाटन के लिए एंटीबायोटिक एनरोफ्लोक्सासिन (22.7 μg / mL) की कुछ बूँदें जोड़ें और इसे 1 मिनट के लिए वहां रहने की अनुमति दें। 1 मिनट के बाद, किसी भी शेष एनरोफ्लोक्सासिन को अवशोषित करने के लिए स्पंज स्ट्रिप के एक ताजा टुकड़े का उपयोग करें। इस प्रक्रिया को दो बार और दोहराएं।
  3. तीसरे धोने के बाद, उद्घाटन में खारा की कुछ बूँदें जोड़ें और इसे 1 मिनट के लिए वहां रहने की अनुमति दें। 1 मिनट के बाद, किसी भी शेष खारा को अवशोषित करने के लिए स्पंज पट्टी के एक ताजा टुकड़े का उपयोग करें। इस धोने की प्रक्रिया को दो बार और दोहराएं और तीसरे धोने के बाद, उद्घाटन में खारा की एक छोटी बूंद जोड़ें।
  4. कवर ग्लास को उद्घाटन के ऊपर रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए संदंश का उपयोग करें कि कांच अच्छी गुणवत्ता की छवियों को प्राप्त करने के लिए उद्घाटन पर फ्लश है।
  5. जबकि धीरे से जगह में कांच को पकड़े हुए, खोपड़ी के लिए खिड़की के किनारों को सील करने के लिए कांच की परिधि के चारों ओर cyanoacrylate चिपकने वाला जेल (सामग्री की तालिका) लागू करें। सुनिश्चित करें कि कवर ग्लास के नीचे गोंद को रिसने न दें, और जितना संभव हो सके कवर ग्लास की सतह से उतना गोंद रखें।
  6. चिपकने वाले जेल पर सुपर गोंद की एक परत लागू करें। गोंद पर दंत सीमेंट तरल की एक परत जोड़ें ताकि यह कठोर हो सके।
  7. एक उचित आकार के हेलीकाप्टर-प्रकार की हेड प्लेट लें और केंद्रीय उद्घाटन के चारों ओर गोंद की एक पतली परत लागू करें। कवर ग्लास पर हेड प्लेट रखें, और गोंद को संक्षेप में सूखने दें।
  8. एक 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में, ट्यूब पर 0.1 मिलीलीटर निशान में दंत सीमेंट पाउडर जोड़ें। तेजी से इलाज, तत्काल चिपकने वाला, और मिश्रण की 7-8 बूँदें जोड़ें। एक 19 जी सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज में ड्रा करें जिसे एक बड़ा उद्घाटन बनाने के लिए काटा गया है।
  9. हेलीकाप्टर बार के पार्श्व छेद के माध्यम से मिश्रण इंजेक्ट करें जब तक कि यह दोनों तरफ से रिस न जाए। खोपड़ी के लिए हेडप्लेट को बांधने के लिए उजागर खोपड़ी के बाकी हिस्सों में दंत सीमेंट / चिपकने वाला मिश्रण लागू करें, जो इमेजिंग के दौरान आंदोलन कलाकृतियों को कम करेगा।
  10. मिश्रण को कम से कम 15 मिनट के लिए हवा से सूखने दें।
  11. वसूली में सहायता करने के लिए खारा चमड़े के नीचे के 0.5 मिलीलीटर के साथ माउस इंजेक्ट करें।

