Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Retinal pigment epiteltransplantasjon i en ikke-menneskelig primatmodell for degenerative netthinnesykdommer

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62638
Automatic Translation
*1,2, *1,3,4, 1, 2, 1,2,5, 1,4,6, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 4Singapore Eye Research Institute (SERI), 5UCL Institute of Ophthalmology, 6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Den ikke-menneskelige primaten (NHP) er en ideell modell for å studere humane retinal cellulære terapeutiske behandlinger på grunn av de anatomiske og genetiske likhetene. Dette manuskriptet beskriver en metode for submaculær transplantasjon av retinal pigment epitelceller i NHP øye og strategier for å forhindre intraoperative komplikasjoner forbundet med makula manipulasjon.

Abstract

Retinal pigment epitel (RPE) transplantasjon holder stort løfte for behandling av arvelige og ervervede retinal degenerative sykdommer. Disse forholdene inkluderer retinitis pigmentosa (RP) og avanserte former for aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), for eksempel geografisk atrofi (GA). Sammen representerer disse lidelsene en betydelig andel av for tiden ubehandlet blindhet globalt. Disse udekkede medisinske behovene har skapt økt faglig interesse for å utvikle metoder for RPE-erstatning. Blant dyremodellene som vanligvis brukes til preklinisk testing av terapeutiske behandlinger, er den ikke-menneskelige primaten (NHP) den eneste dyremodellen som har en makula. Ettersom det deler denne anatomiske likheten med det menneskelige øye, er NHP-øyet en viktig og passende preklinisk dyremodell for utvikling av avanserte terapipreparater (ATMPer) som RPE-celleterapi.

Dette manuskriptet beskriver en metode for submaculær transplantasjon av en RPE monolayer, dyrket på en polyetylentereftalat (PET) cellebærer, under makula på en kirurgisk opprettet RPE sår i immunsupprimerte NHPs. Fovea-den sentrale avaskulære delen av makula-er stedet for den største mekaniske svakheten under transplantasjonen. Foveal traumer vil oppstå hvis den første subretinal væskeinjeksjonen genererer en overdreven kraft på netthinnen. Derfor anbefales langsom injeksjon under perfluorokarbonvæske (PFCL) glasslegemet tamponade med en dobbelboret subretinal injeksjonskanyle ved lavt intraokulært trykk (IOP) for å skape en retinal bleb.

Forbehandling med en intravitreal plasminogen injeksjon for å frigjøre parafoveal RPE-fotoreseptor adhesjoner anbefales også. Disse kombinerte strategiene kan redusere sannsynligheten for foveale tårer sammenlignet med konvensjonelle teknikker. NHP er en viktig dyremodell i den prekliniske fasen av RPE celleterapiutvikling. Denne protokollen tar for seg de tekniske utfordringene knyttet til levering av RPE cellulær terapi i NHP-øyet.

Introduction

RPE-transplantasjon holder stort løfte om behandling av arvelige og oppkjøpte retinal degenerative sykdommer. Disse forholdene inkluderer retinitis pigmentosa (RP, rod-cone dystrofi) og avanserte former for AMD som GA. Samlet representerer disse lidelsene en betydelig andel av for tiden ubehandlet blindhet globalt1,2. De avanserte stadiene av AMD er kategorisert i neovascular AMD (nAMD) og GA. Selv om det finnes effektive behandlingsalternativer for nAMD, for eksempel antivaskulær endotelial vekstfaktor (anti-VEGF) injeksjoner, har pasienter med GA begrensede behandlingsalternativer. RP er en svært heterogen gruppe arvelige retinal lidelser preget av progressiv retinal fotoreseptor degenerasjon. Hos noen pasienter er den forårsakende genetiske defekten plassert i RPE i stedet for fotoreseptorene; Derfor kan RPE-erstatningsterapi være en alternativ strategi hvis genterapi ikke er mulig.

Det er stor interesse for å utvikle effektive behandlinger for disse forholdene. Spesielt har RPE-transplantasjon fått trekkraft som en potensiell terapeutisk tilnærming3,4,5,6,7,8. Siden de første rapportene om RPE-transplantasjon dukket opp på 1980-tallet, har feltet utvidet seg til å omfatte ulike RPE-cellekilder, leveringsstrategier og eksperimentelle modeller for sykdom og transplantasjon10,11,12,13,14. Blant de ulike dyremodellene er det bare Helsingforskomiteen som har en "makula lutea" med en "fovea centralis", en anatomisk spesialisering på den bakre polen av netthinnen som deles med mennesker. Fovea inneholder en svært høy tetthet av kjegle fotoreseptorer som muliggjør høyoppløselig sentral visjon15. NHP har også en lignende genomisk og proteomisk sminke16 sammenlignet med mennesker. Disse likhetene gjør det til en viktig og hensiktsmessig dyremodell for studiet av okulære sykdommer som påvirker den menneskelige netthinnen17,18.

Dette manuskriptet beskriver en metode for submaculær transplantasjon av en RPE xenograft, støttet av en PET-cellebærer, i immunsupprimerte NHPer. En transvitreal teknikk for subretinal RPE-transplantasjon hos kaniner har blitt beskrevet i et tidligere manuskript19. Men i NHPer krever tilstedeværelsen av fovea spesiell forsiktighet under intraoperativ manipulasjon20. Spesielt er det stor risiko for foveal tåre hvis subretinal væske injeksjon metoder generere en overdreven kraft på netthinnen20. Fokuset i dette manuskriptet er derfor på strategier for å redusere risikoen for utilsiktet fostertraume i NHP.

Disse inkluderer bruk av preoperativ intravitreal plasminogen injeksjon for frigjøring av parafoveale adhesjoner og kirurgisk mikroskopintegrert optisk koherenstomografi (miOCT) intraoperativt for sanntidsvisualisering av foveal anatomien. En skreddersydd 25/41 G toboret subretinal kanyle med intraokulær PFCL tamponade under lave IOP-innstillinger foreslås for å tillate en mer kontrollert prosess med føveal løsrivelse. Videre anbefales kirurgisk fjerning av innfødt RPE før implantasjon for å muliggjøre bedre integrasjon mellom transplanterte RPE-celler og vertsfotoreseptorer. Til slutt beskrives en peri- og postoperativ systemisk immunsuppresjonsprotokoll for NHP-modeller for å forbedre overlevelsen til RPE xenograft etter transplantasjon11,21.

Protocol

MERK: Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Forskerforeningen i visjon og oftalmologi (ARVO) for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning. Etikkgodkjenning ble innhentet fra Institutional Animal Care and Use Committee, SingHealth, Singapore. Dyr ble plassert på SingHealth Experimental Medicine Centre godkjent av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Denne godkjenningen fremhever at alle dyreforsøk overholder standardene i National Advisory Committee for Laboratory Animal Research retningslinjer fastsatt av Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore. Følgende eksperimentelle protokoll ble etablert basert på eksperimenter utført i 6 øyne på 6 Macaca fascicularis (4 mann og 2 kvinner, 4 til 6 år, 2,8 til 4,0 kg) .

