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Neuroscience

सूअरों के टंकी मैग्ना में प्रत्यक्ष कैनुला आरोपण

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62641
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Experimental Medical Science, Lund University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University

Summary

यह लेख सूअरों के टंकी मैग्ना में प्रत्यक्ष कैनुला आरोपण के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

Abstract

ग्लिम्फेटिक सिस्टम मस्तिष्क में एक अपशिष्ट निकासी प्रणाली है जो एस्ट्रोसाइट-बाउंड पेरिवैस्कुलर रिक्त स्थान में मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) के प्रवाह पर निर्भर करती है और एमिलॉइड-बीटा जैसे न्यूरोटॉक्सिक पेप्टाइड्स की निकासी में फंस गई है। बिगड़ा हुआ ग्लिम्फेटिक फ़ंक्शन न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के पशु मॉडल में रोग विकृति को बढ़ाता है, जैसे कि अल्जाइमर, जो इस निकासी प्रणाली को समझने के महत्व पर प्रकाश डालता है। ग्लिम्फेटिक प्रणाली का अध्ययन अक्सर सिस्टेरा मैग्ना कैनुलेशन (सीएमसी) द्वारा किया जाता है, जहां ट्रेसर्स को सीधे मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में वितरित किया जाता है। हालांकि, अधिकांश अध्ययन कृन्तकों में किए गए हैं। यहां, हम सूअरों में सीएमसी तकनीक के अनुकूलन का प्रदर्शन करते हैं। सूअरों में सीएमसी का उपयोग करते हुए, ग्लिम्फेटिक सिस्टम का अध्ययन gyrencephalic दिमाग में एक उच्च ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन पर किया जा सकता है और ऐसा करने में कृंतक और मानव ग्लिम्फेटिक्स के बीच ज्ञान के अंतर को पुल किया जा सकता है।

Introduction

मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) रक्त का एक अल्ट्राफिल्ट्रेट है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 1,2 के भीतर और उसके आसपास पाया जाता है। मस्तिष्क को उछाल देने या हानिकारक यांत्रिक बलों को अवशोषित करने के अलावा, सीएसएफ सीएनएस 3 से चयापचय अपशिष्ट को साफ करने में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अपशिष्ट निकासी को हाल ही में विशेषता वाले ग्लिम्फेटिक सिस्टम द्वारा सुविधाजनक बनाया गया है जो पेरिवैस्कुलर स्पेस (पीवीएस) के माध्यम से मस्तिष्क पैरेन्काइमा के माध्यम से सीएसएफ के संवहनी प्रवाह की अनुमति देता है, जो धमनियों को घेरता है3,4,5। इस प्रक्रिया को एक्वापोरिन -4 (AQP4) पर निर्भर दिखाया गया है, जो मुख्य रूप से एस्ट्रोसाइटिक एंडफीट पर व्यक्त किया गया एक जल चैनल है, जो PVS4,6 से बंधा हुआ है। ग्लिम्फेटिक सिस्टम का अध्ययन विवो और एक्स वीवो इमेजिंग दोनों में प्राप्त किया जाता है, या तो उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का उपयोग करके, सीएसएफ 7,8,9,10,11 में फ्लोरोसेंट / रेडियोधर्मी अनुरेखक या कंट्रास्ट एजेंट की शुरुआत के बाद।

मस्तिष्क पैरेन्काइमा को नुकसान पहुंचाए बिना सीएसएफ में एक ट्रेसर पेश करने का एक प्रभावी तरीका टंकी मैग्ना कैनुलेशन (सीएमसी) 12,13 के माध्यम से है। सभी ग्लिम्फेटिक अध्ययनों का एक बड़ा बहुमत, इस प्रकार अब तक कृन्तकों में किया गया है और एक छोटे से स्तनपायी के साथ काम करने की व्यावहारिक सादगी के लिए युग्मित सीएमसी की आक्रामकता के कारण उच्च स्तनधारियों में बचा गया है। इसके अतिरिक्त, चूहों की पतली खोपड़ी एक कपाल खिड़की की आवश्यकता के बिना विवो इमेजिंग में अनुमति देती है और बाद में एक जटिल मस्तिष्क निष्कर्षण 11,14 के लिए अनुमति देती है। मनुष्यों में किए गए प्रयोगों ने ग्लिम्फेटिक फ़ंक्शन पर विवो डेटा में एक मूल्यवान मैक्रोस्कोपिक प्राप्त किया है, लेकिन डिस्टल काठ की रीढ़ में इंट्राथेकल ट्रेसर इंजेक्शन पर भरोसा किया है और इसके अलावा, एमआरआई का उपयोग करता है जो माइक्रोएनाटॉमी को कैप्चर करने के लिए पर्याप्त संकल्प उत्पन्न नहीं करता है ग्लाइम्फेटिक सिस्टम7,15,16 . उच्च स्तनधारियों में ग्लिम्फेटिक प्रणाली की वास्तुकला और सीमा को समझना मनुष्यों के लिए इसके अनुवाद के लिए आवश्यक है। मनुष्यों के लिए ग्लिम्फेटिक अनुवाद को सुविधाजनक बनाने के लिए, उन तकनीकों को लागू करना महत्वपूर्ण है जो कृन्तकों में उच्च स्तनधारियों के लिए किए जाते हैं ताकि बढ़ती अनुभूति और मस्तिष्क की जटिलता की प्रजातियों में ग्लिम्फेटिक सिस्टम की सीधी तुलना की अनुमति दी जा सके। सुअर और मानव मस्तिष्क gyrencephalic हैं, एक तह neuroarchitecture धारण करते हैं, जबकि कृंतक मस्तिष्क lissencephalic हैं, जिससे एक दूसरे के बीच काफी अंतर होता है। समग्र आकार के संदर्भ में, सुअर के दिमाग भी, मनुष्यों के लिए अधिक तुलनीय हैं, मानव मस्तिष्क की तुलना में 10-15 गुना छोटे हैं, जबकि माउस दिमाग 3,000 गुना छोटे हैं। बड़े स्तनधारियों में ग्लिम्फेटिक प्रणाली को बेहतर ढंग से समझने से, स्ट्रोक, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट और न्यूरोडीजेनेरेशन जैसी स्थितियों में भविष्य के चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए मानव ग्लिम्फेटिक सिस्टम का उपयोग करना संभव हो सकता है। विवो में सूअरों में प्रत्यक्ष सीएमसी एक ऐसी विधि है जो एक उच्च स्तनपायी में ग्लिम्फेटिक सिस्टम के उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रकाश माइक्रोस्कोपी की अनुमति देती है। इसके अलावा, उपयोग किए जाने वाले सूअरों के आकार के कारण, मानव सर्जरी में उपयोग किए जाने वाले लोगों के समान निगरानी प्रणालियों को लागू करना संभव है, जिससे यह आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण कार्यों को कसकर दस्तावेज और विनियमित करना संभव हो जाता है कि ये ग्लिम्फेटिक फ़ंक्शन में कैसे योगदान करते हैं।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को यूरोपीय निर्देश 2010/63/EU के अनुसार किया गया था और पशु अनुसंधान पर माल्मो-लुंड नैतिक समिति (Dnr 5.8.18-05527/2019) द्वारा अनुमोदित किया गया था और स्वीडिश अनुसंधान परिषद के कोडेक्स दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था।

