Summary
Cet article présente un protocole étape par étape pour l’implantation directe de canules dans la cisterna magna des porcs.
Abstract
Le système glymphatique est un système d’élimination des déchets dans le cerveau qui repose sur l’écoulement du liquide céphalo-rachidien (LCR) dans les espaces périvasculaires liés aux astrocytes et a été impliqué dans la clairance des peptides neurotoxiques tels que l’amyloïde-bêta. L’altération de la fonction glymphatique exacerbe la pathologie de la maladie dans les modèles animaux de maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, ce qui souligne l’importance de comprendre ce système de clairance. Le système glymphatique est souvent étudié par les canules cisterna magna (CMc), où les traceurs sont délivrés directement dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). La plupart des études, cependant, ont été réalisées sur des rongeurs. Ici, nous démontrons une adaptation de la technique CMc chez les porcs. En utilisant CMc chez les porcs, le système glymphatique peut être étudié à une résolution optique élevée dans les cerveaux gyrencéphales et, ce faisant, combler le fossé des connaissances entre les rongeurs et les glymphatiques humains.
Introduction
Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un ultrafiltrat de sang qui se trouve à l’intérieur et autour du système nerveux central (SNC)1,2. En plus de donner de la flottabilité au cerveau ou d’absorber les forces mécaniques dommageables, le LCR joue également un rôle central dans l’élimination des déchets métaboliques du SNC3. L’élimination des déchets est facilitée par le système glymphatique récemment caractérisé qui permet le flux convectif du LCR à travers le parenchyme cérébral via des espaces périvasculaires (PVS), qui encerclent les artères pénétrantes3,4,5. Il a été démontré que ce processus dépend de l’aquaporine-4 (AQP4), un canal d’eau exprimé principalement sur les pieds astrologiques, lié au PVS4,6. L’étude du système glymphatique est réalisée par imagerie in vivo et ex vivo, à l’aide de la microscopie optique avancée ou de l’imagerie par résonance magnétique (IRM), à la suite de l’introduction d’un traceur fluorescent / radioactif ou d’un agent de contraste dans le LCR7,8,9,10,11.
Un moyen efficace d’introduire un traceur dans le LCR sans subir de dommages au parenchyme cérébral consiste à utiliser la canulation cisterna magna (CMc)12,13. Une grande majorité de toutes les études glymphatiques, jusqu’à présent, ont été réalisées chez des rongeurs et évitées chez les mammifères supérieurs en raison du caractère invasif du CMc associé à la simplicité pratique du travail avec un petit mammifère. De plus, les crânes minces de souris permettent l’imagerie in vivo sans avoir besoin d’une fenêtre crânienne et permettent par la suite une extraction cérébrale simple11,14. Les expériences menées chez l’homme ont fourni de précieuses données macroscopiques in vivo sur la fonction glymphatique, mais se sont appuyées sur des injections intrathécales de traceurs dans la colonne lombaire distale et, en outre, utilisent l’IRM qui ne donne pas une résolution suffisante pour capturer la microanatomie du système glymphatique7,15,16 . Comprendre l’architecture et l’étendue du système glymphatique chez les mammifères supérieurs est essentiel pour sa traduction chez l’homme. Afin de faciliter la traduction glymphatique chez l’homme, il est important d’appliquer les techniques qui sont effectuées chez les rongeurs aux mammifères supérieurs afin de permettre des comparaisons directes du système glymphatique entre les espèces de complexité croissante de la cognition et du cerveau17. Les cerveaux des porcs et des humains sont gyrencéphales, possédant une neuroarchitecture pliée, tandis que les cerveaux des rongeurs sont lissencéphales, ayant ainsi une différence substantielle entre eux. En termes de taille globale, les cerveaux de porc sont également plus comparables à ceux des humains, étant 10 à 15 fois plus petits que le cerveau humain, tandis que les cerveaux de souris sont 3 000 fois plus petits18. En comprenant mieux le système glymphatique chez les grands mammifères, il pourrait être possible d’utiliser le système glymphatique humain pour une intervention thérapeutique future dans des conditions telles que les accidents vasculaires cérébraux, les lésions cérébrales traumatiques et la neurodégénérescence. Le CMc direct chez les porcs in vivo est une méthode qui permet la microscopie optique à haute résolution du système glymphatique chez un mammifère supérieur. En outre, en raison de la taille des porcs utilisés, il est possible d’appliquer des systèmes de surveillance similaires à ceux utilisés dans les chirurgies humaines, ce qui permet de documenter et de réguler étroitement les fonctions vitales afin d’évaluer comment celles-ci contribuent à la fonction glymphatique.
