5-Etil-2'-Deoksiroridin/Fosfo-Histon H3 Drosophila Nöral Kök Hücrelerde Hücre Döngüsü İlerleme Analizi için Çift Etiketleme Protokolü
Summary
5-etil-2′-deoksiyridin (EdU) ve fosfo-histon H3 (pH3) etiketlemeli hücre döngüsü analizi, kapsamlı optimizasyon gerektirebilecek çok adımlı bir prosedürdür. Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri ayırt etmek için görüntü analizi ve niceleme dahil olmak üzere bu prosedür için tüm adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Abstract
In vivo hücre döngüsü ilerleme analizi, mitoz ve DNA replikasyonunu düzenleyen genler üzerinde yapılan çalışmalarda rutin olarak yapılmaktadır. 5-Etil-2′-deoksiyridin (EdU) replikatif/S faz ilerlemesini araştırmak için kullanılırken, fosfo-histon H3’e karşı antikorlar mitotik çekirdekleri ve hücreleri işaretlemek için kullanılmıştır. Her iki etiketin birleşimi, G0/G1 (Boşluk fazı), S (çoğaltıcı) ve M (mitotik) fazlarının sınıflandırılmasını sağlar ve mitotik gen devirmelerinin veya boş mutantların hücre döngüsü ilerlemesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için önemli bir araç olarak hizmet eder. Bununla birlikte, EdU etiketli hücreleri işaretlemek için kullanılan reaktifler birkaç ikincil antikor floresan etiketiyle uyumsuzdur. Bu, birincil ve etiketli ikincil antikorların pH3-pozitif mitotik hücreleri işaretlemek için kullanıldığı immünostainingi zorlaştırır. Bu makalede, mitotik faktörleri incelemek için yoğun olarak kullanılan bir sistem olan Drosophila larva nöral kök hücrelerinde EdU ve pH3’ün çift etiketli olarak etiketlenerek kullanılması için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, etiketli hücreleri G0/G1, S, S>G2/M (S’den G2/M’ye ilerleme) ve M aşamaları olmak üzere 3 ayrı kategoride ayırmak için görüntü analizi ve niceleme için bir protokol sağlanır.
Introduction
Hücre bölünme döngüsü bir G1 fazı (ilk boşluk fazı), bir çoğaltıcı/S fazı, bir G2 (ikinci boşluk aşaması) ve bir M (mitotik) fazını içerir. Bu aşamalardan geçen hücre, sitoskeletal makinelerin hücresel transkripsiyonunda, çevirisinde ve yeniden düzenlenmesinde dramatik değişikliklere uğrar1,2. Gelişimsel ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak, hücreler geçici olarak bölünmeyi ve sessiz hale gelebilir (G0) veya farklılaşabilir ve kalıcı olarak3bölmeyi durdurabilir. DNA hasarı gibi diğer senaryolar erken farklılaşmaya veya apoptoz3,4‘eneden olabilir. Bu tür ipuçlarına yanıt, hücre bölünme döngüsünün bir sonraki aşamasına geçmeden önce temel hücresel süreçlerin bütünlüğünü sağlamak için bir gözetim sistemi görevi gören hücre döngüsü kontrol noktaları tarafından aracılık edilir5. Bu nedenle, DNA replikasyonunu düzenleyen genler, kontrol noktaları ve mitotik makineler üzerinde yapılan çalışmaların, mutant hücrelerde veya bu genlerin siRNA nakavtında oluşabilecek olası hücre döngüsü ilerleme kusurlarını analiz etmesi gerekir. Ayrıca, bu tür analizler genel hücre sağlığını ve ilaç tedavisine verilen hücresel yanıtları test etmek için kullanılabilir.
5-bromo-2′-deoksiyridin (BrdU), replikasyon sırasında DNA’ya dahil edilen bir timidin analogudur6. Bu yöntem, S fazındaki hücreleri tanımlamak için yoğun olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, hücreler daha sonra anti-BrdU antikorları kullanılarak BrdU’nun tespit edilmesine izin vermek için sert DNA denatürasyon prosedürlerine tabi tutulur6. Bu sert tedavi hücresel epitoplara zarar verebilir ve immünostainleme yoluyla numunenin daha fazla karakterizesini önleyebilir. EdU dahil ve daha sonra bakır katalize, ‘tıklama reaksiyonu’ ile küçük, hücre geçirgen, floresan etiketli azide boyaları ile tespit sert denatürasyon prosedürleri ihtiyacını ortadan kaldırır7. Bu nedenle, bu yöntem BrdU şirketleşme için daha pratik bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır.
Ayrıca, pH3 mitotik / M faz hücreleri8için güvenilir bir işaretleyici olarak tanımlanmıştır. Histone H3, geç G2 fazında erken M fazına kadar fosforilize olan ve anafaz8’insonuna doğru fosforilasyondan arındırılan DNA ilişkili bir çekirdek histone proteinidir. Standart immünostaining protokolleri kullanılarak pH3’ün tespit edilmesi için çeşitli ticari antikorlar kullanılabilir. Bu nedenle EdU ve pH3’ün çift boyanması, S fazındaki ve M fazlı hücrelerin tespitini sağlayacaktır. Ek olarak, G1 ve erken G2 fazındaki hücreler her iki belirteç için de olumlu leke olmaz.
Drosophila nural kök hücreler veya nöroblastlar (NB’ler), hücrelerin asimetrik olarak bölünerek aynı kendini yenileyen NB ve farklılaşma için yazılmış bir ganglion ana hücre (GMC) ürettiği iyi karakterize bir kök hücre modeli sunar9. Ek olarak, çeşitli genetik araçlar ve NB’ye özgü antikorlar bu sistemi genetik manipülasyon ve canlı hücre görüntüleme için uygun hale getirir. Sonuç olarak, çeşitli çalışmalar asimetrik bölünmeleri ve hücre kaderini belirlemeyi düzenleyen genleri incelemek içinNB’lerdenyararlanmıştır 9 . Larva beyninin merkezi beyninde (CB) ve optik lobunda (OL) farklı NB popülasyonlarıvardır 9; Mevcut çalışmada CB NB’ler kullanılmıştır. Bu üçüncü instar larva CB NB’ler, mitotik mil montajlarını düzenleyen faktörleri incelemek için de uygun olan büyük hücrelerdir. Hücre döngüsü ilerleme kusurlarını analiz etmek için bir protokol bu tür çalışmalarda hayati bir araç olacaktır.
Daha önce yayınlanan protokoller, EdU dahil ve algılama10için çeşitli Alexa Fluor boyaları ile etiketlenmiş çeşitli reaksiyon bileşenleri ve azide boyaları sağlayan Click-iT EdU Alexa Fluor Hücre Çoğalma Kiti gibi ticari kitler kullandı. Bununla birlikte, bu tür kitlerle birlikte verilen reaktifler, genellikle ikincil antikorlarla kullanılan bazı floresan etiketlerle uyumlu değildir. Bu EdU tespit kiti (Alexa Fluor 647-konjuge azide boyası ile birlikte verilen Click-iT EdU Alexa Fluor Hücre Çoğalma Kiti) Drosophila üçüncü instar larva NB’lerinde test edildi ve NB’ler için bir belirteç olan pH3 ve Miranda’ya karşı antikorlarla birlikte boyama denendi. Ayrıca, NBs11’inplazma zarında Miranda etiketlemesinin tespiti için Alexa Fluor 568 veya Cy3 etiketli ikincil antikorlar kullanılmıştır. Ancak EdU saptanması sonrasında immün yetinme yapılırken bu sekonder antikorlarla beklenen sinyal yoğunluğu ve lekelenme paterni (yayınlanmamış sonuçlar) gözlenmedi.
EdU kuruluşu için, Daul ve meslektaşları tarafından açıklanan protokol, larvaların EdU ve bromofenol mavisi (BPB)10ile karıştırılmış Kankel-Beyaz ortamı ile beslenmesini gerektiriyor. Larvalar, larva bağırsağı yutulması üzerine mavi rengiyle görülebilen EdU ve BPB çivili yiyeceklerle beslenir. Bu yöntem Mms19 fonksiyon kaybı (Mms19 P)üçüncü instar larvalarında EdU dahil için kullanılmış olsa da, Mms19P larvaları görünüşe göre larva bağırsağinde neredeyse hiç mavi renk tespit edildiği için beslenmedi (yayınlanmamış sonuçlar). Mms19P larvaları sert gelişimsel deformiteler gösterir ve sonunda üçüncü başlangıç aşamasında tutuklanır. Bu bir şekilde üçüncü instar larvaların beslenme davranışını etkileyebilir ve EdU besleme protokolünü bu gibi durumlar için uygun hale getirebilir.
Mevcut literatürü inceledikten ve temel adımların standartlaştırılması üzerinde kapsamlı bir şekilde çalıştıktan sonra, Drosophila NBs’de EdU/ pH3 çift etiketleme için alternatif bir yaklaşım önerildi, bu da EdU’yu larvalara beslemeyi gerektirmez. Önceki bir çalışmada, NB’lerdeki hücre döngüsünü analiz etmek için çift EdU / pH3 boyama kullanıldı, ancak ayrıntılı bir protokol sunmadı4. Bu, bu yöntemi uygulamaya çalışan laboratuvarlar için gereksiz bir engel sunar. Ayrıca, çeşitli reaktiflerin EdU kiti ile uyumluluğunu değerlendirmek ve daha fazla optimizasyon yapmak zaman alıcı bir süreç olabilir. Bu makale, parçalanmış larva beyinlerinde EdU birleşmesini ve anti-pH3 antikorları ile immünostainingi kapsayan adım adım bir protokol sunar, ardından NB’leri dört ayrı kategoriye ayırmak için konfokal mikroskopi ve görüntü analizi: G0/G1 fazı, S fazı, S>G2/M (S’den G2/M’ye ilerleme) ve M fazı. En iyi duruma getirilmesi gereken adımlar özetlenir ve büyük veri kümelerinin görüntü analizi için ipuçları sağlanır. Ek olarak, vahşi tip NB’lerdeki EdU/pH3 okuması analiz edilir ve yakın zamanda hücre döngüsü gecikmesi gösterdiği bildirilen Mms19P NB’lerle karşılaştırılır11.
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU şirketleşme ve hücre geçirgen azide ile sonraki ‘tıklama’ reaksiyonu, bu tekniğin daha önce kullanılan BrdU yöntemine göre pratik avantajlarını sunar7. Bununla birlikte, bu reaksiyon Cu(I) iyonları tarafından katalizöre edilir ve Click-it EdU kit üreticisi tarafından açıkça tavsiye edildiği gibi, bu bakır katalizörün varlığında birkaç boya kararsız olabilir. EdU algılama adımının gerçekleştirilmesinden sonra immünostaining deneyleri yapıldığı zaman, kır…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (proje hibe 31003A_173188; www.snf.ch) ve Bern Üniversitesi’nden (www.unibe.ch) BS’ye fon sağlanmasıyla desteklendi. Fon sağlayıcılar çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır.
Materials
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
