Summary
使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和磷酸化组蛋白H3（pH3）标记进行细胞周期分析是一个多步骤程序，可能需要广泛的优化。在这里，我们提出了一个详细的方案，描述了该过程的所有步骤，包括图像分析和定量，以区分不同细胞周期阶段的细胞。
Abstract
体内 细胞周期进展分析通常在调节有丝分裂和DNA复制的基因研究中进行。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）已被用于研究复制性/S相进展，而针对磷酸组蛋白H3的抗体已被用于标记有丝分裂细胞核和细胞。两种标签的组合将能够对G0 / G1（间隙期），S（复制性）和M（有丝分裂）相进行分类，并作为评估有丝分裂基因敲低或零突变体对细胞周期进展的影响的重要工具。然而，用于标记EdU标记细胞的试剂与几种二抗荧光标记不相容。这使得免疫染色复杂化，其中原代和标记的二抗用于标记pH3阳性有丝分裂细胞。本文描述了 果蝇 幼虫神经干细胞中EdU和pH3双重标记的分步方案，该系统被广泛用于研究有丝分裂因子。此外，还提供了用于图像分析和定量的方案，以分配3个不同类别的标记细胞，G0 / G1，S，S，S>G2 / M（从S到G2 / M的进展）和M相。
Introduction
细胞分裂周期包括G1期（第一间隙期），复制期/S期，G2期（第二间隙期）和M期（有丝分裂期）。通过这些阶段，细胞经历细胞转录，翻译和细胞骨架机制1，2的重组发生巨大变化。作为对发育和环境线索的反应，细胞可能暂时停止分裂并变得静止（G0）或分化并永久停止分裂3。其他情况，如DNA损伤，可能导致过早分化或凋亡3，4。对这些线索的反应由细胞周期检查点介导，其充当监视系统，以确保细胞进入分裂周期5的下一阶段之前基本细胞过程的完整性。因此，对调节DNA复制，检查点和有丝分裂机制的基因的研究需要分析突变细胞中或siRNA敲低这些基因时可能发生的细胞周期进展缺陷。此外，这种分析可用于测试整体细胞健康以及细胞对药物治疗的反应。
5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）是一种胸腺嘧啶类似物，在复制过程中掺入DNA6。该方法被广泛用于鉴定S期细胞。然而，然后将细胞进行苛刻的DNA变性程序，以允许通过使用抗BrdU抗体6来检测BrdU。这种苛刻的处理可能会损害细胞表位，并阻止通过免疫染色进一步表征样品。EdU掺入和随后通过铜催化的"咔哒反应"与小的，可渗透的，荧光标记的叠氮化物染料进行检测，消除了对苛刻变性程序的需要7。因此，这种方法成为BrdU合并的更实用的替代方案。
此外，pH3已被描述为有丝分裂/M相细胞8的可靠标志物。组蛋白H3是一种DNA相关的核心组蛋白，在G2期晚期至M期早期左右磷酸化，并在8期末期脱磷酸化。几种商业抗体可用于使用标准免疫染色方案检测pH3。因此，EdU和pH3的双重染色将能够检测S相和M相的细胞。此外，G1和早期G2期的细胞不会对任何一种标志物进行阳性染色。
果蝇 神经干细胞或神经母细胞（NBs）提供了一种表征良好的干细胞模型，其中细胞不对称地分裂以产生一个相同的自我更新NB和一个神经节母细胞（GMC），其注定要分化9。此外，几种遗传工具和NB特异性抗体使该系统适用于遗传操作和活细胞成像。因此，一些研究利用NB来研究调节不对称分裂和细胞命运决定的基因9。在幼虫脑的中央脑（CB）和视叶（OL）中存在不同的NB种群9;CB NB用于本研究。这些三龄幼虫CB NBs是大细胞，也适用于研究调节有丝分裂纺锤体组装的因素。分析细胞周期进展缺陷的方案将是此类研究的重要工具。
先前发布的实验方案采用商业试剂盒，如Click-iT EdU Alexa Fluor Cell增殖试剂盒，其提供几种反应组分和用各种Alexa Fluor染料标记的叠氮化物染料，用于EdU掺入和检测10。然而，与此类试剂盒一起提供的试剂与通常与二抗一起使用的一些荧光标签不相容。该EdU检测试剂盒（Click-iT EdU Alexa Fluor细胞增殖试剂盒，随Alexa Fluor 647偶联叠氮化物染料一起提供）在 果蝇 三龄幼虫NB中进行了测试，并尝试使用针对pH3和Miranda（一种NB标记物）的抗体进行共染色。此外，Alexa Fluor 568或Cy3标记的二抗用于检测NB11质膜上的Miranda标记。然而，在EdU检测后进行免疫染色时，这些二抗未观察到预期的信号强度和染色模式（未发表的结果）。
对于EdU掺入，Daul及其同事描述的方案需要用与EdU和溴酚蓝（BPB）混合的Kankel-White培养基喂养幼虫10。幼虫以EdU和BPB刺激的食物为食，在幼虫肠道中摄入时可以通过其蓝色看到。虽然这种方法被用于将EdU掺入 Mms19 功能丧失（Mms19P）三龄幼虫中，但 Mms19P 幼虫显然没有进食，因为在幼虫肠道中几乎没有检测到任何蓝色（未发表的结果）。 Mms19P 幼虫表现出剧烈的发育畸形，最终在第三龄期停滞。这可能会以某种方式影响三龄幼虫的摄食行为，并使EdU喂养方案不适合这种情况。
在研究了现有文献并广泛研究了基本步骤的标准化之后，提出了一种替代方法，用于果蝇NB中的EdU / pH3双标记，这不需要将EdU喂养到幼虫。之前的一项研究采用双EdU / pH3染色来分析NB中的细胞周期，但没有提供详细的方案4。这为尝试实现此方法的实验室带来了不必要的障碍。此外，评估各种试剂与EdU试剂盒的相容性并进行进一步优化可能是一个耗时的过程。本文提出了一个分步方案，涵盖了在解剖的幼虫脑中掺入EdU和用抗pH3抗体进行免疫染色，然后进行共聚焦显微镜和图像分析，将NB分配到四个不同的类别：G0 / G1期，S期，S>G2 / M（从S到G2 / M的进展）和M期。概述了需要优化的步骤，并提供了有关大型数据集的图像分析的提示。此外，还分析了野生型NB中的EdU / pH3读数，并将其与Mms19P NBs进行了比较，Mms19 P NB最近报道显示细胞周期延迟11。
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Protocol
1. 用于即点式EdU测定的试剂和储备的制备
注：有关试剂盒和试剂盒随附试剂盒的详细信息，请参阅材料表和表1。
- 在准备溶液之前，将小瓶置于室温。
- 通过加入2mL二甲基亚砜（DMSO，组分C）来制备10mM EdU（组分A）储备溶液。充分混合并储存在-20°C。
- 通过加入70μLDMSO（组分C）制备Alexa Fluor 647-叠氮化物（组分B）的工作溶液。充分混合并储存在-20°C。
- 通过将4mL该溶液与36mL去离子水混合来制备1x Click-iT EdU反应缓冲液（组分D）溶液。将剩余的溶液储存在2-6°C。
- 通过加入2 mL去离子水，制作10倍的Click-iT EdU缓冲液添加剂（组分F）的储备（200mg / mL）。充分混合并储存在-20°C。
- 将Hoechst 33342（组分G）储存在2-6°C。 将DMSO（组分C）储存在-20°C的干燥器中。
注意：应使用手套来处理DMSO和Hoechst。
2. 三龄幼虫脑的解剖及EdU掺入
注意：脑部解剖方案在前面已经描述过了12.在开始解剖之前，请确保按照2.6和3.1中所述准备并解冻足够量的EdU和PFA溶液。
- 通过加入25.6克Na 2 HPO 4 .7H20，80克NaCl，2克KCl和2克KH2PO4至1升去离子水，制备10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）。将pH值调节至7.4，随后在去离子水中制备1x溶液。
- 将施耐德解剖介质（SM）加入玻璃（3或9）凹陷玻璃点板的两个连续凹陷中。将 1 倍 PBS 添加到下一个连续的抑郁中。
- 使用一对镊子，挑选游荡的三龄幼虫，并放在用PBS润湿的纸巾上，以清除苍蝇的食物残留物。将幼虫置于PBS的抑郁症中，然后与SM一起置于连续的抑郁症中。
- 使用一对细镊子，去除幼虫下半身的3/4。
- 用一对镊子轻轻抓住幼虫嘴钩，并用另一对镊子将角质层固定在另一端。
- 通过将嘴钩向内推并同时剥离另一端的组织，将幼虫头从内向外翻转。
- 观察附着假想盘的幼虫大脑。去除附着在大脑上的其他组织，并将大脑转移到下一个连续的SM抑郁症。
- 解冻10 mM EdU储备溶液。通过将10mM储备液稀释在SM中来制备100μM溶液。
- 将100μL这种100μM EdU + SM溶液加入Pyrex板上的另一个凹陷中。在100μL的100μM EdU + SM溶液中孵育〜5-10个解剖的大脑，在25°C下孵育2小时。
注意：由于NB在〜2小时内分裂一次，该协议旨在分析一个完整的细胞周期。只使用完整的大脑进行进一步的步骤。丢弃在解剖过程中受损的大脑。
3. 固定和免疫染色
- 在通风橱中制备4%多聚甲醛（PFA）溶液。
- 将4g多聚甲醛粉末加入80mL的1x PBS中，放入放置在磁力搅拌器上的烧杯中，并加热至60°C。 要溶解PFA，加入几滴1 N NaOH。检查pH值，如果需要，用几滴1 M HCl调节至7.0。
- 使用 1 倍 PBS 将音量调节至 100 mL。等分PFA溶液并在2-6°C下储存长达1个月。在PFA溶液中加入0.3%的非离子洗涤剂（见 材料表），以有效固定大型组织，如幼虫脑。
- EdU掺入后，将大脑转移到含有4%PFA的0.6mL微量离心管中。在螺母器上室温孵育15分钟。轻拍实验室工作台上的管子，使大脑在管子的底部稳定下来。
- 取出PFA，在室温下用PBS + 0.3%非离子洗涤剂（PBST）洗涤3次。确保每次洗涤在螺母上持续至少10分钟。最后一次洗涤后，除去PBST，加入封闭溶液（PBST + 5%牛血清白蛋白），并在室温下孵育30分钟。
- 将抗米兰达抗体（1：250）和抗pH3抗体（1：200）稀释在PBST中（两种抗体在同一管中）。除去封闭缓冲液，加入一抗溶液。在螺母上在2-6°C孵育过夜。
注意：Miranda是CB NBs上的膜蛋白。它用于识别CB区域13中的这些大圆形细胞。 - 取出一抗溶液，用PBST洗涤3次。确保每次洗涤在室温下在螺母上持续10分钟。
- 通过在PBST中加入1：500稀释的Alexa Fluor 488抗兔和Alexa Fluor 568抗大鼠来制备二抗溶液。取出PBST，并将二抗溶液加入解剖的大脑中。在黑暗中在2-6°C下在螺母上孵育过夜，并用PBST洗涤3次（步骤3.5）。
4. EdU 检测、DNA 染色和安装
- 要制备EdU检测鸡尾酒，请将组分（见 表2）混合在1.5 mL管中。
- 在最后一次洗涤（步骤3.6）后，取出PBST，并将EdU检测鸡尾酒添加到解剖的大脑中。在室温下在黑暗中在螺母上孵育30分钟。在黑暗中用PBST洗涤2次，每次10分钟。
- 对于DNA染色，将Hoechst 33342（组分G）1：2，000稀释在PBST中，以制备5μg/ mL溶液。
- 第二次洗涤后除去PBST（步骤4.2），并向解剖的大脑中加入500μL5μg/ mL Hoechst溶液。在黑暗中孵育10分钟，取出Hoechst，用PBST清洗一次，每次10分钟。
- 将管子敲到实验室工作台上，让大脑安定下来。从试管中取出PBST，但只留下50-100μL。
- 切下200μL微量移液器尖端的末端，并小心地将大脑转移到干净的载玻片上。通过用滤纸条印迹从载玻片中取出多余的PBST。小心不要让滤纸接触到大脑。
- 将一滴水溶性、非荧光的安装介质滴到大脑上，并调整大脑方向，使腹侧神经索面向载玻片，叶朝上。将大脑排列在单个文件中，以便更容易地连续成像大脑。
- 轻轻地将盖玻片放在大脑的顶部。将载玻片置于2-6°C过夜。
注意：安装介质在过夜储存后会变硬，因此无需用指甲油密封盖玻片。
5. 成像
注：有关本方案中使用的激光扫描显微镜和油浸物镜的详细信息，请参见 材料表 。
- 从 采集 软件中，选择 63x 物镜。
- 在安装的大脑正上方的盖玻片上滴一滴浸没油，以便更容易通过目镜定位组织。
- 使用DAPI/Hoechst 33342通道，通过目镜找到大脑，然后在软件中切换到 采集模式 。
- 设置 4 个通道来对 Hoechst 33342 （DNA）、Alexa Fluor 488 （pH3）、Alexa Fluor 568 （Miranda） 和 Alexa Fluor 647 （EdU） 进行成像。使用 染料助手 工具，该工具可自动为所选染料设置激发激光器和发射滤光片。
- 设置视野，使其包含整个脑叶。通过获取间隔为0.8μm的z-stack来成像脑叶的整个体积。以 *.lif 库 格式存储映像会话中的所有图像。
6. 图像分析
注意：以下步骤描述了对采集图像的分析，以及如何使用ImageJ软件将细胞分为G0 / G1相，S>G2 / M（从S到G2 / M的进展）和M相。
- 从以下 URL 下载斐济（斐济是 ImageJ）：https://fiji.sc/。打开斐济，然后将.lif文件拖放到斐济。
注意：斐济是ImageJ的一个版本，预装了几个插件14。将.lif文件传输到斐济将打开Bio-formats插件，这是处理.lif文件所必需的。生物格式插件也需要打开从其他一些显微镜品牌生成的图像文件，例如，从尼康显微镜生成的nd2文件。此插件预装了斐济。 - 从堆栈查看选项卡中选择数据浏览器，然后从 bio-formats 插件的内存管理选项卡中使用虚拟堆栈。
注意：具有 8-10 个大脑的 z 堆栈的 Lif 文件的大小通常为 300-400 MB。在 RAM 较低的计算机上，打开一些此类文件会迅速耗尽 ImageJ 上的可用 RAM，并阻止任何进一步的图像处理。虚拟堆栈是"只读"的，不需要高RAM进行处理，是将大型数据集加载到斐济的理想选择。 - 观察 ImageJ 中显示的多通道图像。使用图像|颜色 |通道工具从菜单栏中更改通道的颜色。观察米兰达标记的NB作为CB区域中的大圆形细胞。
- 在每个 NB 上使用 椭圆 工具绘制感兴趣区域 （ROI），以避免将 NB 计数两次。
- 从ImageJ 菜单栏中，选择"分析|工具|投资回报率经理.标记当前 z 截面中的所有 NB，并在标记每个单元格后按t。
- 一旦标记了当前z截面中的所有NB，将通道更改为pH3和EdU，并手动计数EdU阳性NB，pH3阳性NB的数量，EdU和pH3染色阳性的NB的数量，以及NB未对两种标记物染色。
- 在随后的 z 部分中搜索 NB，删除旧的 ROI，并添加新的 ROI 以计算不同堆栈中的 NB。
- 准备一个以下列的电子表格： 1.EdU-pH3-：此部分代表处于细胞周期G0 / G1阶段的双阴性细胞;2. EdU+：该类别中的细胞已经掺入了EdU，并且正在经历DNA复制（S期）;3. EdU+ pH3+：这些双阳性细胞已完成S期，并已进展到G2或M期;4. pH3+：这些NB正在经历有丝分裂。
- 计算每个波瓣在上述所有4个类别中存在的NB的百分比。使用电子表格软件准备条形图，显示每个类别中NB百分比的池化数据。
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Representative Results
双叶 果蝇 第三龄幼虫脑已被用作研究基本细胞和发育过程的模型系统9。当前研究的重点是提出一种方案，用于分析CB区域EdU和pH3标记NB的细胞周期进展（图1）。CB NB细分为I型和II型，它们显示出特征性的不对称分割模式9。每个I型NB分区都会生成一个能够自我更新的NB，以及另一个注定用于分化9的GMC。相比之下，II型NB产生运输扩增，未成熟的神经祖细胞（INPs），其自我更新并产生2个GMC9。虽然OL地区存在独特的NB群体，但本研究的重点是CB NB，其体积大且易于识别NB特异性标记。
在这项研究中，Miranda用于识别和分析CB NB（图2）。尽管Miranda也染色OL中的其他细胞群，但CB NB可以与Miranda识别，因为它们的尺寸大且CB位置为13。其他更具体的标记也可用于标记CB NB，例如Deadpan，它是调节NB自我更新的转录因子。然而，由于pH3和EdU都标记染色质，因此使用膜标记Miranda来更容易地可视化和分析标有pH3和EdU的NB。EdU掺入，随后的检测以及通过免疫染色和图像分析进一步表征是一个复杂的过程。重要的是要标准化每个步骤，以确定最佳的染色和成像条件。虽然一些已发布的报告介绍了EdU / pH3标记策略，但这些报告并未详细说明优化和图像分析步骤。 图 1 中概述的工作流程总结了从 EdU 合并到图像分析的步骤。
我们最近表征了Mms19基因，这是NB正常有丝分裂进展所需的11。通过活细胞成像分析，缺乏功能的NB Mms19被证明需要两倍于野生型NB的时间来完成有丝分裂。这在EdU/pH3分析中得到了明显的反映，其中发现Mms19P NB的比例明显高于野生型NB（图3A）。Mms19：：eGFP融合蛋白在Mms19P背景中的表达已被证明可以挽救表型缺陷11，15。这与细胞周期进展分析的结果密切相关，其中M期细胞的比例在Mms19：：eGFP表达时在Mms19：：eGFP表达时被挽救到野生型水平（图3A，B）。
图 1：EdU/pH3 双标记的简化工作流程。 解剖三龄幼虫脑，用100μM EdU孵育2小时。随后，用PFA固定脑组织，并用针对Miranda和pH3的抗体进行免疫染色。在共聚焦显微镜上获得染色大脑的图像，并用ImageJ / Fiji进一步处理，以将细胞分配到不同的细胞周期阶段。缩写： EdU = 与 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;pH3 = 磷酸组蛋白 H3;PFA = 多聚甲醛;SM = 施耐德解剖培养基;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;PBST = PBS + 0.3%非离子洗涤剂;BSA = 牛血清白蛋白。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：将电池分配到G1 / G0;S;S>G2/M 和 M 相位。细胞通过G1，S，G2和M阶段进行，以完成完整的细胞周期。来自游荡的三龄幼虫脑的CB NBs用Miranda（红色），EdU（灰色），pH3（绿色）标记，DNA用Hoechst 33342（蓝色）标记。在ImageJ中分析标记的NB，并根据它们是否对（A）EdU和pH3（G1 / G0），（B）仅EdU（S相），（C）EdU和pH3（S>G2/ M）和（D）仅pH3（M相）染色阳性，将其分配到4个不同的相。此处显示了仅来自野生型大脑的单个NB的示例。比例尺 = 5 μm。缩写： CB = 中枢脑;NB = 神经母细胞;EdU = 与 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;pH3 = 磷酸组蛋白 H3。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：Mms19P对NB细胞周期相位分布的影响。（A） 在分析野生型 （w;+;+） NB 后，发现约 25% 的 NB 处于 M 相。然而，在Mms19P NB中，这一比例增加到近40%。Mms19：：已知Mms19P背景中的eGFP表达可以挽救Mms19P表型，并且该背景中M相NB的比例与野生型相当。（B） 比较了与细胞周期相G1/G0、S、S>G2/M和M相对应的4个不同类别的NB百分比;Mms19P和Mms19：：eGFP， Mms19P基因型。与野生型NB相比，Mms19P NB中M相和G1/ G0相的比例差异很大。相比之下，Mms19：：eGFP，Mms19 P大脑中NB的细胞周期分布与野生型中的细胞周期分布相当。使用Kruskal-Wallis检验计算统计学意义，并使用Dunn的后检验比较多个列;（P<0.001）。此数字已从11 修改。缩写： NB = 神经母细胞;eGFP = 增强型绿色荧光蛋白;WT = 野生型。请点击此处查看此图的放大版本。
| 试剂 | 数量/体积 |
| 教育（构成部分A） | 5毫克 |
| Alexa Fluor 647 – 叠氮化物（组分B） | 1 个小瓶 |
| 二甲基亚砜（DMSO，组分C） | 4 毫升 |
| Click-iT EdU反应缓冲液（组分D） | 4 毫升 （10x 溶液） |
| 硫酸铜（CuSO4，组分E） | 100毫米;1 个小瓶 |
| Click-iT EdU 缓冲液添加剂（组分 F） | 400毫克 |
| 赫希斯特 33342 （组件 G） | 10 毫克/毫升水溶液，35 微升 |
表 1：EdU 套件组件。 Click-iT EdU Alexa Fluor Cell 增殖试剂盒提供的组件以及相应的量/体积。缩写：EdU = 与 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷。
| 反应组分 | 容积（毫升） |
| 1x Click-iT反应缓冲液（在步骤1.4中制备） | 430 |
| 铜溶体4 （组分 E） | 20 |
| Alexa Fluor 647 – 叠氮化物（组分B，在步骤1.3中制备） | 1.2 |
| 反应缓冲液添加剂（组分F，在步骤1.5中制备） | 50 |
| 总体积 | ~500 |
表2：EdU检测鸡尾酒的制备。 通过混合试剂盒组分的指定体积（在第2节中制备）来制备EdU检测鸡尾酒。缩写：EdU = 与 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷。
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Discussion
与先前使用的BrdU方法相比，EdU掺入及其随后与细胞渗透性叠氮化物的"咔哒"反应提供了该技术的实际优势7。然而，该反应是由Cu（I）离子催化的，并且几种染料在该铜催化剂的存在下可能不稳定，正如Click-it EdU试剂盒制造商明确建议的那样。在执行EdU检测步骤后进行免疫染色实验时，使用红色通道染料Alexa Fluor 568和Cy3未观察到预期的信号强度。然而，当免疫染色反应在EdU检测步骤之前完成时，该协议起作用。通过该协议，使用四个通道来可视化Hoechst，pH3，Miranda和EdU。
该协议中另一个优化的步骤是解剖大脑吸收EdU，而不是将EdU加刺的苍蝇食物喂给幼虫。由于整个 果蝇 NB细胞周期持续约2-2.5小时16，大脑摄取EdU2.5小时，如本方案所示，能够跟踪NB的一个完整细胞周期。在第三龄幼虫的情况下，其中NB正在积极分裂，这些静息细胞很可能处于细胞周期的G1阶段。然而，从胚胎晚期到早期第二龄阶段，NB暂时静止17。在这些早期发育阶段，双阴性染色很可能代表G0/静止阶段。
经历DNA复制的NB应对EdU进行阳性染色，而从S期（EdU掺入）进展到晚期G2或M期的细胞应对EdU和pH3均进行阳性染色。然而，使用该方案很难表征G2相，因为早期G2细胞对EdU或pH3的染色不呈阳性。然而，掺入EdU并已进展到早期G2的细胞也会对EdU产生阳性染色，并可能使G2阶段的分析复杂化。几种抑制DNA复制的药物在S期18，19，20处导致细胞周期停滞。该协议可能是分析和鉴定此类药物治疗效果的便捷工具，因为在这种情况下，S期阻断细胞不会进展到M期，并且EdU，pH3双阳性细胞的比例会降低甚至不存在。
在最近发表的一项研究中，我们评估了Mms19基因对NB11中有丝分裂进展的影响。通过活细胞成像，我们证明了Mms19P NB在M相进展中的显着延迟。虽然野生型NB在大约10分钟内完成M阶段，但Mms19PNB花费了大约两倍的时间来完成M阶段11。因此，这种EdU / pH3双标记方案也反映了有丝分裂延迟，因为我们观察到Mms19P大脑中pH3阳性染色的NB数量几乎是野生型大脑的1.5倍。因此，来自该EdU协议的数据可与直接活细胞成像结果相媲美。由于这种直接的活细胞方法非常耗时且需要广泛的优化，因此该方案可用于对此类细胞周期突变体进行快速初始筛选，以了解特定阶段的缺陷。一旦确定了感兴趣的相，就可以通过直接的细胞可视化测定进行后续操作。
细胞周期阶段的持续时间在不同的细胞类型和发育阶段之间可能会有很大差异。例如，在发育中的果蝇胚胎中，有丝分裂激酶的下调导致S期的持续时间延长，而在注定分化的细胞中，例如雪貂（Mustela putorius furo）脑神经祖细胞，S期持续时间明显短21，22。因此，EdU脉冲标记时间应根据给定细胞类型中S和G相的长度进行优化。EdU脉冲的持续时间也取决于实验目标，例如，短脉冲足以测量当前处于S期的细胞比例，而较长的脉冲可以分析细胞通过S期的进展。
对EdU脉冲的广泛优化也可以估计S相位，正如Pereira及其同事23所优雅地证明的那样。这些研究人员展示了一种基于流式细胞术的新型方法，其中HCT116细胞用EdU脉冲标记增量时间段。作者证明，当脉冲时间与S相位23的长度相匹配时，获得EdU的最大荧光强度。此外，对EdU标记细胞的时间进展的分析也使G1和G2 / M相的定量成为可能。虽然目前的EdU/pH3双标记方案能够分析S和M相缺陷，但用这种方案无法测量相的精确持续时间。Pereira及其同事描述的方案可能是需要测定细胞周期相长的测定的合适替代方案。使该协议具有额外的pH3标记，也可能导致检测M相细胞的更高灵敏度。
除了EdU / pH3方法外，基于双凝素的f luorescent u细胞周期指示剂（FUCCI）方法也被用于研究哺乳动物细胞以及果蝇组织中的细胞周期进展24，25。该系统利用两种荧光标记的蛋白质，geminin和Cdt1，它们分别含有APC / C和SCFSkp2特异性泛素化和蛋白酶体降解的基序。由于APC / C仅从有丝分裂末端到G1具有活性，并且SCFSkp2在S和G2相中具有活性，因此荧光标记的geminin和Cdt1的细胞周期阶段特异性降解能够确定细胞周期阶段24。稍微修改的果蝇组织的"Fly-FUCCI"方法依赖于荧光标记的Cyclin B和E2F1，它们分别被APC / C（有丝分裂期间）和CRL4Cdt2（在S期发病期间）降解25。先前的一项研究表征了果蝇幼虫NB响应于非整倍性的过早分化，通过Fly-FUCCI和EdU / pH3方法4分析了细胞周期缺陷。非整倍性诱导NB的过早分化，因此，很大一部分NB退出细胞周期。
这在Fly-FUCCI和EdU / pH3数据4中均得到准确反映。因此，从EdU / pH3方法获得的数据也可与其他细胞周期跟踪方法（如Fly-FUCCI）相媲美。Fly-FUCCI是一种功能强大的工具，所有具有无处不在的荧光标记物或与组织特异性启动子融合的标记物的苍蝇库存都可以从储备中心获得。然而，使用这些构建体来分析空突变体中的细胞周期缺陷或siRNA敲低将涉及遗传重组，以创建携带FUCCI元件，组织特异性驱动因素，特定突变或感兴趣的siRNA的苍蝇种群。这个过程会将实际实验延迟数周，而EdU / pH3方法可以很容易地应用于具有遗传零背景的飞线。或者，对于siRNA敲低，可以使用驱动原液和siRNA培养基之间的一步交叉进行EdU / pH3分析。
这种方法的一个缺点是成像和图像分析管道，它涉及手动定量来自多个大脑样本的大量细胞。最近，流式细胞术方法已被提出作为用于细胞周期分析的传统基于显微镜的测定的高通量替代方案26。使用这种方法同时快速分析数千个细胞是有利的，并且检测多种标记物的能力可以定量特定的细胞类型。虽然易于与培养的细胞系一起使用，但该协议可能难以应用于大型组织样品，例如果蝇幼虫脑。然而，已经发表了一些方案，描述了通过流式细胞术对分离的幼虫NB进行脑组织解离和分析27，28。在这个方向上的进一步创新方法可能为果蝇组织中的高通量细胞周期分析提供新的机会。
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Disclosures
作者宣布不存在相互竞争的利益。
Acknowledgments
这项工作得到了瑞士国家科学基金会（项目赠款31003A_173188;www.snf.ch）和伯尔尼大学（www.unibe.ch）对理学学士的资助。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
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