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la directive européenne 2010/63/UE et ont été approuvées par le comité d’éthique de Malmö-Lund sur la recherche animale (Dnr 5.8.18-05527/2019) et menées conformément aux directives CODEX du Conseil suédois de la recherche.
1. Préparation
- Traceur
- Préparer le LCR artificiel (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM de glucose, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
- À 500 μL de LCR artificiel, ajouter 10 mg d’albumine provenant du sérum bovin (BSA) conjugué avec Alexa Fluor 647 (BSA-647).
- Centrifugez à 5 000 x g pendant 5 min et utilisez le surnageant.
- Canule
- Fixez une seringue de 1 mL à la connexion Luer femelle de la ligne intraveineuse (IV), robinet à 3 voies avec extension de 10 cm.
- Fixez une aiguille de 18 G à l’extrémité mâle.
- Ouvrez le verrou d’arrêt à 3 voies pour permettre la continuité de l’aiguille à la seringue.
- Dégainez soigneusement l’aiguille et aspirez environ 300 μL de la solution saline dans la ligne IV.
- Retirez l’aiguille de la solution saline et procédez à l’introduction dans un peu d’air pour créer une petite bulle d’air (5-10 mm) dans la ligne IV.
- Placez l’aiguille dans le traceur et aspirez les 500 μL du traceur. La solution saline dans la ligne IV doit être visiblement séparée par une bulle d’air.
- Jetez l’aiguille et fermez le verrou d’arrêt à 3 voies.
- Animal
- Sédater un porc par injection intramusculaire (i.m.) de tilétamine (3,75 mg/kg) et de zolazépam (3,75 mg/kg) et de dexmédétomidine (37,5 μg/kg). Attendez qu’il devienne inconscient.
- Préparez une ligne intraveineuse en insérant une canule de 20 G dans la veine de l’oreille.
REMARQUE: Assurez-vous que la canule est dans la veine en injectant 5-10 mL de solution saline à travers la canule. Si la veine a été manquée, cela sera perceptible par un petit œdème dans le tissu de l’oreille. - Intuber le porc pour s’assurer que la fréquence respiratoire peut être régulée tout au long de la chirurgie.
REMARQUE: Assurer une intubation réussie en appliquant une pression sur le thorax du porc et confirmer que de l’air expiré de force sort du tube d’intubation. - Fixez le tube d’intubation à un ventilateur réglé sur un rythme respiratoire de 14 respirations / min.
- Connectez un oxymètre de pouls et un brassard à la queue pour surveiller la fréquence cardiaque (HR), la pression artérielle (BP) et la saturation en oxygène (sats). Insérez un thermomètre rectal pour surveiller la température centrale.
- Préparer un sac IV de kétamine (5 mg/kg/min), de midazolam (0,25 mg/kg/min) et de fentanyl (2,5 μg/kg/min), dans une solution saline et commencer à infuser dans la veine de l’oreille à environ 2 gouttes/s.
REMARQUE: Tout au long de la chirurgie, le débit de perfusion peut devoir être augmenté ou diminué en fonction des signes vitaux de l’animal. - Avec le cochon en position couchée, palper l’arrière de la tête et du cou de l’animal pour localiser et marquer la crête occipitale et la colonne vertébrale des premières vertèbres thoraciques et la base de chaque oreille.
- Tracez une ligne droite entre la crête et les vertèbres le long de l’axe longitudinal. Tracez deux lignes de la crête à la base de chaque oreille en suivant la base du crâne (Figure 1A).
- Vérifiez que l’animal est dans un sommeil profond en serrant soigneusement la queue et en surveillant l’absence de réflexe de queue.
REMARQUE: Si l’animal est encore réflexif, le débit de perfusion d’anesthésique doit être augmenté progressivement jusqu’à ce que l’animal ne présente plus de réflexe.
2. Chirurgie
REMARQUE: Tout au long de la chirurgie, il est nécessaire d’avoir au moins un assistant pour aspirer le saignement léger et cautériser les vaisseaux sectionnés.
- À l’aide d’un scalpel avec une lame # 21, faites une incision cutanée le long de la ligne longitudinale jusqu’au muscle.
