Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een chronisch schedelvenster voor de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbezorgde muizen.
Abstract
Om de cellulaire fysiologie van neuronen en glia bij zich gedragende dieren volledig te begrijpen, is het noodzakelijk om hun morfologie te visualiseren en hun activiteit in vivo vast te leggen bij zich gedragende muizen. Dit artikel beschrijft een methode voor de implantatie van een chronisch schedelvenster om de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbevangen muizen mogelijk te maken. In combinatie met genetische strategieën en virale injecties is het mogelijk om specifieke cellen en interessante gebieden te labelen met structurele of fysiologische markers. Dit protocol laat zien hoe virale injecties kunnen worden gecombineerd om neuronen in de buurt van GCaMP6-tot expressie brengende astrocyten in de cortex te labelen voor gelijktijdige beeldvorming van beide cellen door een schedelvenster. Multifoton beeldvorming van dezelfde cellen kan dagen, weken of maanden worden uitgevoerd bij wakkere, zich gedragende dieren. Deze aanpak biedt onderzoekers een methode om cellulaire dynamica in realtime te bekijken en kan worden toegepast om een aantal vragen in de neurowetenschappen te beantwoorden.
Introduction
Het vermogen om in vivo multifotonenfluorescentiemicroscopie uit te voeren in de cortex van muizen is van het grootste belang voor de studie van cellulaire signalering en structuur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, ziektepathologie 10,11 en cellulaire ontwikkeling12,13 . Met de implantatie van chronische schedelvensters is longitudinale beeldvorming mogelijk, waardoor herhaalde beeldvorming van corticale gebieden gedurende dagen, weken of maanden mogelijk is13,14 bij levende dieren. Multifotonenmicroscopie is ideaal voor in vivo, herhaalde beeldvorming vanwege verbeterde diepte-tastering en verminderde fotoschade in verband met de gebruikte infraroodlaser. Dit maakt de studie van moleculaire en cellulaire dynamica van specifieke cellen in verschillende corticale regio's mogelijk.
Multifotonenmicroscopie is gebruikt voor in vivo beeldvorming van neuronale en gliacellen bij muizen 15,16,17,18,19,20. Verschillende strategieën kunnen worden geïmplementeerd om bepaalde celtypen en interessegebieden te labelen. Een veel voorkomende aanpak is om de expressie van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten op een celspecifieke manier te stimuleren met behulp van het Cre-Lox-recombinatiesysteem. Dit kan worden uitgevoerd met genetisch gemodificeerde muizen, bijvoorbeeld het kruisen van tdTomato "floxed" muis (Ai14) met een muis die Cre-recombinase tot expressie brengt onder een promotor van belang21. Als alternatief kan cel- en plaatsspecifieke etikettering worden bereikt met virale injecties. Hier worden een virus dat codeert voor Cre-recombinase onder een celspecifieke promotor en een virus dat codeert voor een gevlokt gen van belang geïnjecteerd in een gedefinieerd gebied. Geschikte celtypen die beide virale vectoren ontvangen, zullen dan het gewenste gen (en) tot expressie brengen. Deze genen kunnen structurele markers zijn, zoals tdTomato, om veranderingen in cellulaire morfologie22 of genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's), zoals GCaMP en / of RCaMP, te bekijken om calciumdynamiek23 te onderzoeken. Methoden van genetische recombinatie kunnen individueel of in combinatie worden toegepast om een of meer celtypen te labelen. Een derde benadering, waarvoor geen transgene muizen of virale constructies (die een beperkte verpakkingscapaciteit hebben) nodig zijn, is in utero-elektroporatie van DNA-constructen24. Afhankelijk van de timing van de elektroporatie kunnen verschillende celtypen worden gericht op 25,26,27.