1. Oppnå immunsuppresjon i NHP-modellen

  1. Start immunsuppresjon 7 dager før operasjonen og fortsett immunsuppresjon gjennom oppfølgingsperioden.
  2. Vei NHP før administrering av systemisk immunsuppresjon for å sikre nøyaktig legemiddeldosering. Dyret veies ved baseline og ukentlig deretter.
  3. Bruk oral sirolimus, doxycyklin og minocyklin for å oppnå systemisk immunsuppresjon.
    1. Administrer en lastedose på 2 mg oral sirolimus etterfulgt av en daglig vedlikeholdsdose på 1 mg. Få baseline blod sirolimus nivå før administrering og overvåke dette gjennom oppfølgingsperioden. Sørg for en konsentrasjon på minst 5 μg/l for tilstrekkelig immunsuppresjon.
      MERK: Sirolimus-dosen er ikke vekttilpasset.
    2. Administrer en dose på 7,5 mg/kg oral doksycyklin per dag, to ganger per dag.
    3. Administrer en dose på 7,5 mg/kg oral minocyklin per dag, to ganger per dag.
  4. Under immunsuppresjon må du overvåke alle NHPer for bivirkninger av systemet. Se etter betydelig vekttap (>10%), redusert appetitt og vannforbruk, ubetjent hårtap og unormal oppførsel som aggresjon og sløvhet. Vurderinger vil bli gjort på dag 3, 14 og 1 måned, etterfulgt av månedlige vurderinger.

2. Sterilisering av instrumenter

  1. Skyll de kirurgiske instrumentene med destillert vann.
  2. Plasser instrumentene i et ultralydbad fylt med 500 ml destillert vann og 2 ml instrumentdesinfeksjonsmiddel. Rengjør instrumentene ved hjelp av feiefunksjonen til ultralydbadet i 15 min.
  3. Fjern instrumentene fra ultralydbadet. Skyll grundig med destillert vann i 5 minutter hver skylling. Lufttørk instrumentene etter skyllingen.
  4. Plasser instrumentene i en instrumentboks. Autoklaver esken ved hjelp av den universelle programinnstillingen (sterilisering av instrumenter ved 134 °C i 50 min: 30 min for autoklavering, 20 min for tørking).

3. Tilberedning av konserveringsmiddelfritt triamcinolon (40 mg/ml)

  1. Bruk en 1 ml sprøyte og trekk ut 1 ml triamcinolonoppløsning (10 mg/ml). Overfør det til et 15 ml konisk rør og bland det med 4 ml steril balansert saltoppløsning (BSS).
  2. Sentrifuger løsningen ved 120 × g i 5 min. Sørg for at alle triamcinolonpartiklene er på bunnen av det koniske røret. Kast supernatanten (BSS) fra det koniske røret.
  3. Re-suspendere triamcinolonpartiklene med 5 ml steril BSS i det koniske røret. Sentrifuger løsningen ved 120 × g i 5 min. Kast supernatanten igjen.
  4. Gjenta trinn 3.3 for å fullføre vaskingen av triamcinolonpartiklene med BSS (3x).
  5. Re-suspendere triamcinolonpartiklene med 0,25 ml steril BSS for å oppnå en konsentrasjon på 40 mg / ml.
  6. Aspirer det re-suspenderte triamcinolonet (40 mg/ml) med en ny 1 ml sprøyte. Fest en 25 G stumspissfløytekanyle, og hold sprøyten med triamcinolonoppløsningen klar til intraoperativ bruk.

4. Forbehandling av NHP-øyne med intravitreal plasminogen (0,25 μg/μL)

  1. En uke før operasjonen, administrere en intravitreal injeksjon (20 μL) av ape plasminogen (0,25 μg / μL).
  2. Sedate NHP før prosedyren med en intramuskulær injeksjon av ketamin (10-20 mg/kg BW) og en subkutan injeksjon av atropin (0,05 mg/kg kroppsvekt). Administrer tetrakain øyedråper for lokalbedøvelse.
  3. Før intravitreal injeksjon desinfiserer periorbitalområdet med 10% povidon-jod. Desinfiser øyet ved å administrere 5% povidon-jod til konjunktivale i NHP. Sørg for at oppløsningen forblir i i minst 1 min før du skyller grundig med steril BSS.
  4. Bruk en 250 μL sprøyte for å aspirere den pre fortynnede apeplasminogen (0,25 μg / μL) fra hetteglasset. Fest en 30 G nål til sprøyten, og hold apen plasminogen klar for intravitreal administrering.
  5. Bruk et par kalipere for å identifisere injeksjonsstedet på øyet. Administrer intravitreal injeksjon 3 mm fra limbussen.
  6. Fortsett med injeksjonen med nålen rettet mot midten av kloden. Ved fjerning av nålen fra kloden, bruk en bomullsapplikatorpinne for å tamponade injeksjonsstedet og forhindre refluks av det intraokulære innholdet.
  7. Administrer en smøremiddelgel eller salve for å redusere umiddelbar postoperativ okulær overflateirritasjon.

5. Kirurgisk bord- og utstyrsoppsett

  1. Etabler et sterilt felt. Når du er i det sterile feltet, bruk kirurgiske skrubber, maske og hårdeksel til enhver tid.
  2. Forbered konserveringsmiddelfritt triamcinolon (40 mg/ml) for intraoperativ visualisering av glasslegemet (se avsnitt 3). Forbered den sterile BSS i en 10 ml sprøyte og smøremiddel i en 5 ml sprøyte. Legg dem på en gardin.
  3. Hold andre instrumenter klare på en gardin, inkludert 3-0 silke, 7-0 vicryl suturer, bomull applikator pinner, sår lukking strimler, og lysekrone endoillumination fiber wire.
  4. Koble vitrektomisettet, inkludert høyhastighets vitrektor, Venturi-kassett og 25 G lysekrone endoilluminator til vitrektomimaskinen ved hjelp av steril teknikk.
  5. Åpne en BSS-flaske av 500 ml oftalmisk kvalitet og koble den til Venturi-kassetten i henhold til produsentens anvisninger. Fortsett med å grunne systemet.
  6. Slå på miOCT/kirurgisk mikroskop. Velg forhåndsinnstilte konfigurasjoner av det kirurgiske mikroskopet for bakre segmentkirurgi og belysning. Skriv inn detaljene for prosedyren, inkludert ID, kjønn, lateralitet av dyreøyet og navnet på prosedyren.
  7. Monter en ikke-kontakt, vidvinklet, 128-graders funduslinse.
  8. Fest sterile håndstykkedeksler til engangsbruk på det kirurgiske mikroskopet/miOCT. Juster mikroskopposisjonen og fokuser ved hjelp av fotpedalen. Fortsett med operasjonen.

6. Forberedelse av anestesi og posisjonering av dyret (helst utført av veterinærteam)

  1. Sørg for at NHP er fastet i minst 8 timer før induksjon av anestesi for å forhindre oppblåsthet og oppkast. Forseøv NHP før anduksjon av anestesi (se trinn 4.2 for sedasjonsinstruksjoner).
  2. Påfør 1% tropicamid og 2,5% fenylefrin øyedråper minst 3x med 5 min intervaller for å oppnå pupill utvidelse.
  3. Administrer en intramuskulær injeksjon av buprenorfin (0,005-0,03 mg/kg kroppsvekt) 30 min før operasjonen for å oppnå smertestillende midler.
  4. Intuber NHP med et endotrakealrør, vanligvis 3-5 mm i størrelse. Når du prøver intubasjon, må du sørge for at flere størrelser er tilgjengelige. Bruk den største størrelsen som kan passeres gjennom strupehodet uten å forårsake traumer. Mål endet tidevanns-CO2 for å sikre riktig plassering av endotrakealrør.
  5. Lever 2% isofluoranegass via endotrakealrøret for å indusere generell anestesi. Bekreft tilstanden til generell anestesi (mangel på respons på berøring) ved å vurdere NHPs respons på omkringliggende stimuli, inkludert lyder og berøring. Bruk 0,5-2% isofluoranegass for å opprettholde tilstanden til generell anestesi.
  6. Overvåk kontinuerlig NHP-elektrokardiogrammet, luftveiene, blodtrykket og oksygenmetningen under hele operasjonen.
  7. Plasser NHP på det kirurgiske bordet slik at øyet er vinkelrett på det kirurgiske mikroskopet. Administrer en smøremiddelgel eller salve til øyet, som ikke brukes på for å redusere okulær overflateirritasjon under anestesi.
  8. Klipp øyevippene ved hjelp av saks for å redusere sjansen for infeksjoner.
  9. Desinfiser periorbitalområdet med 10% povidon-jod. Desinfiser øyet ved å administrere 5% povidon-jod til konjunktivale i NHP. Sørg for at oppløsningen forblir i i minst 1 min før du skyller grundig med steril BSS.
  10. Plasser en steril gardin slik at den forhåndskuttede åpningen er sentrert over øyet for å gjennomgå kirurgi. Dekk øyet med en selvklebende kirurgisk snittgardin.
  11. Utfør en lateral kantomy på øyet for å gjennomgå kirurgi.
  12. Sett inn Lieberman-spekulumet for å sikre tilstrekkelig åpning av øyelokkene for visualisering av øyet.

