Summary
Dieser Artikel stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die direkte Kanülenimplantation in die Cisterna magna von Schweinen vor.
Abstract
Das glymphatische System ist ein Abfallclearing-System im Gehirn, das auf dem Fluss von Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) in Astrozyten-gebundenen perivaskulären Räumen beruht und an der Clearance von neurotoxischen Peptiden wie Amyloid-Beta beteiligt ist. Eine beeinträchtigte glymphatische Funktion verschlimmert die Krankheitspathologie in Tiermodellen neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, was die Bedeutung des Verständnisses dieses Clearance-Systems unterstreicht. Das glymphatische System wird oft durch Cisterna magna Cannulationen (CMc) untersucht, bei denen Tracer direkt in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) abgegeben werden. Die meisten Studien wurden jedoch an Nagetieren durchgeführt. Hier demonstrieren wir eine Adaption der CMc-Technik bei Schweinen. Mit CMc in Schweinen kann das glymphatische System mit einer hohen optischen Auflösung in gyrenzephalen Gehirnen untersucht werden und schließt so die Wissenslücke zwischen Nagetieren und menschlichen Glymphatika.
Introduction
Liquor cerebrospinalis (CSF) ist ein Ultrafiltrat von Blut, das innerhalb und um das zentrale Nervensystem (ZNS) gefunden wird1,2. Abgesehen davon, dass es dem Gehirn Auftrieb verleiht oder schädliche mechanische Kräfte absorbiert, spielt CSF auch eine entscheidende Rolle bei der Beseitigung von Stoffwechselabfällen aus dem ZNS3. Die Abfallentsorgung wird durch das kürzlich charakterisierte glymphatische System erleichtert, das den konvektiven Fluss von CSF durch das Hirnparenchym über perivaskuläre Räume (PVS) ermöglicht, die durchdringende Arterien umgeben3,4,5. Es wurde gezeigt, dass dieser Prozess von Aquaporin-4 (AQP4) abhängig ist, einem Wasserkanal, der hauptsächlich auf den astrozytären Endfüßen exprimiert wird und an das PVS4,6 gebunden ist. Die Untersuchung des glymphatischen Systems wird sowohl durch In-vivo- als auch durch Ex-vivo-Bildgebung erreicht, entweder unter Verwendung fortgeschrittener Lichtmikroskopie oder Magnetresonanztomographie (MRT), nachdem ein fluoreszierender/radioaktiver Tracer oder ein Kontrastmittel in das CSF7,8,9,10,11 eingeführt wurde.
Eine effektive Möglichkeit, einen Tracer in das Liquor einzuführen, ohne das Parenchym des Gehirns zu schädigen, ist die Cisterna Magna Cannulation (CMc)12,13. Eine große Mehrheit aller glymphatischen Studien wurde bisher an Nagetieren durchgeführt und bei höheren Säugetieren wegen der Invasivität von CMc in Verbindung mit der praktischen Einfachheit der Arbeit mit einem kleinen Säugetier vermieden. Darüber hinaus erlauben die dünnen Schädel von Mäusen eine In-vivo-Bildgebung ohne Schädelfenster und ermöglichen anschließend eine unkomplizierte Hirnextraktion11,14. Experimente, die am Menschen durchgeführt wurden, haben wertvolle makroskopische In-vivo-Daten über die glymphatische Funktion ergeben, stützten sich jedoch auf intrathekale Tracer-Injektionen in die distale Lendenwirbelsäule und verwendeten darüber hinaus MRT, die keine ausreichende Auflösung liefert, um die Mikroanatomie des glymphatischen Systems zu erfassen7,15,16 . Das Verständnis der Architektur und des Ausmaßes des glymphatischen Systems bei höheren Säugetieren ist für seine Übertragung auf den Menschen unerlässlich. Um die glymphatische Translation auf den Menschen zu erleichtern, ist es wichtig, Techniken, die bei Nagetieren durchgeführt werden, auf höhere Säugetiere anzuwenden, um direkte Vergleiche des glymphatischen Systems zwischen Arten mit zunehmender Kognitions- und Gehirnkomplexität zu ermöglichen17. Schweine- und menschliche Gehirne sind gyrenzephal und besitzen eine gefaltete Neuroarchitektur, während Nagetiergehirne lissenzephal sind und dadurch erhebliche Unterschiede zueinander aufweisen. In Bezug auf die Gesamtgröße sind Schweinegehirne auch eher mit Menschen vergleichbar, da sie 10-15 Mal kleiner sind als das menschliche Gehirn, während Mausgehirne 3.000 Mal kleiner sind18. Durch ein besseres Verständnis des glymphatischen Systems bei großen Säugetieren könnte es möglich sein, das menschliche glymphatische System für zukünftige therapeutische Interventionen bei Erkrankungen wie Schlaganfall, Schädel-Hirn-Trauma und Neurodegeneration zu nutzen. Direct CMc in Pigs in vivo ist eine Methode, die die hochauflösende Lichtmikroskopie des glymphatischen Systems bei einem höheren Säugetier ermöglicht. Darüber hinaus ist es aufgrund der Größe der verwendeten Schweine möglich, Überwachungssysteme anzuwenden, die denen in menschlichen Operationen ähneln, so dass es möglich ist, Vitalfunktionen streng zu dokumentieren und zu regulieren, um zu beurteilen, wie diese zur glymphatischen Funktion beitragen.