Bij het uitvoeren van multifoton-beeldvorming kunnen muizen worden afgebeeld terwijl ze wakker zijn of verdoofd. Beeldvorming van wakkere muizen kan worden uitgevoerd door de muis vast te zetten via een bevestigde kopplaat28. Deze aanpak wordt minder stressvol gemaakt door relatief vrije beweging van het dier mogelijk te maken met behulp van methoden, zoals vrij zwevende, luchtondersteunde piepschuimballen29, vrij zwevende loopbanden1, of een luchtgelift thuiskooisysteem waarbij muizen worden vastgemaakt door een bevestigde hoofdplaat en mogen bewegen in een open kamer30. Voor elk van deze beeldvormingscondities zal het eerst nodig zijn om de muizen te laten wennen aan de beeldvormingsopstelling. Dit artikel beschrijft de gewennings- en beeldvormingsprocedure met behulp van een luchtgelift thuiskooisysteem.
Dit protocol beschrijft de implantatie van een chronisch schedelvenster voor longitudinale in vivo beeldvorming in de cortex. Hier zullen we muizen gebruiken die GCaMP6f voorwaardelijk tot expressie brengen in astrocyten om de dynamiek van calciumsignalering te volgen. Verder beschrijft dit artikel de procedure voor virale injecties met tdTomato als een label voor neuronen. Dit maakt het mogelijk om veranderingen in de neuronale synaptische structuur te bepalen en /of de beschikbaarheid als een structurele marker die herhaalde beeldvorming van dezelfde astrocyte mogelijk maakt. Gedurende het hele protocol zullen cruciale stappen worden gemarkeerd om de best mogelijke kwaliteit van beelden verkregen uit multifotonenmicroscopie te garanderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met richtlijnen die zijn goedgekeurd door de IACUC aan het University of Nebraska Medical Center.
1. Voor de operatie
- Bereid pipetten voor virale injecties voor. Trek borosilicaatglascapillairen met behulp van een pipettrekker en schuin de pipet in een hoek van 20°. Steriliseer de pipetten een nacht.
- Bereid verse stukjes steriel gelschuim door ze in kleine vierkantjes te snijden. Dompel het gelschuim onder in een steriele microfugebuis met 0,5 ml zoutoplossing. Week het gelschuim voor gebruik minstens 30 minuten in zoutoplossing.
- Bereid verse stukjes sponsreepjes door ze in dunne reepjes te snijden.
- Injecteer twintig minuten voor de operatie 4-6 weken oude GLAST-CreER/GCaMP6f muizen intraperitoneaal met 0,2 mg/kg dexamethason om zwelling van de hersenen te voorkomen en 5 mg/kg carprofen om ontstekingen te verminderen.
OPMERKING: Om de recombinatie en expressie van GCaMP6f in ongeveer 40% van de astrocyten te induceren, werden GLAST-CreER/GCaMP6f-muizen geïnjecteerd met 100 mg/kg tamoxifen gedurende 3 weken gedurende 5 opeenvolgende dagen.
2. Start van de operatie
- Verdoven de muizen na 20 minuten met 3% isofluraan met zuurstof bij een stroomsnelheid van 1 l/min gedurende ongeveer 1,5 minuut.
- Eenmaal verdoofd, plaatst u de muis op een stereotaxisch frame dat op een waterrecirculatiedeken zit om een lichaamstemperatuur van 37 °C gedurende de hele operatie te handhaven. Bevestig de muis aan het frame met behulp van de snuitklem en oorstaven. Zorg ervoor dat de snuitklem en oorstaven stabiel genoeg zijn zodat het hoofd niet zal bewegen tijdens de procedure, maar niet zo strak dat de schedel beschadigd is.
- Handhaaf anesthesie met 1-1,5% isofluraan met zuurstof bij een stroomsnelheid van 1-2 l / min. Merk op dat sommige dieren meer of minder isofluraan nodig hebben om de sedatie te behouden. Controleer de ademhaling van het dier en zijn reflexen op teen- en staartknijpen en pas het isofluraan op de juiste manier aan.
- Breng oogzalf aan op elk oog met behulp van een wattenstaafje om te voorkomen dat de ogen uitdrogen tijdens de procedure.
- Scheer met behulp van knaagdiertrimmers het haar van de nek tot net voorbij de ogen. Wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat de snorharen van het dier niet per ongeluk worden bijgesneden.
- Reinig het geschoren gebied met één jodiumvoorbereidingspad, gevolgd door één alcoholvoorbereidingspad.