7. Vitrektomi

MERK: For å få tilgang til subretinal plass for levering av PET-stillas RPE graft, anbefaler denne protokollen en 4-port (valved) 25 G vitrectomy som skal utføres ved hjelp av en standard vitreoretinal kirurgisk oppsett og en ikke-kontakt, vidvinklet, 128 ° fundus linse. Protokollen anbefaler også bruk av et kirurgisk mikroskop utstyrt med miOCT for å lede flere kritiske kirurgiske trinn, inkludert induksjon av føveal løsrivelse, implantasjon av RPE-transplantatet og subretinal væskedrenering.

  1. Utfør en 360° konjunktiv peritomy ved å incizing konjunktivene nær limbus ved hjelp av et par vannas saks. Forstørr peritomyen ved å utføre en stump disseksjon.
  2. Bruk et 25 G mikrovitreoretinalt blad til å utføre en sclerotomi klokken 8 for høyre øye eller klokken 4 for venstre øye. Utfør sclerotomy 3 mm fra øyets limbuss.
  3. Sett inn og suturer en 25 G tilpasset sideportinfusjonskanyle ved hjelp av 7-0 vicryl sutur. Etter å ha bekreftet den intravitreale plasseringen, start BSS-infusjonen og sett systemet til å opprettholde en IOP på 20 mmHg.
  4. Bruk en 25 G flat hodetropp, utfør en sclerotomi klokken 2 for høyre øye eller klokken 10 for venstre øye, som i trinn 7.2.
  5. Sett 25 G lysekronelyset inn i flathodetroppen og fest det med klebrig tape. Juster lyskilden til ca. 60 %.
  6. Utfør en annen sclerotomi, lik trinn 7.2, klokken 10 for høyre øye eller klokken 2 for venstre øye. Plasser U-formet vicryl 7-0 suturer rundt sclerotomy uten å binde knutene. Sett vitrectomy cutter spissen gjennom denne sclerotomy.
  7. Start vitrektomien rundt inngangsportene, etterfulgt av en kort kjerne vitrektomi med følgende innstillinger: maksimalt 5000 kutt per minutt, maksimal aspirasjon ved 400 mmHg.
  8. Injiser 20-50 μL triamcinolon (40 mg/ml) for bedre glasslegemet visualisering.
  9. Induser en bakre glasslegemeavløsning (PVD) ved å skille glasslegemet fra netthinnen.
    1. Plasser glasstrektoren over den optiske platen for å tillate skånsom induksjon av PVD. Hold glasstrektoren kun på aspirasjon ved maksimal innstilling på 400 mmHg uten kutting involvert.
    2. Bruk om nødvendig 25 G intraokulære tang for å manipulere glasslegemet ved skivemarginen for å skape en tåre i glasslegemet cortex for å lette løsningen.
      MERK: PVD anses som vellykket hvis triamcinolone krystaller glir uhindret over netthinnen overflaten.
  10. Åpne den bakre hyaloidmembranen med kutteren, og fjern det frittliggende glasslegemet opp til glasslegemet (ved retinal ekvator). Aspirer eventuelt gjenværende triamcinolon på retinaloverflaten.

8. miOCT-guidet foveal løsrivelse

  1. Injiser 1-2 ml PFCL for å dekke bakre pol opp til fremre, middels perifer netthinne.
  2. Gå inn i øyet med en subretinal injeksjonskanyle. Sett IOP til 0-4 mmHg på vitrektomimaskinen (sørg for perfekt vanntett system; om nødvendig, bind suturer rundt portene).
  3. Bruk enten den 25/41 G tilpassede subretinale injeksjonskanylen med dobbel boring eller 25/38 G subretinal injeksjonskanyle koblet til en 250 μL sprøyte, utfør forsiktig en subretinal injeksjon av BSS for å indusere en lokalisert netthinneavløsning. Når blebben bare krysser fovea, stopp injeksjonen. Lag en ny bleb fra en egen retning. Slå sammen begge blebene for å løsne foveaen helt.
  4. Aktiver miOCT-funksjonen for å visualisere blebformasjon. Forsikre deg om at linje- og kubeskanningene er i HD-modus med innstillingene (512 x 128 piksler, skannebredde 4 mm) for å skaffe et bilde ved fovea. Vær oppmerksom på miOCT-bildet for en fullstendig løsrivelse av nevral netthinnen fra RPE-laget ved fovea.
  5. Forstørr retinotomien til 1,5 mm med et par vertikale 25 G vitreoretinal saks for å gi tilgang til det subretinaale rommet for transplantasjon.

9. Fjerning av innfødt RPE

  1. Sett IOP til 50 mmHg på vitrektomimaskinen.
  2. Fjern PFCL via aktiv ekstrudering ved hjelp av en børstet silikonspisskanyle.
  3. Utvid sclerotomien med en 1,4 mm snittkniv for å tillate inngangen til et 20 G instrument.
  4. Bruk et egendefinert 20 G utvidbart sløyfeinstrument til å skrape den submaculære verten RPE for fjerning. Skrap et område som måler minst 2 x 3 mm.

10. Lasting av skytteren for levering av RPE celle monolayer transplantasjon

  1. For generelle instruksjoner om lasting av en kuleformet graft kuttet fra RPE-kulturer på PET-cellebærere, se en tidligere publikasjon22.

11. miOCT-guidet graftimplantasjon og posisjonsjustering

  1. Sett spissen på skyteapparatet gjennom sclerotomien ved en IOP på 20 mmHg. Injiser implantatet mot subretinalrommet via retinotomykanten som er opprettet fra netthinnen.
  2. Injiser implantatet med cellebærersiden vendt mot Bruchs membran og RPE xenograft-siden vendt mot fotoreseptorene.
  3. Aktiver miOCT-funksjonen for å visualisere implantatplasseringen. Forsikre deg om at implantatet hviler flatt på Bruchs membran i subretinalrommet, med en intakt overliggende netthinne. Forsikre deg om at den ligger en rimelig avstand fra den opprettede retinotomien og ikke hindrer retinotomistedet.
  4. Juster implantatposisjonen med den subretinaale injeksjonskaylen eller en 25 G buet intraokulær saks for å sikre at den er godt plassert under makulaen.