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Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der europäischen Richtlinie 2010/63/EU durchgeführt und vom Malmö-Lund Ethikausschuss für Tierversuche (Dnr 5.8.18-05527/2019) genehmigt und gemäß den CODEX-Richtlinien des schwedischen Forschungsrats durchgeführt.
1. Vorbereitung
- Tracer
- Künstliches LIQUOR herstellen (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM Glucose, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
- Zu 500 μL künstlichem CSF werden 10 mg Albumin aus Rinderserum (BSA) hinzugefügt, das mit Alexa Fluor 647 (BSA-647) konjugiert ist.
- Zentrifugiere bei 5.000 x g für 5 min und benutze den Überstand.
- Kanüle
- Befestigen Sie eine 1 mL Spritze an der Luer-Buchse der intravenösen (IV) Leitung, 3-Wege-Hahn mit 10 cm Verlängerung.
- Befestigen Sie eine 18 G Nadel am männlichen Ende.
- Öffnen Sie die 3-Wege-Stoppsperre, um eine Kontinuität von der Nadel bis zur Spritze zu ermöglichen.
- Vorsichtig die Nadel abziehen und ca. 300 μL der Kochsalzlösung in die IV-Leitung absaugen.
- Entfernen Sie die Nadel von der Kochsalzlösung und führen Sie etwas Luft ein, um eine kleine Luftblase (5-10 mm) in der IV-Linie zu erzeugen.
- Legen Sie die Nadel in den Tracer und aspirieren Sie alle 500 μL des Tracers. Die Kochsalzlösung in der IV-Leitung sollte durch eine Luftblase sichtbar getrennt sein.
- Entsorgen Sie die Nadel und schließen Sie die 3-Wege-Stoppsperre.
- Tier
- Sedieren Sie ein Schwein durch intramuskuläre (i.m.) Injektion von Tiletamin (3,75 mg/kg) und Zolazepam (3,75 mg/kg) und Dexmedetomidin (37,5 μg/kg). Warten Sie, bis es bewusstlos wird.
- Bereiten Sie eine intravenöse Leitung vor, indem Sie eine 20 G-Kanüle in die Ohrvene einführen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Kanüle in der Vene befindet, indem Sie 5-10 ml Kochsalzlösung durch die Kanüle injizieren. Wenn die Vene übersehen wurde, macht sich dies durch kleine Ödeme im Ohrgewebe bemerkbar. - Intubieren Sie das Schwein, um sicherzustellen, dass die Atemfrequenz während der gesamten Operation reguliert werden kann.
HINWEIS: Stellen Sie eine erfolgreiche Intubation sicher, indem Sie Druck auf den Brustkorb des Schweins ausüben und bestätigen, dass gewaltsam ausgelaufene Luft aus dem Intubationsrohr austritt. - Befestigen Sie den Intubationsschlauch an einem Beatmungsgerät mit einer Atemfrequenz von 14 Atemzügen/min.
- Schließen Sie ein Pulsoximeter und eine Manschette an den Schwanz an, um die Herzfrequenz (HR), den Blutdruck (BP) und die Sauerstoffsättigung (Sats) zu überwachen. Setzen Sie ein Rektalthermometer ein, um die Kerntemperatur zu überwachen.
- Bereiten Sie einen IV-Beutel mit Ketamin (5 mg / kg / min), Midazolam (0,25 mg / kg / min) und Fentanyl (2,5 μg / kg / min) in Kochsalzlösung vor und beginnen Sie mit etwa 2 Tropfen / s durch die Ohrvene zu infundieren.