- Knip en verwijder met behulp van steriele weefseltang en chirurgische schaar de huid van de frontale hechtingen anterieur aan de bregma helemaal achteraan tot lambda.
- Zodra de huid is verwijderd, voegt u ongeveer 0,1 ml 1% xylocaïne (lidocaïne met epinefrine 1:200.000) toe aan de schedel om bloedingen van de schedel te minimaliseren.
- Met behulp van een steriel maat 11 koolstofstalen chirurgisch mes bevestigd aan een handvat, schraapt u voorzichtig het bindweefsel van de schedel. Wees extra voorzichtig bij het verwijderen van het bindweefsel bij de rand van de schedel, omdat eventueel achtergebleven weefsel later een sterke hechting van het glas of de hoofdplaat kan voorkomen.
- Gebruik steriele weefseltang om los bindweefsel uit de schedel te verwijderen.
- Gebruik steriele wattenstaafjes om alle resterende xylocaïne uit de schedel te verwijderen.
- Eenmaal voltooid, ontvet de schedel grondig met behulp van een steriele wattenstaafplicator gedoopt in aceton. Gebruik perslucht om de schedel onmiddellijk te föhnen.
3. Craniotomie
- Meet met behulp van een fijnpuntmarkering en een liniaal de juiste grootte voor de opening op de gewenste locatie. Bevestig de grootte van de opening door deze te vergelijken met de grootte van het afdekglas (3 of 5 mm in diameter); zorg ervoor dat de opening iets kleiner is dan de grootte van het dekglas.
- Gebruik een tandartsboor om geleidelijk de omtrek van de opening te volgen en het bot dunner te maken. Boor langzaam om boren door het bot te voorkomen en boor in concentrische cirkels om zelfs dunner worden van het bot te vergemakkelijken.
- Voeg na elke concentrische passage een druppel of twee steriele zoutoplossing toe aan het geboorde gebied. Laat de zoutoplossing minstens 10 s zitten om te voorkomen dat het bot oververhit raakt en de onderliggende dura beschadigt.
- Gebruik een steriele wattenstaafplicator om de resterende zoutoplossing te absorberen. Blaas perslucht over het gebied om ervoor te zorgen dat alle resterende zoutoplossing is verdampt voordat het boren wordt hervat. Doe dit om botresten die overblijven weg te blazen.
- Herhaal stap 3.2-3.4 totdat het bot voldoende verdund is voor verwijdering.
- Zorg ervoor dat het bot voldoende wordt verdund voor verwijdering door voorzichtig op het centrale deel van het bot te duwen met een fijne tang om te controleren of de verdunde schedel beweegt. De onderliggende vasculatuur moet zichtbaar zijn waar de boring heeft plaatsgevonden. Merk op dat het bot kan lijken alsof het zal barsten waar verdunning plaatsvond.
OPMERKING: Training in dit stadium is cruciaal om te bepalen wanneer het bot op de juiste manier is verdund. - Voordat u het bot probeert te verwijderen, controleert u de muis om er zeker van te zijn dat deze volledig is verdoofd. Zo niet, verhoog dan geleidelijk het isofluraanonderhoud om zwelling van de hersenen te voorkomen bij het verwijderen van het bot.
- Voeg een klein stukje gelschuim verzadigd met zoutoplossing toe aan de verdunde schedel. Voeg een of twee extra druppels zoutoplossing toe aan de verdunde schedel.
OPMERKING: Het hebben van veel zoutoplossing over de verdunde schedel helpt om bloedingen te verminderen en de dura te beschermen bij het verwijderen van de botflap. - Gebruik een miniatuur 15° puntig mes, steek het mes voorzichtig in het verdunde bot en snijd langs het verdunde bot. Houd het gelschuim gedrenkt in zoutoplossing, klaar om eventuele bloedingen te stoppen.
- Til met behulp van een tang het bot voorzichtig op en verwijder het. Wees zo voorzichtig mogelijk om schade aan het onderliggende weefsel en de vasculatuur te voorkomen. Wees uiterst voorzichtig om de dura mater niet te beschadigen.