- Étendez deux incisions cutanées perpendiculaires plus loin le long des épaules, de 10 à 15 cm de long.
- À partir des crêtes occipitales, faites des incisions cutanées le long de la ligne jusqu’à la base de chaque oreille.
- En saisissant les coins de la peau formés à la crête occipitale avec une pince anatomique, séparez soigneusement la peau du muscle sous-jacent en faisant glisser légèrement la lame du scalpel sur le fascia, passant du rostral au caudal. Une fois que la peau a été réséquée après chacune des cinq incisions, des parties des muscles trapèzes doivent alors être visibles.
- Faites une incision longitudinale avec le scalpel, d’environ 1 cm de profondeur, où le trapèze se réunit à la ligne médiane.
REMARQUE: Lors de la coupe à travers les muscles, il y a une propension accrue à saigner, de sorte que le cautérisateur doit être prêt. Si un vaisseau plus gros est sectionné, une personne doit rapidement le comprimer avec la gaze, tandis que l’autre personne utilise le cautérisateur. - À l’aide d’une combinaison de pinces chirurgicales droites et incurvées, effectuez une dissection émoussée le long de la coupe longitudinale dans les muscles. Cela séparera le ventre du trapèze, ainsi que le muscle biventeur semispinalis capitus sous-jacent.
- Coupez toutes les fibres musculaires persistantes avec un scalpel et continuez la dissection émoussée jusqu’à ce que semispinalis capitus complexus devienne visible.
- Couper les origines des muscles biventeurs trapèze et semispinalis capitus le long de l’aspect postérieur du crâne. Séparez-les soigneusement longitudinalement avec le scalpel effectuant une dissection émoussée jusqu’à ce que le semispinalis capitus complexus soit entièrement visible.
- Rétractez les muscles biventeurs trapèze et semispinalis capitus à l’aide de rétracteurs auto-retenus.
- Là où les ventres du semispinalis capitus complexus se rejoignent dans la ligne médiane, faites une incision longitudinale avec le scalpel d’environ 1 cm de profondeur.
REMARQUE: Soyez conscient de tout saignement supplémentaire ici. Les saignements peuvent être gérés à l’aide d’une combinaison de cotons-tiges et de cautérisation. - À l’aide d’une pince chirurgicale, effectuez une dissection contondante le long de la coupe longitudinale entre les ventres musculaires jusqu’à ce que l’aspect dorsal de l’atlas (IC) soit palpable.
- Couper les origines des muscles semispinalis capitus complexus le long de l’aspect postérieur du crâne et le séparer longitudinalement des vertèbres sous-jacentes par scalpel et dissection contondante.
- Rétractez les muscles semispinalis capitus complexus à l’aide d’un autre ensemble de rétracteurs auto-retenants.
- À l’aide d’un scalpel, retirez soigneusement tout tissu restant recouvrant la région où l’atlas rencontre la base du crâne.
- En plaçant un bras sous le cou de l’animal et un doigt à la jonction de l’atlas et du crâne, élevez simultanément la tête et fléchissez le cou tout en palpant avec le doigt pour révéler la cisterna magna à l’aide de l’autre main.
REMARQUE: La cisterna magna est reconnaissable lors de la palpation comme une structure élastique forte avec une petite quantité de rebond lorsque la pression est libérée avec le doigt.
3. Canulation et injection
REMARQUE: Cette étape nécessite également au moins deux personnes et est effectuée avec la tête de l’animal surélevée et le cou fléchi.
- Assurez-vous qu’une personne élève et fléchit la tête et le cou de l’animal tandis que l’autre palpe pour la cisterna magna en notant son emplacement anatomique.
- Introduire lentement et soigneusement une canule de 22 G à travers la dure-mère et dans la cisterna magna à un angle oblique par rapport à l’axe longitudinal.
REMARQUE: N’insérez pas la canule trop profondément, car cela pourrait causer des dommages au cerveau. Savoir jusqu’où insérer la canule vient avec l’expérience de comprendre ce que l’on ressent pour la canule de percer la dure-mère. Essentiellement, tout comme la dure-mère a été percée, la canule est alors assez profonde pour une injection de traceur réussie. Cette profondeur est d’environ 3-5 mm mais diffère en fonction de la taille ou de l’âge de l’animal. Une canulation réussie doit être immédiatement évidente grâce à la visualisation d’un LCR clair et pulsatile remontant la canule. Pour le meilleur résultat, il est recommandé de pratiquer plusieurs canules au préalable chez les animaux euthanasiés pour comprendre le piercing dural. - Rétractez l’aiguille de la canule et placez un capuchon sur la serrure.