6. पोस्ट ऑपरेशन

  1. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से माउस को निकालें और इसे अपने पिंजरे में वापस कर दें।
  2. वसूली के साथ सहायता करने के लिए एक पानी फिर से परिसंचारी कंबल, अंतरिक्ष जेल हीटिंग पैड या समतापीय पैड पर पिंजरे के एक हिस्से को रखें।
  3. जानवर को उनके नियमित आहार के अलावा, भोजन के छर्रों और गीले भोजन की एक छोटी सी मदद प्रदान करें, वसूली में आगे सहायता करने के लिए। वसूली की अवधि के लिए सर्जरी के बाद प्रत्येक दिन नए भोजन गोली और गीला भोजन जोड़ें।
  4. सर्जरी के अगले दिन, 5 मिलीग्राम / किलोग्राम कार्प्रोफेन और 5 मिलीग्राम / किलोग्राम एनरोफ्लोक्सासिन के साथ एक बार चूहों को इंजेक्ट करें।
  5. दिन 2-6 पर, चूहों को 5 मिलीग्राम / किलोग्राम कार्प्रोफेन के साथ एक बार और दो बार 5 मिलीग्राम / किलोग्राम एनरोफ्लोक्सासिन के साथ इंजेक्ट करें, स्थानीय आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदन लंबित है। एनरोफ्लोक्सासिन इंजेक्शन को कम से कम 8 घंटे से अलग करें।
  6. 7-20 दिनों में, चूहों को 5 मिलीग्राम / किलोग्राम कार्प्रोफेन के साथ दैनिक रूप से इंजेक्ट करें।

7. इमेजिंग के लिए पशु habituation

  1. सर्जरी के बाद 14 वें दिन, ऑप्टिकल स्पष्टता के लिए कपाल खिड़की की जांच करें। अस्पष्ट या अन्यथा क्षतिग्रस्त खिड़कियों (यानी, अत्यधिक एंजियोजेनेसिस) के साथ चूहों का उपयोग न करें।
  2. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत tdTomato अभिव्यक्ति के लिए जाँच करें। यदि लेबल की गई कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है, तो जानवरों की आदत के साथ आगे बढ़ें।
  3. Habituation का पहला दिन (हैंडलिंग)
    1. माउस को कुछ मिनटों के लिए पकड़ो और इसे संभालने के बाद अपने पिंजरे में वापस कर दें। सत्रों के बीच 15 मिनट के अंतराल के साथ हैंडलिंग को तीन बार दोहराएं।
    2. तीसरे परीक्षण के बाद, जानवर को कपड़े के एक छोटे से टुकड़े में लपेटकर माउस की आदत डालें।
    3. लगभग 1 मिनट के लिए कपड़े में लिपटे माउस को पकड़ो।
    4. परीक्षण के बाद, माउस को उसके पिंजरे में वापस कर दें। इस प्रक्रिया को दो बार और दोहराएं, प्रत्येक परीक्षण के बीच 15 मिनट के अंतराल की अनुमति दें।
  4. Habituation का दूसरा दिन
    1. वजन और माउस वजन रिकॉर्ड.
    2. माउस को कपड़े में लपेटें, और इसे अपने सिर की प्लेट के माध्यम से हवा से उठाए गए घर के पिंजरे के सिर निर्धारण हाथ में सुरक्षित करें।
    3. घर के पिंजरे को प्रकाश के संपर्क में छोड़ दें।
    4. माउस को 15 मिनट के लिए मोबाइल होम पिंजरे में सुरक्षित रहने की अनुमति दें।
    5. habituation के बाद, घर के पिंजरे से माउस को हटा दें और एयरफ्लो को बंद कर दें।
    6. माउस को तौलें और इसे अपने पिंजरे में वापस कर दें। केवल उन चूहों को शामिल करने का ध्यान रखें जो अपने शरीर के वजन का 10% से अधिक नहीं खोते हैं। उन चूहों को बाहर करें जो इमेजिंग प्रयोगों से आदत के किसी भी दिन के दौरान अपने वजन का 10% से अधिक खो देते हैं।
  5. Habituation और परे के तीसरे दिन
    1. वजन और हवा से उठाया घर पिंजरे के लिए इसे सुरक्षित करने से पहले माउस वजन रिकॉर्ड.
    2. हवा उठाया घर पिंजरे के लिए माउस को सुरक्षित.
    3. घर के पिंजरे को कुछ के साथ कवर करें जो एक अंधेरे इंटीरियर प्रदान करेगा, जैसे कि एक बॉक्स, और माउस को 30 मिनट के लिए सुरक्षित रहने की अनुमति दें।
    4. 30 मिनट के बाद, घर के पिंजरे को उजागर करें, माउस को हटा दें, और हवा के प्रवाह को बंद कर दें।
    5. habituation के बाद माउस वजन वजन और रिकॉर्ड.
    6. इस प्रक्रिया को हर दिन दोहराएं, जिससे माउस को 15 मिनट तक घर के पिंजरे में सुरक्षित करने की अवधि बढ़ जाती है। इस प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक कि माउस को 1.5 घंटे के लिए घर के पिंजरे में सुरक्षित नहीं किया जा सकता है क्योंकि यह दो-फोटॉन इमेजिंग सत्र की अनुमानित अवधि है।
    7. माउस को शोर करने के लिए आदत डालने के लिए, लेजर स्कैनिंग दर्पणों की ध्वनियों के लिए माउस को अनुकूलित करने के लिए माइक्रोस्कोप पर कुछ आदत सत्र करें। उन चूहों को बाहर करें जो पर्याप्त रूप से आदत डालने में विफल रहते हैं (यानी, vocalizations और तनाव-प्रेरित शौच)।