12. miOCT-styrt drenering av subretinalvæske

  1. Bruk en børstet silikonspisskanyle, utfør en væske-luftutveksling og forsiktig subretinal væskedrenering. Forsøk skånsom subretinal væskeaspirasjon fra bleb retinal avløsning og retinotomi kant apposition.
  2. Aktiver miOCT-funksjonen for sanntidsvisualisering av tilstrekkelig subretinal væskedrenering til netthinnen er festet over implantatet.

13. Avslutte operasjonen

  1. Lukk arbeidsportskalerotomien ved hjelp av den forplasserte 7-0 vicryl suturen. Fjern 25 G lysekrone og 25 G infusjonskanyle. Lukk disse sklerotomiene med 7-0 vicryl suturer.
  2. Administrer 2 mg i 0,05 ml intravitreal konserveringsmiddelfritt triamcinolon (40 mg/ml) ved 8-tiden sclerotomi før suturering.
  3. Palpate øyet for å sikre at IOP er innenfor det akseptable området. Injiser filtrert luft (eller BSS) via en 30 G kanyle om nødvendig.
  4. Suturer konjunktivene med 7-0 vicryl suturer og kantomy med 5-0 prolen (fjern etter 10-14 dager).

14. Postoperativ dyrepleie

  1. Plasser NHP med forsiden ned for 1 time etter operasjonen. Ikke la dyret være uten tilsyn før bevisstheten er gjenvunnet. Forsikre deg om at en veterinær og dyrepleietekniker er tilgjengelig for observasjon og støtte under den postoperative prosessen.
  2. Påfør aktuell antibiotika (tobramycin), steroid (deksametason) salve, og homatropin øyedråper to ganger om dagen i 5 dager postoperativt.
  3. Administrer en annen subkutan buprenorfinin (0,005-0,03 mg/kg kroppsvekt) injeksjon 6 timer etter operasjonen for tilstrekkelig smertekontroll.
  4. Returner NHP til selskap av andre dyr bare når det har fullt ut gjenvunnet bevissthet.
  5. Utfør multimodale bildebehandlingsoppfølginger på dag 3, 14 og måned 1 etter prosedyren, etterfulgt av månedlige kontroller. Utfør FEIL hver måned etter prosedyren. Fjern 5-0 prolen suturer for kantomy på dag 14 samtidig med sedasjonsperioden som brukes til multimodal avbildning. De resterende suturene er resorberbare, 7-0 vicryl suturer, som ikke krever fjerning.

15. Postoperative overvåkingsmetoder for multimodal avbildning

  1. Rask NHP over natten. Sedate NHP like før avbildning (se trinn 4.2 for medikament og konsentrasjon for sedasjon). Hvis sedasjon ikke er tilstrekkelig til å stoppe øyebevegelsen, bør du vurdere bruk av generell anestesi.
  2. Påfør 1% tropicamid og 2,5% fenylefrin øyedråper for å oppnå pupill utvidelse før avbildning (se trinn 6.2).
  3. Utfør autofluorescence (AF), fundus fluorescein angiografi (FFA) og optisk koherenstomografi (OCT) ved hjelp av en høyoppløselig OCT-maskin med en 55° feltlinse og 30 ° feltlinse.
    1. Administrer intravenøs 10 % fluorescein (0,1 ml/kg kroppsvekt) for FFA. Hvis du vil ha et bilde i tidlig fase, tar du et bilde innen 30 s etter injeksjon. For en senfaset bilde, ta et bilde 5-10 min etter injeksjonen.
  4. Utfør fundusfotografering ved hjelp av et funduskamera mellom tidlig og sen fase av FFA.

16. Postoperative overvåkingsmetoder for fullfelts elektroretinogramstudier (ERG)

  1. Rask NHP-ene over natten. Sedate NHP før ERG-studier (se trinn 4.2 for medikament og konsentrasjon for sedasjon). Gjennom ERG-opptakene administreres sedasjon på nytt når det er hensiktsmessig.
  2. Separate multimodale avbildninger og ERG-opptak med et intervall på minst 2-3 dager.
  3. Når den er bedøvet, må du sørge for at NHP er mørktilpasset i 30 minutter før ERG-opptaket.
  4. Plasser de subdermale nåleelektrodene i rustfritt stål på venstre og høyre laterale kant (referanseelektroder) og baksiden av NHP-kroppen (bakkeelektrode). Plasser ERG-kontaktlinselektrodene på NHP-hornhinnen ved hjelp av vidisisk gel for å hjelpe til med kontakt og vedheft.
  5. Baser all ERG-testing på de menneskelige protokollene som anbefales av International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV)14. Start ERG-opptak under scotopic forhold og start med dimmer blinker. Følg ISCEV-anbefalingene for anbefalte interstimulusintervaller.
  6. Forsikre deg om at NHP er lett tilpasset i 10 minutter før fotopisk testing, igjen ved hjelp av standard ISCEV-anbefalinger for bakgrunnsstyrke.

17. Eutanasi av NHP

  1. For å avlive NHP for enukleasjon, administrer intravenøs natrium pentobarbital (75 mg /kg), som anbefalt av panelet om eutanasi av American Veterinary Medical Association.

Representative Results

De multimodale avbildningsmodalitetene (fundusfotografering, fundus autofluorescence imaging (FAF), fundus fluorescein angiography (FFA)-early-phase and late-phase, and optical coherence tomography (OCT)) fremhever funksjonene i en vellykket submaculær RPE-grafttransplantasjon (figur 1). Fundusfotografering viser plasseringen av RPE-grafttransplantasjonen ved fovea uten migrasjon over tid. FAF-avbildning viser minimale endringer i hyper-autofluorescens (demonstrert av hvite områder med høy intensitet) som overlapper RPE-transplantatet. Tidlig- og senfase FFA viser ingen åpenbar lekkasje (demonstrert av hvite områder med høy intensitet som forstørres med tiden) rundt RPE-transplantatet. Innledende bilder på dag 3 viser vindusfeil på grunn av fjerning av innfødt RPE før graftimplantasjon. Macular OCT-bilder viser bevaring av ytre netthinnelag (spesielt fotoreseptorlaget) over RPE-transplantatet etter hvert som tiden skrider frem. Hematoksylin og eosinfarging viser intakte netthinnelag uten tegn på mikrotearer. Bevaringen av det ytre kjernefysiske laget over periferiene av transplantatet antyder at RPE-cellene utfører sine fysiologiske funksjoner for å opprettholde fotoreseptorhelsen.

De intraokulære og eksterne visningene av den doble borekanylen 25/41 G fremhever mekanismen som IOP styres av under subretinal injeksjon (figur 2). BSS kommer inn i subretinal plass under subretinal væskeinjeksjon via den sentrale lengre kanylen. Betydelige økninger i intraokulært trykk fører til at BSS i glasslegemet kommer ut av øyet via kanylens større metallboring. BSS reiser deretter langs kanylen og blir til slutt kastet ut fra utgående port nær kanyleknutepunktet. For å vurdere om kanylen fungerer som forventet, må du sørge for at væske strømmer fra utgående port nær kanylenavet.

MiOCT tillater visualisering av bleb-dimensjonene og en potensiell foveal tåre intraoperativt under føveal løsrivelse (figur 3). Figur 3A1-A3 fremhever et tilfelle av bleb med foveal tåre. I figur 3A1, mens den dårligere bleb er synlig under det kirurgiske mikroskopet, er visualisering av tåren vanskelig. Figur 3A2 viser langsgående del av en bleb uten tårer. Figur 3A3 viser en foveal tåre ved vurdering av den vertikale delen av blebben. Figur 3B1-B3 viser en vellykket skapte bleb uten tilstedeværelse av tårer.