- Zodra de botklep is verwijderd, voegt u een vers stuk gelschuim verzadigd met zoutoplossing toe aan de cortex. Voeg een paar druppels zoutoplossing toe om te voorkomen dat het gelschuim uitdroogt, omdat dit schade aan het onderliggende weefsel zal veroorzaken.
4. Virale injecties
- Voer virale injecties uit met behulp van een stereotaxisch apparaat.
- Bereid AAV1 voor. CaMKII.0.4.Cre (titer van 3 × 1013 genoomkopieën (GC)/ml) bij 1:5.000 door seriële verdunningen in zoutoplossing.
- Bereid het mengsel van AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5.000) en AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (titer van 5 × 1012 GC/ml) op een klein stukje parafilm.
- Vul een steriele afgeschuinde glazen pipet met een puntgrootte van 20 μm met het virusmengsel door de pipet voorzichtig op de oplossing te plaatsen.
- Laat de pipet zakken zodat deze net het oppervlak van de hersenen raakt en blijf zakken voor nog eens 200-300 μm voor L2 /3-injecties. Met behulp van een intracellulair micro-injectiedoseersysteem (zie de tabel met materialen) wordt 12-15 keer per minuut (20 psi, 9 ms pulsduur) onder druk geïnjecteerd. Observeer de meniscus in de pipetdruppel bij elke injectie om ervoor te zorgen dat de pipet niet wordt geblokkeerd.
- Eenmaal geïnjecteerd, laat de pipet 4-5 minuten in de hersenen om terugstroming te voorkomen. Trek de pipet langzaam terug.
- Herhaal de injecties op 2-3 plaatsen (ongeveer 500 μm uit elkaar).
- Gooi de gebruikte glazen pipetten, parafilm, pipetpunten en microfugebuizen die worden gebruikt voor seriële verdunningen van het Cre-virus weg tot 10% bleekmiddel.
5. Implantatie van het schedelvenster
- Verwijder eventuele gelschuim en gebruik een kleine strook sponsstrips om de resterende zoutoplossing op te nemen.
- Voeg een paar druppels van het antibioticum enrofloxacine (22,7 μg/ml) toe aan de opening en laat het daar 1 minuut staan. Gebruik na 1 minuut een vers stuk sponsstrip om eventuele resterende enrofloxacine te absorberen. Herhaal dit proces nog twee keer.
- Voeg na de derde wasbeurt een paar druppels zoutoplossing toe aan de opening en laat het daar 1 minuut staan. Gebruik na 1 minuut een vers stuk sponsstrip om eventuele resterende zoutoplossing te absorberen. Herhaal dit wasproces nog twee keer en voeg na de derde wasbeurt een klein druppeltje zoutoplossing toe aan de opening.
- Plaats het dekglas over de opening. Gebruik een tang om ervoor te zorgen dat het glas vlak over de opening ligt om beelden van goede kwaliteit te verkrijgen.
- Terwijl u het glas voorzichtig op zijn plaats houdt, brengt u cyanoacrylaatlijmgel (Tafel van Materialen) aan rond de omtrek van het glas om de randen van het venster naar de schedel af te sluiten. Zorg ervoor dat u de lijm niet onder het afdekglas laat sijpelen en houd zoveel mogelijk lijm van het oppervlak van het afdekglas.
- Breng een laagje superlijm aan over de zelfklevende gel. Voeg een laag tandcementvloeistof toe over de lijm om deze te laten uitharden.
- Neem een helikopterkopplaat van het juiste formaat en breng een dunne laag lijm aan rond de centrale opening. Plaats de kopplaat over het afdekglas en laat de lijm kort drogen.
- Voeg in een microfugebuis van 1,5 ml tandcementpoeder toe aan de markering van 0,1 ml op de buis. Voeg 7-8 druppels snel uithardende, instant lijm toe en meng. Trek in een spuit van 1 ml met een naald van 19 G die is gesneden om een grotere opening te creëren.