HINWEIS: Während der gesamten Operation muss die Infusionsrate möglicherweise erhöht oder verringert werden, basierend auf den Vitalwerten des Tieres. - Tasten Sie mit dem Schwein in Bauchlage den Hinterkopf und den Nacken des Tieres ab, um den Hinterhauptkamm und die Wirbelsäule der ersten Brustwirbel und die Basis jedes Ohrs zu lokalisieren und zu markieren.
- Zeichnen Sie eine gerade Linie zwischen dem Kamm und den Wirbeln entlang der Längsachse. Zeichnen Sie zwei Linien vom Kamm bis zur Basis jedes Ohres, indem Sie der Schädelbasis folgen (Abbildung 1A).
- Überprüfen Sie, ob sich das Tier in einem tiefen Schlaf befindet, indem Sie den Schwanz vorsichtig festklemmen und auf das Fehlen eines Schwanzreflexes achten.
HINWEIS: Wenn das Tier immer noch reflexiv ist, sollte die Anästhesie-Infusionsrate schrittweise erhöht werden, bis das Tier keinen Reflex mehr zeigt.
2. Chirurgie
HINWEIS: Während der gesamten Operation ist es notwendig, mindestens einen Assistenten zu haben, um die leichten Blutungen abzusaugen und alle durchtrennten Gefäße zu kauterisieren.
- Verwenden Sie ein Skalpell mit einer # 21-Klinge, machen Sie einen dermalen Schnitt entlang der Längslinie bis zum Muskel.
- Strecken Sie zwei senkrechte hautnahe Schnitte weiter entlang der Schultern aus, 10-15 cm lang.
- Machen Sie von den Okzipitalkämmen dermale Einschnitte entlang der Linie bis zur Basis jedes Ohres.
- Wenn Sie die am Hinterhauptkamm gebildeten Hautecken mit einer anatomischen Pinzette greifen, trennen Sie die Haut vorsichtig vom darunter liegenden Muskel, indem Sie die Skalpellklinge leicht über die Faszie führen und sich vom Rostral zum Schwanz bewegen. Sobald die Haut nach jedem der fünf Schnitte reseziert wurde, sollten Teile der Trapezmuskeln sichtbar sein.
- Machen Sie einen Längsschnitt mit dem Skalpell, etwa 1 cm tief, wo der Trapezius an der Mittellinie zusammenkommt.
HINWEIS: Beim Durchschneiden der Muskeln besteht eine erhöhte Blutungsneigung, daher sollte der Kauterizer bereit sein. Wenn ein größeres Gefäß durchtrennt wird, sollte eine Person es schnell mit der Gaze komprimieren, während die andere Person den Kauterizer verwendet. - Führen Sie mit einer Kombination aus gerader und gekrümmter chirurgischer Pinzette eine stumpfe Dissektion entlang des Längsschnitts in den Muskeln durch. Dies trennt die Bäuche des Trapezius sowie den darunter liegenden Musculus semispinalis capitus biventer.
- Trennen Sie alle verbleibenden Muskelfasern mit einem Skalpell und setzen Sie die stumpfe Dissektion fort, bis Semispinalis capitus complexus sichtbar wird.
- Trennen Sie die Ursprünge der Musculi trapezius und semispinalis capitus biventer entlang des hinteren Aspekts des Schädels. Trennen Sie sie vorsichtig in Längsrichtung mit dem Skalpell, das eine stumpfe Dissektion durchführt, bis der Semispinalis capitus complexus vollständig sichtbar ist.
- Ziehen Sie die Musculus trapezius und semispinalis capitus biventer mit selbsterhaltenden Retraktoren ein.
- Wo die Bäuche des Semispinalis capitus complexus in der Mittellinie zusammenkommen, machen Sie einen Längsschnitt mit dem Skalpell etwa 1 cm tief.
HINWEIS: Achten Sie hier auf zusätzliche Blutungen. Blutungen können mit einer Kombination aus Wattestäbchen und Kauterisation behandelt werden. - Führen Sie mit einer chirurgischen Pinzette eine stumpfe Dissektion durch, die entlang des Längsschnitts zwischen den Muskelbäuchen arbeitet, bis der dorsale Aspekt des Atlas (CI) tastbar ist.
- Trennen Sie die Ursprünge der Muskeln semispinalis capitus complexus entlang des hinteren Aspekts des Schädels und trennen Sie ihn längs von den darunter liegenden Wirbeln durch Skalpell und stumpfe Dissektion.
- Ziehen Sie die Muskeln semispinalis capitus complexus mit einem anderen Satz selbsterhaltender Retraktoren zurück.
- Entfernen Sie mit einem Skalpell vorsichtig das verbleibende Gewebe, das über der Region liegt, in der der Atlas auf die Schädelbasis trifft.