Fraværet av betydelig forverring i ERG-bølgeformene tyder på at den globale funksjonen til både stang- og kjeglefotoreseptorer opprettholdes med subretinale RPE xenografts (figur 4). ERG-bølgeformene viser netthinnens generelle funksjon. Spesielt bør det tas hensyn til A-bølgene for å bestemme tap av fotoreseptorfunksjon.

Figure 1
Figur 1: Postoperativ in vivo-analyse med multimodal avbildning. (A) In vivo avbildning av venstre øye submacular RPE graft transplantasjon (gul på fundus fotografering) på ulike bildemodaliteter (venstre til høyre kolonner: fundus fotografering, autofluorescence, fundus fluorescein angiografi-tidlig fase, fundus fluorescein angiografi-sen fase, optisk koherens tomografi) for tidspoeng opptil 3 måneder (topp til bunn rader: Dager 3, 14; Måned 1, 3). Stjernen på fundusfotografiet indikerer stedet for retinotomien; Den hvite stiplede pilen angir retningen på linjeskanningen. Den gule tegnede formen på fundus autofluorescence imaging fremhever plasseringen av transplantasjonen. De hvite trekantene på OCT-bildene angir de respektive sidekantene på transplantatet (i henhold til linjeskanningen på fargefondet). (B) Hematoksylin og eosinfarging av transplantasjonen under atrofisk fovea (på grunn av intraoperativ tåre) med lag merket. Skalalinjer = 1 mm i A (autofluorescence- og FA-bilder), 200 μm i A (OCT-bilder) og 100 μm i B. Forkortelser: FA = fundus angiografi; OKT = optisk koherenstomografi; RGC = retinal ganglion cellelag; INL = indre kjernefysisk lag; ONL = ytre kjernefysisk lag; RPE = retinal pigment epitel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Intraokulære og eksterne visninger av den 25/41 G dobbeltborede kanylen. (A) Intraokulær visning av den 25/41 G dobbeltborede kanylen under subretinal bleboppretting. Den hvite pilen peker på den lengre sentrale kanylen for subretinal injeksjon. Den stiplede pilen peker på åpningen av utgående kanyle som BSS passerer gjennom for å gå ut av øyet. (B) Ekstern visning av 25/41 G kanyle med dobbel boring. Stjernen markerer utgående port nær kanylenavet som den intraokulære BSS dreneres fra. Forkortelse: BSS = balansert saltoppløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Intraoperative mikroskopbilder og miOCT-bilder av subretinal bleb komplisert av en foveal tåre. (A1) Et intraoperativt mikroskopbilde som viser posisjonen til langsgående (blå) og tverrgående (rød) skanninger i en bleb med foveal tåre. (A2) Langsgående miOCT-skanning som viser en subretinal bleb i fovealområdet (gul pil). (A3) Tverrgående miOCT-skanning som fanger en foveal tåre (hvit pilspiss), sammen med en retinotomi (stjerne og en subretinal bleb (gul pil). (B1) Et intraoperativt mikroskopisk bilde som viser posisjonen til langsgående (blå) og tverrgående (røde) skanninger i en vellykket dannet bleb. (B2) Langsgående miOCT-skanning som viser en subretinal bleb i fovealområdet (gul pil). (B3) Tverrgående miOCT-skanning som viser en vellykket opprettet subretinal bleb med en intakt fovea overlegent (hvit diamant). Forkortelse: miOCT = mikroskopintegrert optisk koherenstomografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: ERG av RPE xenograft-transplantert øye. For den funksjonelle vurderingen av netthinnen viser fullfelts ERG-vurderinger av RPE-xenografted øyet utført ved baseline (øverste rad) og 3 måneder etter transplantasjon (nederste rad) ingen signifikant effekt av RPE xenografttransplantasjon på responsamplituder, timing eller bølgeform under enten mørktilpassede eller lystilpassede forhold. Forkortelser: RPE = retinal pigment epitel; ERG = elektroretinogram; DA = mørktilpasset; LA = letttilpasset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Det er to hovedtilnærminger som evalueres for submaculær RPE-transplantasjon - injeksjon av en RPE-suspensjon og transplantasjon av en monolayer RPE-graft. En detaljert sammenligning mellom de to metodene er utenfor omfanget av dette manuskriptet. Imidlertid kan transplantasjonen av en monolayer RPE-graft være fordelaktig ettersom RPE-cellene er mer organisert i et monolayer enn i en suspensjon. RPE-celler i transplantatet er organisert i en konfluent monolayer, som ligner organiseringen av det fysiologiske RPE-cellelaget og gjør det mulig for de transplanterte RPE-cellene å utføre sine fysiologiske funksjoner. Dette muliggjør mer presise doseringsparametere sammenlignet med cellefjæringer, noe som er svært relevant for regulatorisk arbeid og industriell oppskalering.

Levering av RPE patch graft inn i subretinal plass krever forsiktig manipulering av makula og nøyaktig innsetting av graft i subretinal plass. Teknologiske fremskritt innen mikrokirurgi, som miOCT, og en bedre forståelse av intraoperativ retinal vevsdynamikk har redusert læringskurven i denne prosedyren. I denne diskusjonen vil begrunnelsen for følgende aspekter bli forklart: i) preoperativ plasminogeninjeksjon; ii) bruk av intraoperativ miOCT; iii) bruk av en tilpasset 41 G dual-bore kanyle, lave IOP-innstillinger og PFCL for subretinal bleb opprettelse; iv) skraping av det opprinnelige RPE-cellelaget før transplantasjon; v) bruk av sirolimus, triamcinolon, doxycyklin og minocyklin for å redusere immunogen graftavvisning.

Preoperative plasminogeninjeksjoner frigjør parafoveale retinal adhesjoner
I de første eksperimentene var det utfordrende å løsne fovea med en enkelt væskebølge. Ved vurdering med miOCT avslørte bildene tilstedeværelsen av parafoveale ytre retinal adhesjoner til den innfødte RPE sammen med bevis på intraretinale traumer20. Disse adhesjonene kan ha ført til en vertikal utvidelse av bleb i stedet for den subretinale væskebølgen som sprer seg over retinal konturen, noe som resulterer i føveal traumer. Plasminogen er den inaktive forløperen til plasmin, en protease rettet mot fibronectin og laminin. Ocriplasmin er en bioengineered variant av humant plasmin, godkjent av Food and Drug Administration (FDA) og European Medicines Agency (EMA) for behandling av symptomatisk vitreomakulær trekkraft med eller uten samtidig makulade hull. Imidlertid har postapproval rapporter om cystoid makula ødem utvikling etter ocriplasmin injeksjon antydet en mer omfattende effekt av enzymet på netthinnen23.