- Injecteer het mengsel door de zijgaten van de helikopterbalk totdat het van beide kanten sijpelt. Breng het tandheelkundige cement / lijmmengsel aan op de rest van de blootgestelde schedel om de hoofdplaat aan de schedel vast te maken, waardoor bewegingsartefacten tijdens het afbeelden worden verminderd.
- Laat het mengsel minstens 15 minuten aan de lucht drogen.
- Injecteer de muis subcutaan met 0,5 ml zoutoplossing om te helpen bij het herstel.
6. Nabewerking
- Verwijder de muis uit het stereotaxische frame en breng hem terug naar de kooi.
- Plaats een deel van de kooi op een waterrecirculatiedeken, ruimtegelverwarmingspads of isothermische pads om te helpen bij het herstel.
- Geef het dier een kleine portie voedselkorrels en natvoer, naast hun normale dieet, om verder te helpen bij het herstel. Voeg elke dag na de operatie nieuwe voedselkorrels en natvoer toe voor de duur van het herstel.
- Injecteer muizen de dag na de operatie eenmaal met 5 mg/kg carprofen en 5 mg/kg enrofloxacine.
- Injecteer de muizen op dag 2-6 eenmaal met 5 mg/kg carprofen en tweemaal met 5 mg/kg enrofloxacine, in afwachting van goedkeuring door de lokale IACUC. Scheid de enrofloxacine-injecties met ten minste 8 uur.
- Injecteer de muizen op dag 7-20 dagelijks met 5 mg/kg carprofen.
7. Gewenning van dieren voor beeldvorming
- Onderzoek op dag 14 na de operatie het schedelvenster op optische helderheid. Gebruik geen muizen met onduidelijke of anderszins beschadigde vensters (d.w.z. overmatige angiogenese).
- Controleer op tdTomato-expressie onder een fluorescentiemicroscoop. Als gelabelde cellen kunnen worden geïdentificeerd, ga dan verder met dierlijke gewenning.
- Eerste dag van gewenning (hanteren)
- Houd de muis een paar minuten vast en breng hem na het hanteren terug naar zijn kooi. Herhaal de verwerking drie keer met een interval van 15 minuten tussen de sessies.
- Na de derde proef, wen de muis door het dier in een klein stukje doek te wikkelen.
- Houd de muis gewikkeld in doek ongeveer 1 minuut.
- Breng de muis na de proef terug naar zijn kooi. Herhaal dit proces nog twee keer, met een interval van 15 minuten tussen elke proef.
- Tweede dag van gewenning
- Weeg en noteer het gewicht van de muis.
- Wikkel de muis in doek en bevestig hem via de kopplaat aan de hoofdbevestigingsarm van de luchtgelifte thuiskooi.
- Laat de thuiskooi blootgesteld aan het licht.
- Laat de muis 15 minuten vastzitten in de kooi van de stacaravan.
- Verwijder na gewenning de muis uit de thuiskooi en schakel de luchtstroom uit.
- Weeg de muis en breng hem terug naar zijn kooi. Zorg ervoor dat u alleen muizen opneemt die niet meer dan 10% van hun lichaamsgewicht verliezen. Sluit muizen die meer dan 10% van hun gewicht verliezen tijdens een dag van gewenning uit van beeldvormingsexperimenten.
- Dag drie van gewenning en daarna
- Weeg en noteer het gewicht van de muis voordat u het vastzet aan de luchtgelifte thuiskooi.
- Bevestig de muis aan de door de lucht opgetilde thuiskooi.
- Bedek de thuiskooi met iets dat een donkere binnenkant biedt, zoals een doos, en laat de muis 30 minuten vastzitten.
- Na 30 minuten maakt u de thuiskooi bloot, verwijdert u de muis en schakelt u de luchtstroom uit.
- Weeg en noteer het gewicht van de muis na gewenning.
- Herhaal dit proces elke dag en verhoog de duur dat de muis aan de thuiskooi is bevestigd met 15 minuten. Ga door met dit proces totdat de muis gedurende 1,5 uur aan de thuiskooi kan worden bevestigd, omdat dit de geschatte duur is van een beeldsessie met twee fotonen.