8. मल्टीफोटॉन इमेजिंग

  1. खिड़की को साफ करने की अनुमति देने के लिए सर्जरी के बाद 3 सप्ताह की इमेजिंग शुरू करें।
  2. एक कस्टम-निर्मित या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग करें जो एक Ti: नीलम लेजर से सुसज्जित है। एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करें।
    नोट: दो चैनल इमेजिंग एक 565 एनएम dichroic दर्पण और दो बाहरी photomultiplier ट्यूब का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। GCaMP6f उत्सर्जन का पता लगाने के लिए एक 535/50 बैंडपास फ़िल्टर का उपयोग किया जाता है, और tdTomato का पता लगाने के लिए 610/75 बैंडपास फ़िल्टर का उपयोग किया जाता है। एक 25x जल विसर्जन उद्देश्य (1.05 एनए) और अनुनादी स्कैनर का उपयोग चित्र 1 और चित्र 2 में दिखाई गई छवियों को प्राप्त करने के लिए किया गया था। ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र में 1 μm द्वारा अक्षीय रूप से अलग छवियों का एक ढेर शामिल था। प्रत्येक ऑप्टिकल अनुभाग को 512 x 512 पिक्सेल, 0.18 μm / पिक्सेल पर एकत्र किया गया था। छवियों को प्राथमिक मोटर कॉर्टेक्स के अग्रभाग क्षेत्र से प्राप्त किया गया था जैसा कि स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक द्वारा निर्धारित किया गया था।
  3. लेजर की तरंग दैर्ध्य को 920 एनएम पर सेट करें (990 एनएम यदि एक लाल-स्थानांतरित जीईसीआई का उपयोग किया जाता है)।
  4. मोबाइल घर पिंजरे पर माउस रखें, और सिर निर्धारण हाथ के लिए हेडप्लेट क्लैंप।
  5. खिड़की के केंद्र में पानी की कुछ बूँदें जोड़ें।
  6. माइक्रोस्कोप के वाइड-फील्ड मोड का उपयोग करते हुए, आसानी से पहचाने जाने योग्य वास्कुलचर के 2-3 पदों का चयन करें। इन रक्त वाहिकाओं की छवियों को सहेजें और बाद के इमेजिंग सत्रों के लिए tdTomato-लेबल डेंड्राइट्स को स्थानांतरित करने के लिए मोटर नियंत्रक पर दिखाई देने वाले एक्स- और वाई-निर्देशांक रिकॉर्ड करें। रक्त वाहिकाओं की सहेजी गई छवियों के साथ पुन: संरेखित करने के लिए हर बार एक्स- और वाई-निर्देशांक को समायोजित करें।
  7. एक बार जब वास्कुलचर को चित्रित किया गया है और पदों को दर्ज किया गया है, तो टीडीटोमेटो (चित्रा 1) को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स के साथ क्षेत्रों का पता लगाएं। एस्ट्रोसाइट्स में न्यूरॉन्स और GCaMP6f गतिविधि के सिनैप्टिक संरचनाओं (डेंड्राइट्स और अक्षतंतुओं) की छवि।
    नोट: डेंड्राइट्स मज़बूती से एक ही क्षेत्रों में लौटने के लिए स्थलों के रूप में काम करेंगे और दोहराए गए दिनों में एक ही डेंड्राइट्स और एस्ट्रोसाइट्स की छवि बनाएंगे। इमेजिंग विमान में कोई पता लगाने योग्य बदलाव स्थिर सिर निर्धारण के साथ और सिर निर्धारण के लिए habituation के बाद देखा गया था। X और Y दिशाओं में होने वाला विस्थापन गति-सही है।
  8. इमेजिंग के बाद, माउस को उसके पिंजरे में वापस कर दें।
    नोट: चूहों को आमतौर पर अधिकतम 2 घंटे के लिए गुंजाइश पर रखा जाता है। जब इमेजिंग लंबे समय तक चलती है, तो उद्देश्य के तहत पानी सूख सकता है। प्रयोगों के दौरान पानी मिलाया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, पानी के बजाय एक अल्ट्रासोनिक जेल का उपयोग किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