- Tout d’abord, appliquez de la superglue et un accélérateur où la canule pénètre dans le tissu, suivi de l’application du ciment dentaire. Attendez 5 min pour que le ciment durcisse.
- Retirez soigneusement le capuchon de la canule et fixez l’extrémité mâle du robinet de ligne IV préalablement préparé avec une extension de 10 cm, avec le traceur, à la canule.
- Injecter lentement le traceur à la main ou à l’aide d’une micro-pompe à perfusion à une vitesse de 100 μL/min. Retirez le robinet de ligne IV à 3 voies avec une extension de 10 cm et remplacez-le par le capuchon. Tracer devrait maintenant être visible pulsé à la base de la canule (vidéo supplémentaire 1).
REMARQUE: Si vous injectez à la main, faites-le jusqu’à ce que le traceur soit encore visible dans l’arbre de la canule, à environ 1-2 mm au-dessus de l’endroit où le ciment dentaire recouvre l’arbre. - Après l’injection, placez des sacs de sable sous le cou pour maintenir une certaine flexion. La tête peut alors être relâchée et l’animal est laissé dans une position couchée au repos.
- Relâchez les rétracteurs auto-retenus et placez les muscles comme ils se trouvaient avant. Rassemblez la peau sur les muscles à l’aide de pinces à serviette chirurgicales.
- Couvrez les pinces à serviette et l’incision avec de la gaze, puis une couverture pour limiter les pertes de chaleur.
- Laissez le traceur circuler pendant le temps souhaité avant d’euthanasier l’animal par i.v. Injection de pentobarbital (140 mg/kg). Confirmer l’euthanasie par l’absence de sons cardiaques lors de l’auscultation avec un stéthoscope.
4. Extraction et traitement du cerveau
- À l’aide d’un scalpel à 20 lames, étendez l’incision cutanée longitudinale de la crête occipitale à environ 7 cm au-dessus du nez.
- Réfléchissez la peau recouvrant l’aspect dorsal du crâne à l’aide du scalpel.
REMARQUE: Il existe plusieurs façons de couper et d’enlever l’aspect dorsal du crâne de porc animal par animal. Ce qui suit est la procédure qui a fonctionné le plus souvent pour cette expérience. - À l’aide d’une scie compacte portative, faites une coupe coronale dans le crâne, à environ 3 cm au-dessus des deux grandes veines qui sortent du crâne. Étendez à deux autres coupes verticales à partir des coupes coronales et à deux autres coupes pour rapprocher les coupes verticales dans la ligne médiane.
REMARQUE: Maintenez une prise ferme de la scie lorsque vous faites les coupes d’os du crâne, car elle aura tendance à s’éloigner au premier contact avec l’os ou le tissu, ce qui peut entraîner une blessure grave. - Assurez-vous que les coupes du crâne traversent toute l’épaisseur de l’os en suivant avec un marteau et un ciseau étroit (10 mm) à chacune des coupes.
- À l’aide du marteau, frappez enfin un large ciseau (25-30 mm) dans la coupe coronale. Avec une personne soutenant la tête, assurez-vous que l’autre personne applique un effet de levier sur le ciseau pour grimacer le crâne dorsal.
- Une fois le fragment de crâne dorsal retiré, disséquez la dure-mère sus-jacente à l’aide de ciseaux chirurgicaux incurvés.
- Utilisez une spatule pour sévèrer la moelle épinière du cervelet à l’aspect rostral. Ensuite, guidez la spatule sous le cerveau par l’avant, en coupant les bulbes olfactifs, l’hypophyse et les nerfs crâniens.
- Placez la spatule derrière le cervelet et appliquez une bonne pression pour déloger le cerveau de la cavité crânienne, en le soulevant soigneusement une fois lâche.
- Fixez immédiatement tout le cerveau par immersion tissulaire dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit.
REMARQUE: Après cette étape, il est possible d’effectuer l’imagerie cérébrale entière à l’aide d’un stéréoscope (Figure 1E). - Le lendemain, faites des tranches coronales du cerveau à l’aide d’un couteau à saumon et fixez les tranches pendant la nuit par immersion tissulaire dans 4% de paraformaldéhyde.
- Enfin, placez les tranches dans de l’azoture à 0,01% dans PBS pour un stockage à long terme.