- Om de muis te laten wennen aan ruis, voert u enkele gewenningssessies uit op de microscoop om de muis te laten wennen aan de geluiden van de laserscanspiegels. Sluit muizen uit die niet voldoende wennen (d.w.z. vocalisaties en stress-geïnduceerde ontlasting).
8. Multifoton beeldvorming
- Begin 3 weken na de operatie met beeldvorming om het venster te laten verdwijnen.
- Voer beeldvorming uit op een op maat gemaakte of in de handel verkrijgbare multifotonenmicroscoop uitgerust met een Ti: Sapphire-laser. Verkrijg beelden met behulp van een wateronderdompelingsobjectief met een hoog numeriek diafragma (NA).
OPMERKING: Tweekanaals beeldvorming wordt bereikt met behulp van een 565 nm dichroïsche spiegel en twee externe fotomultiplicatorbuizen. Een 535/50 bandpass filter wordt gebruikt om GCaMP6f emissie te detecteren, en een 610/75 bandpass filter wordt gebruikt om tdTomato te detecteren. Een 25x waterdompelingsobjectief (1,05 NA) en resonantiescanners werden gebruikt om beelden te verkrijgen die in figuur 1 en figuur 2 worden getoond. Elk interessegebied bestond uit een stapel afbeeldingen, axiaal gescheiden door 1 μm. Elke optische sectie werd verzameld op 512 x 512 pixels, 0,18 μm / pixel. Beelden werden verkregen uit het voorpootgebied van de primaire motorische cortex zoals bepaald door stereotaxische coördinaten. - Stel de golflengte van de laser in op 920 nm (990 nm als een rood verschoven GECI wordt gebruikt).
- Plaats de muis op de kooi van de stacaravan en klem de kopplaat vast aan de hoofdbevestigingsarm.
- Voeg een paar druppels water toe aan het midden van het raam.
- Selecteer met behulp van de breedveldmodus van de microscoop 2-3 posities van gemakkelijk identificeerbare vasculatuur. Sla de beelden van deze bloedvaten op en noteer de X- en Y-coördinaten die op de motorcontroller verschijnen om de tdTomato-gelabelde dendrieten te verplaatsen voor volgende beeldvormingssessies. Pas de X- en Y-coördinaten elke keer aan om opnieuw uit te lijnen met de opgeslagen beelden van de bloedvaten.
- Zodra de vasculatuur in beeld is gebracht en posities zijn vastgelegd, lokaliseer je de gebieden met neuronen die tdTomato tot expressie brengen (figuur 1). Stel je de synaptische structuren (dendrieten en axonen) van neuronen en GCaMP6f-activiteit in astrocyten voor.
OPMERKING: De dendrieten zullen dienen als oriëntatiepunten om betrouwbaar terug te keren naar dezelfde regio's en dezelfde dendrieten en astrocyten gedurende herhaalde dagen in beeld te brengen. Er werd geen waarneembare verschuiving in het beeldvlak waargenomen bij stabiele hoofdfixatie en na gewenning aan hoofdfixatie. Verplaatsing die optreedt in de X- en Y-richtingen wordt door beweging gecorrigeerd. - Breng de muis na het afbeelden terug naar zijn kooi.
OPMERKING: Muizen worden meestal maximaal 2 uur op de scope gehouden. Wanneer de beeldvorming lang aanhoudt, kan het water onder het objectief opdrogen. Water moet worden toegevoegd tijdens de experimenten. Als alternatief kan een ultrasone gel worden gebruikt in plaats van water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kwaliteit van het schedelvenster kan worden beoordeeld aan de hand van hoe helder de neuronale structuren eruit zien. In een goed venster zijn dendritische stekels duidelijk zichtbaar (figuur 1). Met de opgeslagen structurele en positionele gegevens kan hetzelfde dier dagen, weken of maanden herhaaldelijk in beeld worden gebracht om dezelfde cellen te onderzoeken (figuur 1). De beelden in figuur 1 zijn verkregen uit het voorpootgebied van de primaire motorische cortex (in een venster van 5 mm). Een verscheidenheid aan parameters kan worden gemeten, waaronder dichtheid en dynamiek van dendritische stekels en axonale boutons om structurele synaptische plasticiteit te bestuderen. Astrocytische activiteit kan worden bestudeerd door de spatiotemporale dynamiek van calciumsignalering te analyseren (figuur 2). Afhankelijk van de microscoopmogelijkheden (d.w.z. resonantiescanners, piëzomotor die het objectief regelt) en de experimentele vraag, kan time-lapse beeldvorming worden uitgevoerd in een enkel focal vlak of in een volume of multiregio om de calciumactiviteit met de gewenste acquisitiefrequentie te volgen.