कपाल खिड़की की गुणवत्ता का आकलन इस बात से किया जा सकता है कि न्यूरोनल संरचनाएं कितनी कुरकुरा दिखाई देती हैं। एक अच्छी खिड़की में, डेंड्राइटिक स्पाइन स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं (चित्रा 1)। संग्रहीत संरचनात्मक और स्थितिगत डेटा के साथ, एक ही जानवर को एक ही कोशिकाओं की जांच करने के लिए दिनों, हफ्तों या महीनों के लिए बार-बार चित्रित किया जा सकता है (चित्रा 1)। चित्रा 1 में छवियों को प्राथमिक मोटर कॉर्टेक्स (5 मिमी विंडो में) के अग्रभाग क्षेत्र से प्राप्त किया गया था। विभिन्न प्रकार के मापदंडों को मापा जा सकता है, जिसमें घनत्व और डेंड्राइटिक स्पाइन की गतिशीलता और संरचनात्मक सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए चेताक्षीय बाउटन शामिल हैं। एस्ट्रोसाइटिक गतिविधि का अध्ययन कैल्शियम सिग्नलिंग (चित्रा 2) के स्पैटिओटेम्पोरल गतिशीलता का विश्लेषण करके किया जा सकता है। माइक्रोस्कोप क्षमताओं (यानी, अनुनादी स्कैनर, पीजो मोटर उद्देश्य को नियंत्रित करने) और प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर, समय-चूक इमेजिंग को वांछित अधिग्रहण आवृत्ति पर कैल्शियम गतिविधि की निगरानी करने के लिए एकल फोकल प्लेन या वॉल्यूम या मल्टीरीजन में किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: दिनों में डेंड्राइट्स और एस्ट्रोसाइट्स की बार-बार इमेजिंग। TdTomato (मैजेंटा) को व्यक्त करने वाला एक डेंड्राइट GCaMP6f-अभिव्यक्त एस्ट्रोसाइट्स (सफेद) की पहचान और दोहराए गए इमेजिंग को निकटता में अनुमति देता है। एस्ट्रोसाइट्स के भीतर सीए2 + गतिविधि को अलग-अलग दिनों में अलग-अलग समय बिंदुओं पर दिखाया गया है। सिनैप्टिक संरचनात्मक प्लास्टिसिटी को समवर्ती रूप से चित्रित किया जा सकता है। दिन 2 पर दिखाई देने वाले दो नए स्पाइन को तीरों के साथ चिह्नित किया गया है। जबकि एक रीढ़ की हड्डी बनी रही और दिन 5 (नीले तीर) पर दिखाई दे रही थी, दूसरी रीढ़ को समाप्त कर दिया गया था (हरा तीर)। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम सिग्नलिंग की इमेजिंग। GCaMP6f को व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट से Ca2+ गतिविधि को दर्शाने वाली छवियां। पैनलों Ca2 + गतिविधि अधिग्रहण के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर एक 4 μm मात्रा से दर्ज की गई है। प्रक्रियाओं और माइक्रोडोमेन में कैल्शियम सिग्नलिंग को आराम की अवधि के दौरान देखा जा सकता है। पूरे सेल को शामिल करने वाली एक वैश्विक घटना को 188 सेकंड में लोकोमोशन बाउट के दौरान देखा जा सकता है। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां, हमने क्रोनिक कपाल खिड़कियों के आरोपण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है, जो जागने में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के विवो इमेजिंग में, हवा से उठाए गए घर के पिंजरे पर सिर-संयमित चूहों के लिए है। इमेजिंग एस्ट्रोसाइट्स के लिए कपाल विंडो एप्लिकेशन के विशिष्ट उदाहरण प्रदान किए गए हैं जो जीईसीआई और न्यूरोनल सिनैप्टिक संरचनाओं को व्यक्त करते हैं। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ, एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम सिग्नलिंग गतिशीलता और संरचनात्मक सिनैप्टिक गतिशीलता को दिनों में बार-बार रिकॉर्ड किया जा सकता है।