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Representative Results
Une fois que le porc est inconscient, il est palpé et son anatomie de surface est marquée, en commençant par la crête occipitale (OC) et en travaillant vers les vertèbres thoraciques (TV) et chaque base de l’oreille (EB). C’est dans ce sens que sont pratiquées les incisions cutanées (Figure 1A). Les trois couches musculaires, dont le trapèze, le semispinalis capitus biventer et le semispinalis capitus complexus, sont réséquées et maintenues ouvertes par deux ensembles de rétracteurs auto-retenants pour exposer la cisterna magna (CM) (Figure 1B). La tête est ensuite fléchie pour ouvrir l’espace entre l’arrière du crâne et l’atlas et faciliter l’accès au CM (Figure 1C). Une canule de 18 G est insérée avec précaution de 3 à 5 mm dans le CM et fixée en place par de la super colle et du ciment dentaire (DC). Tracer peut ensuite être injecté à un taux fixe. Une fois le traceur injecté, la ligne IV et la seringue sont remplacées par un capuchon de canule (Figure 1C-D). Les muscles sont ensuite remis à l’endroit et le cochon est recouvert et maintenu au chaud pendant le temps que le traceur circule. Après la circulation, l’animal est euthanasié et le cerveau est rapidement retiré. Il est possible de générer des images macroscopiques cousues de la surface dorsale du cerveau, ce qui facilite la fourniture d’informations détaillées sur les modèles de distribution du traceur sur la surface du cerveau dorsal à travers les sulci et les fissures (Figure 1E). Des images similaires peuvent être générées à partir des surfaces ventrales et latérales du cerveau où la distribution du traceur peut être étudiée dans le lobe temporal (TL) et la fissure latérale (LF) (Figure 1E). Un stéréoscope peut également être utilisé pour produire des images à grossissement plus élevé de la surface du cerveau où il est possible de voir le traceur dans le PVS le long des artères (Figure 1F-G). Les sections macroscopiques du cerveau coronal, d’environ 8 mm d’épaisseur, sont coupées à l’aide d’un couteau à saumon et fournissent un aperçu plus approfondi de la profondeur de pénétration du traceur dans la fissure interhémisphérique (IHS), ainsi que de la distribution des traceurs sous-corticaux dans des structures telles que l’hippocampe (HPC) et le striatum (STR) (Figure 1H).
La coloration immunohistochimique de l’AQP4 exprimée aux extrémités astrocytaires, la protéine acide gliale-fibrillaire (GFAP) exprimée dans les astrocytes et l’actine musculaire lisse (SMA) situées autour des artérioles a montré que le traceur se localisait à la fois dans le PVS et se déplaçait dans le parenchyme cérébral (Figure 1I-M). La coloration AQP4 et GFAP est utilisée pour identifier les astrocytes et plus précisément, les processus du pied astrocytaire qui forment la surface externe du PVS tandis que la lectine et le GLUT-1 colorent les cellules endothéliales qui forment la surface interne du PVS (Figure 1I-L). En effectuant ces colorations pour définir les limites PVS, il est alors possible d’identifier le traceur injecté par CSF localisé dans l’espace PVS. Cela soutient l’idée que le LCR accède au cerveau gyencéphale via un transport PVS étendu qui facilite ensuite l’afflux glymphatique dans le parenchyme cérébral. La coloration SMA identifie les artères et les artérioles en se liant aux cellules musculaires lisses présentes dans les parois artérielles et peut être utilisée pour montrer que l’afflux de PVS se produit le long des artères par opposition aux veines, ce qui constitue la physiologie de base de la fonction glymphatique normale (Figure 1M).