- Legen Sie einen Arm unter den Hals des Tieres und einen Finger an der Schnittstelle von Atlas und Schädel, heben Sie gleichzeitig den Kopf an und beugen Sie den Hals, während Sie mit dem Finger tasten, um die Cisterna magna mit der anderen Hand zu enthüllen.
HINWEIS: Die Cisterna magna ist beim Abtasten als starke elastische Struktur mit einem geringen Rückprall erkennbar, wenn der Druck mit dem Finger freigesetzt wird.
3. Kanülierung und Injektion
HINWEIS: Dieser Schritt erfordert auch mindestens zwei Personen und wird mit erhöhtem Kopf des Tieres und gebeugtem Hals durchgeführt.
- Stellen Sie sicher, dass eine Person den Kopf und den Hals des Tieres anhebt und beugt, während die andere person für die Cisterna magna palpiert und sich ihre anatomische Lage notiert.
- Langsam und vorsichtig eine 22 G Kanüle durch die Dura und in die Cisterna magna in einem schrägen Winkel zur Längsachse einführen.
HINWEIS: Führen Sie die Kanüle nicht zu tief ein, da dies das Gehirn schädigen kann. Zu wissen, wie weit die Kanüle eingeführt werden muss, kommt mit der Erfahrung, zu verstehen, wie es sich für die Kanüle anfühlt, die Dura zu durchbohren. Im Wesentlichen, so wie die Dura durchstochen wurde, ist die Kanüle dann tief genug für eine erfolgreiche Tracer-Injektion. Diese Tiefe beträgt ca. 3-5 mm, unterscheidet sich jedoch je nach Größe oder Alter des Tieres. Eine erfolgreiche Kanülierung sollte sofort durch die Visualisierung von klarem, pulsierendem Liquor, der die Kanüle hinaufsteigt, offensichtlich sein. Für das beste Ergebnis wird empfohlen, bei eingeschläferten Tieren vorher mehrere Kanülen zu üben, um das Duralpiercing zu verstehen. - Ziehen Sie die Nadel von der Kanüle zurück und setzen Sie eine Kappe auf das Schloss.
- Wenden Sie zuerst Sekundenkleber und einen Beschleuniger an, wo die Kanüle in das Gewebe eindringt, gefolgt von der Anwendung des Zahnzements. Warten Sie 5 Minuten, bis der Zement ausgehärtet ist.
- Entfernen Sie vorsichtig die Kappe von der Kanüle und befestigen Sie das männliche Ende des zuvor vorbereiteten IV-Leinenhahns mit 10 cm Verlängerung mit dem Tracer an der Kanüle.
- Injizieren Sie den Tracer langsam von Hand oder mit einer Mikroinfusionspumpe mit einer Geschwindigkeit von 100 μL/min. Entfernen Sie den 3-Wege-IV-Line-Hahn mit 10 cm Verlängerung und ersetzen Sie ihn durch die Kappe. Tracer sollte nun an der Basis der Kanüle pulsierend sichtbar sein (Ergänzungsvideo 1).
HINWEIS: Wenn Sie von Hand injizieren, tun Sie dies, bis der Tracer noch im Kanülenschaft sichtbar ist, etwa 1-2 mm über der Stelle, an der der Zahnzement den Schaft bedeckt. - Legen Sie nach der Injektion Sandsäcke unter den Hals, um eine gewisse Beugung zu erhalten. Der Kopf kann dann losgelassen werden, und das Tier wird in einer ruhenden Bauchlage gelassen.
- Lassen Sie die selbsthaltenden Retraktoren los und platzieren Sie die Muskeln so, wie sie vorher lagen. Bringen Sie die Haut mit chirurgischen Handtuchklemmen über die Muskeln zusammen.
- Decken Sie Handtuchklemmen und Schnitt mit Gaze und dann einer Decke ab, um den Wärmeverlust zu begrenzen.
- Lassen Sie den Tracer für die gewünschte Zeit zirkulieren, bevor Sie das Tier per i.v. einschläfern. Pentobarbital-Injektion (140 mg/kg). Bestätigen Sie die Euthanasie durch das Fehlen von Herztönen bei der Auskultation mit einem Stethoskop.
4. Extraktion und Verarbeitung des Gehirns
- Verlängern Sie mit einem Skalpell mit 20 Klingen den longitudinalen Hautschnitt vom Hinterhauptkamm bis etwa 7 cm über der Nase.
- Reflektieren Sie die Haut über dem dorsalen Aspekt des Schädels mit dem Skalpell.