एक पुरानी कपाल खिड़की अच्छी ऑप्टिकल इमेजिंग गुणवत्ता प्रदान करती है और एक ही न्यूरोनल और ग्लियाल संरचनाओं के प्रदर्शन के लिए कई इमेजिंग सत्रों की अनुमति देती है। यह दृष्टिकोण एक कवर ग्लास के साथ क्रैनियोटॉमी को कवर करने से पहले इंट्राक्रैनियल वायरल इंजेक्शन करना भी संभव बनाता है।
उपयोगकर्ताओं को क्रोनिक कपाल खिड़कियों के आरोपण के माध्यम से कई सीमाओं के बारे में पता होना चाहिए। एक उच्च गुणवत्ता वाली खिड़की प्राप्त करने और जानवरों के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए अनुभव और बहुत अभ्यास की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सर्जरी आक्रामक है और इसके परिणामस्वरूप एक भड़काऊ प्रतिक्रिया हो सकती है। सर्जरी के दौरान औषधीय उपचार और शल्य चिकित्सा के बाद की वसूली में विरोधी भड़काऊ दवाएं और एंटीबायोटिक्सशामिल हैं 31। विरोधी भड़काऊ दवाओं का उपयोग न्यूरोइंफ्लेमेशन के मॉडल की जांच करने वाले अध्ययनों में उपयुक्त नहीं हो सकता है क्योंकि ये दवाएं अध्ययन के तहत घटना को भी प्रभावित कर सकती हैं।

हाल ही में, मेनिंगियल लिम्फएंजियोजेनेसिस को कपाल खिड़की आरोपण32 के जवाब में होने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, क्रोनिक कपाल खिड़की इसलिए मेनिंगियल लसीका वाहिकाओं की जांच करने वाले अध्ययनों के लिए स्वीकार्य नहीं हो सकती है। महत्वपूर्ण रूप से, 31,33 इमेजिंग प्रयोगों से पहले सर्जरी के बाद2-3-सप्ताह की प्रतीक्षा अवधि आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, चूहों की उम्र, साथ ही साथ ऑपरेशन के बाद की वसूली का समय, बहुत शुरुआती विकास की घटनाओं की छवि बनाने की क्षमता को सीमित करता है। जबकि कपाल खिड़कियों को छोटे चूहों (P15-21)34 में प्रत्यारोपित किया जा सकता है, संभावित दुष्प्रभाव, जैसे कि सूजन, पर विचार करने की आवश्यकता है।

पुरानी कपाल खिड़की के विकल्प के रूप में, पतली खोपड़ी की तैयारी भी की जा सकती है। इस विधि के परिणामस्वरूप इमेजिंग से पहले ब्याज के क्षेत्र में खोपड़ी का पतला होना होता है। एक पतली खोपड़ी की खिड़की कम आक्रामक है और विरोधी भड़काऊ दवा प्रशासन की आवश्यकता को दूर करती है, जिससे यह न्यूरोइंफ्लेमेशन और न्यूरोइम्यून इंटरैक्शन के मॉडल की जांच करने वाले अध्ययनों में एक विकल्प बन जाता है। हालांकि, बार-बार इमेजिंग वांछित होनी चाहिए, इमेजिंग से पहले खोपड़ी को फिर से पतला करने की आवश्यकता होती है, और छवि की गुणवत्ता35 को कम करने से पहले हड्डी को केवल सीमित संख्या में फिर से पतला किया जा सकता है।