Selv om de eksakte mekanismene ikke er identifisert, ble det antydet at plasmin kunne svekke retinal vedheft gjennom nedbrytning av interphotoreceptormatriseelementene som er ansvarlige for fotoreseptor-RPE-adhesjon24. I denne protokollen ble NHP-øyne behandlet med intravitreal plasminogen 1 uke før operasjonen for å frigjøre parafoveale ytre retinal adhesjoner. Under forutsetning av at fotoreseptoren-RPE-adhesjonen er svekket, er det nødvendig med en lavere kraft for å løsne den nevrosensoriske netthinnen, inkludert den distale parafoveale ringen, som vanligvis motstår den subretinaale væskebølgen20. Dermed resulterer kraften som administreres under retinal blebavløsning, i utvidelsen av bleb over netthinnekonturen i stedet for å strekke netthinnen tangentielt. Dette reduserer risikoen for føveale tårer. Det skal imidlertid bemerkes at effekten av plasminogen på langsiktig graftoverlevelse ikke ble studert i denne protokollen. Fremtidige studier bør forsøke å fastslå denne effekten.

miOCT gir anatomisk tilbakemelding for å veilede subretinal bleb-opprettelse, graftimplantasjon og subretinal væskedrenering
Intraoperativ, atraaumatisk manipulering av makula er nøkkelen til å oppnå gode transplantasjonsresultater. Imidlertid kan mikrostrukturelle endringer i makula relatert til manipulering ikke alltid være tydelige på operasjonsmikroskopet. I slike prosedyrer er miOCT et viktig verktøy som gir sanntids, tredimensjonal, intraoperativ tilbakemelding av den makulære strukturen. miOCT er spesielt nyttig i løpet av trinnene for føveal løsrivelse, graftimplantasjon og drenering av subretinalvæsken ved hjelp av en væske-luftutveksling. Under føveal løsrivelse kan miOCT bestemme blebens vertikale og horisontale dimensjoner. Foveale mikrotearer, som kanskje ikke visualiseres tydelig på det kirurgiske mikroskopet, kan bekreftes av miOCT (figur 3). Under graftimplantasjonen veileder miOCT-bilder ved å vise graftets plassering eller nærhet til fovea, gjennom den ofte mindre gjennomsiktige, frittliggende netthinnen. miOCT kan også fremheve mulige områder med retinal vedheft under en vanskelig transplantasjonsprosess25. Til slutt, i den subretinaale væskedreneringsprosessen, kan miOCT pålitelig lede subretinal væskedrenering til fullstendig retinal-RPE graft kontakt oppnås.

Kombinasjonen av en dobbelboret kanyle, lave IOP-innstillinger og PFCL glasslegemet tamponade reduserer synergistisk makulatraumer under subretinal bleb-opprettelse
Tangentiell retinal strekk og væsketurbulens kan oppstå under subretinal BSS injeksjon for føveal løsrivelse fører til uønskede foveal tårer. For å motvirke disse fenomenene har faktorer som relativ posisjon og avstand fra føvesenteret der injeksjonen er initiert, injeksjonsvolum og hastighet, glasslegemet tamponade, valg av subretinal instrumentering og IOP vist seg å være relevant20,26,27. Den subretinale bleb for føveal løsrivelse bør ligge på et sted tilstrekkelig fjernt fra fovea, da retinal strekk kan være høyest på bleb initieringsstedet27. IOP bør også holdes lavt gjennom opprettelsen av subretinal bleb. Når øyets IOP er høy, observeres en høyere vertikal økning i blebstørrelse i stedet for ekspansjon langs netthinnens kontur, mens blebene er grunnere ved lavere trykk20. Videre, selv om en intravitreal injeksjon på 50 μL effektivt vil doble IOP hos mennesker28, gitt kortere øyelengde i NHPer, vil IOP-økningen under subretinal injeksjon sannsynligvis være høyere og raskere enn hos mennesker. Mens de fleste vitrektomimaskiner justerer for IOP-svingninger, er justeringen ikke en samtidig, men snarere en reaktiv prosess som oppstår som subretinal injeksjon fortsetter. Jo høyere IOP er, jo høyere er risikoen for retinal overstretching og resulterende føveal traumer. Dermed er det viktig å opprettholde en stabil lav IOP under subretinal injeksjon.

En kommersiell 20/41 G (DORC) eller en skreddersydd 25/41 G toboret subretinal kanyle anbefales for subretinal injeksjon. Kanylen gjør det mulig for væske å gå ut av glasslegemet i bytte mot BSS injisert i subretinale rommet. Dette sikrer "samtidig" regulering av IOP under subretinal injeksjon. En skjematisk av den doble borekanylen er sett i figur 2. Til slutt brukes PFCL for å redusere risikoen for foveale tårer20,26,27. Ettersom PFCLer, som oktalin, har høyere spesifikk tyngdekraft, utøver de en nedadgående kraft på netthinnen under føveal løsrivelse29. Dette stabiliserer ytterligere føveal løsrivelse bleb opprettelsesprosessen og forbedrer utvidelsen av bleb langs retinal konturen. Denne teknikken har blitt brukt til subretinal injeksjon av rtPA i innstillingen av massiv submacular blødning på grunn av nAMD30.

Fjerning av pretransplantasjon av opprinnelig RPE tillater restaurering av RPE-fotoreseptorkompleks
Vert RPE bør fjernes før grafttransplantasjon. Dette skyldes at restaureringen av RPE-fotoreseptorkomplekset er nødvendig for at RPE-transplantasjonen skal kunne utføre sine fysiologiske funksjoner for å støtte fotoreseptorene21. Verten RPE, hvis den ikke fjernes, kan utgjøre en mekanisk barriere, noe som forhindrer restaurering av dette komplekset. Det kan fjernes enten gjennom administrering av RPE-giftige kjemikalier eller ved å bruke fysiske metoder for fjerning. Kjemiske fjerningsmetoder inkluderer systemisk eller subretinal administrering av natrium iodate31,32. Ettersom natrium iodate forårsaker utbredt degenerasjon av fotoreseptorer, RPE celler, og Choriocapillaris når administreres, dens retinal og systemisk toksisitet utelukker bruk for menneskelige studier32,33. Derfor foretrekkes fysiske intraoperative teknikker. Ulike fysiske metoder har blitt konseptualisert. Når fysiske metoder benyttes, er det avgjørende at Bruchs membran forblir uskadd. Mange in vitro-studier har vist avhengigheten av RPE-graftoverlevelse på en intakt Bruchs membran34,35,36.

Forsøk på hydraulisk debridering var forbundet med brudd i Bruchs membran, økt grad av epiretinal membranutvikling og proliferativ vitreoretinopati, noe som resulterte i trekkraft retinal løsrivelse37. En diamant-støvet spatel foreslått for RPE debridement førte også til brudd i Bruch membran, noe som resulterte i cellulær spredning fra choroid inn i subretinal plass38. Interessant nok kan et skreddersydd uttrekkbart sløyfeinstrument fjerne den overdrevne RPE med bevaring av Bruchs membran i øynene til kaniner og griser11,39. Fjerningen av den underliggende RPE er også nyttig for å etablere dyremodeller med RPE og ytre retinal atrofi, som ligner den avanserte atrofiske formen for AMD. Når et fokusområde av RPE fjernes fra makula, lukkes RPE-såret via hypertrofien til de resterende RPE-cellene. Imidlertid er denne sårhelingsresponsen forbundet med atrofi av det ytre kjernefysiske laget40. Mens opprettelsen av en dyremodell er utenfor omfanget av dette manuskriptet, kan en lignende prosedyre skape en dyremodell av en avansert atrofisk AMD-fenotype for testing av RPE-avledede celleterapeutiske.

Bruk av sirolimus, triamcinolon, doxycyklin og minocyklin for å redusere immunogen graftavvisning
Det subretinale rommet antas å være et immunprivilegert sted, vedlikeholdt av en intakt blodretinal barriere og andre faktorer41. I mange studier som involverer subretinal transplantasjon av stamcellederivater med en intakt blodretinal barriere, spiller immundempende medikamenter en ubetydelig rolle i graftoverlevelse42. Den ytre blod-retinal barrieren antas å være dannet av det opprinnelige RPE-laget og de tette kryssene mellom RPE-cellene. Mens innfødt RPE-fjerning gir bedre integrasjon av transplanterte RPE og vert fotoreseptorer, blir blod-retinal barrieren forstyrret i prosessen, noe som øker sannsynligheten for immunavvisning. Klassisk er T-celler sentrale i prosessen med transplantasjonsavvisning av andre organer som nyre og lever43. Derfor ble innledende immundempende regimer for retinal vevstransplantasjon rettet mot å redusere disse adaptive immunresponsene.

