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Transplantation d’épithélium pigmentaire rétinien dans un modèle de primate non humain pour les maladies dégénératives de la rétine

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62638
Automatic Translation
*1,2, *1,3,4, 1, 2, 1,2,5, 1,4,6, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 4Singapore Eye Research Institute (SERI), 5UCL Institute of Ophthalmology, 6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Le primate non humain (PSN) est un modèle idéal pour étudier les thérapies cellulaires rétiniennes humaines en raison des similitudes anatomiques et génétiques. Ce manuscrit décrit une méthode de transplantation sous-maculaire de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dans l’œil NHP et des stratégies pour prévenir les complications peropératoires associées à la manipulation maculaire.

Abstract

La transplantation épithéliale pigmentaire rétinienne (EPR) est très prometteuse pour le traitement des maladies dégénératives rétiniennes héréditaires et acquises. Ces conditions comprennent la rétinite pigmentaire (RP) et les formes avancées de dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), telles que l’atrophie géographique (GA). Ensemble, ces troubles représentent une proportion importante de la cécité actuellement incurable dans le monde. Ces besoins médicaux non satisfaits ont suscité un intérêt accru de la part des universitaires pour l’élaboration de méthodes de remplacement de l’EPR. Parmi les modèles animaux couramment utilisés pour les essais précliniques de produits thérapeutiques, le primate non humain (PSN) est le seul modèle animal qui a une macula. Comme il partage cette similitude anatomique avec l’œil humain, l’œil NHP est un modèle animal préclinique important et approprié pour le développement de médicaments de thérapie innovante (ATMP) tels que la thérapie cellulaire RPE.

Ce manuscrit décrit une méthode de transplantation sous-maculaire d’une monocouche RPE, cultivée sur un support cellulaire de polyéthylène téréphtalate (PET), sous la macula sur une plaie RPE créée chirurgicalement dans les PSN immunodéprimés. La fovéa - la partie avasculaire centrale de la macula - est le site de la plus grande faiblesse mécanique pendant la transplantation. Un traumatisme fovéal se produira si l’injection initiale de liquide sous-rétinien génère une force excessive sur la rétine. Par conséquent, une injection lente sous tamponnade vitréenne liquide perfluorocarboné (PFCL) est recommandée avec une canule d’injection sous-rétinienne à double alésage à basse pression intraoculaire (PIO) pour créer un bleb rétinien.

Un prétraitement par injection intravitréenne de plasminogène pour libérer des adhérences parafoveal RPE-photorécepteurs est également conseillé. Ces stratégies combinées peuvent réduire la probabilité de déchirures fovéales par rapport aux techniques conventionnelles. Le PSN est un modèle animal clé dans la phase préclinique du développement de la thérapie cellulaire RPE. Ce protocole aborde les défis techniques associés à l’administration de la thérapie cellulaire RPE dans l’œil NHP.

Introduction

La transplantation d’EPR est très prometteuse pour le traitement des maladies dégénératives rétiniennes héréditaires et acquises. Ces conditions comprennent la rétinite pigmentaire (RP, dystrophie du cône de bâtonnet) et les formes avancées de DMLA telles que GA. Collectivement, ces troubles représentent une proportion importante de la cécité actuellement incurable dans le monde1,2. Les stades avancés de la DMLA sont classés en DMLA néovasculaire (nAMD) et GA. Bien qu’il existe des options de traitement efficaces pour la dMLA, telles que les injections de facteur de croissance endothélial anti-vasculaire (anti-VEGF), les patients atteints d’AG ont des options de traitement limitées. La RP est un groupe très hétérogène de troubles rétiniens héréditaires caractérisés par une dégénérescence progressive des photorécepteurs rétiniens. Chez certains patients, le défaut génétique causal est situé dans l’EPR plutôt que dans les photorécepteurs; par conséquent, la thérapie de remplacement de l’EPR peut être une stratégie alternative si la thérapie génique n’est pas réalisable.

Il y a un intérêt important à développer des traitements efficaces pour ces conditions. En particulier, la transplantation d’EPR a gagné du terrain en tant qu’approche thérapeutique potentielle3,4,5,6,7,8. Depuis que les premiers rapports sur la transplantation d’EPR sont apparus dans les années 19809, le domaine s’est élargi pour inclure diverses sources de cellules d’EPR, des stratégies d’administration et des modèles expérimentaux de maladie et de transplantation10,11,12,13,14. Parmi les différents modèles animaux, seul le PSN possède une « macula lutea » avec une « fovéa centralis », une spécialisation anatomique au pôle postérieur de la rétine partagée avec l’homme. La fovéa contient une très haute densité de photorécepteurs coniques permettant une vision centrale à haute résolution15. Le PSN a également une composition génomique et protéomique similaire16 par rapport aux humains. Ces similitudes en font un modèle animal important et approprié pour l’étude des maladies oculaires qui affectent la rétine humaine17,18.

Ce manuscrit décrit une méthode de transplantation sous-maculaire d’une xénogreffe RPE, soutenue par un porteur de cellules PET, chez les PSN immunodéprimés. Une technique transvitréenne de transplantation d’EPR sous-rétinienne chez le lapin a été décrite dans un manuscrit précédent19. Cependant, chez les PSN, la présence de la fovéa nécessite une attention particulière lors des manipulations peropératoires20. En particulier, il existe un risque élevé de déchirure fovéale si les méthodes d’injection de liquide sous-rétinien génèrent une force excessive sur la rétine20. Ce manuscrit se concentre donc sur les stratégies visant à réduire le risque de traumatisme fovéal accidentel chez les PSN.

Il s’agit notamment de l’utilisation de l’injection intravitréenne préopératoire de plasminogène pour la libération d’adhérences parafovéales et de la tomographie par cohérence optique intégrée au microscope chirurgical (miOCT) en peropératoire pour la visualisation en temps réel de l’anatomie fovéale. Une canule sous-rétinienne à double alésage de 25/41 G sur mesure avec tamponnade intraoculaire PFCL sous faible PIO est proposée pour permettre un processus plus contrôlé de détachement fovéal. De plus, l’ablation chirurgicale de l’EPR native est recommandée avant l’implantation pour permettre une meilleure intégration entre les cellules RPE transplantées et les photorécepteurs hôtes. Enfin, un protocole d’immunosuppression systémique péri- et postopératoire pour les modèles de PSN est décrit pour améliorer la survie de la xénogreffe RPE après la transplantation11,21.

Protocol

REMARQUE: Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément à l’Association of Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision. L’approbation éthique a été obtenue auprès du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux, SingHealth, Singapour. Les animaux ont été hébergés au SingHealth Experimental Medicine Centre approuvé par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Cette approbation souligne que toutes les expériences sur les animaux sont conformes aux normes du Comité consultatif national pour la recherche sur les animaux de laboratoire établies par l’Autorité agroalimentaire et vétérinaire de Singapour. Le protocole expérimental suivant a été établi sur la base d’expériences menées dans 6 yeux de 6 Macaca fascicularis (4 mâles et 2 femelles, 4 à 6 ans, 2,8 à 4,0 kg ).