Figuur 1: Herhaalde beeldvorming van dendrieten en astrocyten gedurende dagen. Een dendriet die tdTomato (magenta) tot expressie brengt, maakt de identificatie en herhaalde beeldvorming van GCaMP6f-tot expressie brengende astrocyten (wit) in de nabijheid mogelijk. Ca2+ activiteit binnen astrocyten wordt getoond op verschillende tijdstippen op verschillende dagen. Synaptische structurele plasticiteit kan tegelijkertijd worden afgebeeld. Twee nieuwe stekels die op dag 2 verschenen, zijn gemarkeerd met pijlen. Terwijl de ene wervelkolom aanhield en zichtbaar was op dag 5 (blauwe pijl), werd de andere wervelkolom geëlimineerd (groene pijl). Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beeldvorming van astrocytische calciumsignalering. Afbeeldingen van Ca2+ activiteit van een astrocyte die GCaMP6f uitdrukt. Panelen tonen Ca2+ activiteit geregistreerd van een 4 μm volume op verschillende tijdstippen tijdens de acquisitie. Calciumsignalering in processen en microdomeinen kan worden waargenomen tijdens de rustperioden. Een globale gebeurtenis die de hele cel omvat, kan worden waargenomen tijdens een voortbewegingsaanval op 188 s. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we een protocol gepresenteerd voor de implantatie van chronische schedelvensters voor in vivo beeldvorming van corticale astrocyten en neuronen in wakkere, hoofdbezorgde muizen op een luchtgelifte thuiskooi. Er zijn specifieke voorbeelden gegeven van de craniale venstertoepassing voor het afbeelden van astrocyten die GECI's en neuronale synaptische structuren tot expressie brengen. Met behulp van multifotonenmicroscopie kunnen astrocytische calciumsignaleringsdynamiek en structurele synaptische dynamica gedurende dagen herhaaldelijk worden vastgelegd.
Een chronisch craniaal venster biedt een goede optische beeldkwaliteit en maakt het mogelijk om meerdere beeldvormingssessies uit te voeren van dezelfde neuronale en gliale structuren. De aanpak maakt het ook mogelijk om intracraniële virale injecties uit te voeren voordat de craniotomie met een dekglas wordt bedekt.
Gebruikers moeten zich bewust zijn van een aantal beperkingen die worden opgelopen door de implantatie van chronische schedelvensters. Ervaring en veel oefening zijn nodig om een kwalitatief hoogstaand venster te bereiken en het overleven van dieren te garanderen. Bovendien is de operatie invasief en kan deze resulteren in een ontstekingsreactie. Farmacologische behandeling tijdens chirurgie en postoperatief herstel omvat ontstekingsremmende geneesmiddelen en antibiotica31. Het gebruik van ontstekingsremmende geneesmiddelen is mogelijk niet geschikt in studies die modellen van neuro-inflammatie onderzoeken, omdat deze geneesmiddelen ook van invloed kunnen zijn op het onderzochte fenomeen.
Meer recent is aangetoond dat meningeale lymfangangiogenese optreedt als reactie op craniale vensterimplantatie32. Het chronische schedelvenster is daarom mogelijk niet acceptabel voor studies die meningeale lymfevaten onderzoeken. Belangrijk is dat een wachttijd van 2-3 weken na de operatie nodig is voordat beeldvormingsexperimenten31,33. Bovendien beperkt de leeftijd van de muizen, evenals de hersteltijd na de operatie, het vermogen om zeer vroege ontwikkelingsgebeurtenissen in beeld te brengen. Hoewel schedelvensters kunnen worden geïmplanteerd bij jongere muizen (P15-21)34, moeten mogelijke bijwerkingen, zoals ontsteking, worden overwogen.