Sirolimus, et mekanistisk mål for rapamycinhemmer, og takrolimus, en kalsineurinhemmer, er eksempler på immundempende medikamenter rettet mot adaptive immunresponser. Til tross for tilstrekkelig T-celleundertrykking forblir imidlertid graftoverlevelsesraten lav. I tillegg er RPE-celler kjent for å undertrykke T-celleaktivering gjennom frigjøring av hemmende faktorer og fremme generering av regulatoriske T-celler44. Derfor har det blitt stadig tydeligere at adaptiv immunitet kanskje ikke er den eneste bidragsyteren til graftavvisning42. Subretinal transplantasjon av cellulære produkter kan føre til akkumulering og aktivering av mikroglia45.

Mikroglia er makrofagene i netthinnen. De består av to hovedpopulasjoner: 1) perivascular mikroglia av den indre retinal vaskulaturen og 2) mikroglia i retinal vev parenchyma. Siden mikroglia er en del av den medfødte immunresponsen, kan intravitreale glukokortikoider, som triamcinolon, undertrykke cytokinmediert spredning46. Doxycyklin og minocyklin kan også undertrykke mikroglial aktivering og bør betraktes som47,48. Til slutt er forskjeller i immunavvisning av RPE-allografter versus xenografter ufullstendig forstått49. For eksempel har alloantistoffer mot induserte pluripotente stamcelleavledede RPE-celler blitt rapportert i serumet til in vivo immunavvisningsmodeller. Imidlertid er rollen til disse antistoffene og betydningen av antistoffmediert avvisning i graftoverlevelse fortsatt ukjent50. Derfor foreslås det en kombinasjon av triamcinolon, doxycyklin og minocyklin for medfødt immunitetsundertrykking. Dette regimet har blitt vellykket brukt hos kaniner med gode graftoverlevelsesresultater og minimale systemiske effekter11.

Begrensninger ved denne kirurgiske teknikken
Dette dokumentet beskriver en mulig kirurgisk metode for å levere et RPE-graftark i det subretinale rommet til NHP; Dette betyr imidlertid ikke at dette er den eneste optimaliserte måten. Ulike vitreo-retinal kirurger kan ha andre preferanser for instrumentering og teknikk. For eksempel kan denne implantasjonsenhetsdesignen bare levere flate implantater som støttes med en stivere cellebærer og kan derfor ikke være egnet for relativt fleksible (eller rullede) implantater. RPE suspensjon transplantasjoner kan utelate mye av denne teknikken. Følgelig vil kirurgiske detaljer kreve modifikasjon basert på hver leveringsstrategi.

Ettersom interessen for cellulære terapeutiske behandlinger for behandling av degenerative netthinnesykdommer fortsetter å vokse, vil NHP-dyremodellen være avgjørende i prekliniske studier for å studere faktorene som påvirker RPE-graftoverlevelse. I dette manuskriptet foreslås strategier for å muliggjøre jevnere levering av en submaculær monolayer RPE-graft i NHP-øyet. Metoder for bedre visualisering av intraoperative komplikasjoner anbefales også. Det forventes at disse metodene vil fortsette å forbedre seg etter hvert som bruken av cellulære terapeutiske midler utvides. Fremtidige metodepapirer bør også vurdere å foreslå en omfattende liste over undersøkelser for å vurdere ulike strukturelle og funksjonelle aspekter ved transplantatet.

Disclosures

Boris Stanzel har et amerikansk patent 9980851 på et instrument (RPE scraper) som brukes i denne studien. Foredragsholder æresbelønning fra C. Zeiss Meditec og Geuder til Boris Stanzel. De andre forfatterne har ingen interessekonflikt å erklære.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, Singapore (H17/01/a0/013), NUS Start-up grant NUHSRO/2016/100/SU/01, NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) stipend og National Research Foundation Competitive Research Programme, Singapore (NRF-CRP21-2018-0008) til X.S., Hong Leong Endowed Professorship midler til G.E.H. og B.V.S. Vi vil gjerne anerkjenne veterinærteamet ved Translational Pre-Clinical Model Platform (Singapore Eye Research Institute, Singapore) for å gi støtte i NHP-kirurgiforberedelse og dyreoppfølging. Vi ønsker å utvide vår takknemlighet til Jill Teo og kolleger fra C. Zeiss Meditec Singapore for teknisk støtte for OPMI-Lumera 700 med integrert intraoperativ OCT-enhet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation Alcon SIN 4715P Surgical procedure
10% Neutral buffered formalin Leica 3800598 Histology procedure
2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution Alcon No. 01785 Surgical procedure
25 G AWH Vivid Chandelier Synergetics 56.54.25P Surgical procedure
25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack Bausch & Lomb SE5525WVB Surgical procedure
AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation Abbott Medical Optics 15020 Surgical procedure
Apo-minocycline Apotex Inc 2084104 Immunosuppression
AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v Aurolab TN 00002387 Surgical procedure
Autoclave MELAG, Vacuklav MELAG 1131-B2300 Surgical procedure
Autostainer XL (ST5010) Leica 2433 Histology procedure
Balanced Saline Solution Beaver Visitec 581732 Surgical procedure
Cotton Bud WINNER MEDICAL 1NA6-100 Surgical procedure
Diagnosys Espion E3 Console Diagnosys 272 Ophthamic imaging
Doxycycline Yung Shin MAL 19950403AEZ Immunosuppression
Eosin Y Merck Millipore 1.15935.0100 Histology procedure
ERG-Jet contact lens electrodes Fabrinal F-06 Ophthamic imaging
Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G MedOne 3247 Surgical procedure
FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm MedOne 3222 Surgical procedure
Fluoresceine 10% Faure Curatis AG 5030376 Ophthamic imaging
Gauze Swab WINNER MEDICAL 1NP3275 Surgical procedure
Hamilton gas tight syringe 250 µL Hamilton 81101 Surgical procedure
Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System Heidelberg Engineering N.A. Ophthamic imaging
Hematoxylin Gill II Merck Millipore 3801520 Histology procedure
Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V) Nikon 33131 Histology procedure
Ketamin injection Ceva 37711/58317 Surgical procedure
Lithium carbonate Merck Millipore 1.05680.0250 Histology procedure
Monkey plasminogen Molecular Innovations SKU-CYPLG Surgical procedure
Non-contact wide angled 128 degree fundus lens C. Zeiss Medtech Resight 700 Surgical procedure
Non-woven Ophthalmic Drape Alcon 8065103120 Surgical procedure
Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G Alcon 8065912001 Surgical procedure
Paraffin Embedding Station Leica EG1150 H Histology procedure
Paraplast High Melt Paraffin Leica 39601095 Histology procedure
Phloxin B Merck Millipore 1.15935.0025 Histology procedure
Prepowdered Surgical Gloves MAXITEX 85-173-2/85-173-3/85-173-4 Surgical procedure
PRODINE Povidone-Iodine Solution BP ICM PHARMA PMLBLP20-01 Surgical procedure
Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB) Righton-Oph 5200162 Ophthamic imaging
Rotary microtome Leica RM2255 Histology procedure
Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0 B.Braun G1048711 Surgical procedure
SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL Yung Shin SHI40 SGP-2610015-001 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 21 G B.Braun 4657527 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 23 G B.Braun 4657667 Surgical procedure
Sirolimus Pfizer SIN12034P Immunosuppression
Stainless steel subdermal needle electrode OcuScience F-E2 Ophthamic imaging
Stellaris Elite vision enhancement system Bausch & Lomb BL15455 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm B.Braun 4665406 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm B.Braun 4656300 Surgical procedure
Surgical gown + 2 Hand Towels STERIL APP10 00 01 Surgical procedure
Tegaderm Film 3M 1626W Surgical procedure
TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G Teruma SS-01S Surgical procedure
TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-03L Surgical procedure
TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-05L Surgical procedure
TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment Alcon No. 01577 Surgical procedure
Topcon Retinal Camera TRC-50DX Topcon 948605 Ophthamic imaging
Vidisic Gel Bausch & Lomb GB41789155517 Surgical procedure
Xylazil-20 Ilium 38653/50276 Surgical procedure
Zeiss Opmi Rescan 700 Carl Zeiss Meditec AG 7210 Surgical procedure