1. Atteindre l’immunosuppression dans le modèle de PSN

  1. Commencez l’immunosuppression 7 jours avant la chirurgie et poursuivez l’immunosuppression tout au long de la période de suivi.
  2. Peser le PSN avant l’administration de l’immunosuppression systémique pour assurer un dosage précis du médicament. L’animal est pesé au départ et chaque semaine par la suite.
  3. Utilisez le sirolimus oral, la doxycycline et la minocycline pour obtenir une immunosuppression systémique.
    1. Administrer une dose de charge de 2 mg de sirolimus par voie orale suivie d’une dose d’entretien quotidienne de 1 mg. Obtenir le taux de sirolimus sanguin de base avant l’administration et le surveiller tout au long de la période de suivi. Assurer une concentration d’au moins 5 μg/L pour une immunosuppression adéquate.
      REMARQUE: La dose de sirolimus n’est pas adaptée au poids.
    2. Administrer une dose de 7,5 mg/kg de doxycycline par voie orale par jour, deux fois par jour.
    3. Administrer une dose de 7,5 mg/kg de minocycline par voie orale par jour, deux fois par jour.
  4. Pendant l’immunosuppression, surveillez tous les PSN pour détecter les effets systémiques indésirables. Recherchez une perte de poids corporel significative (>10%), une diminution de l’appétit et de la consommation d’eau, une perte de cheveux non damée et un comportement anormal tel que l’agressivité et la léthargie. Les évaluations seront effectuées les jours 3, 14 et 1 mois, suivies d’évaluations mensuelles.

2. Stérilisation des instruments

  1. Rincez les instruments chirurgicaux à l’eau distillée.
  2. Placez les instruments dans un bain à ultrasons rempli de 500 mL d’eau distillée et de 2 mL de désinfectant pour instruments. Nettoyez les instruments à l’aide de la fonction de balayage du bain à ultrasons pendant 15 minutes.
  3. Retirez les instruments du bain à ultrasons. Rincer deux fois à fond avec de l’eau distillée pendant 5 min à chaque rinçage. Séchez les instruments à l’air libre après le rinçage.
  4. Placez les instruments dans une boîte à instruments. Autoclavez la boîte en utilisant le réglage universel du programme (stérilisation des instruments à 134 °C pendant 50 min: 30 min pour l’autoclavage, 20 min pour le séchage).

3. Préparation de triamcinolone sans conservateur (40 mg/mL)

  1. À l’aide d’une seringue de 1 mL, prélever 1 mL de solution de triamcinolone (10 mg/mL). Transférer dans un tube conique de 15 mL et mélanger avec 4 mL de solution saline équilibrée stérile (BSS).
  2. Centrifuger la solution à 120 × g pendant 5 min. Assurez-vous que toutes les particules de triamcinolone se trouvent au fond du tube conique. Jeter le surnageant (BSS) du tube conique.
  3. Remettez en suspension les particules de triamcinolone avec 5 mL de BSS stérile dans le tube conique. Centrifuger la solution à 120 × g pendant 5 min. Jetez à nouveau le surnageant.
  4. Répétez l’étape 3.3 pour terminer le lavage des particules de triamcinolone avec BSS (3x).
  5. Remettez en suspension les particules de triamcinolone avec 0,25 mL de BSS stérile pour atteindre une concentration de 40 mg/mL.
  6. Aspirer la triamcinolone en suspension (40 mg/mL) avec une nouvelle seringue de 1 mL. Fixez une aiguille de flûte à pointe émoussée de 25 G et gardez la seringue avec la solution de triamcinolone prête pour une utilisation peropératoire.

4. Prétraitement des yeux PSN avec du plasminogène intravitréen (0,25 μg/μL)

  1. Une semaine avant la chirurgie, administrer une injection intravitréenne (20 μL) de plasminogène de singe (0,25 μg/μL).
  2. Sédater le PSN avant la procédure avec une injection intramusculaire de kétamine (10-20 mg/kg p.c.) et une injection sous-cutanée d’atropine (0,05 mg/kg p.c.). Administrer des gouttes oculaires de tétracaïne pour l’anesthésie locale.
  3. Avant l’injection intravitréenne, désinfecter la région périorbitaire avec 10% de povidone-iode. Désinfectez l’œil en administrant 5% de povidone-iode aux fornices conjonctivaux du PSN. Assurez-vous que la solution reste dans les fornices pendant au moins 1 min avant de bien rincer avec du BSS stérile.
  4. Utilisez une seringue de 250 μL pour aspirer le plasminogène de singe prédilué (0,25 μg/μL) du flacon. Fixez une aiguille de 30 G à la seringue et gardez le plasminogène de singe prêt pour l’administration intravitréenne.
  5. Utilisez une paire d’étriers pour identifier le site d’injection sur l’œil. Administrer l’injection intravitréenne à 3 mm des limbes.
  6. Procéder à l’injection avec l’aiguille dirigée vers le centre du globe. Lors du retrait de l’aiguille du globe, utilisez un bâton applicateur en coton pour tamponner le site d’injection et prévenir le reflux du contenu intraoculaire.
  7. Administrer un gel lubrifiant ou une pommade pour réduire l’irritation immédiate de la surface oculaire postopératoire.

5. Installation de la table chirurgicale et de l’équipement

  1. Établissez un champ stérile. Lorsque vous êtes dans le champ stérile, portez des gommages chirurgicaux, un masque et une couverture capillaire en tout temps.
  2. Préparer la triamcinolone sans conservateur (40 mg/mL) pour la visualisation peropératoire du vitré (voir rubrique 3). Préparer le BSS stérile dans une seringue de 10 mL et le lubrifiant dans une seringue de 5 mL. Placez-les sur un drapé.
  3. Gardez les autres instruments prêts sur un drapé, y compris la soie 3-0, les sutures de vicryl 7-0, les bâtonnets d’applicateur en coton, les bandes de fermeture des plaies et le fil de fibre d’endoillumination du lustre.
  4. Connectez l’ensemble de vitrectomie, y compris le vitrétiseur à grande vitesse, la cassette Venturi et l’endoilluminateur de lustre 25 G à la machine de vitrectomie en utilisant une technique stérile.
  5. Ouvrez une bouteille BSS de qualité ophtalmique de 500 mL et connectez-la à la cassette Venturi conformément aux instructions du fabricant. Procédez à l’amorçage du système.
  6. Allumez le microscope miOCT/chirurgical. Sélectionnez les configurations prédéfinies du microscope chirurgical pour la chirurgie du segment postérieur et l’éclairage. Entrez les détails de la procédure, y compris l’ID, le sexe, la latéralité de l’œil animal et le nom de la procédure.
  7. Montez une lentille de fond d’œil sans contact, grand angle et à 128 degrés.
  8. Fixez des couvercles stériles jetables à main sur le microscope chirurgical / miOCT. Ajustez la position du microscope et faites la mise au point à l’aide de la pédale. Procéder à la chirurgie.

6. Préparation de l’anesthésie et positionnement de l’animal (de préférence effectué par une équipe vétérinaire)

  1. Assurez-vous que le PSN est à jeun pendant au moins 8 h avant l’induction de l’anesthésie pour prévenir les régurgitations et les vomissements. Sédez le PSN avant l’induction de l’anesthésie (voir l’étape 4.2 pour les instructions de sédation).
  2. Appliquer 1% de tropicamide et 2,5% de collyre de phényléphrine au moins 3x avec des intervalles de 5 minutes pour obtenir une dilatation de la pupille.
  3. Administrer une injection intramusculaire de buprénorphine (0,005-0,03 mg/kg p.c.) 30 min avant la chirurgie pour obtenir une analgésie.
  4. Intuber le PSN avec un tube endotrachéal, généralement de 3 à 5 mm. Lorsque vous tentez l’intubation, assurez-vous que plusieurs tailles sont disponibles. Utilisez la plus grande taille qui peut être passée à travers le larynx sans causer de traumatisme. Mesurer le CO2 de marée final pour assurer un placement approprié du tube endotrachéal.
  5. Administrer 2% de gaz isofluoré via le tube endotrachéal pour induire une anesthésie générale. Confirmer l’état de l’anesthésie générale (absence de réponse au toucher) en évaluant la réponse du PSN aux stimuli environnants, y compris les sons et le toucher. Utilisez 0,5 à 2% d’isofluorane gazeux pour maintenir l’état d’anesthésie générale.
  6. Surveillez en permanence l’électrocardiogramme NHP, la fréquence respiratoire, la pression artérielle et la saturation en oxygène pendant toute la chirurgie.
  7. Positionnez le PSN sur la table chirurgicale de manière à ce que l’œil soit perpendiculaire au microscope chirurgical. Administrer un gel lubrifiant ou une pommade à l’œil, qui n’est pas opéré pour réduire l’irritation de la surface oculaire pendant l’anesthésie.
  8. Coupez les cils à l’aide de ciseaux pour réduire le risque d’infections.
  9. Désinfecter la région périorbitaire avec 10% de povidone-iode. Désinfectez l’œil en administrant 5% de povidone-iode aux fornices conjonctivaux du PSN. Assurez-vous que la solution reste dans les fornices pendant au moins 1 min avant de bien rincer avec du BSS stérile.
  10. Positionnez un drap stérile de telle sorte que l’ouverture prédécoupée soit centrée sur l’œil pour subir une intervention chirurgicale. Couvrez l’œil avec un drap d’incision chirurgicale adhésif.
  11. Effectuer une canthotomie latérale sur l’œil pour subir une intervention chirurgicale.
  12. Insérez le spéculum de Lieberman pour assurer une ouverture adéquate des paupières pour la visualisation de l’œil.

7. Vitrectomie

REMARQUE: Pour accéder à l’espace sous-rétinien pour l’administration de la greffe d’EPR TEP-échafaudage, ce protocole recommande une vitrectomie à 4 ports (valve) de 25 G à effectuer à l’aide d’une configuration chirurgicale vitréo-rétinienne standard et d’une lentille de fond d’œil sans contact, grand angle et à 128 °. Le protocole recommande également l’utilisation d’un microscope chirurgical équipé de miOCT pour guider plusieurs étapes chirurgicales critiques, y compris l’induction du décollement fovéal, l’implantation du greffon RPE et le drainage du liquide sous-rétinien.

  1. Effectuez une péritomie conjonctivale à 360° en incisant la conjonctive près du limbe à l’aide d’une paire de ciseaux vannas. Agrandir le péritomie en effectuant une dissection contondante.
  2. À l’aide d’une lame microvitrétinienne de 25 G, effectuer une sclérotome à 8 heures pour l’œil droit ou à 4 heures pour l’œil gauche. Effectuez la sclérotome à 3 mm du limbe de l’œil.
  3. Insérez et suturez une canule de perfusion latérale personnalisée de 25 G à l’aide d’une suture vicryl 7-0. Après avoir confirmé l’emplacement intravitréen, démarrez la perfusion de BSS et réglez le système pour maintenir une PIO de 20 mmHg.
  4. À l’aide d’un trochar à tête plate de 25 G, effectuer une sclérotomie à 2 heures pour l’œil droit ou à 10 heures pour l’œil gauche, comme à l’étape 7.2.
  5. Insérez la lampe du lustre 25 G dans le trochar à tête plate et fixez-la avec du ruban adhésif. Réglez la source lumineuse à environ 60 %.
  6. Effectuez une autre sclérototomie, semblable à l’étape 7.2, à 10 heures pour l’œil droit ou à 2 heures pour l’œil gauche. Placez des sutures de vicryl 7-0 en forme de U autour de la sclérotome sans nouer les nœuds. Insérez la pointe de coupe de vitrectomie à travers cette sclérotome.
  7. Commencez la vitrectomie autour des points d’entrée, suivie d’une vitrectomie à noyau court avec les réglages suivants: maximum 5000 coupures par minute, aspiration maximale à 400 mmHg.
  8. Injecter 20-50 μL de triamcinolone (40 mg/mL) pour une meilleure visualisation du vitré.
  9. Induire un décollement postérieur du vitré (PVD) en séparant le corps vitré de la rétine.
    1. Placez le vitré au-dessus du disque optique pour permettre une induction douce du PVD. Gardez le vitré uniquement à l’aspiration au réglage maximal de 400 mmHg sans aucune coupe.
    2. Si nécessaire, utilisez une pince intraoculaire de 25 G pour manipuler le vitré à la marge du disque afin de créer une déchirure dans le cortex vitré afin de faciliter le détachement.
      REMARQUE: PvD est considéré comme réussi si les cristaux de triamcinolone glissent sans entrave sur la surface rétinienne.
  10. Ouvrez la membrane hyaloïde postérieure avec l’cutter et retirez la jupe vitrée détachée jusqu’à la base vitréenne (à l’équateur rétinien). Aspirer toute triamcinolone restante sur la surface de la rétine.

8. détachement fovéal guidé par miOCT

  1. Injecter 1 à 2 mL de PFCL pour couvrir le pôle postérieur jusqu’à la rétine antérieure mi-périphérique.
  2. Entrez dans l’œil avec une canule d’injection sous-rétinienne. Réglez la PIO à 0-4 mmHg sur l’appareil de vitrectomie (assurez-vous d’un système parfaitement étanche; si nécessaire, attachez les sutures autour des orifices).
  3. À l’aide de la canule d’injection sous-rétinienne à double alésage personnalisée de 25/41 G ou de la canule d’injection sous-rétinienne de 25/38 G reliée à une seringue de 250 μL, effectuez doucement une injection sous-rétinienne de BSS pour induire un décollement localisé de la rétine. Une fois que le bleb vient de traverser la fovéa, arrêtez l’injection. Créez un deuxième bleb à partir d’une direction distincte. Fusionnez les deux blebs pour détacher complètement la fovéa.
  4. Activez la fonction miOCT pour visualiser la formation de bleb. Assurez-vous que les numérisations ligne et cube sont en mode HD avec les paramètres (512 x 128 pixels, largeur de numérisation 4 mm) pour acquérir une image au niveau de la fovéa. Observez l’image miOCT pour un décollement complet de la rétine neurale de la couche RPE au niveau de la fovéa.
  5. Agrandir la rétinotomie à 1,5 mm avec une paire de ciseaux vitréo-rétiniens verticaux de 25 G pour permettre l’accès à l’espace sous-rétinien pour la transplantation.

9. Suppression du RPE natif

  1. Réglez la PIO sur 50 mmHg sur l’appareil de vitrectomie.
  2. Retirez le PFCL par extrusion active à l’aide d’une canule à pointe en silicone brossé.
  3. Étendez la sclérotome avec un couteau d’incision de 1,4 mm pour permettre l’entrée d’un instrument de 20 G.
  4. À l’aide d’un instrument à boucle extensible personnalisé de 20 G, grattez l’EPR de l’hôte sous-maculaire pour l’enlever. Gratter une zone qui mesure au moins 2 x 3 mm.

10. Chargement du tireur pour la livraison de la greffe monocouche de cellules RPE

  1. Pour obtenir des instructions générales sur le chargement d’une greffe en forme de balle découpée à partir de cultures RPE sur des supports de cellules PET, reportez-vous à une publication précédente22.

11. Implantation de greffon guidée par miOCT et ajustement de la position

  1. Insérez la pointe du dispositif de tir à travers la sclérototomie à une PIO de 20 mmHg. Injecter l’implant vers l’espace sous-rétinien via le bord de rétinotomie créé à partir de la surface rétinienne.
  2. Injecter l’implant avec le côté porteur cellulaire face à la membrane de Bruch et le côté xénogreffe RPE face aux photorécepteurs.
  3. Activez la fonction miOCT pour visualiser l’emplacement de l’implant. Assurez-vous que l’implant repose à plat sur la membrane de Bruch dans l’espace sous-rétinien, avec une rétine sous-jacente intacte. Assurez-vous qu’il est situé à une distance raisonnable de la rétinotomie créée et qu’il n’empiète pas sur le site de la rétinotomie.
  4. Ajustez la position de l’implant avec la canule d’injection sous-rétinienne ou un ciseau intraoculaire incurvé de 25 G pour vous assurer qu’il est bien positionné sous la macula.

12. drainage du liquide sous-rétinien guidé par miOCT

  1. À l’aide d’une canule à pointe en silicone brossé, effectuez un échange fluide-air et un drainage soigneux du liquide sous-rétinien. Tenter une aspiration douce du liquide sous-rétinien à partir du décollement de la rétine et de l’apposition du bord de la rétinotomie.
  2. Activer la fonction miOCT pour la visualisation en temps réel d’un drainage adéquat du liquide sous-rétinien jusqu’à ce que la rétine soit rattachée sur l’implant.

13. Fin de l’opération

  1. Fermez la sclérototomie à orifice de travail à l’aide de la suture vicryl 7-0 pré-placée. Retirez le lustre de 25 G et la canule d’infusion de 25 G. Fermez ces sclérotomies avec 7-0 sutures vicryliques.
  2. Administrer 2 mg dans 0,05 ml de triamcinolone sans agent de conservation intravitréen (40 mg/ml) à la sclérototomie de 8 heures avant la suture.
  3. Palper l’œil pour s’assurer que la PIO se situe dans la plage acceptable. Injecter de l’air filtré (ou BSS) via une aiguille de 30 G si nécessaire.
  4. Suturez la conjonctive avec 7-0 sutures vicryliques et canthotomie avec 5-0 prolene (retirer après 10-14 jours).

14. Soins postopératoires aux animaux

  1. Positionnez le PSN face cachée pendant 1 h après la chirurgie. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce que la conscience ait été retrouvée. S’assurer qu’un vétérinaire et un technicien en soins aux animaux sont disponibles pour l’observation et le soutien pendant le processus postopératoire.
  2. Appliquez un antibiotique topique (tobramycine), une pommade stéroïde (dexaméthasone) et des gouttes ophtalmiques homatropine deux fois par jour pendant 5 jours après l’opération.
  3. Administrer une autre injection sous-cutanée de buprénorphine (0,005-0,03 mg/kg p.c.) 6 h après la chirurgie pour un contrôle adéquat de la douleur.
  4. Ne remettez le PSN en compagnie d’autres animaux que lorsqu’il a complètement repris conscience.
  5. Effectuer des suivis d’imagerie multimodale les jours 3, 14 et le mois 1 après la procédure, suivis de bilans mensuels. Effectuez des GRE tous les mois après la procédure. Retirez les sutures de prolène 5-0 pour la canthotomie au jour 14 en même temps que la période de sédation utilisée pour l’imagerie multimodale. Les sutures restantes sont résorbables, 7-0 sutures vicryl, qui ne nécessitent pas de retrait.

15. Méthodes de surveillance postopératoire pour l’imagerie multimodale

  1. Accélérez le PSN du jour au lendemain. Calmer le PSN juste avant l’imagerie (voir l’étape 4.2 pour le médicament et la concentration pour la sédation). Si la sédation est insuffisante pour arrêter le mouvement des yeux, envisagez l’utilisation d’une anesthésie générale.
  2. Appliquer 1 % de tropicamide et 2,5 % de collyre de phényléphrine pour obtenir une dilatation de la pupille avant l’imagerie (voir étape 6.2).
  3. Effectuer l’autofluorescence (AF), l’angiographie à la fluorescéine du fond d’œil (FFA) et la tomographie par cohérence optique (OCT) à l’aide d’une machine OCT haute résolution avec une lentille de champ de 55 ° et une lentille de champ de 30 °.
    1. Administrer par voie intraveineuse 10 % de fluorescéine (0,1 mL/kg p.c.) pour la FFA. Pour obtenir une image de phase précoce, capturez une image dans les 30 s suivant l’injection. Pour une image en phase tardive, capturez une image 5 à 10 minutes après l’injection.
  4. Effectuez la photographie du fond d’œil à l’aide d’un appareil photo de fond d’œil entre les phases initiales et tardives de la FFA.

16. Méthodes de surveillance postopératoire pour les études d’électrorétinogramme plein champ (ERG)

  1. Accélérez les PNP du jour au lendemain. Calmer le PSN avant les études ERG (voir l’étape 4.2 pour le médicament et la concentration pour la sédation). Tout au long des enregistrements ERG, réadministrez la sédation au besoin.
  2. Séparer l’imagerie multimodale et les enregistrements ERG avec un intervalle d’au moins 2-3 jours.
  3. Une fois sous sédation, assurez-vous que le PSN est adapté à l’obscurité pendant 30 minutes avant l’enregistrement ERG.
  4. Positionnez les électrodes à aiguille sous-dermique en acier inoxydable sur les canthi latéraux gauche et droit (électrodes de référence) et à l’arrière du corps du PSN (électrode de masse). Placez les électrodes des lentilles de contact ERG sur la cornée NHP à l’aide d’un gel vidisique pour faciliter le contact et l’adhérence.
  5. Baser tous les tests ERG sur les protocoles humains recommandés par l’International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV)14. Commencez l’enregistrement ERG dans des conditions scotopiques et commencez avec les clignotements du gradateur. Suivez les recommandations de l’ISCEV pour les intervalles interstimulus recommandés.
  6. Assurez-vous que le PSN est adapté à la lumière pendant 10 minutes avant les tests photopic, en utilisant à nouveau les recommandations standard de l’ISCEV pour la résistance de fond.

17. Euthanasie des PSN

  1. Pour euthanasier le PSN pour l’énucléation, administrer par voie intraveineuse du pentobarbital de sodium (75 mg/kg), comme recommandé par le groupe scientifique sur l’euthanasie de l’American Veterinary Medical Association.

Representative Results

Les modalités d’imagerie multimodale (photographie du fond d’œil, imagerie par autofluorescence du fond d’œil (FAF), angiographie de la fluorescéine du fond d’œil (FFA) - phase précoce et phase tardive, et tomographie par cohérence optique (OCT)) mettent en évidence les caractéristiques d’une greffe d’EPR sous-maculaire réussie (Figure 1). La photographie du fond d’œil montre le positionnement de la greffe RPE au niveau de la fovéa sans migration au fil du temps. L’imagerie FAF montre des changements minimes dans l’hyper-autofluorescence (démontrée par des zones blanches de haute intensité) chevauchant le greffon RPE. Les FFA de phase précoce et tardive ne montrent aucune fuite évidente (démontrée par des zones blanches de haute intensité qui s’agrandissent avec le temps) entourant le greffon RPE. Les premières images au jour 3 montrent un défaut de fenêtre dû à l’élimination de l’EPR natif avant l’implantation du greffon. Les images OCT maculaires montrent la préservation des couches rétiniennes externes (en particulier, la couche photoréceptrice) sur le greffon RPE au fil du temps. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine montre des couches rétiniennes intactes sans aucune preuve de microtéaires. La préservation de la couche nucléaire externe au-dessus des périphéries du greffon suggère que les cellules EPR remplissent leurs fonctions physiologiques de maintien de la santé des photorécepteurs.

Les vues intraoculaires et externes de la canule à double alésage 25/41 G mettent en évidence le mécanisme par lequel la PIO est contrôlée lors de l’injection sous-rétinienne (Figure 2). Le BSS pénètre dans l’espace sous-rétinien lors de l’injection de liquide sous-rétinien via la canule centrale plus longue. Des augmentations significatives de la pression intraoculaire provoquent la sortie du BSS dans la cavité vitrée de l’œil par le plus grand alésage métallique de la canule. BSS se déplace ensuite le long de la canule et est finalement éjecté du port de sortie près du hub de la canule. Pour évaluer si la canule fonctionne comme prévu, assurez-vous que le fluide s’écoule du port de sortie près du moyeu de la canule.

Le miOCT permet la visualisation des dimensions du bleb et d’une déchirure fovéale potentielle en peropératoire lors du décollement fovéal (Figure 3). La figure 3A1-A3 met en évidence un cas de bleb avec une déchirure fovéale. Dans la figure 3A1, alors que le bleb inférieur est visible sous le microscope chirurgical, la visualisation de la déchirure est difficile. La figure 3A2 montre la section longitudinale d’un bleb sans aucune déchirure. La figure 3A3 montre une déchirure fovéale lors de l’évaluation de la section verticale du bleb. La figure 3B1-B3 montre un bleb créé avec succès sans la présence de déchirures.

L’absence de détérioration significative des formes d’onde ERG suggère que la fonction globale des photorécepteurs bâtonnets et coniques est maintenue avec les xénogreffes RPE sous-rétiniennes (Figure 4). Les formes d’onde ERG montrent la fonction globale de la rétine. En particulier, une attention particulière doit être accordée aux ondes A pour déterminer toute perte de la fonction photoréceptrice.

Figure 1
Figure 1 : Analyse in vivo postopératoire avec imagerie multimodale. (A) Imagerie in vivo de la greffe d’EPR submaculaire de l’œil gauche (jaune sur la photographie du fond d’œil) sur diverses modalités d’imagerie (colonnes de gauche à droite : photographie du fond d’œil, autofluorescence, angiographie de la fluorescéine du fond d’œil - phase précoce, angiographie de la fluorescéine du fond d’œil - phase tardive, tomographie par cohérence optique) pour des points de temps allant jusqu’à 3 mois (rangées de haut en bas : jours 3, 14 ; Mois 1, 3). L’astérisque sur la photographie du fond d’œil indique le site de la rétinotomie; la flèche pointillée blanche indique la direction de l’analyse de ligne. La forme jaune dessinée sur l’imagerie d’autofluorescence du fond d’œil met en évidence l’emplacement de la greffe. Les triangles blancs sur les images OCT indiquent les bords latéraux respectifs de la greffe (selon le balayage de ligne sur l’image du fond d’œil couleur). (B) Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de la greffe sous fovéa atrophique (due à une déchirure peropératoire) avec des couches marquées. Barres d’échelle = 1 mm en A (images d’autofluorescence et FA), 200 μm en A (images OCT) et 100 μm en B. Abréviations : FA = angiographie du fond d’œil; OCT = tomographie par cohérence optique; RGC = couche de cellules ganglionnaires rétiniennes; INL = couche nucléaire interne; ONL = couche nucléaire externe; EPR = épithélium pigmentaire rétinien. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Vues intraoculaires et externes de la canule à double alésage de 25/41 G. (A) Vue intraoculaire de la canule à double alésage de 25/41 G lors de la création de bleb sous-rétinienne. La flèche blanche pointe vers la canule centrale plus longue pour l’injection sous-rétinienne. La flèche pointillée pointe vers l’ouverture de la canule de sortie à travers laquelle le BSS passe pour sortir de l’œil. (B) Vue extérieure de la canule à double alésage 25/41 G. L’astérisque marque l’orifice de sortie près du moyeu de la canule à partir duquel le BSS intraoculaire est drainé. Abréviation : BSS = solution saline équilibrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images au microscope peropératoire et images miOCT d’un bleb sous-rétinien compliqué par une déchirure fovéale. (A1) Image au microscope peropératoire montrant la position des scans longitudinaux (bleu) et transversaux (rouge) dans un bleb avec une déchirure fovéale. (A2) Balayage miOCT longitudinal montrant un bleb sous-rétinien à la région fovéale (flèche jaune). (A3) MiOCT transverse capturant une déchirure fovéale (pointe de flèche blanche), ainsi qu’une rétinotomie (astérisque et un bleb sous-rétinien (flèche jaune). (B1) Image microscopique peropératoire montrant la position des balayages longitudinaux (bleus) et transversaux (rouges) dans un bleb formé avec succès. (B2) Balayage miOCT longitudinal montrant un bleb sous-rétinien à la région fovéale (flèche jaune). (B3) Scan miOCT transversal montrant un bleb sous-rétinien créé avec succès avec une fovéa intacte de manière supérieure (diamant blanc). Abréviation : miOCT = tomographie par cohérence optique intégrée au microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : ERG de l’œil transplanté par xénogreffe RPE. Pour l’évaluation fonctionnelle de la rétine, les évaluations ERG plein champ de l’œil xénogreffé RPE effectuées au départ (rangée du haut) et 3 mois après la transplantation (rangée du bas) ne montrent aucun effet significatif de la greffe de xénogreffe RPE sur les amplitudes de réponse, le moment ou la forme d’onde dans des conditions adaptées à l’obscurité ou à la lumière. Abréviations : EPR = épithélium pigmentaire rétinien; ERG = électrorétinogramme; DA = adapté à l’obscurité; LA = adapté à la lumière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Il existe deux approches principales en cours d’évaluation pour la transplantation d’EPR sous-maculaire : l’injection d’une suspension d’EPR et la transplantation d’un greffon d’EPR monocouche. Une comparaison détaillée entre les deux méthodes dépasse le cadre de ce manuscrit. Cependant, la transplantation d’un greffon RPE monocouche peut être avantageuse car les cellules RPE sont plus organisées en monocouche que dans une suspension. Les cellules EPR dans le greffon sont organisées en une monocouche confluente, qui ressemble à l’organisation de la couche cellulaire RPE physiologique et permet aux cellules RPE transplantées de remplir leurs fonctions physiologiques. Cela permet des paramètres de dosage plus précis par rapport aux suspensions cellulaires, ce qui est très pertinent pour les travaux de réglementation et la mise à l’échelle industrielle.