यद्यपि एक प्रबलित पतली-खोपड़ी विधि का एक संशोधित संस्करण जिसे रीथिनिंग की आवश्यकता नहीं होती है,36 का वर्णन किया गया है, एक गैर-समान खोपड़ी की मोटाई गोलाकार विपथन का कारण बन सकती है, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट संरचनाओं का विरूपणहो सकता है। इस प्रकार, जब मात्रात्मक माप दर्ज किए जा रहे हैं, जैसे कि कैल्शियम सिग्नलिंग गतिशीलता38 या सिनैप्टिक प्रोटीन27 का स्तर, जैसा कि डेंड्राइटिक स्पाइन जैसी संरचनाओं की पहचान के विपरीत है, तो पुरानी कपाल खिड़की अधिक ऑप्टिकल रूप से स्थिर और विश्वसनीय तैयारी प्रदान करती है। इस प्रकार, अनुदैर्ध्य के लिए, विवो इमेजिंग में, कपाल खिड़कियों का सम्मिलन दवा उपचार39 के परिणामस्वरूप परिवर्तनों की जांच करने के लिए बेहतर तरीका है, एक व्यवहार प्रतिमान 4,25 में प्रशिक्षण, और न्यूरोलॉजिकल विकारों में सिनैप्टिक रीमॉडलिंग11,27।

वर्णित प्रक्रिया तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और गुणवत्ता छवि अधिग्रहण के लिए एक बाधा प्रदान करती है। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक चरण में अत्यधिक देखभाल की जानी चाहिए कि खिड़की संक्रमण से मुक्त रहती है, और अंतर्निहित ऊतक को नुकसान से बचा जाता है। इसमें खोपड़ी पर संयोजी ऊतक का कोमल स्क्रैपिंग शामिल है, ड्रिलिंग करते समय हड्डी को ठंडा करने के लिए पर्याप्त ब्रेक लेना, आसान हड्डी हटाने की सुविधा के लिए समान पतला करना सुनिश्चित करना, मस्तिष्क की सूजन को रोकना, और सर्जरी के दौरान ड्यूरा मेटर को नुकसान न पहुंचाने के लिए अत्यधिक देखभाल करना। केवल सबसे अच्छी खिड़की की तैयारी इमेजिंग की लंबी अवधि के लिए ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी रहती है।

जबकि सिनैप्टिक संरचनाओं में परिवर्तन को दिनों में एनेस्थेटिक चूहों में चित्रित किया जा सकता है, एस्ट्रोसाइट कैल्शियम सिग्नलिंग की जांच करते समय इसे पसंद नहीं किया जाता है क्योंकि एनेस्थीसिया को विवो40 में एस्ट्रोसाइट कैल्शियम सिग्नलिंग को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। जागने, सिर-संयमित चूहों में विवो इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए, मोबाइल होम पिंजरे, फ्री-फ्लोटिंग ट्रेडमिल, एयर-लिफ्टेड स्टायरोफोम बॉल, या अन्य उपकरणमें इमेजिंग स्थितियों के लिए जानवर को आदत डालना आवश्यक है। उचित habituation न केवल इमेजिंग के दौरान तनाव को कम करेगा, बल्कि इमेजिंग सत्रों के दौरान आंदोलन कलाकृतियों को कम करने के लिए भी कार्य करेगा।