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Progress in Retinal and Eye Research. 66, 157-186 (2018).
  3. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  4. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  5. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  6. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  7. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  8. Sugita, S., et al. HLA-matched allogeneic iPS cells-derived RPE transplantation for macular degeneration. Journal of Clinical Medicine. 9 (7), 2217 (2020).
  9. Gouras, P., Flood, M. T., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured human retinal cells to monkey retina. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 56 (4), 431-443 (1984).
  10. Koster, C., et al. A systematic review on transplantation studies of the retinal pigment epithelium in animal models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2719 (2020).
  11. Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
  12. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  13. Ben M'Barek, K., et al. Clinical-grade production and safe delivery of human ESC derived RPE sheets in primates and rodents. Biomaterials. 230, 119603 (2020).
  14. Fujii, S., et al. A strategy for personalized treatment of iPS-retinal immune rejections assessed in cynomolgus monkey models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3077 (2020).
  15. Kolb, H., Nelson, R., Ahnelt, P., Ortuño-Lizarán, I., Cuenca, N. The Architecture Of The Human Fovea. Webvision. Moran Eye Center. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-ii-anatomy-and-physiology-of-the-retina/the-architecture-of-the-human-fovea/ (2021).
  16. Francis, P. J., et al. Rhesus monkeys and humans share common susceptibility genes for age-related macular disease. Human Molecular Genetics. 17 (17), 2673-2680 (2008).
  17. Picaud, S., et al. The primate model for understanding and restoring vision. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26280-26287 (2019).
  18. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  19. Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e53927 (2016).
  20. Tan, G. S. W., et al. Hints for gentle submacular injection in non-human primates based on intraoperative OCT guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10 (2021).
  21. Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  22. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  23. Shaikh, M., Miller, J. B., Papakostas, T. D., Husain, D. The efficacy and safety profile of ocriplasmin in vitreomacular interface disorders. Seminars in Ophthalmology. 32 (1), 52-55 (2017).
  24. Johnson, M. W., Fahim, A. T., Rao, R. C. Acute ocriplasmin retinopathy. Retina. 35 (6), 1055-1058 (2015).
  25. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  26. Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 358 (21), 2240-2248 (2008).
  27. Xue, K., Groppe, M., Salvetti, A. P., MacLaren, R. E. Technique of retinal gene therapy: delivery of viral vector into the subretinal space. Eye. 31 (9), 1308-1316 (2017).
  28. Grzybowski, A., et al. Update on intravitreal injections: Euretina Expert Consensus Recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
  29. Wong, D., Williams, R., Stappler, T., Groenewald, C. What pressure is exerted on the retina by heavy tamponade agents. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 474-477 (2005).
  30. Steel, G. B., Kearns, V., Stanzel, B. V., Wong, D. Subretinal injection under perfluorocarbon liquids to avoid foveal dehiscence. Retina. , (2021).
  31. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  32. Koh, A. E. -H. Retinal degeneration rat model: A study on the structural and functional changes in the retina following injection of sodium iodate. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 196, 111514 (2019).
  33. Bürgi, H., Schaffner, T. H., Seiler, J. P. The toxicology of iodate: a review of the literature. Thyroid. 11 (5), 449-456 (2001).
  34. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  35. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 235 (1), 41-47 (1997).
  36. Castellarin, A. A., et al. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane. Experimental Eye Research. 66 (1), 49-67 (1998).
  37. Lopez, P. F., et al. Retinal pigment epithelial wound healing in vivo. Archives of Ophthalmology. 113 (11), 1437-1446 (1995).
  38. Lopez, R., Gouras, P., Brittis, M., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured rabbit retinal epithelium to rabbit retina using a closed-eye method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (7), 1131-1137 (1987).
  39. Thieltges, F., et al. Localized RPE removal with a novel instrument aided by viscoelastics in rabbits. Translational Vision Science & Technology. 5 (3), 11 (2016).
  40. Phillips, S. J., et al. Autologous transplantation of retinal pigment epithelium after mechanical debridement of Bruch's membrane. Current Eye Research. 26 (2), 81-88 (2003).
  41. Sugita, S., Mandai, M., Kamao, H., Takahashi, M. Immunological aspects of RPE cell transplantation. Progress in Retinal & Eye Research. , (2021).
  42. Xian, B., Huang, B. The immune response of stem cells in subretinal transplantation. Stem Cell Research & Therapy. 6, 161 (2015).
  43. Issa, F., Schiopu, A., Wood, K. J. Role of T cells in graft rejection and transplantation tolerance. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (1), 155-169 (2010).
  44. Yan, F., et al. Transforming growth factor-β2 increases the capacity of retinal pigment epithelial cells to induce the generation of regulatory T cells. Molecular Medicine Reports. 13 (2), 1367-1372 (2016).
  45. Singhal, S., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans and microglia prevent migration and integration of grafted Müller stem cells into degenerating retina. Stem Cells. 26 (4), 1074-1082 (2008).
  46. Singhal, S., Lawrence, J. M., Salt, T. E., Khaw, P. T., Limb, G. A. Triamcinolone attenuates macrophage/microglia accumulation associated with NMDA-induced RGC death and facilitates survival of Müller stem cell grafts. Experimental Eye Research. 90 (2), 308-315 (2010).
  47. Santa-Cecília, F. V., et al. Doxycycline suppresses microglial activation by inhibiting the p38 MAPK and NF-kB signaling pathways. Neurotoxicity Research. 29 (4), 447-459 (2016).
  48. Scholz, R., et al. Minocycline counter-regulates pro-inflammatory microglia responses in the retina and protects from degeneration. Journal of Neuroinflammation. 12, 209 (2015).
  49. Sugita, S., Makabe, K., Iwasaki, Y., Fujii, S., Takahashi, M. Natural killer cell inhibition by HLA-E molecules on induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (5), 1719-1731 (2018).
  50. Sugita, S., et al. Detection of retinal pigment epithelium-specific antibody in iPSC-derived retinal pigment epithelium transplantation models. Stem Cell Reports. 9 (5), 1501-1515 (2017).

Tags

Medisin utgave 172

Erratum

Formal Correction: Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases
Posted by JoVE Editors on 12/29/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR),
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

to:

Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

Retinal pigment epiteltransplantasjon i en ikke-menneskelig primatmodell for degenerative netthinnesykdommer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., … More

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., Wong, W., Holder, G. E., Amutha Barathi, V., Lingam, G., Su, X., Stanzel, B. V. Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. J. Vis. Exp. (172), e62638, doi:10.3791/62638 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter