Summary
Denne artikel præsenterer en trinvis protokol for direkte kanyle implantation i cisterna magna af svin.
Abstract
Det glymphatic system er et affaldsrydningssystem i hjernen, der er afhængig af strømmen af cerebrospinalvæske (CSF) i astrocytbundne perivaskulære rum og har været involveret i clearance af neurotoksiske peptider som amyloid-beta. Nedsat glymphatic funktion forværrer sygdom patologi i dyremodeller af neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers, som fremhæver vigtigheden af at forstå denne clearance system. Det glymphatic system er ofte undersøgt af cisterna magna cannulations (CMc), hvor sporstoffer leveres direkte ind i cerebrospinalvæsken (CSF). De fleste undersøgelser er imidlertid blevet udført hos gnavere. Her demonstrerer vi en tilpasning af CMc-teknikken hos grise. Ved hjælp af CMc hos svin kan glymphatic-systemet studeres ved en høj optisk opløsning i gyrencephalic hjerner og dermed broer videnskløften mellem gnaver og menneskelige glymphatics.
Introduction
Cerebrospinalvæske (CSF) er en ultrafiltret blod, som findes i og omkring centralnervesystemet (CNS)1,2. Bortset fra at give opdrift til hjernen eller absorbere skadelige mekaniske kræfter, CSF spiller også en afgørende rolle i clearing metabolisk affald fra CNS3. Affaldsrydning lettes af det nyligt karakteriserede glymphatic system, som tillader konvektiv strøm af CSF gennem hjernen parenchyma via perivaskulære rum (PVS), som omkranser gennemtrængende arterier3,4,5. Denne proces har vist sig at være afhængig af aquaporin-4 (AQP4), en vandkanal udtrykt primært på den astrocytiske endfeet, bundet til PVS4,6. Undersøgelsen af det glymphatic system opnås ved både in vivo og ex vivo imaging, ved hjælp af enten avanceret lysmikroskopi eller magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) efter indførelsen af et fluorescerende/ radioaktivt sporstof eller kontrastmiddel i CSF7,8,9,10,11.
En effektiv måde at indføre et sporstof i CSF uden at pådrage sig skader på hjernen parenkym er gennem cisterna magna cannulation (CMc)12,13. Et stort flertal af alle glymphatic undersøgelser, hidtil er blevet udført i gnavere og undgået i højere pattedyr på grund af invasivitet CMc koblet til den praktiske enkelhed at arbejde med et lille pattedyr. Derudover tillader de tynde kranier af mus in vivo imaging uden behov for et kranievindue og giver efterfølgende mulighed for en ukompliceret hjerneudvinding11,14. Forsøg udført hos mennesker har givet værdifulde makroskopiske in vivo-data om den glymphatic funktion, men påberåbt sig intrathecal tracer injektioner i distal lændehvirvelsøjlen og desuden udnytte MR, som ikke giver tilstrækkelig opløsning til at fange mikroanatomi det glymphatic system7,15,16 . Forståelse af arkitekturen og omfanget af det glymphatic system hos højere pattedyr er afgørende for dets oversættelse til mennesker. For at lette glymphatic oversættelse til mennesker er det vigtigt at anvende teknikker, der udføres i gnavere til højere pattedyr for at give mulighed for direkte sammenligninger af det glymphatic system på tværs af arter af stigende kognition og hjernekompleksitet17. Gris og menneskelige hjerner er gyrencephalic, besidder en foldet neuroarkitektur, mens gnaver hjerner er lissencephalic, og dermed har betydelig forskel mellem hinanden. Med hensyn til den samlede størrelse er svinehjerner også mere sammenlignelige med mennesker, der er 10-15 gange mindre end den menneskelige hjerne, mens musehjerner er 3.000 gange mindre18. Ved bedre at forstå det glymphatic system i store pattedyr, kan det være muligt at udnytte det menneskelige glymphatic system til fremtidig terapeutisk intervention i forhold som slagtilfælde, traumatisk hjerneskade og neurodegeneration. Direkte CMc hos svin in vivo er en metode, der giver mulighed for høj opløsning lysmikroskopi af glymphatic systemet i et højere pattedyr. På grund af størrelsen af de anvendte svin er det desuden muligt at anvende overvågningssystemer svarende til dem, der anvendes i menneskelige operationer, hvilket gør det muligt at dokumentere og regulere vitale funktioner tæt for at vurdere, hvordan disse bidrager til glymphatic-funktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med EU-direktivet 2010/63/EU og blev godkendt af Malmö-Lunds etiske udvalg for dyreforskning (Dnr 5.8.18-05527/2019) og gennemført i henhold til CODEX-retningslinjerne fra det svenske forskningsråd.
1. Forberedelse
- Tracer
- Klargør kunstig CSF (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glukose, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
- Til 500 μL kunstig CSF, tilføje 10 mg albumin fra kvæg serum (BSA) konjugeret med Alexa Fluor 647 (BSA-647).
- Centrifuge ved 5.000 x g i 5 min og brug supernatanten.
- Kanyle
- Fastgør en 1 mL sprøjte til den kvindelige Luer-forbindelse af den intravenøse (IV) linje, 3-vejs hane med 10 cm forlængelse.
- Fastgør en 18 G nål til den mandlige ende.
- Åbn den 3-vejs stoplås for at give mulighed for kontinuitet fra nålen til sprøjten.
- Opvarm forsigtigt nålen og aspirer ca. 300 μL af saltvandet ind i IV-linjen.
- Fjern nålen fra saltvandet og fortsæt med at indføre i lidt luft for at skabe en lille luftboble (5-10 mm) i IV-linjen.
- Placer nålen i sporstoffet og aspirere alle 500 μL af sporstoffet. Saltvandet i IV-linjen skal være synligt adskilt af en luftboble.
- Kassér nålen, og luk den trevejs stoplås.
- Dyr
- Bedøve et svin ved intramuskulær (i.m.) injektion af tiletamin (3,75 mg/kg) og zolazepam (3,75 mg/kg) og dexmedetomidin (37,5 μg/kg). Vent på, at den bliver bevidstløs.
- Forbered en intravenøs linje ved at indsætte en 20 G kanyle i ørevenen.
BEMÆRK: Sørg for, at kanylen er i venen ved at injicere 5-10 mL saltvand gennem kanylen. Hvis venen er blevet savnet, vil dette være mærkbart ved lille ødem i ørevævet. - Intuberere grisen for at sikre, at vejrtrækningen kan reguleres under hele operationen.
BEMÆRK: Sørg for en vellykket intubering ved at lægge pres på grisens brystkasse, og bekræft, at der kommer med magtudløben luft ud af intuberingsrøret. - Fastgør intubationsrøret til en ventilator indstillet til en udåndingshastighed på 14 vejrtrækninger / min.
- Tilslut en puls oximeter og manchet til halen for at overvåge pulsen (HR), blodtryk (BP), og iltmætning (sats). Sæt et rektaltermometer ind for at overvåge kernetemperaturen.
- Der fremstilles en IV-pose ketamin (5 mg/kg/min), midazolam (0,25 mg/kg/min) og fentanyl (2,5 μg/kg/min), i saltvand og begynder at trække gennem ørevenen ved ca. 2 dråber/s.
BEMÆRK: Under hele operationen kan det være nødvendigt at øge infusionshastigheden eller nedsættes baseret på dyrets vitale. - Med grisen i den udsatte position palper dyrets baghoved og nakke for at finde og markere den occipitale kam og rygsøjlen af de første brysthvirvler og bunden af hvert øre.
- Tegn en lige linje mellem kammen og ryghvirvlerne langs langsgående akse. Tegn to linjer fra toppen til bunden af hvert øre ved at følge bunden af kraniet (Figur 1A).
- Kontroller, at dyret er i en dyb søvn ved omhyggeligt at spænde halen og se på fraværet af en halerefleks.
BEMÆRK: Hvis dyret stadig er refleksivt, skal den bedøvelsesinfusionshastighed øges gradvist, indtil dyret ikke længere udviser en refleks.
2. Kirurgi
BEMÆRK: Gennem hele operationen er det nødvendigt at have mindst én assistent til at suge lysblødningen og ætse eventuelle afskårne fartøjer.
- Ved hjælp af en skalpel med en # 21 klinge, lav et dermalt snit langs langs langsgående linje ned til musklen.
- Udvid to vinkelrette dermale snit længere langs skuldrene, 10-15 cm i længden.
- Fra occipital kamme, gøre dermale snit langs linjen ned til bunden af hvert øre.
- Gribende huden hjørner dannet på occipital crest med anatomiske sammenkædning, omhyggeligt adskille huden fra den underliggende muskel ved let at køre skalpelbladet over fascia, der flytter fra rostral til kaukasal. Når huden er blevet resected efter hver af de fem snit, dele af trapezius muskler bør derefter være synlige.
- Lav et langsgående snit med skalpellen, ca. 1 cm dyb, hvor trapezius kommer sammen i midterlinjen.
BEMÆRK: Når du skærer gennem musklerne, er der en øget tilbøjelighed til blødning, så cauterizeren skal være klar. Hvis et større fartøj er afskåret, skal en person hurtigt komprimere det med gasbindet, mens den anden person bruger cauterizeren. - Ved hjælp af en kombination af lige og buede kirurgiske sammenkædninger, udføre stump dissektion arbejder langs langs længde cut i musklerne. Dette vil adskille bugen af trapezius, samt den underliggende semispinalis capitus biventer muskel.
- Skær eventuelle vedvarende muskelfibre med en skalpel og fortsæt stump dissektion, indtil semispinalis capitus complexus bliver synlig.
- Skær oprindelsen af trapezius og semispinalis capitus biventer muskler langs den bageste aspekt af kraniet. Adskil dem forsigtigt i længderetningen med skalpellen udfører stump dissektion, indtil semispinalis capitus complexus er fuldt synlig.
- Træk trapezius og semispinalis capitus biventer muskler ved hjælp af selvbevarende retraktorer.
- Hvor halvspinalis capitus complexus maver mødes i midterlinjen, skal du lave et langsgående snit med skalpellen ca. 1 cm dyb.
BEMÆRK: Vær opmærksom på yderligere blødninger her. Blødning kan styres ved hjælp af en kombination af vatpinde og cauterization. - Ved hjælp af kirurgiske tang, udføre en stump dissektion arbejder langs langs længde cut mellem muskel maver, indtil det dorsale aspekt af atlas (CI) er håndgribelig.
- Skær oprindelsen af semispinalis capitus complexus muskler langs den bageste aspekt af kraniet og adskille det langsgående fra de underliggende ryghvirvler ved skalpel og stump dissektion.
- Træk semispinalis capitus complexus muskler ved hjælp af et andet sæt af selvbevarende retraktorer.
- Brug en skalpel, forsigtigt fjerne eventuelle resterende væv overlying regionen, hvor atlas opfylder kraniet base.
- Placering af den ene arm under dyrets hals og en finger på atlasets og kraniets uncture hæves samtidig hovedet og bøjer nakken, mens du palper med fingeren for at afsløre cisterna magnaen ved hjælp af den anden hånd.
BEMÆRK: Cisterna magna er genkendelig, når palpering som en stærk elastisk struktur med en lille mængde rebound som tryk frigives med fingeren.
3. Cannulation og injektion
BEMÆRK: Dette trin kræver også mindst to personer og udføres med dyrets hoved forhøjet og nakke bøjet.
- Sørg for, at en person hæver og bøjer dyrets hoved og hals, mens den anden palper til cisterna magnaen noterer sin anatomiske placering.
- Langsomt og forsigtigt indføre en 22 G kanyle gennem dura og ind i cisterna magna i en skrå vinkel til langsgående akse.
BEMÆRK: Indsæt ikke kanylen for dybt, da dette kan forårsage skade på hjernen. At vide, hvor langt man skal indsætte kanylen kommer med erfaring i at forstå, hvordan det føles for kanylen at gennembore duraen. I det væsentlige, ligesom duraen er blevet gennemboret, er kanylen så dyb nok til en vellykket sporstofindsprøjtning. Denne dybde er ca. 3-5 mm, men vil variere afhængigt af dyrets størrelse eller alder. Vellykket cannulation bør være umiddelbart indlysende gennem visualisering af klare, pulsatile CSF stigende kanylen. For det bedste resultat anbefales det at øve flere cannulations på forhånd i aflivede dyr for at få ens forståelse af dural piercing. - Træk nålen tilbage fra kanylen, og sæt hætten på låsen.
- Først skal du anvende superlim og en accelerator, hvor kanylen kommer ind i vævet, efterfulgt af anvendelsen af tandcementet. Vent i 5 minutter på, at cementen hærder.
- Fjern forsigtigt hætten fra kanylen og fastgør den mandlige ende af den tidligere forberedte IV-linjehane med 10 cm forlængelse med sporstoffet til kanylen.
- Indsprøjt langsomt sporstoffet manuelt eller ved hjælp af en mikroinfusionspumpe med en hastighed på 100 μL/min. Fjern 3-vejs IV linjehanen med 10 cm forlængelse og udskift den med hætten. Tracer skal nu være synlig pulserende i bunden af kanylen (Supplerende Video 1).
BEMÆRK: Hvis du injicerer i hånden, skal du gøre dette, indtil sporstoffet stadig er synligt i kanyleakslen, ca. 1-2 mm over, hvor tandcementet dækker akslen. - Efter injektion skal du placere sandsække under nakken for at opretholde en vis fleksion. Hovedet kan derefter frigives, og dyret efterlades i en hvilende udsat position.
- Slip de selvbevarende retraktorer og læg musklerne, mens de lå før. Bring huden sammen over musklerne ved hjælp af kirurgisk håndklæde klemmer.
- Dæk håndklæde klemmer og snit med gaze og derefter et tæppe for at begrænse varmetab.
- Lad sporstoffet cirkulere i den ønskede tid, før dyret aflives ved i.v. Pentobarbital injektion (140 mg/kg). Bekræft aktiv dødshjælp ved fraværet af hjertelyde ved auskultation med stetoskop.
4. Hjerneudvinding og -behandling
- Brug en skalpel med 20-blade, udvide langsgående dermal snit fra occipital crest til ca 7 cm over næsen.
- Afspejler huden overlying dorsal aspekt af kraniet ved hjælp af skalpellen.
BEMÆRK: Der er flere måder at skære og fjerne det dorsale aspekt af svinekraniet på dyr-for-dyr-basis. Det følgende er den procedure, der oftest har fungeret for dette eksperiment. - Ved hjælp af en håndholdt kompakt sav skal du lave et koronarklip i kraniet, ca. 3 cm over de to store vener, der ses komme ud af kraniet. Udvid til yderligere to lodrette snit fra koronarskæringerne og yderligere to snit for at bringe de lodrette snit sammen i midterlinjen.
BEMÆRK: Hold fast greb om saven, når kraniet knoglen skærer, da det vil have tendens til at trække væk ved den første kontakt med knoglen eller vævet, hvilket kan føre til en alvorlig skade. - Sørg for, at kraniets snit er gennem hele tykkelsen af knoglen ved at følge op med en hammer og smal mejsel (10 mm) til hvert af snittene.
- Brug hammeren, endelig banke en bred mejsel (25-30 mm) i koronar cut. Med en person, der støtter hovedet, skal du sikre dig, at den anden person anvender gearing på mejslen for at wince åbne det dorsale kranium.
- Når det dorsale kraniefragment er fjernet, dissekerer dura-materen ved hjælp af buet kirurgisk saks.
- Brug en spatel til at svær rygmarven fra lillehjernen på rostral aspekt. Fortsæt derefter med at guide spatelen under hjernen fra forsiden og afskære de olfaktoriske pærer, hypofysen og kranienervenner.
- Placer spatel bag lillehjernen og anvende en hel del pres for at løsne hjernen fra kraniehulen, forsigtigt løfte det ud, når løs.
- Umiddelbart fastsætte hele hjernen ved væv nedsænkning i 4% paraformaldehyd natten over.
BEMÆRK: Efter dette trin er det muligt at udføre hele hjernescanningen ved hjælp af et stereoskop (Figur 1E). - Den næste dag, gøre koronar skiver af hjernen ved hjælp af en laks kniv og fastsætte skiver natten over ved væv nedsænkning i 4% paraformaldehyd.
- Endelig placere skiverne i 0,01% azide i PBS for langsigtet opbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når grisen er bevidstløs, er den palperet, og dens overflade anatomi er markeret, startende ved occipital crest (OC) og arbejder hen imod brysthvirvlerne (TV) og hver øre base (EB). Det er i denne retning, at dermale snit er lavet (figur 1A). De tre muskellag, herunder trapezius, semispinalis capitus biventer og semispinalis capitus complexus, resected og holdes åbne af to sæt selvbevarende retraktorer for at eksponere cisterna magna (CM) (Figur 1B). Hovedet bøjes derefter for at åbne rummet mellem bagsiden af kraniet og atlasset og lette adgangen til CM (Figur 1C). En 18 G kanyle indsættes forsigtigt 3-5 mm i CM og fastgøres på plads af både superlim og dental cement (DC). Tracer kan derefter injiceres med en fast sats. Når sporstoffet er injiceret, udskiftes IV-linjen og sprøjten med en kanylehætte (figur 1C-D). Musklerne sættes derefter tilbage på stedet, og grisen er dækket og holdes varm i den tid, sporstoffet cirkuleres. Efter cirkulation aflives dyret, og hjernen fjernes hurtigt. Det er muligt at generere syede makroskopiske billeder af hjernens dorsale overflade, hvilket letter med at give detaljeret indsigt i sporstofets fordelingsmønstre på den dorsale hjerneoverflade på tværs af sulci og sprækker (Figur 1E). Lignende billeder kan genereres fra hjernens ventrale og laterale overflader, hvor sporstoffordelingen kan undersøges i TL (TL) og den laterale revne (LF) (figur 1E). Et stereoskop kan desuden anvendes til at producere højere forstørrelse billeder af hjernens overflade, hvor det er muligt at se sporstof i PVS langs arterierne (Figur 1F-G). Makroskopiske koronar hjerne sektioner, ca 8 mm tyk, skæres ved hjælp af en laksekniv og giver yderligere indsigt i dybden af sporstof penetration i interhemispheric revne (IHS), samt subcortical tracer fordeling i strukturer som hippocampus (HPC) og striatum (STR), (Figur 1H).
Immunohistokemisk farvning til AQP4 udtrykt ved astrocytisk endfeet, glial-fibrillary acidic protein (GFAP) udtrykt i hele astrocytter og glat muskel actin (SMA) placeret omkring arterioles viste, at sporstoffet lokaliseret både inden for PVS og bevæger sig ind i hjernen parenchyma (Figur 1I-M). AQP4 og GFAP farvning bruges til at identificere astrocytter og mere specifikt de astrocyt fod processer, der danner den ydre overflade af PVS, mens lectin og GLUT-1 plette endotelceller, der danner den indre overflade af PVS (Figur 1I-L). Ved at udføre disse pletter for at definere PVS-grænserne er det muligt derefter at identificere CSF-injicerede sporstof, der er lokaliseret til PVS-rummet. Dette understøtter forestillingen om, at CSF får adgang til gyrencephalic hjernen via omfattende PVS transport, som derefter letter glymphatic tilstrømning i hjernen parenchyma. SMA farvning identificerer arterier og arteriel ved at binde sig til glatte muskelceller findes i arterievæggene og kan bruges til at vise, at PVS tilstrømning sker langs arterierne i modsætning til vener, som udgør den grundlæggende fysiologi af normal glymphatic funktion (Figur 1M).
Figur 1. Cisterna magna cannulation hos grise. (A) Gris prepped før starten af operationen og markeret, hvor dermale snit vil blive udført startende fra occipital crest (OC) derefter posterior til brysthvirvler (TV) og lateral til hver øre base (EB). (B) Hovedet i afslappet position med trapezius, semispinalis capitus biventer og semispinalis capitus complexus muskler trukket tilbage, og dermed udsætter cisterna magna (CM). (C) Hovedet bøjes manuelt for at øge adgangen til CM for cannulation og injektion. (D) Nærbillede af en kanyle, der er indsat i CM efter injektion og fastgjort med tandcementet (DC). (E) Dorsal, ventrale og laterale hjerneoverflader, henholdsvis efter fluorescerende billeddannelse med ledsagende strukturelle hvide lysbilleder. Interesseområder, der er synlige på disse overflader, omfatter den interhemisfæriske revne (IHS), temporal lobe (TL) og lateral fissure (LF). (F) Strukturelt hvidt lys billede af arterien og venerne på hjernens overflade. (G) Fluorescerende billede af (F), der viser sporstoffordelingen langs overfladearterien. (H) Makroskopiske skiver fra de forreste og bageste cerebrale regioner viser todimensionel sporstofspredning og -fordeling i sprækker (LF, IHS) og subkortikale strukturer som striatum (STR) og hippocampus (HPC). (I-J). Confocal billeder, der viser sporstoffet i PVS, afgrænset af lectin-farvede endotelceller internt og AQP4 på astrocyt fod processer eksternt. (K-L). Confocal billeder, der viser sporstoffet i PVS, afgrænset af endotelceller internt med astrocyt fod processer farves for glial fibrillary surt protein (GFAP) synlige danner en ydre grænse. (M) Confocal billede, der viser sporstoffet i PVS omkring en arteriole farves for glat muskel actin (SMA) med sporstof også synlige i og omkring, omkring hjernen parenkym. CM, cisterna magna; DC, dental cement; EB, ørebase; GFAP, gialflimren surt protein; HPC, hippocampus; IHS, interhemispheric revne; LF, sideværts revne; OLB, olfaktorisk pære; OC, occipital crest; STR, striatum; TL, tidsmæssig lap; Tv, brysthvirvler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende video 1: CSF pulsering efter sporstofindsprøjtningen. Nærbillede af cisterna magnaen efter sporstofindsprøjtningen. Blå sporstof er synlig i kanylen hals pulserende på rytmen af CSF og er tegn på en vellykket cannulation og injektion. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri beskrives en detaljeret protokol til at udføre den direkte cannulation af cisterna magna hos grise, herunder det nødvendige præparat, kirurgisk procedure, tracer infusion og ekstraktion af hjernen. Dette kræver en person med erfaring og certificering for at arbejde med store dyr. Hvis det udføres korrekt, giver dette mulighed for levering af ønskede molekyler med sikkerhed direkte ind i CSF, hvorefter en række forskellige avancerede lysbilleddannelsesmetoder kan bruges til at udforske CSF-fordeling og glymphatic funktion ved høj opløsning i et stort pattedyr.
Det er vigtigt at bemærke, at selvom dette er den samme procedure som cisterna magna cannulation hos gnavere, er det lidt mere udfordrende og kræver flere timers træning. En sådan træning omfatter håndtering af store pattedyr under laboratorieforhold, en forståelse af anatomien og bevægeapparatet, specielt hos svin, og en vis grad af færdigheder i at bruge kirurgiske instrumenter. Når disse kriterier er opfyldt, er det muligt at udføre denne teknik, som hidtil har en 100% succesrate sammenlignet med en 80-90% succesrate hos mus. Det mest kritiske punkt for at udføre proceduren korrekt, er at hæve hovedet og bøje nakken, mens du indsætter kanylen og infunderer sporstoffet. Selv om sporstof blev injiceret her i hånden, blev det gjort på en kontrolleret måde på 100 μL i minuttet. Hos mus injiceres 10 μL sporstof typisk, og når man sammenligner hjernestørrelser direkte, vil dette oversættes til ca. 2 mL i en 50 kg gris6,11,18. Derfor var injektionen af 500 μL sporstof faktisk et konservativt volumen og burde ikke have givet længere perturbances i intrakranielt tryk (ICP). Derudover har det for nylig vist sig, at perivaskulær glymphatic funktion ikke blot er en artefakt af forbigående stigninger i ICP, men fortsætter, når ICP opretholdes ved baseline ved hjælp af en dobbelt sprøjte metode yderligere at styrke forestillingen om, at disse resultater ikke afspejler artefakter af ændret ICP19.
Dette er ikke den eneste teknik, der kan bruges til at udføre CMc hos grise, og selvom det er væsentligt mere invasivt, ser det ud til at give en mere præcis sporinfusion. En anden måde at udføre CMc i grise er ved at ligge dem på deres side i den laterale liggende stilling og gå i blinde med en 150 mm spinal needle20. Selv om dette var en attraktiv metode på grund af dens minimale invasivitet, blev den potentielle succesrate opfattet som lavere. Da bagsiden af svinehovedet er fladt og CM sidder meget dybt (10-12 cm) fra overfladen, har rygmarvsnålen en lang afstand at rejse, før den trænger ind i CM, hvilket begrænser sikkerheden for vellykket cannulation. Bortset fra den store afstand til CM diameteren af CM selv er kun omkring 10 mm, yderligere at reducere risikoen for en vellykket cannulation. I modsætning hertil er det ved at udnytte den direkte CMc-metode muligt direkte at visualisere cannulationen og dermed med sikkerhed vide, at den har været vellykket, og at agenterne er blevet leveret til CSF og ikke lækket ud i det omgivende blødt væv. Det er vigtigt at sikre en vellykket cannulation for sådanne eksperimenter på grund af de høje omkostninger ved svin, kirurgifacilitet og fluorescerende sporstoffer samt for at minimere antallet af anvendte grise.
Begrænsningerne ved denne metode, bortset fra invasivitet, er, at omkostninger og tid afskrækker mange gentagelser sammenlignet med gnavere. Den første operation, der blev udført, tog omkring 3 timer, men den udføres i øjeblikket på ca. 45 minutter. Dette repræsenterer en betydelig tidsforbedring, men at udføre en cannulation i en mus, det tager mindre end 5 minutter for en dygtig forsker, hvilket betyder, at den faktiske operationstid ved at nå færdighed er stadig 9 gange længere end hos mus. Derudover betyder den store hjerne, at sporstofcirkulationstiderne i grisen er mere omfattende, for eksempel 2-6 timer, mens en standardcirkulationstid i mus er 30 minutter. Bortset fra de høje omkostninger ved sporstoffet, der er nødvendige i store mængder for grisen, gør de faktiske omkostninger ved grisen selv samt dets boliger, bedøvelsesmidler og omkostninger ved at bruge en fuld operationsstue slutomkostningerne ved denne procedure for en gris 15 gange dyrere end i en enkelt mus. En ekstra tidsrelateret udfordring er den tid, det tog for hjerneudvindingen efter sporstofcirkulationen. Tidligere rapporter har vist, at en vis bevægelse af sporstoffet gennem PVS fortsætter efter aktiv dødshjælp21. Dette gør det vigtigt at udtrække hjerner, så hurtigt som muligt, for at minimere eventuelle forvirrende virkninger fra dette fænomen. Mens musen hjerneudtrækning kun beløber sig til et par minutter, gris hjerneudtrækninger tage cirka 15-20 minutter af tid. Hjernen skal fjernes så hurtigt som muligt for at begrænse denne effekt, men med tykkelsen og arkitekturen af svinekraniet er det svært at reducere de nuværende ekstraktionstider.
Selv om direkte cannulation gør proceduren temmelig invasiv, samlede blodtab kun i gennemsnit 100 mL per operation, hvilket udgør et tab på mindre end 3% af det samlede blodvolumen. Desuden modtager dyret en kontinuerlig saltvandsinfusion med bedøvelsesmidlerne og en yderligere IV-linje af Ringers's laktat, der afbøder risikoen for hypovolemia.
Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at udforske oversættelsen af de glymphatic fysiologiske drivere identificeret i mus, samt glymphatic funktion i vågen eller naturligt sovende svin til at fjerne virkningen af bedøvelse22,23. For at undersøge den naturlige søvn eller vågen tilstand, vil det være nødvendigt at tilpasse den nuværende protokol, således at tracer kan leveres via mindre invasive midler og samtidig opretholde en høj succesrate. Dette kan potentielt opnås ved at udføre CM-injektioner under computertomografifluoskopi, som tidligere er blevet anvendt til lumbalpunktur hos svin24. Fremadrettet ville det være af stor interesse at kombinere denne teknik med genetiske manipulationer af AQP4-vandkanalen for at forstå dens rolle i glymphatic funktion i et stort pattedyr. Ved at udforske det fulde omfang af det glymphatic system i et stort pattedyr, bevæger feltet sig tættere på at forstå glymphatic funktion hos mennesker, og hvordan det kan udnyttes terapeutisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Knut og Alice Wallenberg Fonden, Hjärnfonden, Wenner Gren Fondene og Crafoord fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M.
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, Clifton, N.J. (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D'Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