1. तैयारी

  1. अनुरेखक
    1. कृत्रिम CSF तैयार करें (126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM ग्लूकोज, 26 mM NaHCO3; pH 7.4)
    2. कृत्रिम सीएसएफ के 500 μL के लिए, एलेक्सा फ्लोर 647 (बीएसए -647) के साथ संयुग्मित गोजातीय सीरम (बीएसए) से 10 मिलीग्राम एल्ब्यूमिन जोड़ें।
    3. 5 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant का उपयोग करें।
  2. प्रवेशिका
    1. अंतःशिरा (IV) लाइन की महिला Luer कनेक्शन के लिए एक 1 mL सिरिंज संलग्न करें, 10 सेमी विस्तार के साथ 3-तरीके टैप करें।
    2. पुरुष के अंत में एक 18 जी सुई संलग्न करें।
    3. सुई से सिरिंज तक निरंतरता के लिए अनुमति देने के लिए 3-तरफ़ा स्टॉप लॉक खोलें।
    4. ध्यान से सुई unsheathe और aspirate लगभग 300 μL खारा के IV लाइन में.
    5. खारा से सुई निकालें और IV लाइन में एक छोटा हवा बुलबुला (5-10 मिमी) बनाने के लिए कुछ हवा में पेश करने के लिए आगे बढ़ें।
    6. अनुरेखक में सुई रखें और अनुरेखक के सभी 500 μL aspirate। IV लाइन में खारा स्पष्ट रूप से एक हवा के बुलबुले द्वारा अलग किया जाना चाहिए।
    7. सुई को छोड़ दें और 3-वे स्टॉप लॉक को बंद करें।
  3. जानवर
    1. टिलेटामाइन (3.75 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ोलाज़ेपाम (3.75 मिलीग्राम / किग्रा) और डेक्समेडेटोमिडिन (37.5 μg / किग्रा) के इंट्रामस्क्युलर (i.m.) इंजेक्शन द्वारा एक सुअर को बेहोश करें। इसके बेहोश होने का इंतजार करें।
    2. कान की नस में 20 जी प्रवेशनी डालकर एक अंतःशिरा रेखा तैयार करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्रवेशनी प्रवेशनी के माध्यम से खारा के 5-10 मिलीलीटर इंजेक्ट करके नस में है। यदि नस को याद किया गया है, तो यह कान के ऊतकों में छोटे एडिमा द्वारा ध्यान देने योग्य होगा।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए सुअर को इंटुबेट करें कि श्वास दर को सर्जरी के दौरान विनियमित किया जा सकता है।
      नोट: सुअर के वक्ष पर दबाव लागू करके सफल इंटुबैषेण सुनिश्चित करें और पुष्टि करें कि जबरन समाप्त हो चुकी हवा इंटुबैषेण ट्यूब से बाहर आ रही है।
    4. इंटुबैषेण ट्यूब को 14 साँस / मिनट की सांस दर पर सेट किए गए वेंटिलेटर पर संलग्न करें।
    5. हृदय गति (एचआर), रक्तचाप (बीपी), और ऑक्सीजन संतृप्ति (सैट्स) की निगरानी के लिए एक पल्स ऑक्सीमीटर और कफ को पूंछ से कनेक्ट करें। कोर तापमान की निगरानी करने के लिए एक रेक्टल थर्मामीटर डालें।
    6. केटामाइन (5 मिलीग्राम / किग्रा / मिनट), मिडाज़ोलम (0.25 मिलीग्राम / किग्रा / मिनट), और फेन्टानिल (2.5 μg / किग्रा / मिनट) का एक IV बैग तैयार करें, नमकीन में और लगभग 2 बूंदों / सेकंड पर कान की नस के माध्यम से संक्रमित करना शुरू करें।
      नोट: सर्जरी के दौरान, जलसेक दर को जानवरों के विटाल के आधार पर बढ़ाने या कम करने की आवश्यकता हो सकती है।
    7. प्रवण स्थिति में सुअर के साथ, पहले वक्षीय कशेरुकाओं और प्रत्येक कान के आधार के पश्चकपाल शिखा और रीढ़ की हड्डी का पता लगाने और चिह्नित करने के लिए जानवर के सिर और गर्दन के पीछे palpate।
    8. अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ शिखा और कशेरुकाओं के बीच एक सीधी रेखा खींचें। खोपड़ी के आधार का पालन करके शिखा से प्रत्येक कान के आधार तक दो रेखाएं खींचें (चित्र 1 ए)।
    9. जांचें कि जानवर पूंछ को ध्यान से क्लैंप करके और पूंछ पलटा की अनुपस्थिति के लिए देखकर गहरी नींद में है।
      नोट: यदि जानवर अभी भी रिफ्लेक्सिव है, तो एनेस्थेटिक जलसेक दर को वृद्धिशील रूप से बढ़ाया जाना चाहिए जब तक कि जानवर अब एक पलटा प्रदर्शित नहीं करता है।