Graphique 1. Cisterna magna cannulation chez les porcs. (A) Porc préparé avant le début de la chirurgie et marqué où les incisions cutanées seront effectuées à partir de la crête occipitale (OC) puis postérieure aux vertèbres thoraciques (TV) et latérale à chaque base de l’oreille (EB). (B) Tête en position détendue avec les muscles trapèze, semispinalis capitus biventer et semispinalis capitus complexus rétractés, exposant ainsi la cisterna magna (CM). (C) Tête fléchie manuellement pour augmenter l’accès à la CM pour la canulation et l’injection. (D) Image en gros plan d’une canule insérée dans CM après injection et fixée en place avec le ciment dentaire (DC). (E) Surfaces dorsales, ventrales et latérales du cerveau, respectivement, après imagerie fluorescente accompagnée d’images structurelles en lumière blanche. Les zones d’intérêt visibles à ces surfaces comprennent la fissure interhémisphérique (IHS), le lobe temporal (TL) et la fissure latérale (LF). (F) Image structurelle en lumière blanche de l’artère et des veines à la surface du cerveau. (G) Image fluorescente de (F) montrant la distribution du traceur le long de l’artère de surface. (H) Les tranches macroscopiques des régions cérébrales antérieure et postérieure montrent une dispersion et une distribution de traceurs bidimensionnels dans les fissures (LF, IHS) et les structures sous-corticales comme le striatum (STR) et l’hippocampe (HPC). (I-J). Images confocales montrant le traceur dans le PVS, délimité par des cellules endothéliales colorées par la lectine à l’intérieur et AQP4 sur les processus du pied astrocytaire à l’extérieur. (K-L). Images confocales montrant le traceur dans le PVS, délimité par des cellules endothéliales internes avec des processus du pied astrocytaire colorés pour la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) visible formant une frontière externe. (M) Image confocale montrant le traceur dans le PVS autour d’une artériole colorée pour l’actine musculaire lisse (SMA) avec traceur également visible dans et autour, entourant le parenchyme cérébral. CM, cisterna magna; DC, ciment dentaire; EB, base d’oreille; GFAP, protéine acide fibrillaire gliale; HPC, hippocampe; IHS, fissure interhémisphérique; LF, fissure latérale; OLB, ampoule olfactive; OC, crête occipitale; STR, striatum; TL, lobe temporal; TV, vertèbres thoraciques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo supplémentaire 1 : Pulsation du LCR après l’injection du traceur. Vidéo en gros plan de la cisterna magna après l’injection du traceur. Le traceur bleu est visible dans le cou de la canule en pulsant au rythme du LCR et indique une canulation et une injection réussies. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Ici, est décrit, un protocole détaillé pour effectuer la canulation directe de la cisterna magna chez les porcs, y compris la préparation nécessaire, la procédure chirurgicale, la perfusion de traceur et l’extraction du cerveau. Cela nécessite une personne ayant de l’expérience et une certification pour travailler avec de gros animaux. S’il est effectué correctement, cela permet la livraison des molécules souhaitées avec caution directement dans le LCR, après quoi une série de différentes modalités avancées d’imagerie lumineuse peuvent être utilisées pour explorer la distribution du LCR et la fonction glymphatique à haute résolution chez un grand mammifère.
Il est important de noter que bien qu’il s’agisse de la même procédure que la canulation cisterna magna chez les rongeurs, elle est légèrement plus difficile et nécessite plusieurs heures de formation. Cette formation comprend la manipulation de grands mammifères dans des conditions de laboratoire, une compréhension de l’anatomie et du système musculo-squelettique, en particulier chez les porcs, et un certain degré de compétence dans l’utilisation d’instruments chirurgicaux. Une fois ces critères remplis, il est possible de réaliser cette technique, qui a jusqu’à présent un taux de réussite de 100% par rapport à un taux de réussite de 80-90% chez la souris. Le point le plus critique pour effectuer correctement la procédure est d’élever la tête et de fléchir le cou tout en insérant la canule et en injectant le traceur. Bien que le traceur ait été injecté ici à la main, il l’a été de manière contrôlée de 100 μL par minute. Chez la souris, 10 μL de traceur sont généralement injectés et, en comparant directement la taille du cerveau, cela se traduirait par environ 2 mL chez un porc de 50 kg6,11,18. Par conséquent, l’injection de 500 μL de traceur était en fait un volume conservateur et n’aurait pas dû produire de perturbations prolongées en pression intracrânienne (PCI). De plus, il a récemment été démontré que la fonction glymphatique périvasculaire n’est pas simplement un artefact d’augmentation transitoire de la PCI, mais persiste lorsque la PCI est maintenue à l’inclusion à l’aide d’une méthode à double seringue, renforçant encore la notion que ces résultats ne reflètent pas les artefacts de l’ICP19 modifié.
Ce n’est pas la seule technique qui peut être utilisée pour effectuer le CMc chez les porcs, et bien qu’elle soit beaucoup plus invasive, elle semble donner une perfusion de traceur plus précise. Une autre façon d’effectuer le CMc chez les porcs est de les allonger sur le côté en position couchée latérale et de les mettre à l’aveugle avec une aiguille spinale de 150 mm20. Bien qu’il s’agisse d’une méthode attrayante en raison de son caractère peu invasif, le taux de réussite potentiel était perçu comme étant plus faible. Étant donné que l’arrière de la tête de porc est plat et que le CM est très profond (10-12 cm) de la surface, l’aiguille vertébrale a une longue distance à parcourir avant de pénétrer dans le CM, limitant ainsi la certitude d’une canulation réussie. Outre la grande distance au CM, le diamètre du CM lui-même n’est que d’environ 10 mm, ce qui réduit encore les chances de réussite de la canulation. En revanche, en utilisant la méthode CMc directe, il est possible de visualiser directement la canulation et ainsi de savoir avec certitude qu’elle a réussi et que les agents ont été livrés au LCR et ne se sont pas échappés dans les tissus mous environnants. Assurer le succès de la canulation est important pour de telles expériences en raison du coût élevé des porcs, de l’installation chirurgicale et des traceurs fluorescents, ainsi que pour minimiser le nombre de porcs utilisés.
Les limites de cette méthode, outre le caractère invasif, sont que le coût et le temps découragent de nombreuses répétitions par rapport aux rongeurs. La première intervention chirurgicale a duré environ 3 heures, mais elle est actuellement effectuée en environ 45 minutes. Cela représente une amélioration significative du temps, cependant, pour effectuer une canulation chez une souris, il faut moins de 5 minutes pour un chercheur qualifié, ce qui signifie que le temps réel de chirurgie après avoir atteint la compétence est encore 9 fois plus long que chez la souris. De plus, le gros cerveau signifie que les temps de circulation du traceur chez le porc sont plus étendus, par exemple, 2 à 6 heures, tandis que chez la souris, un temps de circulation standard est de 30 minutes. Outre le coût élevé du traceur, nécessaire en grands volumes pour le porc, le coût réel du porc lui-même ainsi que son logement, ses anesthésiques et le coût d’utilisation d’une salle d’opération complète rendent le coût final de cette procédure pour un porc 15 fois plus cher que chez une seule souris. Un défi supplémentaire lié au temps est le temps nécessaire à l’extraction du cerveau après la circulation du traceur. Des rapports antérieurs ont montré qu’une partie du mouvement du traceur à travers pvsien persiste après l’euthanasie21. Il est donc important d’extraire les cerveaux, le plus rapidement possible, afin de minimiser les effets de confusion de ce phénomène. Alors que l’extraction du cerveau de la souris ne représente que quelques minutes, les extractions du cerveau du porc prennent environ 15 à 20 minutes de temps. Le cerveau doit être retiré le plus rapidement possible pour limiter cet effet, mais avec l’épaisseur et l’architecture du crâne du porc, il est difficile de réduire les temps d’extraction actuels.
Bien que la canulation directe rende la procédure assez invasive, la perte de sang globale n’était en moyenne que de 100 mL par chirurgie, ce qui constitue une perte de moins de 3% du volume sanguin total. De plus, l’animal reçoit une perfusion saline continue avec les anesthésiques et une ligne IV supplémentaire de lactate de Ringers, ce qui atténue le risque d’hypovolémie.
Des études futures sont nécessaires pour explorer la traduction des facteurs physiologiques glymphatiques identifiés chez la souris, ainsi que la fonction glymphatique chez les porcs éveillés ou naturellement endormis afin d’éliminer l’impact des anesthésiques22,23. Afin d’étudier l’état naturel de sommeil ou d’éveil, il sera nécessaire d’adapter le protocole actuel de manière à ce que le traceur puisse être administré par des moyens moins invasifs tout en maintenant un taux de réussite élevé. Cela pourrait potentiellement être réalisé en effectuant des injections de CM sous fluoroscopie par tomodensitométrie, qui a déjà été utilisée pour la ponction lombaire chez les porcs24. À l’avenir, il serait très intéressant de combiner cette technique avec des manipulations génétiques du canal d’eau AQP4 pour comprendre son rôle dans la fonction glymphatique chez un grand mammifère. En explorant toute l’étendue du système glymphatique chez un grand mammifère, le domaine se rapproche de la compréhension de la fonction glymphatique chez l’homme et de la façon dont elle pourrait être utilisée thérapeutiquement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation Knut et Alice Wallenberg, Hjärnfonden, les Fondations Wenner Gren et la Fondation Crafoord.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
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