संक्षेप में, एक पुरानी कपाल खिड़की के माध्यम से विवो मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी में कॉर्टेक्स में कोशिकाओं के संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। सेल-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंजक और पत्रकारों का उपयोग करके, सेलुलर आकृति विज्ञान, इंटरैक्शन और गतिविधि का अध्ययन करना संभव है। पुरानी कपाल खिड़कियों द्वारा अनुमत अनुदैर्ध्य इमेजिंग के साथ, यह जांचना संभव है कि सिनैप्टिक संरचनाएं13,14 समय के साथ कैसे बदलती हैं और विकसित होती हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, संवेदी उत्तेजना23,38, लोकोमोशन या चौंका देने वाले 6,41, रोग 15,42, या ब्याज के अन्य मापदंडों के कारण एस्ट्रोसाइट्स में कैल्शियम सिग्नलिंग गतिशीलता की जांच करना संभव है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15o Pointed Blade Surgistar 6500 Surgery Tools
19 G Needles BD 305186 Surgery Supply
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato Addgene 28306-AAV1 Viral Vector
AAV1-CaMKII-0-4-Cre Addgene 105558-AAV1 Viral Vector
Acteone Fisher Scientific A16P4 Reagent
Alcohol Prep Pads Fisher Scientific Covidien 5750 Surgery Supply
Beveler Narishige Equipment
Borosilicate Glass World Precision Instruments TW100F-4 Surgery Supply
Carbide Burs SS White Dental 14717 Surgery Tools
Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL Zoetis Mylan Institutional, LLC. Drug
Compressed Air Fisher Scientific 23-022-523 Surgery Supply
Cotton Tip Applicators Puritan 836-WC NO BINDER Surgery Supply
Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm Warner Instruments 64-0720, 64-0700 Surgery Supply
Dental Drill Aseptico Equipment
Dexamethasone, 4 mg/mL Mylan Institutional, LLC. Drug
Dissecting Microscope Nikon Equipment
Duralay Liquid  (dental cement liquid) Patterson Dental 602-8518 Reagent
Duralay Powder  (dental cement powder) Patterson Dental 602-7932 Reagent
Enrofloxacin, 2.27% Bayer Drug
Eye Ointment Dechra 17033-211-38 Surgery Supply
Fiber Lite High Intensity Illuminator Dolan-Jenner Industries Equipment
Forceps (Large) World Precision Instruments 14099 Surgery Tools
Forceps (Small) World Precision Instruments 501764 Surgery Tools
GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J The Jackson Laboratory Stock No: 024105 Mouse line
Germinator Fisher Scientific Equipment
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J The Jackson Laboratory Stock No: 012586 Mouse Line
Headplate Neurotar Model 1, Model 3 Surgery Supply
Hemostatic forceps World Precision Instruments 501705 Surgery Tools
Holder for 15o Pointed Blade World Precision Instruments 501247 Surgery Tools
Holder for Scalpel Blades World Precision Instruments 500236 Surgery Tools
Iodine Prep Pads Avantor 15648-926 Surgery Supply
Isoflurane Piramal Surgery Supply
Isoflurane table top system with Induction Box Harvard Apparatus Equipment
Isoflurane Vaporizer SurgiVet Equipment
Krazy Glue Office Depot KG517 Reagent
Loctite 401 Henkel 40140 fast-curing instant adhesive
Loctite 454 Fisher Scientific NC9194415 cyanoacrylate adhesive gel
Micropipette Puller Sutter Instruments Equipment
Multiphoton Microscope Equipment
Nitrogen Matheson NI M200 Gas
Oxygen Matheson OX M250 Gas
Picospritzer Parker intracellular microinjection dispense system
Pipette Tips Rainin 17014340 Surgery Supply
Rodent Hair Trimmer Wahl Equipment
Saline (0.9% Sodium Chloride) Med Vet International RX0.9NACL-30BAC Surgery Supply
Scalpel Blades, Size 11 Integra 4-111 Surgery Tools
Scissors World Precision Instruments 503667 Surgery Tools
Stereotaxic Instrument Stoelting Equipment
Sugi Sponge Strips (sponge strips) Kettenbach Dental 31002 Surgery Supply
SURGIFOAM (gel foam) Ethicon 1972 Surgery Supply
Syringe with 26 G Needle BD 309625 Surgery Supply
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648-1G Reagent
Ti:Sapphire Laser Coherent Equipment
Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM Surgery Supply
Water Blanket Fisher Scientific Equipment
Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL Fresenius Kabi USA Drug

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
  2. Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
  3. Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
  4. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  5. Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
  6. Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
  7. Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
  8. Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
  9. Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
  10. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  11. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
  12. Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  15. Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
  16. Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
  17. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  18. Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
  19. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  20. Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
  21. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  22. Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
  23. Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  24. Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
  25. Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
  26. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  27. Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
  28. Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
  29. Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  30. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
  31. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  32. Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
  33. De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
  34. Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
  35. Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  36. Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
  37. Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
  38. Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
  39. Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
  40. Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  41. Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
  42. Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 172
जागते चूहों <em>में वीवो</em> इमेजिंग में दोहराया के लिए एक कपाल खिड़की का आरोपण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, … More

Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice. J. Vis. Exp. (172), e62633, doi:10.3791/62633 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter