Summary
Bu makale, domuzların sarnıç magnasında doğrudan canül implantasyonu için adım adım bir protokol sunun.
Abstract
Glimfik sistem, beyin omurilik sıvısının (CSF) astrositlere bağlı pervasküler alanlarda akışına dayanan ve amiloid-beta gibi nörotoksik peptitlerin temizlenmesinde bulaşmış bir atık temizleme sistemidir. Bozulmuş glimfik fonksiyon, Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıkların hayvan modellerinde hastalık patolojisini şiddetlendirir ve bu da bu boşluk sistemini anlamanın önemini vurgular. Glimfik sistem genellikle sezgilerin doğrudan beyin omurilik sıvısına (CSF) teslim edildiği sarnıç magna cannülasyonları (CMc) tarafından incelenir. Bununla birlikte, çoğu çalışma kemirgenlerde yapılmıştır. Burada, domuzlarda CMc tekniğinin bir uyarlamasını gösteriyoruz. Domuzlarda CMc kullanılarak, glimfatik sistem jinekökenik beyinlerde yüksek optik çözünürlükte incelenebilir ve bunu yaparken kemirgen ve insan glimfatiği arasındaki bilgi boşluğunu kapatır.
Introduction
Beyin omurilik sıvısı (CSF), merkezi sinir sistemi (CNS)1,2 içinde ve çevresinde bulunan ultrafilt kandır. CSF, beyne yüzdürme vermenin veya zarar verici mekanik kuvvetleri emmenin yanı sıra, metabolik atıkların CNS3'ten temizlenmesinde de önemli bir rol oynar. Atık temizliği, CSF'nin beyin parankiminde pervasküler boşluklar (PVS) yoluyla konvektif akışına izin veren ve nüfuz eden arterleri çevreleyen yakın zamanda karakterize edilen glimfik sistem tarafından kolaylaştırılmıştır3,4,5. Bu işlemin, öncelikle astrositik endfeet üzerinde ifade edilen ve PVS4,6'ya bağlı bir su kanalı olan aquaporin-4'e (AQP4) bağlı olduğu gösterilmiştir. Glimfik sistemin çalışması, CSF7,8,9,10,11'e floresan/radyoaktif izleyici veya kontrast madde girmesini takiben gelişmiş ışık mikroskopisi veya manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanılarak hem in vivo hem de ex vivo görüntüleme ile elde edilir.
Beyin parankiminde hasara yol etmeden CSF'ye bir izleyici sokmanın etkili bir yolu sarnıç magna kanülasyonundan (CMc)12,13'dür. Tüm glimfik çalışmaların büyük bir çoğunluğu, şimdiye kadar kemirgenlerde yapılmış ve CMc'nin istilacılığı ve küçük bir memeli ile çalışmanın pratik basitliği nedeniyle daha yüksek memelilerde kaçınılmıştır. Ek olarak, farelerin ince kafatasları, kafatası penceresine ihtiyaç duymadan in vivo görüntülemeye izin verir ve daha sonra karmaşık olmayan bir beyin ekstraksiyonuna izin verir11,14. İnsanlarda yapılan deneyler glimfatik fonksiyon hakkında değerli bir makroskopik in vivo veri elde etti, ancak distal lomber omurgadaki intratekal izleyici enjeksiyonlarına dayandı ve ayrıca glimfatik sistemi mikroanatomi yakalamak için yeterli çözünürlük vermeyen MRI'ı kullandı7,15,16 . Yüksek memelilerde glimfik sistemin mimarisini ve kapsamını anlamak, insanlara çevrilmesinde esastır. İnsanlara glimfik çeviriyi kolaylaştırmak için, kemirgenlerde gerçekleştirilen tekniklerin daha yüksek memelilere uygulanması önemlidir, böylece glimfik sistemin artan biliş ve beyin karmaşıklığı türleri arasında doğrudan karşılaştırılmasına izin vermek önemlidir17. Domuz ve insan beyinleri katlanmış bir nöroarşisitture sahip olan jinekfaliktir, kemirgen beyinleri ise lisensefaliktir, böylece birbirleri arasında önemli bir fark vardır. Genel boyut açısından, domuz beyinleri de, insan beyninden 10-15 kat daha küçükken, fare beyinleri 3.000 kat daha küçüktür18. Büyük memelilerde glimfik sistemi daha iyi anlayarak, inme, travmatik beyin hasarı ve nörodejenerasyon gibi durumlarda gelecekteki terapötik müdahale için insan glimfik sistemini kullanmak mümkün olabilir. Domuz in vivo doğrudan CMc, daha yüksek bir memelide glimfik sistemin yüksek çözünürlüklü ışık mikroskopisine izin veren bir yöntemdir. Ayrıca, kullanılan domuzların büyüklüğü nedeniyle, insan ameliyatlarında kullanılanlara benzer izleme sistemleri uygulamak mümkündür, bu da bunların glimfik işleve nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek için hayati işlevleri sıkı bir şekilde belgelemeyi ve düzenlemeyi mümkün hale getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Avrupa direktifi 2010/63/EU uyarınca gerçekleştirilmiş ve Malmö-Lund Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi (Dnr 5.8.18-05527/2019) tarafından onaylanmış ve İsveç Araştırma Konseyi'nin CODEX yönergelerine göre yürütülmüştür.
1. Hazırlık
- Izleyici
- Yapay CSF (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glikoz, 26 mM NaHCO3; pH 7,4) hazırlayın
- 500 μL yapay CSF'ye, Alexa Fluor 647 (BSA-647) ile eşleştirilmiş sığır serumundan (BSA) 10 mg albümin ekleyin.
- 5 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüj ve süpernatant kullanın.
- Kanül
- İntravenöz (IV) hattın dişi Luer bağlantısına 1 mL şırınna, 10 cm uzantılı 3 yönlü musluk takın.
- Erkek ucuna 18 G iğne takın.
- İğneden şırıngaya kadar süreklilik sağlamak için 3 yönlü durdurma kilidini açın.
- İğneyi dikkatlice ısıtın ve serum hattına yaklaşık 300 μL salin epire edin.
- İğneyi salinden çıkarın ve IV hattında küçük bir hava kabarcığı (5-10 mm) oluşturmak için biraz hava vermeye devam edin.
- İğneyi izleyiciye yerleştirin ve izleyicinin 500 μL'lik kısmının tamamını aspire edin. IV hattındaki salin gözle görülür bir şekilde bir hava kabarcığı ile ayrılmalıdır.
- İğneyi atın ve 3 yönlü durdurma kilidini kapatın.
- Hayvan
- Bir domuzu karotamin (3.m,75 mg/kg) ve zolazepam (3,75 mg/kg) ve deksmedetomidin (37,5 μg/kg) enjeksiyonu ile yatıştırın. Bilinçsiz olmasını bekle.
- Kulak damarına 20 G'lık bir damar yerleştirerek damar içi bir çizgi hazırlayın.
NOT: Damardan 5-10 mL salin enjekte ederek kanın damarda olduğundan emin olun. Damar ıskalanmışsa, bu kulak dokusundaki küçük ödem ile fark edilecektir. - Nefes alma oranının ameliyat boyunca düzenlenebilmesini sağlamak için domuzu entübe edin.
NOT: Domuzun toraksına basınç uygulayarak başarılı entübasyon sağlayın ve entübasyon tüpünden zorla süresi dolmuş havanın geldiğini onaylayın. - Entübasyon tüpünü 14 nefes/dk nefes hızına ayarlanmış bir ventilatöre takın.
- Kalp atış hızını (hr), kan basıncını (BP) ve oksijen doygunluğunu (sat) izlemek için kuyruğa bir darbe oksimetresi ve manşet bağlayın. Çekirdek sıcaklığını izlemek için bir rektal termometre yerleştirin.
- Salin içinde bir IV torba ketamin (5 mg/kg/dk), midazolam (0,25 mg/kg/dk) ve fentanil (2,5 μg/kg/dk) hazırlayın ve kulak damarından yaklaşık 2 damla/sn'de demlenmeye başlayın.
NOT: Ameliyat boyunca, infüzyon oranının hayvanın hayati değerlerine göre arttırılması veya azaltılması gerekebilir. - Domuz eğilimli pozisyondayken, ilk torasik omurların oksipital tepesini ve omurgasını ve her kulağın tabanını bulmak ve işaretlemek için hayvanın başının ve boynunun arkasını palpe edin.
- Uzunlamasına eksen boyunca tepe ve omurlar arasında düz bir çizgi çizin. Kafatasının tabanını takip ederek her kulağın tabanına armadan iki çizgi çizin (Şekil 1A).
- Kuyruğu dikkatlice kenetleyerek ve kuyruk refleksinin yokluğunu izleyerek hayvanın derin bir uykuda olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Hayvan hala refleksifse, hayvan artık refleks sergilemeyene kadar anestezik infüzyon oranı artımlı olarak artırılmalıdır.
2. Cerrahi
NOT: Ameliyat boyunca, ışık kanamasını emmek ve kopmuş damarları dağlamak için en az bir asistana sahip olmak gerekir.
- 21 numaralı bıçaklı bir neşter kullanarak, uzunlamasına çizgi boyunca kaslara kadar dermal bir kesi yapın.
- omuzlar boyunca 10-15 cm uzunluğunda iki dik dermal kesiyi daha uzatın.
- Oksipital armalardan, her kulağın tabanına kadar olan çizgi boyunca dermal kesiler yapın.
- Oksipital krepte oluşan cilt köşelerini anatomik forseps ile kavrama, neşter bıçağını fasya üzerinde hafifçe çalıştırarak, rostralden kaudal'a geçerek cildi alttaki kastan dikkatlice ayırın. Beş kesiden her birini takiben cilt reseksiyon edildikten sonra, trapezius kaslarının parçaları daha sonra görünmelidir.
- Trapezin orta çizgide bir araya geldiği yaklaşık 1 cm derinliğinde neşterle uzunlamasına bir kesi yapın.
NOT: Kasları keserken, kanama eğilimi artar, bu nedenle koterizatör hazır olmalıdır. Daha büyük bir damar kesilirse, bir kişi gazlı bezle hızlı bir şekilde sıkıştırmalı, diğer kişi ise kouterizörü kullanmalıdır. - Düz ve kavisli cerrahi kürlerin bir kombinasyonunu kullanarak, kaslardaki boyuna kesim boyunca çalışarak künt diseksiyon gerçekleştirin. Bu, yamuk karınlarını ve alttaki semispinalis kapitus biventer kasını ayıracaktır.
- Kalıcı kas liflerini neşterle kesin ve semispinalis capitus complexus görünene kadar künt diseksiyona devam edin.
- Kafatasının arka yönü boyunca yamuk ve semispinalis kapitus biventer kaslarının kökenlerini ayırın. Semispinalis capitus complexus tamamen görünene kadar neşter künt diseksiyon yapan neşterle uzunlamasına dikkatlice ayırın.
- Trapezius ve semispinalis capitus biventer kaslarını kendi kendini koruyan retraktörler kullanarak geri çek.
- Semispinalis capitus complexus'un karınlarının orta çizgide bir araya geldiği yerde, neşterle yaklaşık 1 cm derinliğinde uzunlamasına bir kesi yapın.
NOT: Burada herhangi bir ek kanama için dikkat edin. Kanama, pamuklu çubuklar ve koterizasyon kombinasyonu kullanılarak yönetilebilir. - Cerrahi tokmalar kullanarak, atlasın (CI) dorsal yönü hissedilebilene kadar kas karınları arasındaki boyuna kesik boyunca çalışarak künt bir diseksiyon yapın.
- Semispinalis capitus complexus kaslarının kökenlerini kafatasının arka yönü boyunca kesin ve neşter ve künt diseksiyon ile alttaki omurlardan uzunlamasına ayırın.
- Semispinalis capitus complexus kaslarını başka bir kendi kendini koruyan retraktörler kümesi kullanarak geri çek.
- Neşter kullanarak, atlasın kafatası tabanıyla buluştuğu bölgenin üzerinde kalan tüm dokuları dikkatlice çıkarın.
- Bir kolu hayvanın boynunun altına, bir parmağınızı atlasın ve kafatasının ucuna yerleştirin, aynı anda başı yükseltin ve diğer eli kullanarak sarnıç magnasını ortaya çıkarmak için parmakla palpe ederken boynu esnetin.
NOT: Sarnıç magna, parmakla basınç salındıkça az miktarda ribaund ile güçlü bir elastik yapı olarak palping yaparken tanınabilir.
3. Canülasyon ve enjeksiyon
NOT: Bu adım aynı zamanda en az iki kişi gerektirir ve hayvanın başı yükseltilmiş ve boynu esnemiş olarak gerçekleştirilir.
- Bir kişinin hayvanın başını ve boynunu yükselttiği ve esnettiğinden emin olun, diğer kişi ise anatomik konumunu not eden sarnıç magna için palpe eder.
- Yavaşça ve dikkatlice dura boyunca ve sarnıç magna içine boyuna eksene eğik bir açıyla 22 G kanül tanıtın.
NOT: Canülleri çok derine sokmayın, çünkü bu beyne zarar verebilir. Canül'ün ne kadar uzağa yerleştirılacağını bilmek, canüllerin durayı delmenin nasıl hissettirdiğini anlama deneyimi ile birlikte gelir. Esasen, dura delindiği gibi, cannula daha sonra başarılı bir izleyici enjeksiyonu için yeterince derindir. Bu derinlik yaklaşık 3-5 mm'dir, ancak hayvanın büyüklüğüne veya yaşına göre farklılık gösterecektir. Başarılı cannülasyon, canüle yükselen net, pulsatil CSF'nin görselleştirilmesiyle hemen belirgin olmalıdır. En iyi sonuç için, kişinin dural piercing anlayışını elde etmek için ötenazili hayvanlarda önceden birkaç cannülasyon uygulanması önerilir. - İğneyi kanülden geri çek ve kilidin üzerine bir kapak yerleştirin.
- İlk olarak, süperglue ve canülün dokuya girdiği bir hızlandırıcı uygulayın, ardından diş çimentosunun uygulanması. Çimentonun sertleşmesi için 5 dakika bekleyin.
- Kapağı kanamadan dikkatlice çıkarın ve daha önce hazırlanmış IV hat musluğunun erkek ucunun 10 cm uzantılı, izleyici ile birlikte damara takın.
- İzleyiciyi elle veya 100 μL/dk hızında bir mikro infüzyon pompası kullanarak yavaşça enjekte edin. 10 cm uzantılı 3 yönlü IV hat musluğunu çıkarın ve kapakla değiştirin. İzleyici artık canül tabanında nabız atarken görünür olmalıdır (Ek Video 1).
NOT: Elle enjekte ediyorsanız, izleyici, diş çimentosunda şaftın kaplandığı yerin yaklaşık 1-2 mm yukarısındaki ampul şaftında hala görünene kadar bunu yapın. - Enjeksiyondan sonra, biraz esnemeyi korumak için boynun altına kum torbaları yerleştirin. Baş daha sonra serbest bırakılabilir ve hayvan dinlenmeye eğilimli bir pozisyonda bırakılır.
- Kendini koruyan retraktörleri serbest bırakın ve kasları daha önce uzandıkları gibi yerleştirin. Cerrahi havlu kelepçeleri kullanarak cildi kasların üzerinde bir araya getirin.
- Havlu kelepçelerini ve kesiyi gazlı bezle örtün ve ardından ısı kaybını sınırlamak için bir battaniye.
- İzleyicinin, hayvanı i.v. ile ötenazi yapmadan önce istenen süre boyunca dolaşmasına izin verin. Pentobarbital enjeksiyon (140 mg/kg). Ötanaziyi stetoskopla auscultasyon üzerine kalp seslerinin yokluğu ile onaylayın.
4. Beyin çıkarma ve işleme
- 20 bıçaklı bir neşter kullanarak, uzunlamasına dermal kesiği oksipital kretten burundan yaklaşık 7 cm yukarı uzatın.
- Neşteri kullanarak kafatasının dorsal yönünün üzerinde bulunan cildi yansıtın.
NOT: Domuz kafatasının sırt yönünü hayvan bazında kesmenin ve çıkarmanın birkaç yolu vardır. Aşağıdakiler, bu deney için en sık işe yarayan prosedürdür. - El tipi kompakt bir testere kullanarak, kafatasından çıkarken görülen iki büyük damarın yaklaşık 3 cm üzerinde kafatasında bir koronal kesim yapın. Koronal kesimlerden iki dikey kesime ve dikey kesimleri orta çizgide bir araya getirmek için iki kesime daha genişletin.
NOT: Kafatası kemik kesiklerini yaparken testerenin sıkı bir tutuşunu sağlayın, çünkü kemik veya doku ile ilk temasta çekilme eğilimindedir, bu da ciddi bir yaralanmaya yol açabilir. - Her kesime bir çekiç ve dar keski (10 mm) ile takip ederek kafatası kesiklerinin kemiğin tüm kalınlığından geçtiğinden emin olun.
- Çekici kullanarak, son olarak koronal kesime geniş bir keski (25-30 mm) vurun. Bir kişi başı desteklerken, diğer kişinin sırt kafatasını açmak için keskiye kaldıraç uyguladığından emin olun.
- Sırt kafatası parçası çıkarıldıktan sonra, kavisli cerrahi makas kullanarak overlying dura mater'i parçalara çıkarın.
- Rostral açıdan beyinciği serebellumdan şiddetli hale getirmek için bir spatula kullanın. Daha sonra beynin altındaki spatulayı önden yönlendirmeye devam edin, koku ampullerini, hipofiz bezini ve kraniyal sinirleri ayırın.
- Spatulayı beyinciğin arkasına yerleştirin ve beyni kafatası boşluğundan çıkarmak için oldukça fazla basınç uygulayın, serbest kaldıktan sonra dikkatlice kaldırın.
- Bir gecede % 4 paraformaldehit içinde doku daldırma ile hemen tüm beyni sabitlemek.
NOT: Bu adımdan sonra, tüm beyin görüntülemesini stereoskop kullanarak gerçekleştirmek mümkündür (Şekil 1E). - Ertesi gün, bir somon bıçağı kullanarak beynin koronal dilimlerini yapın ve dilimleri bir gecede% 4 paraformaldehitte doku daldırma ile sabitleyin.
- Son olarak, dilimleri uzun süreli depolama için PBS'de% 0.01 azide yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Domuz bilinçsiz hale geldikten sonra palpe olur ve yüzey anatomisi oksipital kret (OC) den başlayarak torasik omurlara (TV) ve her kulak tabanına (EB) doğru çalışarak işaretlenir. Dermal kesilerin yapıldığı bu hatlar boyuncadır (Şekil 1A). Trapezius, semispinalis capitus biventer ve semispinalis capitus complexus dahil olmak üzere üç kas tabakası resected ve sarnıç magna (CM) ortaya çıkarmak için kendi kendini tutan retraktörler iki set tarafından açık tutulur (Şekil 1B). Kafa daha sonra kafatasının arkası ile atlas arasındaki boşluğu açmak ve CM'ye erişimi kolaylaştırmak için esnetilir (Şekil 1C). 18 G'lik bir kanonül, CM'ye 3-5 mm dikkatlice yerleştirilir ve hem süper tutkal hem de diş çimentosu (DC) ile yerine sabitlenir. İzleyici daha sonra sabit bir oranda enjekte edilebilir. İzleyici enjekte edildikten sonra, IV hattı ve şırınna bir kanolan kapağı ile değiştirilir (Şekil 1C-D). Kaslar daha sonra tekrar yerine konur ve domuz kaplanır ve izleyicinin dolaştığı süre boyunca sıcak tutulur. Dolaşımdan sonra, hayvan ötenaziye tabir edilir ve beyin hızla çıkarılır. Beynin dorsal yüzeyinin dikişli makroskopik görüntülerini oluşturmak mümkündür, bu da dorsal beyin yüzeyindeki izleyicinin sülçü ve çatlaklar boyunca dağılım kalıpları hakkında ayrıntılı içgörüler sağlamayı kolaylaştırır (Şekil 1E). Temporal lobda (TL) ve lateral fissürde (LF) izleyici dağılımının araştırılabildiği beynin ventral ve lateral yüzeylerinden de benzer görüntüler oluşturulabilir (Şekil 1E). Ayrıca, izleyiciyi arterler boyunca PVS'de görmenin mümkün olduğu beyin yüzeyinin daha yüksek büyütme görüntülerini üretmek için bir stereoskop kullanılabilir (Şekil 1F-G). Yaklaşık 8 mm kalınlığındaki makroskopik koronal beyin bölümleri somon bıçağı kullanılarak kesilir ve interhemisferik fissürde (IHS) izleyici penetrasyonunun derinliğinin yanı sıra hipokampus (HPC) ve striatum (STR) gibi yapılarda subkortikal izleyici dağılımı hakkında daha fazla bilgi sağlar (Şekil 1H).
AQP4 için astrositik endfeet, astrositler boyunca ifade edilen glial-fibriler asidik protein (GFAP) ve arteriyüllerin etrafında bulunan düz kas aktisin (SMA) ile ifade edilen immünohistokimyasal lekeleme, izleyicinin hem PVS içinde lokalize olduğunu hem de beyin parankimine girdiğini göstermiştir (Şekil 1I-M). AQP4 ve GFAP boyama astrositleri tanımlamak için kullanılır ve daha spesifik olarak, PVS'nin dış yüzeyini oluşturan astrosit ayak işlemleri, lektin ve GLUT-1 ise PVS'nin iç yüzeyini oluşturan endotel hücrelerini lekeler (Şekil 1I-L). PVS sınırlarını tanımlamak için bu lekeleri gerçekleştirerek, PVS alanına yerelleştirilmiş CSF enjekte edilmiş izleyiciyi tanımlamak mümkündür. Bu, CSF'nin gyrencephalic beyne kapsamlı PVS nakli yoluyla eriştiği ve daha sonra beyin parankimine glimfatik akını kolaylaştırdığı fikrini desteklemektedir. SMA lekeleme, arter duvarlarında bulunan düz kas hücrelerine bağlanarak arterleri ve arteriyolleri tanımlar ve normal glimfik fonksiyonun temel fizyolojisini oluşturan damarlar boyunca PVS akınının meydana geldiğini göstermek için kullanılabilir (Şekil 1M).
Şekil 1. Domuzlarda sarnıç magna cannulation. (A) Domuz, ameliyatın başlangıcından önce hazırlandı ve oksipital kretten (OC) başlayarak daha sonra torasik omurlara (TV) arka ve her kulak tabanına (EB) kadar dermal kesilerin nerede yapılacağı işaretlendi. (B) Trapezius, semispinalis capitus biventer ve semispinalis capitus complexus kasları geri çekildi, böylece sarnıç magna (CM) maruz rahat pozisyonda kafa. (C) Kafa, canülasyon ve enjeksiyon için CM'ye erişimi artırmak için manuel olarak esnetilir. (D) Enjeksiyondan sonra CM'ye yerleştirilen ve diş çimentosu (DC) ile yerine sabitlenen bir kolayın yakın çekim görüntüsü. (E) Sırasıyla dorsal, ventral ve lateral beyin yüzeyleri, floresan görüntülemeden sonra eşlik eden yapısal beyaz ışık görüntüleri. Bu yüzeylerde görülebilen ilgi alanları arasında interhemisferik fissür (IHS), temporal lob (TL) ve lateral fissür (LF) sayılıyor. (F) Beyin yüzeyindeki arter ve damarların yapısal beyaz ışık görüntüsü. (G) Yüzey arteri boyunca izleyici dağılımını gösteren (F) floresan görüntüsü. (H) Ön ve arka serebral bölgelerden alınan makroskopik dilimler, çatlaklarda (LF, IHS) ve striatum (STR) ve hipokampus (HPC) gibi subkortikal yapılarda iki boyutlu izleyici dağılımı ve dağılımını gösterir. (I-J). PVS'deki izleyiciyi gösteren konfokal görüntüler, dahili olarak lektin lekeli endotel hücreleri ve astrosit ayak üzerinde AQP4 ile sınırlanmış harici olarak işlenir. (K-L). PVS'deki izleyiciyi gösteren konfokal görüntüler, içsel olarak endotel hücreleri tarafından sınırlanmış, glial fibril asidik protein (GFAP) için lekelenmiş astrosit ayak işlemleri dış sınır oluşturur. (M) PVS'deki izleyiciyi düz kas aksini (SMA) için boyanmış bir arteriyolün etrafında gösteren konfokal görüntü, izlemeci de beyin parenkimini çevreleyen ve çevresinde görülebilir. CM, sarnıç magna; DC, diş çimentosu; EB, kulak tabanı; GFAP, glial fibril asidik protein; HPC, hipokampus; IHS, interhemisferik çatlak; LF, yanal çatlak; OLB, koku ampulü; OC, oksipital arma; STR, striatum; TL, temporal lob; Televizyon, torasik omurlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: İzleyici enjeksiyonundan sonra CSF titreşimi. İzleyici enjeksiyonundan sonra sarnıç magnasının yakın çekim videosu. Mavi izleyici, CSF'nin ritminde titreşen cannula boynunda görülebilir ve başarılı bir canülasyon ve enjeksiyonun göstergesidir. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, gerekli hazırlık, cerrahi prosedür, izleyici infüzyonu ve beynin çıkarılması da dahil olmak üzere domuzlarda sarnıç magnasının doğrudan kanülasyonunu gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu, büyük hayvanlarla çalışmak için deneyime ve sertifikaya sahip birini gerektirir. Doğru bir şekilde gerçekleştirilirse, bu, istenen moleküllerin doğrudan CSF'ye teslim edilmesine izin verir, bundan sonra büyük bir memelide CSF dağılımını ve glimfik fonksiyonu yüksek çözünürlükte keşfetmek için bir dizi farklı gelişmiş ışık görüntüleme yöntemi kullanılabilir.
Bunun kemirgenlerde sarnıç magna cannülasyonu ile aynı prosedür olmasına rağmen, biraz daha zor olduğunu ve birkaç saat eğitim gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Bu tür bir eğitim, büyük memelilerin laboratuvar koşullarında ele alınmasını, özellikle domuzlarda anatomi ve kas-iskelet sisteminin anlaşılmasını ve cerrahi aletlerin kullanılmasında bir dereceye kadar yeterliliği içerir. Bu kriterler yerine getirildikten sonra, şimdiye kadar farelerde% 80-90 başarı oranına kıyasla% 100 başarı oranına sahip olan bu tekniği gerçekleştirmek mümkündür. İşlemi doğru yapmak için en kritik nokta, kanül takılırken ve izleyiciyi aşılarken başı yükseltmek ve boynu esnetmektir. İzleyici buraya elle enjekte edilmiş olmasına rağmen, dakikada 100 μL kontrollü bir şekilde yapıldı. Farelerde 10 μL izleyici tipik olarak enjekte edilir ve beyin boyutlarını doğrudan karşılaştırırken bu, 50 kg'lık bir domuzun içinde yaklaşık 2 mL'ye dönüşür6,11,18. Bu nedenle, 500 μL izleyici enjeksiyonu aslında konservatif bir hacimdi ve intrakraniyal basınçta (ICP) genişletilmiş perturbances üretmemeliydi. Ek olarak, son zamanlarda perakvasküler glimfik fonksiyonun sadece ICP'deki geçici artışların bir eseri olmadığı, ancak ICP'nin çift şırınma yöntemi kullanılarak taban çizgisine dayanak noktası olarak korunduğunda devam ettiği ve bu bulguların değiştirilmiş ICP19'un yapıtlarını yansıtmadığı fikrini daha da güçlendirdiği gösterilmiştir.
Bu, domuzlarda CMc yapmak için kullanılabilecek tek teknik değildir ve önemli ölçüde daha istilacı olmasına rağmen, daha doğru bir izleyici infüzyonu verdiği görülmektedir. Domuzlarda CMc yapmanın bir başka yolu da yanlarına yanal rekumbency pozisyonunda yatmak ve 150 mm omurilik iğnesi20 ile kör olmaktır. Bu minimal invazivliği nedeniyle çekici bir yöntem olmasına rağmen, potansiyel başarı oranının daha düşük olduğu algılandı. Domuz kafasının arkası düz olduğundan ve CM yüzeyden çok derine (10-12cm) oturduğundan, omurilik iğnesi CM'ye nüfuz etmeden önce seyahat etmek için uzun bir mesafeye sahiptir, böylece başarılı kanülasyonun kesinliğini sınırlar. CM'ye olan geniş mesafenin yanı sıra, CM'nin çapı sadece yaklaşık 10 mm'dir ve başarılı bir canülasyon şansını daha da azaltır. Buna karşılık, doğrudan CMc yöntemini kullanarak, doğrudan canülasyonu görselleştirmek ve böylece başarılı olduğunu ve ajanların CSF'ye teslim edildiğini ve çevredeki yumuşak dokuya sızmadığını kesin olarak bilmek mümkündür. Başarılı bir kanülasyon sağlamak, domuzların, cerrahi tesisin ve floresan izleyicilerin yüksek maliyeti nedeniyle bu tür deneyler için ve kullanılan domuz sayısını en aza indirmek için önemlidir.
Bu yöntemin sınırlamaları, istilacılığın yanı sıra, maliyet ve zamanın kemirgenlere kıyasla birçok tekrarı caydırdığıdır. Yapılan ilk ameliyat yaklaşık 3 saat sürdü, ancak şu anda yaklaşık 45 dakika içinde yapılıyor. Bu, bir farede bir kanülasyon gerçekleştirmek için önemli bir zaman iyileştirmesini temsil eder, yetenekli bir araştırmacı için 5 dakikadan az sürer, yani yeterliliğe ulaştıktan sonraki gerçek ameliyat süresi farelere göre hala 9 kat daha uzundur. Ek olarak, büyük beyin, domuzdaki izleyici dolaşım sürelerinin daha geniş olduğu anlamına gelir, örneğin 2-6 saat, farelerde ise standart dolaşım süresi 30 dakikadır. Domuz için büyük hacimlerde ihtiyaç duyulan izleyicinin yüksek maliyetinin yanı sıra, domuzun gerçek maliyeti ve tam bir ameliyathane kullanma maliyeti, bu prosedürün son maliyetini tek bir fareden 15 kat daha pahalı hale getirir. Zamanla ilgili ek bir zorluk, izleyici dolaşımından sonra beyin çekimi için geçen süredir. Önceki raporlar, ötanazi21'den sonra izleyicinin PVS üzerinden bir miktar hareketinin devam ettiğini göstermiştir. Bu, bu fenomenden herhangi bir kafa karıştırıcı etkiyi en aza indirmek için beyinleri mümkün olduğunca çabuk çıkarmayı önemli kılar. Fare beyin ekstraksiyonu sadece birkaç dakika sürerken, domuz beyin ekstraksiyonları yaklaşık 15-20 dakika sürer. Beyin bu etkiyi sınırlamak için mümkün olduğunca çabuk çıkarılmalıdır, ancak domuz kafatasının kalınlığı ve mimarisi ile mevcut ekstraksiyon sürelerini azaltmak zordur.
Doğrudan kanülasyon işlemi oldukça invaziv hale getirse de, genel kan kaybı ameliyat başına ortalama 100 mL'dir ve bu da toplam kan hacminin% 3'ünden daha az bir kayıp oluşturur. Ayrıca, hayvan anesteziklerle sürekli bir tuzlu infüzyon ve Ringers'ın laktatının ek bir IV hattını alır ve hipovolemi riskini azaltır.
Farelerde tanımlanan glimfik fizyolojik sürücülerin çevirisini ve anesteziklerin etkisini gidermek için uyanık veya doğal olarak uyuyan domuzlarda glimfik işlevi araştırmak için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır22,23. Doğal uykuyu veya uyanık durumu araştırmak için, mevcut protokolü, izleyicinin daha az invaziv yollarla teslim edilebilmesi ve hala yüksek bir başarı oranını koruyabilmesi için uyarlamak gerekecektir. Bu, daha önce domuzlarda lomber delinme için kullanılan bilgisayarlı tomografi floroskopisi altında CM enjeksiyonları yapılarak elde edilebilir24. İleride, büyük bir memelide glimfatik işlevdeki rolünü anlamak için bu tekniği AQP4 su kanalının genetik manipülasyonlarıyla birleştirmek büyük ilgi çekici olacaktır. Büyük bir memelide glimfik sistemin tam kapsamını keşfederken, alan insanlardaki glimfik fonksiyonu ve terapötik olarak nasıl kullanılabileceğini anlamaya daha yakındır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Knut ve Alice Wallenberg Vakfı, Hjärnfonden, Wenner Gren Vakıfları ve Crafoord vakfı tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M.
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, Clifton, N.J. (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D'Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