L’administration du patch RPE dans l’espace sous-rétinien nécessite une manipulation minutieuse de la macula et une insertion précise du greffon dans l’espace sous-rétinien. Les progrès technologiques en microchirurgie, tels que miOCT, et une meilleure compréhension de la dynamique des tissus rétiniens peropératoires ont réduit la courbe d’apprentissage de cette procédure. Au cours de cette discussion, les raisons d’être des aspects suivants seront expliquées : i) injection préopératoire de plasminogène; ii) l’utilisation de miOCT peropératoire; iii) l’utilisation d’une canule à double alésage personnalisée de 41 G, de réglages à faible PIO et de PFCL pour la création de bleb sous-rétinal; iv) grattage de la couche cellulaire RPE native avant la transplantation; v) l’utilisation du sirolimus, de la triamcinolone, de la doxycycline et de la minocycline pour réduire le rejet immunogène du greffon.

Les injections préopératoires de plasminogène libèrent des adhérences rétiniennes parafoveales
Dans les premières expériences, il était difficile de détacher la fovéa avec une seule onde fluide. Lors de l’évaluation avec miOCT, les images ont révélé la présence d’adhérences rétiniennes externes parafoveales à l’EPR native ainsi que des preuves de traumatisme intrarétinien20. Ces adhérences peuvent avoir conduit à une expansion verticale du bleb plutôt qu’à l’onde du liquide sous-rétinien se propageant sur le contour de la rétine, entraînant un traumatisme fovéal. Le plasminogène est le précurseur inactif de la plasmine, une protéase ciblant la fibronectine et la laminine. L’ocriplasmine est une variante bio-modifiée de la plasmine humaine, approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) et l’Agence européenne des médicaments (EMA) pour le traitement de la traction vitréomaculaire symptomatique avec ou sans trou maculaire concomitant. Cependant, les rapports post-approbation du développement d’un œdème de la macula cystoïde après l’injection d’ocriplasmine ont suggéré un effet plus étendu de l’enzyme sur la rétine23.

Bien que les mécanismes exacts n’aient pas été identifiés, il a été suggéré que la plasmine pourrait affaiblir l’adhésion rétinienne par la dégradation des éléments de la matrice interphotoréceptrice responsables de l’adhésion photorécepteur-EPR24. Dans ce protocole, les yeux PSN ont été traités avec du plasminogène intravitréen 1 semaine avant la chirurgie pour libérer les adhérences rétiniennes externes parafoveales. En supposant que l’adhésion photorécepteur-EPR est affaiblie, une force plus faible est nécessaire pour détacher la rétine neurosensorielle, y compris l’anneau parafoveal distal, qui résiste généralement à l’onde du liquide sous-rétinien20. Ainsi, la force administrée lors du décollement du bleb rétinien entraîne l’expansion du bleb à travers le contour rétinien plutôt que d’étirer la rétine tangentiellement. Cela réduit le risque de déchirures fovéales. Cependant, il convient de noter que l’effet du plasminogène sur la survie à long terme du greffon n’a pas été étudié dans ce protocole. Des études futures devraient tenter de déterminer cet effet.

miOCT fournit une rétroaction anatomique pour guider la création de bleb sous-rétinal, l’implantation de greffe et le drainage du liquide sous-rétinien
La manipulation peropératoire et atraumatique de la macula est essentielle pour obtenir de bons résultats de transplantation. Cependant, les changements microstructuraux de la macula liés à la manipulation peuvent ne pas toujours être évidents sur le microscope opératoire. Dans de telles procédures, le miOCT est un outil important qui fournit une rétroaction peropératoire tridimensionnelle en temps réel de la structure maculaire. miOCT est particulièrement utile pendant les étapes de décollement fovéal, d’implantation de greffe et de drainage du liquide sous-rétinien à l’aide d’un échange fluide-air. Pendant le détachement fovéal, miOCT peut déterminer les dimensions verticales et horizontales du bleb. Les microtears fovéaux, qui peuvent ne pas être visualisés clairement au microscope chirurgical, peuvent être confirmés par miOCT (Figure 3). Pendant l’implantation du greffon, les images miOCT guident en montrant l’emplacement du greffon ou la proximité de la fovéa, à travers la rétine souvent moins transparente et détachée. miOCT peut également mettre en évidence les zones possibles d’adhésion rétinienne au cours d’un processus de transplantation difficile25. Enfin, dans le processus de drainage du liquide sous-rétinien, miOCT peut guider de manière fiable le drainage du liquide sous-rétinien jusqu’à ce que le contact complet du greffon rétinien-EPR soit atteint.

La combinaison d’une canule à double alésage, de faibles réglages de PIO et d’une tamponnade vitrée PFCL réduit en synergie les traumatismes maculaires lors de la création de bleb sous-rétiniens
L’étirement tangentiel de la rétine et la turbulence du liquide peuvent se produire pendant l’injection sous-rétinienne de BSS pour le décollement fovéal conduisant à des déchirures fovéales indésirables. Pour contrer ces phénomènes, des facteurs tels que la position relative et la distance par rapport au centre fovéal où l’injection est initiée, le volume et la vitesse d’injection, la tamponnade vitrée, le choix de l’instrumentation sous-rétinienne et la PIO se sont tous révélés pertinents20,26,27. Le bleb sous-rétinien pour le décollement fovéal doit être situé à un endroit suffisamment éloigné de la fovéa, car l’étirement rétinien peut être le plus élevé au site d’initiation du bleb27. La PIO doit également être maintenue à un niveau bas tout au long de la création du bleb sous-rétinien. Lorsque la PIO de l’œil est élevée, on observe une augmentation verticale plus élevée de la taille des blebs plutôt qu’une expansion le long du contour de la rétine, tandis que les blebs sont moins profonds à des pressions plus faibles20. De plus, bien qu’une injection intravitréenne de 50 μL doublera effectivement la PIO chez l’homme28, étant donné la longueur plus courte des yeux chez les PSN, l’augmentation de la PIO pendant l’injection sous-rétinienne sera probablement plus élevée et plus rapide que chez l’homme. Alors que la plupart des appareils de vitrectomie s’ajustent à la fluctuation de la PIO, l’ajustement n’est pas un processus simultané mais plutôt un processus réactif qui se produit au fur et à mesure que l’injection sous-rétinienne se déroule. Par conséquent, plus la PIO est élevée, plus le risque de surmenage de la rétine et de traumatisme fovéal qui en résulte est élevé. Ainsi, il est essentiel de maintenir une faible PIO stable lors de l’injection sous-rétinienne.