2. सर्जरी

नोट: सर्जरी के माध्यम से, प्रकाश रक्तस्राव को चूसने और किसी भी कटे हुए जहाजों को सैटराइज़ करने के लिए कम से कम एक सहायक होना आवश्यक है।

  1. # 21 ब्लेड के साथ एक स्केलपेल का उपयोग करके, मांसपेशी के नीचे अनुदैर्ध्य रेखा के साथ एक त्वचीय चीरा बनाएं।
  2. कंधों के साथ दो लंबवत त्वचीय चीरों को आगे बढ़ाएं, लंबाई में 10-15 सेमी।
  3. ओसीसीपटल शिखा से, प्रत्येक कान के आधार तक लाइन के साथ त्वचीय चीरों को बनाएं।
  4. शारीरिक संदंश के साथ ओसीसीपटल शिखा पर गठित त्वचा के कोनों को पकड़ना, ध्यान से त्वचा को अंतर्निहित मांसपेशी से अलग करना, ध्यान से प्रावरणी पर स्केलपेल ब्लेड को हल्के से चलाकर, रोस्ट्रल से पुच्छल तक बढ़ रहा है। एक बार जब त्वचा को पांच चीरों में से प्रत्येक के बाद उच्छेदन किया जाता है, तो ट्रेपेज़ियस मांसपेशियों के कुछ हिस्सों को तब दिखाई देना चाहिए।
  5. स्केलपेल के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाएं, लगभग 1 सेमी गहरा, जहां ट्रेपेज़ियस मिडलाइन पर एक साथ आता है।
    नोट: मांसपेशियों के माध्यम से काटने पर, रक्तस्राव के लिए एक बढ़ी हुई प्रवृत्ति होती है, इसलिए कॉटराइज़र तैयार होना चाहिए। यदि एक बड़ा पोत काट दिया जाता है, तो एक व्यक्ति को जल्दी से इसे धुंध के साथ संपीड़ित करना चाहिए, जबकि दूसरा व्यक्ति कॉटराइज़र का उपयोग करता है।
  6. सीधे और घुमावदार सर्जिकल संदंश के संयोजन का उपयोग करते हुए, मांसपेशियों में अनुदैर्ध्य कटौती के साथ काम करते हुए कुंद विच्छेदन करें। यह ट्रेपेज़ियस के पेट को अलग करेगा, साथ ही साथ अंतर्निहित सेमीस्पिनलिस कैपिटस बिवेंटर मांसपेशी भी।
  7. एक स्केलपेल के साथ किसी भी निरंतर मांसपेशी तंतुओं को तोड़दें और कुंद विच्छेदन जारी रखें जब तक कि सेमीस्पिनलिस कैपिटस कॉम्प्लेक्स दिखाई न दे।
  8. खोपड़ी के पीछे के पहलू के साथ trapezius और semispinalis capitus biventer मांसपेशियों की उत्पत्ति को अलग करें। ध्यान से उन्हें अनुदैर्ध्य रूप से अलग करें, जब तक कि अर्धस्पाइनलिस कैपिटस कॉम्प्लेक्स पूरी तरह से दिखाई न दे, तब तक कुंद विच्छेदन करने वाले स्केलपेल के साथ अनुदैर्ध्य रूप से अलग करें।
  9. ट्रेपेज़ियस और सेमीस्पिनलिस कैपिटस बिवेंटर मांसपेशियों को वापस लें, जो स्व-रिटेनिंग रिट्रेक्टर्स का उपयोग करते हैं।
  10. जहां सेमीस्पिनलिस कैपिटस कॉम्प्लेक्स के पेट मिडलाइन में एक साथ आते हैं, लगभग 1 सेमी गहरे स्केलपेल के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाते हैं।
    नोट: यहां किसी भी अतिरिक्त रक्तस्राव के लिए जागरूक रहें। कपास swabs और cauterization के संयोजन का उपयोग कर खून बह रहा है प्रबंधित किया जा सकता है.
  11. सर्जिकल संदंश का उपयोग करते हुए, मांसपेशियों के पेट के बीच अनुदैर्ध्य कटौती के साथ काम करने वाला एक कुंद विच्छेदन करें जब तक कि एटलस (सीआई) का पृष्ठीय पहलू स्पष्ट न हो।
  12. खोपड़ी के पीछे के पहलू के साथ सेमीस्पाइनलिस कैपिटस कॉम्प्लेक्सस मांसपेशियों की उत्पत्ति को अलग करें और इसे स्केलपेल और कुंद विच्छेदन द्वारा अंतर्निहित कशेरुकाओं से अनुदैर्ध्य रूप से अलग करें।
  13. स्व-बनाए रखने वाले retractors के एक और सेट का उपयोग कर semispinalis capitus complexus मांसपेशियों को वापस लें।
  14. एक स्केलपेल का उपयोग करके, उस क्षेत्र में किसी भी शेष ऊतक को सावधानीपूर्वक हटा दें जहां एटलस खोपड़ी के आधार से मिलता है।
  15. एटलस और खोपड़ी के मोड़ पर जानवर की गर्दन के नीचे एक हाथ और एक उंगली को रखते हुए, साथ ही साथ सिर को ऊपर उठाएं और गर्दन को फ्लेक्स करें, जबकि दूसरे हाथ का उपयोग करके टंकी मैग्ना को प्रकट करने के लिए उंगली के साथ पैलेटिंग करें।
    नोट: टंकी मैग्ना पहचानने योग्य है जब दबाव के रूप में रिबाउंड की एक छोटी राशि के साथ एक मजबूत लोचदार संरचना के रूप में palpating उंगली के साथ जारी किया जाता है।