HINWEIS: Es gibt mehrere Möglichkeiten, den dorsalen Aspekt des Schweineschädels tierweise zu schneiden und zu entfernen. Was folgt, ist das Verfahren, das für dieses Experiment am häufigsten funktioniert hat. - Machen Sie mit einer Handsäge einen koronalen Schnitt in den Schädel, etwa 3 cm über den beiden großen Venen, die aus dem Schädel austreten. Erweitern Sie zwei weitere vertikale Schnitte von den koronalen Schnitten und zwei weitere Schnitte, um die vertikalen Schnitte in der Mittellinie zusammenzubringen.
HINWEIS: Behalten Sie einen festen Griff der Säge bei, wenn Sie den Schädelknochen schneiden, da er beim ersten Kontakt mit dem Knochen oder Gewebe dazu neigt, sich wegzuziehen, was zu einer schweren Verletzung führen kann. - Stellen Sie sicher, dass die Schädelschnitte die gesamte Knochendicke durchgehen, indem Sie mit einem Hammer und einem schmalen Meißel (10 mm) zu jedem der Schnitte folgen.
- Schlagen Sie mit dem Hammer schließlich einen breiten Meißel (25-30 mm) in den koronalen Schnitt. Wenn eine Person den Kopf stützt, stellen Sie sicher, dass die andere Person einen Hebel auf den Meißel ausübt, um den dorsalen Schädel zu öffnen.
- Sobald das dorsale Schädelfragment entfernt wurde, sezieren Sie die darüber liegende Dura mater mit einer gekrümmten chirurgischen Schere.
- Verwenden Sie einen Spatel, um das Rückenmark vom Kleinhirn am rostralen Aspekt zu durchtrennen. Dann fahren Sie fort, den Spatel unter dem Gehirn von vorne zu führen und die Riechkolben, die Hypophyse und die Hirnnerven zu durchtrennen.
- Legen Sie den Spatel hinter das Kleinhirn und üben Sie einen angemessenen Druck aus, um das Gehirn aus der Schädelhöhle zu entfernen, und heben Sie es vorsichtig heraus, sobald es losgelassen ist.
- Fixieren Sie sofort das gesamte Gehirn durch Eintauchen des Gewebes in 4% Paraformaldehyd über Nacht.
HINWEIS: Nach diesem Schritt ist es möglich, die Bildgebung des gesamten Gehirns mit einem Stereoskop durchzuführen (Abbildung 1E). - Machen Sie am nächsten Tag koronale Scheiben des Gehirns mit einem Lachsmesser und fixieren Sie die Scheiben über Nacht durch Eintauchen des Gewebes in 4% Paraformaldehyd.
- Zum Schluss legen Sie die Scheiben in 0,01% Azid in PBS für die Langzeitlagerung.
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Representative Results
Sobald das Schwein bewusstlos ist, wird es palpiert und seine Oberflächenanatomie wird markiert, beginnend am Hinterhauptkamm (OC) und in Richtung der Brustwirbel (TV) und jeder Ohrbasis (EB). In diesem Sinne werden die hautnahen Schnitte vorgenommen (Abbildung 1A). Die drei Muskelschichten, darunter Trapezius, Semispinalis capitus biventer und Semispinalis capitus complexus, werden von zwei Sätzen selbsthaltender Retraktoren reseziert und offen gehalten, um die Cisterna magna (CM) freizulegen (Abbildung 1B). Der Kopf wird dann gebeugt, um den Raum zwischen der Rückseite des Schädels und dem Atlas zu öffnen und den Zugang zum CM zu erleichtern (Abbildung 1C). Eine 18 G Kanüle wird vorsichtig 3-5 mm in das CM eingeführt und sowohl mit Sekundenkleber als auch mit Zahnzement (DC) fixiert. Tracer kann dann mit einer festen Rate injiziert werden. Sobald der Tracer injiziert wurde, werden die IV-Linie und die Spritze durch eine Kanülenkappe ersetzt (Abbildung 1C-D). Die Muskeln werden dann wieder an den Ort gebracht und das Schwein wird bedeckt und für die Zeit warm gehalten, in der der Tracer zirkuliert. Nach der Durchblutung wird das Tier eingeschläfert und das Gehirn schnell entfernt. Es ist möglich, zusammengefügte makroskopische Bilder der dorsalen Oberfläche des Gehirns zu erzeugen, die detaillierte Einblicke in die Verteilungsmuster des Tracers auf der dorsalen Hirnoberfläche über die Sulci und Fissuren ermöglichen (Abbildung 1E). Ähnliche Bilder können von den ventralen und lateralen Oberflächen des Gehirns erzeugt werden, wo die Tracerverteilung im Temporallappen (TL) und in der lateralen Fissur (LF) untersucht werden kann (Abbildung 1E). Ein Stereoskop kann zusätzlich verwendet werden, um Bilder mit höherer Vergrößerung der Gehirnoberfläche zu erzeugen, wo es möglich ist, den Tracer im PVS entlang der Arterien zu sehen (Abbildung 1F-G). Makroskopische koronale Hirnschnitte, etwa 8 mm dick, werden mit einem Lachsmesser geschnitten und geben weitere Einblicke in die Tiefe der Tracer-Penetration in der interhemisphärischen Fissur (IHS) sowie die subkortikale Tracerverteilung in Strukturen wie dem Hippocampus (HPC) und dem Striatum (STR) (Abbildung 1H).