Une canule sous-rétinienne commerciale de 20/41 G (DORC) ou de 25/41 G à double alésage fabriquée sur mesure est recommandée pour l’injection sous-rétinienne. La canule permet au liquide de sortir de la cavité vitréenne en échange de BSS injecté dans l’espace sous-rétinien. Cela garantit la régulation « simultanée » de la PIO pendant l’injection sous-rétinienne. Un schéma de la canule à double alésage est illustré à la figure 2. Enfin, le PFCL est utilisé pour réduire le risque de déchirures fovéales20,26,27. Comme les PFL, tels que l’octaline, ont une densité plus élevée, ils exercent une force vers le bas sur la rétine pendant le décollement fovéal29. Cela stabilise davantage le processus de création de bleb de décollement fovéal et améliore l’expansion du bleb le long du contour rétinien. Cette technique a été utilisée avec succès pour l’injection sous-rétinienne de rtPA dans le cadre d’une hémorragie sous-maculaire massive due à la nAMD30.

L’élimination par prétransplantation de l’EPR natif permet la restauration du complexe RPE-photorécepteur
L’EPR de l’hôte doit être retirée avant la transplantation du greffon. En effet, la restauration du complexe RPE-photorécepteurs est nécessaire pour permettre à la greffe RPE de remplir ses fonctions physiologiques de soutien des photorécepteurs21. L’EPR de l’hôte, s’il n’est pas enlevé, peut se présenter comme une barrière mécanique, ce qui empêche la restauration de ce complexe. Il peut être éliminé soit par l’administration de produits chimiques toxiques pour l’EPR, soit en utilisant des moyens physiques d’élimination. Les méthodes d’élimination chimique comprennent l’administration systémique ou sous-rétinienne d’iodate de sodium31,32. Comme l’iodate de sodium provoque une dégénérescence généralisée des photorécepteurs, des cellules EPR et de Choriocapillaris lorsqu’il est administré, sa toxicité rétinienne et systémique empêche son utilisation pour les essais chez l’homme32,33. Par conséquent, les techniques peropératoires physiques sont préférées. Diverses méthodes physiques ont été conceptualisées. Lorsque des méthodes physiques sont utilisées, il est crucial que la membrane de Bruch reste intacte. De nombreuses études in vitro ont démontré la dépendance de la survie du greffon RPE sur une membrane de Bruch intacte34,35,36.

Les tentatives de débridement hydraulique ont été associées à des ruptures de la membrane de Bruch, à une augmentation du taux de développement de la membrane épirétinienne et à une vitréorétinopathie proliférative, entraînant un décollement tractionnel de la rétine37. Une spatule saupoudrée de diamants proposée pour le débridement RPE a également conduit à des ruptures dans la membrane de Bruch, entraînant une prolifération cellulaire de la choroïde dans l’espace sous-rétinien38. Fait intéressant, un instrument à boucle extensible sur mesure pourrait éliminer l’EPR sus-jacent avec préservation de la membrane de Bruch dans les yeux des lapins et des porcs11,39. L’élimination de l’EPR sous-jacente est également utile pour établir des modèles animaux atteints d’EPR et d’atrophie rétinienne externe, similaires à la forme atrophique avancée de la DMLA. Lorsqu’une zone focale de l’EPR est retirée de la macula, la plaie de l’EPR se referme via l’hypertrophie des cellules d’EPR restantes. Cependant, cette réponse cicatrisante est associée à une atrophie de la couche nucléaire externe40. Bien que la création d’un modèle animal dépasse la portée de ce manuscrit, une procédure similaire peut créer un modèle animal d’un phénotype avancé de DMLA atrophique pour les tests de thérapies cellulaires dérivées de l’EPR.

L’utilisation du sirolimus, de la triamcinolone, de la doxycycline et de la minocycline pour réduire le rejet immunogène du greffon
On pense que l’espace sous-rétinien est un site immuno-privilégié, maintenu par une barrière hémato-rétinienne intacte et d’autres facteurs41. Dans de nombreuses études portant sur la transplantation sous-rétinienne de dérivés de cellules souches avec une barrière hémato-rétinienne intacte, les médicaments immunosuppresseurs jouent un rôle négligeable dans la survie du greffon42. On pense que la barrière hémato-rétinienne externe est formée par la couche RPE native et les jonctions serrées entre les cellules RPE. Alors que l’élimination native de l’EPR permet une meilleure intégration de l’EPR transplanté et des photorécepteurs de l’hôte, la barrière hémato-rétinienne est perturbée dans le processus, ce qui augmente la probabilité d’un rejet immunitaire. Classiquement, les lymphocytes T sont au cœur du processus de rejet de greffe d’autres organes tels que le rein et le foie43. Par conséquent, les schémas immunosuppresseurs initiaux pour la transplantation de tissu rétinien visaient à réduire ces réponses immunitaires adaptatives.

Le sirolimus, une cible mécaniste de l’inhibiteur de la rapamycine, et le tacrolimus, un inhibiteur de la calcineurine, sont des exemples de médicaments immunosuppresseurs ciblant les réponses immunitaires adaptatives. Cependant, malgré une suppression adéquate des lymphocytes T, les taux de survie du greffon restent faibles. De plus, les cellules EPR sont connues pour supprimer l’activation des lymphocytes T par la libération de facteurs inhibiteurs et favoriser la génération de lymphocytes T régulateurs44. Par conséquent, il est devenu de plus en plus évident que l’immunité adaptative n’est peut-être pas le seul facteur contribuant au rejet du greffon42. La transplantation sous-rétinienne de produits cellulaires peut entraîner l’accumulation et l’activation de microglies45.

Les microglies sont les macrophages de la rétine. Ils se composent de deux populations principales: 1) la microglie périvasculaire du système vasculaire rétinien interne et 2) la microglie du parenchyme du tissu rétinien. Comme les microglies font partie de la réponse immunitaire innée, les glucocorticoïdes intravitréens, tels que la triamcinolone, peuvent supprimer la prolifération médiée par les cytokines46. La doxycycline et la minocycline peuvent également supprimer l’activation microgliale et doivent être envisagées47,48. Enfin, les différences entre le rejet immunitaire des allogreffes RPE et celles des xénogreffes sont incomplètement comprises49. Par exemple, des alloanticorps contre les cellules EPR induites dérivées de cellules souches pluripotentes ont été rapportés dans le sérum de modèles de rejet immunitaire in vivo. Cependant, le rôle de ces anticorps et l’importance du rejet médié par les anticorps dans la survie du greffon restent inconnus50. Par conséquent, un régime multimédicament utilisant le sirolimus pour la suppression de l’immunité adaptative et une combinaison de triamcinolone, de doxycycline et de minocycline pour la suppression de l’immunité innée est proposé. Ce régime a été utilisé avec succès chez des lapins avec de bons résultats de survie du greffon et des effets systémiques minimes11.

Limites de cette technique chirurgicale
Cet article décrit une méthode chirurgicale possible pour délivrer une feuille de greffe RPE dans l’espace sous-rétinien du PSN; cependant, cela ne signifie pas que c’est le seul moyen optimisé. Différents chirurgiens vitréo-rétiniens peuvent avoir d’autres préférences pour l’instrumentation et la technique. Par exemple, cette conception de dispositif d’implantation ne peut délivrer que des implants plats soutenus par un support cellulaire plus rigide et peut donc ne pas convenir aux implants relativement flexibles (ou roulés). Les greffes de suspension RPE peuvent omettre une grande partie de cette technique. En conséquence, les détails chirurgicaux devront être modifiés en fonction de chaque stratégie d’accouchement.

Alors que l’intérêt pour les thérapies cellulaires pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine continue de croître, le modèle animal NHP sera essentiel dans les études précliniques pour étudier les facteurs affectant la survie du greffon RPE. Dans ce manuscrit, des stratégies sont proposées pour permettre l’administration plus fluide d’un greffon RPE monocouche sous-maculaire dans l’œil NHP. Des méthodes pour une meilleure visualisation des complications peropératoires sont également recommandées. On s’attend à ce que ces méthodes continuent de s’améliorer à mesure que l’utilisation des thérapies cellulaires se développe. Les futurs documents méthodologiques devraient également envisager de proposer une liste complète d’investigations pour évaluer divers aspects structurels et fonctionnels de la greffe.

Disclosures

Boris Stanzel est titulaire d’un brevet américain 9980851 sur un instrument (grattoir RPE) utilisé dans cette étude. Conférencier honoraire de C. Zeiss Meditec et Geuder à Boris Stanzel. Les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID) : OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, Singapour (H17/01/a0/013), la subvention de démarrage NUS NUHSRO/2016/100/SU/01, la subvention NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) et le National Research Foundation Competitive Research Programme, Singapour (NRF-CRP21-2018-0008) à X.S., Hong Leong Endowed Professorship funds to G.E.H. and B.V.S. Nous tenons à remercier l’équipe vétérinaire de la Translational Pre-Clinical Model Platform (Singapore Eye Research Institute, Singapour) pour son soutien dans la préparation de la chirurgie PSN et le suivi des animaux. Nous tenons à remercier Jill Teo et ses collègues de C. Zeiss Meditec Singapour pour le support technique de l’OPMI-Lumera 700 avec dispositif OCT peropératoire intégré.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation Alcon SIN 4715P Surgical procedure
10% Neutral buffered formalin Leica 3800598 Histology procedure
2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution Alcon No. 01785 Surgical procedure
25 G AWH Vivid Chandelier Synergetics 56.54.25P Surgical procedure
25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack Bausch & Lomb SE5525WVB Surgical procedure
AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation Abbott Medical Optics 15020 Surgical procedure
Apo-minocycline Apotex Inc 2084104 Immunosuppression
AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v Aurolab TN 00002387 Surgical procedure
Autoclave MELAG, Vacuklav MELAG 1131-B2300 Surgical procedure
Autostainer XL (ST5010) Leica 2433 Histology procedure
Balanced Saline Solution Beaver Visitec 581732 Surgical procedure
Cotton Bud WINNER MEDICAL 1NA6-100 Surgical procedure
Diagnosys Espion E3 Console Diagnosys 272 Ophthamic imaging
Doxycycline Yung Shin MAL 19950403AEZ Immunosuppression
Eosin Y Merck Millipore 1.15935.0100 Histology procedure
ERG-Jet contact lens electrodes Fabrinal F-06 Ophthamic imaging
Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G MedOne 3247 Surgical procedure
FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm MedOne 3222 Surgical procedure
Fluoresceine 10% Faure Curatis AG 5030376 Ophthamic imaging
Gauze Swab WINNER MEDICAL 1NP3275 Surgical procedure
Hamilton gas tight syringe 250 µL Hamilton 81101 Surgical procedure
Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System Heidelberg Engineering N.A. Ophthamic imaging
Hematoxylin Gill II Merck Millipore 3801520 Histology procedure
Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V) Nikon 33131 Histology procedure
Ketamin injection Ceva 37711/58317 Surgical procedure
Lithium carbonate Merck Millipore 1.05680.0250 Histology procedure
Monkey plasminogen Molecular Innovations SKU-CYPLG Surgical procedure
Non-contact wide angled 128 degree fundus lens C. Zeiss Medtech Resight 700 Surgical procedure
Non-woven Ophthalmic Drape Alcon 8065103120 Surgical procedure
Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G Alcon 8065912001 Surgical procedure
Paraffin Embedding Station Leica EG1150 H Histology procedure
Paraplast High Melt Paraffin Leica 39601095 Histology procedure
Phloxin B Merck Millipore 1.15935.0025 Histology procedure
Prepowdered Surgical Gloves MAXITEX 85-173-2/85-173-3/85-173-4 Surgical procedure
PRODINE Povidone-Iodine Solution BP ICM PHARMA PMLBLP20-01 Surgical procedure
Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB) Righton-Oph 5200162 Ophthamic imaging
Rotary microtome Leica RM2255 Histology procedure
Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0 B.Braun G1048711 Surgical procedure
SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL Yung Shin SHI40 SGP-2610015-001 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 21 G B.Braun 4657527 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 23 G B.Braun 4657667 Surgical procedure
Sirolimus Pfizer SIN12034P Immunosuppression
Stainless steel subdermal needle electrode OcuScience F-E2 Ophthamic imaging
Stellaris Elite vision enhancement system Bausch & Lomb BL15455 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm B.Braun 4665406 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm B.Braun 4656300 Surgical procedure
Surgical gown + 2 Hand Towels STERIL APP10 00 01 Surgical procedure
Tegaderm Film 3M 1626W Surgical procedure
TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G Teruma SS-01S Surgical procedure
TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-03L Surgical procedure
TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-05L Surgical procedure
TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment Alcon No. 01577 Surgical procedure
Topcon Retinal Camera TRC-50DX Topcon 948605 Ophthamic imaging
Vidisic Gel Bausch & Lomb GB41789155517 Surgical procedure
Xylazil-20 Ilium 38653/50276 Surgical procedure
Zeiss Opmi Rescan 700 Carl Zeiss Meditec AG 7210 Surgical procedure

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References

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Médecine numéro 172

Erratum

Formal Correction: Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases
Posted by JoVE Editors on 12/29/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR),
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

to:

Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

Transplantation d’épithélium pigmentaire rétinien dans un modèle de primate non humain pour les maladies dégénératives de la rétine
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Cite this Article

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., … More

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., Wong, W., Holder, G. E., Amutha Barathi, V., Lingam, G., Su, X., Stanzel, B. V. Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. J. Vis. Exp. (172), e62638, doi:10.3791/62638 (2021).

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