3. Cannulation और इंजेक्शन

नोट: इस चरण में कम से कम दो लोगों की भी आवश्यकता होती है और जानवर के सिर को ऊंचा और गर्दन फ्लेक्स के साथ किया जाता है।

  1. सुनिश्चित करें कि एक व्यक्ति जानवर के सिर और गर्दन को ऊंचा और फ्लेक्स करता है, जबकि टंकी मैग्ना के लिए अन्य पैलेट अपने शारीरिक स्थान का एक नोट बनाते हैं।
  2. धीरे-धीरे और सावधानी से ड्यूरा के माध्यम से और अनुदैर्ध्य अक्ष के लिए एक तिरछे कोण पर टंकी मैग्ना में एक 22 जी कैनुला पेश करें।
    नोट: प्रवेशनी बहुत गहरी सम्मिलित न करें, क्योंकि यह मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकता है। यह जानना कि कैनुला को कितनी दूर तक सम्मिलित करना है, यह समझने में अनुभव के साथ आता है कि यह ड्यूरा को छेदने के लिए कैनुला के लिए कैसा लगता है। अनिवार्य रूप से, जैसे ही ड्यूरा को छेदा गया है, कैनुला तब एक सफल अनुरेखक इंजेक्शन के लिए काफी गहरा होता है। यह गहराई लगभग 3-5 मिमी है, लेकिन जानवर के आकार या उम्र के आधार पर अलग-अलग होगी। सफल कैनुलेशन को तुरंत स्पष्ट, स्पंदन सीएसएफ के दृश्य के माध्यम से स्पष्ट किया जाना चाहिए जो कैनुला पर चढ़ता है। सबसे अच्छे परिणाम के लिए, ड्यूरल भेदी की समझ प्राप्त करने के लिए euthanized जानवरों में पहले से ही कई cannulations का अभ्यास करने की सिफारिश की जाती है।
  3. कैनुला से सुई को वापस लें और लॉक पर एक टोपी रखें।
  4. सबसे पहले, superglue और एक त्वरक लागू करें जहां प्रवेशनी ऊतक में प्रवेश करती है, इसके बाद दंत सीमेंट का आवेदन होता है। सीमेंट के सख्त होने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  5. ध्यान से प्रवेशनी से टोपी को हटा दें और पहले से तैयार IV लाइन नल के पुरुष अंत को 10 सेमी विस्तार के साथ, अनुरेखक के साथ, कैनुला में संलग्न करें।
  6. धीरे-धीरे हाथ से या 100 μL / मिनट की दर से एक माइक्रो-इन्फ्यूजन पंप का उपयोग करके अनुरेखक इंजेक्ट करें। 10 सेमी एक्सटेंशन के साथ 3-तरीकों से IV लाइन टैप को हटा दें और इसे कैप के साथ बदलें। अनुरेखक अब प्रवेशनी (पूरक वीडियो 1) के आधार पर स्पंदन दिखाई देना चाहिए।
    नोट: यदि हाथ से इंजेक्शन लगाते हैं, तो ऐसा तब तक करें जब तक कि अनुरेखक अभी भी कैनुला शाफ्ट में दिखाई नहीं देता है, लगभग 1-2 मिमी ऊपर जहां दंत सीमेंट शाफ्ट को कवर कर रहा है।
  7. इंजेक्शन के बाद, कुछ लचीलापन बनाए रखने के लिए गर्दन के नीचे सैंडबैग रखें। सिर को तब जारी किया जा सकता है, और जानवर को आराम करने वाली प्रवण स्थिति में छोड़ दिया जाता है।
  8. स्व-बनाए रखने वाले retractors को छोड़ें और मांसपेशियों को रखें क्योंकि वे पहले लेटे हुए थे। सर्जिकल तौलिया clamps का उपयोग कर मांसपेशियों पर एक साथ त्वचा को लाने.
  9. तौलिया clamps और धुंध के साथ चीरा कवर और फिर गर्मी के नुकसान को सीमित करने के लिए एक कंबल.
  10. अनुरेखक को i.v. द्वारा जानवर को euthanizing से पहले वांछित समय के लिए परिचालित करने की अनुमति दें। पेंटोबार्बिटल इंजेक्शन (140 मिलीग्राम / किग्रा)। एक स्टेथोस्कोप के साथ auscultation पर दिल की आवाज़ की अनुपस्थिति से इच्छामृत्यु की पुष्टि करें।

4. मस्तिष्क निष्कर्षण और प्रसंस्करण

  1. 20-ब्लेड के साथ एक स्केलपेल का उपयोग करते हुए, अनुदैर्ध्य त्वचीय चीरा को ओसीसीपटल शिखा से नाक के ऊपर लगभग 7 सेमी तक बढ़ाएं।
  2. स्केलपेल का उपयोग करके खोपड़ी के पृष्ठीय पहलू को अतिरंजित करने वाली त्वचा को प्रतिबिंबित करें।
    नोट: पशु-दर-पशु आधार पर सुअर की खोपड़ी के पृष्ठीय पहलू को काटने और हटाने के कई तरीके हैं। इस प्रकार की प्रक्रिया है जिसने इस प्रयोग के लिए सबसे अधिक बार काम किया है।
  3. एक हैंडहेल्ड कॉम्पैक्ट आरी का उपयोग करके, खोपड़ी में एक कोरोनल कट बनाएं, खोपड़ी से बाहर निकलने वाली दो बड़ी नसों से लगभग 3 सेमी ऊपर। कोरोनल कटौती से दो और ऊर्ध्वाधर कटौती और मध्यरेखा में ऊर्ध्वाधर कटौती को एक साथ लाने के लिए दो और कटौती तक बढ़ाएं।
    नोट: खोपड़ी की हड्डी में कटौती करते समय आरी की एक मजबूत पकड़ बनाए रखें क्योंकि यह हड्डी या ऊतक के साथ पहले संपर्क पर दूर खींचने की प्रवृत्ति होगी, जिससे गंभीर चोट लग सकती है।
  4. सुनिश्चित करें कि खोपड़ी में कटौती एक हथौड़ा और संकीर्ण छेनी (10 मिमी) के साथ प्रत्येक कटौती के लिए पालन करके हड्डी की पूरी मोटाई के माध्यम से कर रहे हैं।
  5. हथौड़ा का उपयोग करते हुए, अंत में कोरोनल कट में एक विस्तृत छेनी (25-30 मिमी) दस्तक दें। सिर का समर्थन करने वाले एक व्यक्ति के साथ, सुनिश्चित करें कि दूसरा व्यक्ति पृष्ठीय खोपड़ी को खोलने के लिए छेनी पर उत्तोलन लागू करता है।
  6. एक बार पृष्ठीय खोपड़ी के टुकड़े को हटा दिया गया है, घुमावदार सर्जिकल कैंची का उपयोग करके ओवरलाइंग ड्यूरा मेटर को विच्छेदित करें।
  7. रोस्ट्रल पहलू पर सेरिबैलम से रीढ़ की हड्डी को गंभीर करने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें। फिर सामने से मस्तिष्क के नीचे स्पैटुला का मार्गदर्शन करने के लिए आगे बढ़ें, घ्राण बल्ब, पिट्यूटरी ग्रंथि और कपाल तंत्रिकाओं को अलग करें।
  8. सेरिबैलम के पीछे स्पैटुला रखें और मस्तिष्क को कपाल गुहा से हटाने के लिए दबाव की एक उचित मात्रा लागू करें, सावधानीपूर्वक इसे एक बार ढीला करने के बाद बाहर उठाएं।
  9. तुरंत रात भर 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में ऊतक विसर्जन द्वारा पूरे मस्तिष्क को ठीक करें।
    नोट: इस चरण के बाद, स्टीरियोस्कोप (चित्रा 1E) का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क इमेजिंग को पूरा करना संभव है।
  10. अगले दिन, एक सैल्मन चाकू का उपयोग करके मस्तिष्क के कोरोनल स्लाइस बनाएं और 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में ऊतक विसर्जन द्वारा रातभर स्लाइस को ठीक करें।
  11. अंत में, लंबे समय तक भंडारण के लिए पीबीएस में 0.01% एज़ाइड में स्लाइस रखें।

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Representative Results

एक बार जब सुअर बेहोश हो जाता है, तो इसे पैलेट किया जाता है, और इसकी सतह की शारीरिक रचना को चिह्नित किया जाता है, जो ओसीसीपटल शिखा (ओसी) से शुरू होता है और वक्षीय कशेरुकाओं (टीवी) और प्रत्येक कान के आधार (ईबी) की ओर काम करता है। यह इन लाइनों के साथ है कि त्वचीय चीरों को बनाया जाता है (चित्रा 1 ए)। Trapezius, semispinalis capitus biventer और semispinalis capitus complexus सहित तीन मांसपेशियों की परतों को उच्छेदित किया जाता है और सिस्टेरा मैग्ना (सीएम) (चित्रा 1 बी) को बेनकाब करने के लिए आत्म-बनाए रखने वाले रिट्रेक्टर्स के दो सेटों द्वारा खुला रखा जाता है। सिर को तब खोपड़ी और एटलस के पीछे की जगह को खोलने और सीएम तक पहुंच को आसान बनाने के लिए फ्लेक्स किया जाता है (चित्रा 1 सी)। एक 18 जी प्रवेशनी को सीएम में 3-5 मिमी ध्यान से डाला जाता है और सुपर गोंद और डेंटल सीमेंट (डीसी) दोनों द्वारा जगह में तय किया जाता है। अनुरेखक को तब एक निश्चित दर पर इंजेक्ट किया जा सकता है। एक बार अनुरेखक इंजेक्ट किया गया है, IV-लाइन और सिरिंज को एक कैनुला कैप (चित्रा 1 C-D) के साथ बदल दिया जाता है। मांसपेशियों को फिर से जगह में डाल दिया जाता है और सुअर को कवर किया जाता है और ट्रेसर को प्रसारित करने के समय के लिए गर्म रखा जाता है। परिसंचरण के बाद, जानवर को euthanized है, और मस्तिष्क जल्दी से हटा दिया जाता है। मस्तिष्क की पृष्ठीय सतह की सिली हुई मैक्रोस्कोपिक छवियों को उत्पन्न करना संभव है, जो sulci और विदर (चित्रा 1E) के पार पृष्ठीय मस्तिष्क की सतह पर अनुरेखक के वितरण पैटर्न में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सुविधा प्रदान करता है। इसी तरह की छवियों को मस्तिष्क की वेंट्रल और पार्श्व सतहों से उत्पन्न किया जा सकता है जहां ट्रेसर वितरण की जांच टेम्पोरल लोब (टीएल) और पार्श्व विदर (एलएफ) (चित्रा 1 ई) में की जा सकती है। एक स्टीरियोस्कोप का उपयोग मस्तिष्क की सतह की उच्च आवर्धन छवियों का उत्पादन करने के लिए भी किया जा सकता है जहां धमनियों के साथ पीवीएस में अनुरेखक को देखना संभव है (चित्रा 1 एफ-जी)। मैक्रोस्कोपिक कोरोनल मस्तिष्क वर्गों, लगभग 8 मिमी मोटी, एक सामन चाकू का उपयोग करके काटा जाता है और इंटरहेमिस्फेरिक विदर (आईएचएस) में अनुरेखक प्रवेश की गहराई में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, साथ ही हिप्पोकैम्पस (एचपीसी) और स्ट्रिएटम (एसटीआर) जैसी संरचनाओं में सबकॉर्टिकल ट्रेसर वितरण, (चित्रा 1 एच)।

एस्ट्रोसाइटिक एंडफीट, ग्लियाल-फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) में व्यक्त एक्यूपी 4 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग एस्ट्रोसाइट्स और धमनियों के चारों ओर स्थित चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) में व्यक्त किया गया है, से पता चला है कि ट्रेसर पीवीएस के भीतर दोनों को स्थानीयकृत करता है और मस्तिष्क पैरेन्काइमा (चित्रा 1आई-एम) में चला जाता है। AQP4 और GFAP धुंधला का उपयोग एस्ट्रोसाइट्स की पहचान करने के लिए किया जाता है और अधिक विशेष रूप से, एस्ट्रोसाइट्स पैर की प्रक्रियाएं जो पीवीएस की बाहरी सतह बनाती हैं, जबकि लेक्टिन और GLUT-1 एंडोथेलियल कोशिकाओं को दागते हैं जो पीवीएस की आंतरिक सतह बनाते हैं (चित्रा 1I-L)। पीवीएस सीमाओं को परिभाषित करने के लिए इन दागों को पूरा करके, पीवीएस स्पेस में स्थानीयकृत सीएसएफ-इंजेक्टेड ट्रेसर की पहचान करना संभव है। यह इस धारणा का समर्थन करता है कि सीएसएफ व्यापक पीवीएस परिवहन के माध्यम से gyrencephalic मस्तिष्क तक पहुंच प्राप्त करता है जो तब मस्तिष्क पैरेन्काइमा में ग्लिम्फेटिक प्रवाह की सुविधा प्रदान करता है। एसएमए धुंधला धमनी की दीवारों में पाए जाने वाले चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को बाध्य करके धमनियों और धमनियों की पहचान करता है और इसका उपयोग यह दिखाने के लिए किया जा सकता है कि पीवीएस प्रवाह नसों के विपरीत धमनियों के साथ होता है, जो सामान्य ग्लिम्फेटिक फ़ंक्शन (चित्रा 1 एम) के मूल शरीर विज्ञान का गठन करता है।

Figure 1
चित्र 1. सूअरों में टंकी मैग्ना कैनुलेशन. (ए) सर्जरी की शुरुआत से पहले सुअर तैयार किया गया था और चिह्नित किया गया था जहां त्वचीय चीरों को ओसीसीपटल क्रेस्ट (ओसी) से शुरू किया जाएगा, फिर वक्षीय कशेरुकाओं (टीवी) के पीछे और प्रत्येक कान के आधार (ईबी) के पार्श्व के पीछे। (बी) trapezius, semispinalis capitus biventer और semispinalis capitus complexus मांसपेशियों के साथ आराम की स्थिति में सिर वापस ले लिया, इस प्रकार cisterna magna (सीएम) को उजागर. (सी) कैनुलेशन और इंजेक्शन के लिए सीएम तक पहुंच बढ़ाने के लिए मैन्युअल रूप से लचीला सिर। (डी) इंजेक्शन के बाद सीएम में डाली गई एक कैनुला की क्लोज-अप छवि और दंत सीमेंट (डीसी) के साथ जगह में तय की गई। (ई) पृष्ठीय, वेंट्रल, और पार्श्व मस्तिष्क की सतहों, क्रमशः, संरचनात्मक सफेद प्रकाश छवियों के साथ फ्लोरोसेंट इमेजिंग के बाद। इन सतहों पर दिखाई देने वाले ब्याज के क्षेत्रों में इंटरहेमिस्फेरिक फिशर (आईएचएस), टेम्पोरल लोब (टीएल), और पार्श्व विदर (एलएफ) शामिल हैं। (च) मस्तिष्क की सतह पर धमनी और नसों की संरचनात्मक सफेद प्रकाश छवि। (जी) (एफ) की फ्लोरोसेंट छवि सतह धमनी के साथ अनुरेखक वितरण दिखा रही है। (एच) पूर्वकाल और पीछे के सेरेब्रल क्षेत्रों से मैक्रोस्कोपिक स्लाइस विदर (एलएफ, आईएचएस) और स्ट्रिएटम (एसटीआर) और हिप्पोकैम्पस (एचपीसी) जैसी सबकॉर्टिकल संरचनाओं में दो आयामी अनुरेखक फैलाव और वितरण दिखाते हैं। (आई-जे)। CONFOCal छवियों पीवीएस में अनुरेखक दिखा, आंतरिक रूप से लेक्टिन-सना हुआ एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट पैर प्रक्रियाओं पर AQP4 बाहरी रूप से घिरा हुआ है। (के-एल)। CONFOCal छवियों PVS में अनुरेखक दिखा, एस्ट्रोसाइट पैर प्रक्रियाओं glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) एक बाहरी सीमा बनाने के लिए दिखाई के लिए दाग के साथ आंतरिक रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं से घिरा हुआ है। (एम) Confocal छवि एक धमनी की हड्डी के चारों ओर पीवीएस में अनुरेखक दिखा रही है चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) अनुरेखक के साथ भी और आसपास दिखाई दे रही है, मस्तिष्क पैरेन्काइमा के आसपास. मुख्यमंत्री, टंकी मैग्ना; डीसी, दंत सीमेंट; ईबी, कान का आधार; GFAP, glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन; एचपीसी, हिप्पोकैम्पस; आईएचएस, इंटरहेमिस्फेरिक विदर; एलएफ, पार्श्व विदर; OLB, घ्राण बल्ब; ओसी, ओसीसीपटल शिखा; STR, striatum; टीएल, टेम्पोरल लोब; टीवी, वक्षीय कशेरुकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1: अनुरेखक इंजेक्शन के बाद सीएसएफ स्पंदन। ट्रेसर इंजेक्शन के बाद टंकी मैग्ना का क्लोज-अप वीडियो। नीला अनुरेखक सीएसएफ की लय पर स्पंदन कैनुला गर्दन में दिखाई देता है और एक सफल कैनुलेशन और इंजेक्शन का संकेत है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इसमें, वर्णित है, सूअरों में टंकी मैग्ना के प्रत्यक्ष कैनुलेशन को निष्पादित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, जिसमें आवश्यक तैयारी, सर्जिकल प्रक्रिया, अनुरेखक जलसेक और मस्तिष्क का निष्कर्षण शामिल है। इसके लिए बड़े जानवरों के साथ काम करने के लिए अनुभव और प्रमाणन वाले किसी व्यक्ति की आवश्यकता होती है। यदि सही ढंग से किया जाता है, तो यह सीएसएफ में सीधे ज़मानत के साथ वांछित अणुओं के वितरण की अनुमति देता है, जिसके बाद विभिन्न उन्नत प्रकाश इमेजिंग तौर-तरीकों की एक श्रृंखला का उपयोग एक बड़े स्तनपायी में उच्च रिज़ॉल्यूशन पर सीएसएफ वितरण और ग्लिम्फेटिक फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हालांकि यह कृन्तकों में सिस्टेरा मैग्ना कैनुलेशन के समान प्रक्रिया है, यह थोड़ा अधिक चुनौतीपूर्ण है और कई घंटों के प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इस तरह के प्रशिक्षण में प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत बड़े स्तनधारियों की हैंडलिंग, शरीर रचना विज्ञान और मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम की समझ, विशेष रूप से सूअरों में, और सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करने में कुछ हद तक प्रवीणता शामिल है। एक बार इन मानदंडों को पूरा करने के बाद, इस तकनीक को पूरा करना संभव है, जिसमें चूहों में 80-90% सफलता दर की तुलना में अब तक 100% सफलता दर है। प्रक्रिया को सही ढंग से करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बिंदु, सिर को ऊपर उठाना और गर्दन को फ्लेक्स करना है, जबकि कैनुला डालने और अनुरेखक को संक्रमित करना है। यद्यपि अनुरेखक को यहां हाथ से इंजेक्ट किया गया था, लेकिन यह प्रति मिनट 100 μL के नियंत्रित तरीके से किया गया था। चूहों में ट्रेसर के 10 μL को आमतौर पर इंजेक्ट किया जाता है और जब सीधे मस्तिष्क के आकार की तुलना की जाती है तो यह 50 किलोग्राम पिग 6,11,18 में लगभग 2 मिलीलीटर का अनुवाद करेगा। इसलिए, अनुरेखक के 500 μL का इंजेक्शन वास्तव में एक रूढ़िवादी मात्रा थी और इंट्राक्रैनियल दबाव (आईसीपी) में विस्तारित परेशानियों का उत्पादन नहीं करना चाहिए था। इसके अतिरिक्त, यह हाल ही में दिखाया गया है कि पेरिवैस्कुलर ग्लिम्फेटिक फ़ंक्शन केवल आईसीपी में क्षणिक वृद्धि का एक विरूपण साक्ष्य नहीं है, लेकिन जब आईसीपी को दोहरी सिरिंज विधि का उपयोग करके बेसलाइन पर बनाए रखा जाता है तो यह धारणा को और मजबूत करता है कि ये निष्कर्ष परिवर्तित आईसीपी 19 की कलाकृतियों को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं।

यह एकमात्र तकनीक नहीं है जिसका उपयोग सूअरों में सीएमसी करने के लिए किया जा सकता है, और हालांकि यह काफी अधिक आक्रामक है, यह अधिक सटीक अनुरेखक जलसेक देने के लिए प्रतीत होता है। सूअरों में सीएमसी करने का एक और तरीका उन्हें पार्श्व recumbency स्थिति में उनके पक्ष में झूठ बोल रहा है और एक 150 मिमी रीढ़ की हड्डी की सुई 20 के साथ अंधे में जा रहा है। यद्यपि यह अपनी न्यूनतम आक्रामकता के कारण एक आकर्षक तरीका था, संभावित सफलता दर को कम माना जाता था। चूंकि सुअर के सिर का पिछला हिस्सा सपाट है और सीएम सतह से बहुत गहरा (10-12 सेमी) बैठता है, रीढ़ की सुई में सीएम को भेदने से पहले यात्रा करने के लिए एक लंबी दूरी होती है, इस प्रकार सफल कैनुलेशन की निश्चितता को सीमित किया जाता है। सीएम के लिए बड़ी दूरी के अलावा सीएम का व्यास केवल 10 मिमी के बारे में है, जिससे सफल कैनुलेशन की संभावना कम हो जाती है। इसके विपरीत, प्रत्यक्ष सीएमसी विधि का उपयोग करके, सीधे कैनुलेशन की कल्पना करना संभव है और इस प्रकार निश्चितता के साथ पता है कि यह सफल रहा है और एजेंटों को सीएसएफ को वितरित किया गया है और आसपास के नरम ऊतक में लीक नहीं हुआ है। सफल कैनुलेशन सुनिश्चित करना सूअरों, सर्जरी की सुविधा और फ्लोरोसेंट ट्रेसर्स की उच्च लागत के कारण इस तरह के प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है, साथ ही साथ उपयोग किए जाने वाले सूअरों की संख्या को कम करने के लिए भी।