Immunhistochemische Färbung für AQP4, exprimiert an astrozytären Endfüßen, glial-fibrillärem saurem Protein (GFAP), exprimiert in Astrozyten und glattem Muskelaktin (SMA), das sich um Arteriolen herum befindet, zeigte, dass der Tracer sowohl im PVS lokalisiert ist als auch sich in das Hirnparenchym bewegt (Abbildung 1I-M). AQP4- und GFAP-Färbung werden verwendet, um Astrozyten und insbesondere die Astrozytenfußprozesse zu identifizieren, die die äußere Oberfläche des PVS bilden, während Lektin und GLUT-1 die Endothelzellen färben, die die innere Oberfläche des PVS bilden (Abbildung 1I-L). Durch die Durchführung dieser Flecken zur Definition der PVS-Grenzen ist es dann möglich, CSF-injizierten Tracer zu identifizieren, der im PVS-Raum lokalisiert ist. Dies unterstützt die Vorstellung, dass CSF über einen umfangreichen PVS-Transport Zugang zum gyrenzephalen Gehirn erhält, der dann den glymphatischen Zustrom in das Hirnparenchym erleichtert. Die SMA-Färbung identifiziert Arterien und Arteriolen durch Bindung an glatte Muskelzellen in den Arterienwänden und kann verwendet werden, um zu zeigen, dass der PVS-Zustrom entlang der Arterien und nicht entlang der Venen auftritt, was die grundlegende Physiologie der normalen glymphatischen Funktion darstellt (Abbildung 1M).
Abbildung 1. Cisterna magna Kanüle bei Schweinen. (A) Schwein, das vor Beginn der Operation vorbereitet und markiert wird, wo dermale Schnitte durchgeführt werden, beginnend mit dem Okzipitalkamm (OC), dann posterior zu den Brustwirbeln (TV) und lateral zu jeder Ohrbasis (EB). (B) Kopf in entspannter Position mit eingezogenen Muskeln Trapezius, Semispinalis capitus biventer und Semispinalis capitus complexus, wodurch Cisterna magna (CM) freigelegt wird. (C) Der Kopf wird manuell gebeugt, um den Zugang zu CM für die Kanülierung und Injektion zu verbessern. (D) Nahaufnahme einer Kanüle, die nach der Injektion in CM eingeführt und mit dem Zahnzement (DC) fixiert wird. (E) Dorsale, ventrale bzw. laterale Hirnoberflächen nach fluoreszierender Bildgebung mit begleitenden strukturellen Weißlichtbildern. Bereiche von Interesse, die an diesen Oberflächen sichtbar sind, sind die interhemisphärische Fissur (IHS), der Temporallappen (TL) und die laterale Fissur (LF). (F) Strukturelles Weißlichtbild der Arterie und venen auf der Gehirnoberfläche. (G) Fluoreszierende Aufnahme von (F), die die Tracerverteilung entlang der Oberflächenarterie zeigt. (H) Makroskopische Schnitte aus den vorderen und hinteren Hirnregionen zeigen eine zweidimensionale Tracerdispersion und -verteilung in Fissuren (LF, IHS) und subkortikalen Strukturen wie dem Striatum (STR) und Hippocampus (HPC). (I-J). Konfokale Bilder, die den Tracer im PVS zeigen, der intern durch lektingefärbte Endothelzellen und extern durch AQP4 an Astrozytenfußprozessen begrenzt wird. (K-L). Konfokale Bilder, die den Tracer im PVS zeigen, der intern von Endothelzellen begrenzt wird, wobei Astrozytenfußprozesse, die für das saure Gliafibrillärprotein (GFAP) gefärbt sind, sichtbar sind und eine äußere Grenze bilden. (M) Konfokales Bild, das den Tracer im PVS um eine Arteriole zeigt, die für glattes Muskelaktin (SMA) gefärbt ist, wobei tracer auch in und um das Hirnparenchym herum sichtbar ist. CM, cisterna magna; DC, Zahnzement; EB, Ohrfuß; GFAP, Gliafibrillen-saures Protein; HPC, Hippocampus; IHS, interhemisphärische Fissur; LF, laterale Fissur; OLB, Riechkolben; OC, Okzipitalkamm; STR, Striatum; TL, Temporallappen; TV, Brustwirbel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzungsvideo 1: Liquorpulsation nach der Tracerinjektion. Nahaufnahme der Cisterna magna nach der Tracer-Injektion. Blauer Tracer ist im Kanülenhals sichtbar, der im Rhythmus des Liquors pulsiert und auf eine erfolgreiche Kanülierung und Injektion hinweist. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Hierin wird ein detailliertes Protokoll zur Durchführung der direkten Kanülierung der Cisterna magna bei Schweinen beschrieben, einschließlich der notwendigen Vorbereitung, des chirurgischen Eingriffs, der Tracerinfusion und der Extraktion des Gehirns. Dies erfordert jemanden mit Erfahrung und Zertifizierung für die Arbeit mit großen Tieren. Bei korrekter Durchführung ermöglicht dies die Abgabe der gewünschten Moleküle mit Sicherheit direkt in das Liquor, wonach eine Reihe verschiedener fortschrittlicher Lichtbildgebungsmodalitäten verwendet werden kann, um die CSF-Verteilung und die glymphatische Funktion mit hoher Auflösung in einem großen Säugetier zu untersuchen.
Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl dies das gleiche Verfahren wie die Cisterna Magna-Kanülierung bei Nagetieren ist, es etwas anspruchsvoller ist und mehrere Stunden Training erfordert. Diese Ausbildung umfasst den Umgang mit großen Säugetieren unter Laborbedingungen, ein Verständnis der Anatomie und des Bewegungsapparates, insbesondere bei Schweinen, und ein gewisses Maß an Kompetenz im Umgang mit chirurgischen Instrumenten. Sobald diese Kriterien erfüllt sind, ist es möglich, diese Technik durchzuführen, die bisher eine Erfolgsquote von 100% im Vergleich zu einer Erfolgsrate von 80-90% bei Mäusen aufweist. Der kritischste Punkt für die korrekte Durchführung des Eingriffs ist das Anheben des Kopfes und das Beugen des Halses beim Einführen der Kanüle und beim Infusion des Tracers. Obwohl tracer hier von Hand injiziert wurde, geschah dies kontrolliert von 100 μL pro Minute. Bei Mäusen werden typischerweise 10 μL Tracer injiziert, und beim direkten Vergleich der Gehirngrößen würde dies bei einem 50 kg schweren Schwein etwa 2 ml entsprechen6,11,18. Daher war die Injektion von 500 μL Tracer in der Tat ein konservatives Volumen und hätte keine ausgedehnten Störungen des intrakraniellen Drucks (ICP) erzeugen dürfen. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass die perivaskuläre glymphatische Funktion nicht einfach ein Artefakt vorübergehender ICP-Erhöhungen ist, sondern bestehen bleibt, wenn der ICP mit einer Dual-Spritzen-Methode an der Basislinie aufrechterhalten wird, was die Vorstellung weiter stärkt, dass diese Ergebnisse keine Artefakte von verändertem ICP19 widerspiegeln.
Dies ist nicht die einzige Technik, die verwendet werden kann, um CMc bei Schweinen durchzuführen, und obwohl es wesentlich invasiver ist, scheint es eine genauere Tracer-Infusion zu geben. Eine andere Möglichkeit, CMc bei Schweinen durchzuführen, besteht darin, sie in der seitlichen Liegeposition auf die Seite zu legen und mit einer 150 mm Spinalnadel zu erblinden20. Obwohl dies aufgrund ihrer minimalen Invasivität eine attraktive Methode war, wurde die potenzielle Erfolgsquote als geringer empfunden. Da die Rückseite des Schweinekopfes flach ist und CM sehr tief (10-12 cm) von der Oberfläche entfernt sitzt, hat die Spinalnadel eine lange Strecke zurückzulegen, bevor sie in die CM eindringt, wodurch die Sicherheit einer erfolgreichen Kanülierung eingeschränkt wird. Abgesehen von der großen Entfernung zum CM beträgt der Durchmesser des CM selbst nur etwa 10 mm, was die Chance auf eine erfolgreiche Kanülierung weiter verringert. Im Gegensatz dazu ist es durch die Verwendung der direkten CMc-Methode möglich, die Kanülierung direkt zu visualisieren und so mit Sicherheit zu wissen, dass sie erfolgreich war und dass die Wirkstoffe an das CSF abgegeben wurden und nicht in das umgebende Weichgewebe ausgetreten sind. Die Sicherstellung einer erfolgreichen Kanülierung ist für solche Experimente aufgrund der hohen Kosten für Schweine, chirurgische Einrichtungen und fluoreszierende Tracer sowie für die Minimierung der Anzahl der verwendeten Schweine wichtig.
Die Einschränkungen dieser Methode, abgesehen von der Invasivität, bestehen darin, dass die Kosten und die Zeit im Vergleich zu Nagetieren viele Wiederholungen entmutigen. Die erste durchgeführte Operation dauerte etwa 3 Stunden, wird aber derzeit in etwa 45 Minuten durchgeführt. Dies stellt eine signifikante Zeitverbesserung dar, aber um eine Kanülierung in einer Maus durchzuführen, dauert es weniger als 5 Minuten für einen erfahrenen Forscher, was bedeutet, dass die tatsächliche Operationszeit bei Erreichen der Leistung immer noch 9-mal länger ist als bei Mäusen. Darüber hinaus bedeutet das große Gehirn, dass die Tracer-Zirkulationszeiten im Schwein umfangreicher sind, zum Beispiel 2-6 Stunden, während bei Mäusen eine Standardzirkulationszeit 30 Minuten beträgt. Abgesehen von den hohen Kosten des Tracers, der in großen Mengen für das Schwein benötigt wird, machen die tatsächlichen Kosten des Schweins selbst sowie seine Haltung, Anästhesie und Kosten für die Verwendung eines vollen Operationssaals die Endkosten dieses Verfahrens für ein Schwein 15-mal teurer als bei einer einzelnen Maus. Eine zusätzliche zeitliche Herausforderung ist die Zeit, die für die Hirnextraktion nach der Tracerzirkulation benötigt wird. Frühere Berichte haben gezeigt, dass eine gewisse Bewegung des Tracers durch PVS nach der Euthanasie bestehen bleibt21. Dies macht es wichtig, Gehirne so schnell wie möglich zu extrahieren, um störende Effekte dieses Phänomens zu minimieren. Während die Extraktion des Mausgehirns nur wenige Minuten dauert, dauern die Extraktionen des Schweinegehirns etwa 15-20 Minuten. Das Gehirn sollte so schnell wie möglich entfernt werden, um diesen Effekt zu begrenzen, aber mit der Dicke und Architektur des Schweineschädels ist es schwierig, die aktuellen Extraktionszeiten zu reduzieren.
Obwohl die direkte Kanülierung das Verfahren ziemlich invasiv macht, betrug der Gesamtblutverlust nur durchschnittlich 100 ml pro Operation, was einem Verlust von weniger als 3% des gesamten Blutvolumens entspricht. Darüber hinaus erhält das Tier eine kontinuierliche Kochsalzinfusion mit den Anästhetika und einer zusätzlichen IV-Linie von Ringers-Laktat, wodurch das Risiko einer Hypovolämie gemindert wird.
Zukünftige Studien sind erforderlich, um die Translation der bei Mäusen identifizierten glymphatischen physiologischen Treiber sowie die glymphatische Funktion bei wachen oder natürlich schlafenden Schweinen zu untersuchen, um die Wirkung von Anästhetika zu beseitigen22,23. Um den natürlichen Schlaf- oder Wachzustand zu untersuchen, wird es notwendig sein, das aktuelle Protokoll so anzupassen, dass tracer über weniger invasive Mittel verabreicht werden kann und gleichzeitig eine hohe Erfolgsrate aufrechterhalten wird. Dies könnte möglicherweise durch die Durchführung von CM-Injektionen im Rahmen der Computertomographie-Fluoroskopie erreicht werden, die zuvor für die Lumbalpunktion bei Schweinen verwendet wurde24. In Zukunft wäre es von großem Interesse, diese Technik mit genetischen Manipulationen des AQP4-Wasserkanals zu kombinieren, um seine Rolle bei der glymphatischen Funktion eines großen Säugetiers zu verstehen. Bei der Erforschung des vollen Ausmaßes des glymphatischen Systems bei einem großen Säugetier nähert sich das Feld dem Verständnis der glymphatischen Funktion beim Menschen und wie sie therapeutisch genutzt werden könnte.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Knut und Alice Wallenberg Stiftung, Hjärnfonden, Wenner Gren Stiftungen und der Crafoord Stiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
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