Als alternatief voor het chronische schedelvenster kunnen ook verdunde schedelpreparaten worden gemaakt. Deze methode resulteert in het dunner worden van de schedel over het gebied van belang vóór beeldvorming. Een verdund schedelvenster is minder invasief en overwint de behoefte aan toediening van ontstekingsremmende geneesmiddelen, waardoor het een keuze is in studies die modellen van neuro-inflammatie en neuro-immuuninteracties onderzoeken. Als herhaalde beeldvorming echter gewenst is, moet de schedel opnieuw worden verdund voordat de beeldvorming wordt uitgevoerd en kan het bot slechts een beperkt aantal keren opnieuw worden verdund voordat de beeldkwaliteit afneemt35.
Hoewel een aangepaste versie van een versterkte dunne schedelmethode die niet hoeft te worden vernieuwd, is beschreven36, kan een niet-uniforme schedeldikte bolvormige aberraties veroorzaken, wat resulteert in de vervorming van fluorescerende structuren37. Dus wanneer kwantitatieve metingen worden geregistreerd, zoals calciumsignaleringsdynamiek38 of niveaus van synaptische eiwitten27, in tegenstelling tot de identificatie van structuren zoals dendritische stekels, biedt het chronische schedelvenster een optisch stabieler en betrouwbaarder preparaat. Voor longitudinale, in vivo beeldvorming is het inbrengen van schedelvensters dus de superieure methode voor het onderzoeken van veranderingen als gevolg van medicamenteuze behandeling39, training in een gedragsparadigma 4,25 en synaptische remodellering bij neurologische aandoeningen11,27.
De beschreven procedure is technisch uitdagend en vormt een barrière voor kwaliteitsvolle beeldverwerving. Bij elke stap moet uiterste zorg worden besteed om ervoor te zorgen dat het venster vrij blijft van infectie en schade aan het onderliggende weefsel wordt vermeden. Dit omvat het zacht schrapen van bindweefsel op de schedel, het nemen van voldoende pauzes voor het koelen van het bot tijdens het boren, zorgen voor uniforme verdunning om eenvoudige botverwijdering te vergemakkelijken, het voorkomen van zwelling van de hersenen en extreme zorg om de dura mater niet te beschadigen tijdens de operatie. Alleen de beste raamvoorbereidingen blijven optisch transparant voor langere perioden van beeldvorming.
Hoewel veranderingen in synaptische structuren in de loop van dagen kunnen worden afgebeeld bij verdoofde muizen, heeft dit niet de voorkeur bij het onderzoeken van astrocytencalciumsignalering, omdat is aangetoond dat anesthesie de astrocytencalciumsignalering in vivoverstoort 40. Om in vivo beeldvorming uit te voeren bij wakkere, in bedwang gehouden muizen, is het essentieel om het dier te laten wennen aan de beeldvormingsomstandigheden in de kooi van de stacaravan, de vrij zwevende loopband, de door de lucht opgetilde piepschuimbal of andere apparaten. Een goede gewenning zal niet alleen stress tijdens het beeldvormen verminderen, maar ook werken om bewegingsartefacten tijdens de beeldvormingssessies te minimaliseren.
Kortom, in vivo multifotonenmicroscopie door een chronisch schedelvenster is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van structurele en functionele veranderingen van cellen in de cortex. Met behulp van celspecifieke fluorescerende kleurstoffen en reporters is het mogelijk om cellulaire morfologie, interacties en activiteit te bestuderen. Met de longitudinale beeldvorming die wordt toegestaan door chronische schedelvensters, is het mogelijk om te onderzoeken hoe synaptische structuren in de loop van de tijd veranderen en zich ontwikkelen13,14. Met behulp van het hier gepresenteerde protocol is het mogelijk om de calciumsignaleringsdynamiek in astrocyten te onderzoeken als gevolg van sensorische stimulatie 23,38, voortbeweging of schrik 6,41, ziekte15,42 of andere parameters van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