आक्रामकता के अलावा, इस विधि की सीमाएं यह है कि लागत और समय कृन्तकों की तुलना में कई पुनरावृत्तियों को हतोत्साहित करता है। पहली सर्जरी में लगभग 3 घंटे लगे, लेकिन वर्तमान में यह लगभग 45 मिनट में किया जा रहा है। यह एक महत्वपूर्ण समय सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, हालांकि, माउस में एक कैनुलेशन करने के लिए, एक कुशल शोधकर्ता के लिए 5 मिनट से भी कम समय लगता है, जिसका अर्थ है कि प्रवीणता तक पहुंचने पर वास्तविक सर्जरी का समय अभी भी चूहों की तुलना में 9 गुना अधिक है। इसके अतिरिक्त, बड़े मस्तिष्क का मतलब है कि सुअर में अनुरेखक परिसंचरण समय अधिक व्यापक है, उदाहरण के लिए, 2-6 घंटे, जबकि चूहों में एक मानक परिसंचरण समय 30 मिनट है। अनुरेखक की उच्च लागत के अलावा, सुअर के लिए बड़ी मात्रा में आवश्यक, सुअर की वास्तविक लागत के साथ-साथ इसके आवास, एनेस्थेटिक्स, और एक पूर्ण ऑपरेटिंग थिएटर का उपयोग करने की लागत एक सुअर के लिए इस प्रक्रिया की अंतिम लागत को एक एकल माउस की तुलना में 15 गुना अधिक महंगी बनाती है। एक अतिरिक्त समय से संबंधित चुनौती अनुरेखक परिसंचरण के बाद मस्तिष्क निष्कर्षण के लिए लिया गया समय है। पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि पीवीएस के माध्यम से अनुरेखक का कुछ आंदोलन इच्छामृत्यु 21 के बाद भी बना रहता है। यह इस घटना से किसी भी भ्रमित प्रभाव को कम करने के लिए जितनी जल्दी हो सके, दिमाग को निकालने के लिए महत्वपूर्ण बनाता है। जबकि माउस मस्तिष्क निष्कर्षण केवल कुछ मिनटों की मात्रा में होता है, सुअर मस्तिष्क निष्कर्षण में लगभग 15-20 मिनट का समय लगता है। इस प्रभाव को सीमित करने के लिए मस्तिष्क को जितनी जल्दी हो सके हटा दिया जाना चाहिए, लेकिन सुअर की खोपड़ी की मोटाई और वास्तुकला के साथ वर्तमान निष्कर्षण समय को कम करना मुश्किल है।

यद्यपि प्रत्यक्ष कैनुलेशन प्रक्रिया को काफी आक्रामक बनाता है, समग्र रक्त हानि केवल प्रति सर्जरी 100 मिलीलीटर औसत है, जो कुल रक्त की मात्रा के 3% से कम की हानि का गठन करती है। इसके अलावा, जानवर को एनेस्थेटिक्स के साथ एक निरंतर खारा जलसेक और रिंगर्स के लैक्टेट की एक अतिरिक्त IV लाइन प्राप्त होती है, जो हाइपोवोलेमिया के जोखिम को कम करती है।

चूहों में पहचाने जाने वाले ग्लिम्फेटिक शारीरिक ड्राइवरों के अनुवाद का पता लगाने के लिए भविष्य के अध्ययनों की आवश्यकता है, साथ ही साथ एनेस्थेटिक्स 22,23 के प्रभाव को हटाने के लिए जागने या स्वाभाविक रूप से सोने वाले सूअर में ग्लिम्फेटिक फ़ंक्शन। प्राकृतिक नींद या जागृत राज्य की जांच करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना आवश्यक होगा जैसे कि ट्रेसर को कम आक्रामक साधनों के माध्यम से वितरित किया जा सकता है, जबकि अभी भी उच्च सफलता दर बनाए रखता है। यह संभावित रूप से गणना टोमोग्राफी फ्लोरोस्कोपी के तहत सीएम इंजेक्शन लेकर प्राप्त किया जा सकता है, जिसका उपयोग पहले सूअरों में काठ पंचर के लिए किया गया है24। आगे बढ़ते हुए, एक बड़े स्तनपायी में ग्लिम्फेटिक फ़ंक्शन में अपनी भूमिका को समझने के लिए AQP4 जल चैनल के आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ इस तकनीक को संयोजित करना बहुत दिलचस्पी होगी। एक बड़े स्तनपायी में ग्लिम्फेटिक सिस्टम की पूरी सीमा की खोज में, क्षेत्र मनुष्यों में ग्लिम्फेटिक फ़ंक्शन को समझने के करीब जाता है और इसका उपयोग चिकित्सीय रूप से कैसे किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को Knut और Alice Wallenberg Foundation, Hjärnfonden, Wenner Gren Foundations और Crafoord Foundation द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01% azide in PBS Sigmaaldrich S2002
18G needle Mediq
1ml Syringe FischerSci 15849152
20G cannula Mediq NA
22G cannula Mediq NA
4% paraformaldehyde Sigmaaldrich P6148
Anatomical forceps NA NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate ThermoFischer A34785 2 vials (10mg)
CaCl2 Sigmaaldrich C1016
Chisel ClasOhlson 40-8870
Dental cement Agnthos 7508
compact saw ClasOhlson 40-9517
Glucose Sigmaaldrich G8270
Hammer ClasOhlson 40-7694
Insta-Set CA Accelerator BSI-Inc BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension Bbraun NA
KCl Sigmaaldrich P9333
Marker pen NA NA
MgCl2 Sigmaaldrich M8266
MilliQ water NA NA
NaCL Sigmaaldrich S7653
NaH2PO4 Sigmaaldrich S8282
NaHCO3 Sigmaaldrich S5761
No. 20 scalpel blade Agnthos BB520
No. 21 Scalpel blade Agnthos BB521
No. 4 Scalpel handle Agnthos 10004-13
Saline Mediq NA
Salmon knife Fiskers NA
Self-retaining retractors NA NA
Superglue NA NA
Surgical curved scissors NA NA
Surgical forceps NA NA
Surgical towel clamps NA NA

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References

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा 172 ग्लिम्फेटिक प्रणाली मस्तिष्कमेरु द्रव टंकी मैग्ना कैनुलेशन सुअर
सूअरों के टंकी मैग्ना में प्रत्यक्ष कैनुला आरोपण
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Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Direct Cannula Implantation in the Cisterna Magna of Pigs. J. Vis. Exp. (172), e62641, doi:10.3791/62641 (2021).

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