Summary
5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU) 및 인산히스톤 H3(pH3) 라벨링을 함유한 세포 주기 분석은 광범위한 최적화를 요구할 수 있는 다단계 절차이다. 여기서는 상이한 세포 주기 단계에서 세포를 구별하기 위해 이미지 분석 및 정량화를 포함한 이 절차에 대한 모든 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
생체 내 세포 주기 진행 분석은 미토시스 및 DNA 복제를 조절하는 유전자에 대한 연구에서 일상적으로 수행됩니다. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)는 복제 /S 상 진행을 조사하기 위해 활용된 반면 인 - 히스톤 H3에 대한 항체는 미토틱 핵및 세포를 표시하는 데 활용되었습니다. 두 라벨의 조합은 G0/G1(갭 상), S(복제), M(미토틱) 단계의 분류를 가능하게 하고 세포 주기 진행에 미토성 유전자 녹다운 또는 null 돌연변이체의 효과를 평가하는 중요한 도구로 작용합니다. 그러나, EdU 라벨이 부착된 세포를 표시하는 데 사용되는 시약은 여러 이차 항체 형광 태그와 호환되지 않습니다. 이것은 pH3 양성 미토아 세포를 표시하기 위하여 1 차적이고 태그된 이차 항체가 이용되는 면역 염색을 복잡하게 합니다. 이 논문은 드로소필라 애벌레 신경 줄기 세포에서 EdU와 pH3의 이중 라벨링을 위한 단계별 프로토콜을 설명하며, 이는 미토Tic 요인을 연구하기 위해 광범위하게 활용된 시스템입니다. 또한, 이미지 분석 및 정량화를 위해 3개의 별개의 범주, G0/G1, S, S>G2/M(S에서 G2/M로진행) 및 M 상에 표지된 셀을 할당하기 위한 프로토콜이 제공됩니다.
Introduction
상기 세포 분열 주기는 G1 상(제1 갭상), 복제/S-phase, G2(제2 갭 상), 및 M(미토틱) 위상을 포함한다. 이러한 단계를 통과하면 세포는 세포 전사, 번역 및 세포 켈레탈기계1,2의재구성에 극적인 변화를 겪습니다. 발달 및 환경 단서에 응하여, 세포는 일시적으로 분할을 중단하고 정지(G0)가 되거나 분화하고 영구적으로3를분할하는 것을 중단할 수 있다. DNA 손상과 같은 다른 시나리오는 조기 분화 또는세포멸을일으킬 수 있습니다3,4. 이러한 단서에 대한 반응은 세포 주기 검사점에 의해 중재되며, 이는 세포가 분할 주기5의다음 단계에 커밋하기 전에 필수 세포 프로세스의 무결성을 보장하기 위해 감시 시스템역할을 한다. 따라서 DNA 복제, 검사점 및 미토틱 기계를 조절하는 유전자에 대한 연구는 돌연변이 세포 또는 이러한 유전자의 siRNA 녹다운 시 발생할 수 있는 가능한 세포 주기 진행 결함을 분석해야 합니다. 추가적으로, 그 같은 분석은 약물 치료에 대한 세포 반응뿐만 아니라 전반적인 세포 건강을 테스트하기 위해 사용될 수있다.
5-브로모-2'-데옥시리딘(BrdU)은 복제6동안 DNA에 통합되는 티미딘 아날로그이다. 이 방법은 S-phase에서 세포를 식별하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 그러나, 세포는 그 때 반대로 BrdU 항체 6의 사용을 통해 BrdU의 검출을 허용하기 위하여 가혹한 DNA 변성 절차를 복종한다6. 이 가혹한 처리는 세포 전형을 손상하고 면역 염색을 통해 견본의 추가 특성화를 방지할 수 있습니다. EdU 는 구리 촉매에 의한 후속 검출, 작은 세포 투과성, 형광 태그 아지드 염료로 '클릭 반응'은 가혹한 변성 절차7의필요성을 제거합니다. 따라서 이 방법은 BrdU 통합에 대한 보다 실용적인 대안으로 부상했습니다.
또한, pH3는 미토틱/M상세포(8)에대한 신뢰할 수 있는 마커로 기재되었다. 히스톤 H3는 후기 G2 상에서 초기 M 상으로 인광되는 DNA 관련 코어 히스톤 단백질로, 아나상8의끝을 향해 탈인된다. 몇몇 상업적인 항체는 표준 면역 염색 프로토콜을 사용하여 pH3를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 따라서 EdU 및 pH3의 이중 염색은 M-phase뿐만 아니라 S 상에서 세포의 검출을 가능하게 합니다. 추가적으로, G1 및 초기 G2 상에 있는 세포는 마커의 둘 다에 대해 긍정적으로 얼룩지지 않을 것입니다.
Drosophila 신경 줄기 세포 또는 신경 폭발 (NBs)는 세포가 비대칭적으로 분할하여 1 개의 동일한 자기 갱신 NB및 신경절 모세포 (GMC)를 생성하는 잘 특징적인 줄기 세포 모델을 제공하며, 이는 분화9에대해 지방이 된다. 추가적으로, 몇몇 유전 공구 및 NB 특정 항체는 유전 조작 및 살아있는 세포 화상 진찰에 적합한 이 시스템을 만듭니다. 따라서, 몇몇 연구 결과는 비대칭 분열 및 세포 운명 결정결정 9를통제하는 유전자를 연구하기 위하여 NB를 이용했습니다. NB의 뚜렷한 인구는 중앙 뇌 (CB) 및 애벌레 뇌의 광학 엽 (OL)에존재9; CB NB는 현재 연구에 사용되었습니다. 이 세 번째 인스타 애벌레 CB NB는 또한 미토틱 스핀들 조립을 조절하는 요인을 연구하는 데 적합한 큰 세포입니다. 세포 주기 진행 결함을 분석 하는 프로토콜 이러한 연구에서 중요 한 도구가 될 것 이다.
이전에 발표된 프로토콜은 EdU 통합 및검출(10)에대한 다양한 알렉사 플루오르 염료로 태그된 여러 반응 성분및 아지드 염료를 제공하는 Click-iT EdU Alexa Fluor 세포 증식 키트와 같은 상용 키트를 이전에 사용했다. 그러나, 이러한 키트와 함께 공급되는 시약은 종종 이차 항체와 함께 사용되는 일부 형광 태그와 호환되지 않는다. 이 EdU 검출 키트(알렉사 플루어 647-컨쥬게이트 아지드 염료와 함께 제공된 Click-iT EdU Alexa Fluor 세포 증식 키트)는 드로소필라 제3 인스타 애벌레 NBs에서 테스트되었으며, NB의 마커인 pH3및 Miranda에 대한 항체로 공동 염색을 시도하였다. 또한, 알렉사 플루어(568) 또는 Cy3 태그이 부착된 이차 항체는NBs(11)의혈장 막에 미란다 라벨링의 검출을 위해 사용되었다. 그러나, 예상 신호 강도 및 염색 패턴(미공개 결과)은 EdU 검출 후 면역염색이 수행되었을 때 이러한 이차 항체와 함께 관찰되지 않았다.
EdU 통합의 경우, Daul과 동료가 설명한 프로토콜은 EdU 및 브로모페놀 블루(BPB)10과혼합된 칸켈-화이트 배지로 애벌레를 먹이야 하였다. 애벌레는 EdU와 BPB 가시 식품에 먹이를 주었는데, 이는 애벌레 창자에 섭취시 청색으로 보일 수 있습니다. 이 방법은 Mms19 기능 상실(Mms19P)세 번째 인스타 애벌레에 EdU 편입에 사용되었지만, Mms19P 유충은 분명히 유충 장에서 검출된 거의 모든 파란색으로 공급되지 않았다 (공개되지 않은 결과). Mms19P 애벌레는 과감한 발달 기형을 보여주고 결국 세 번째 인스타 단계에서 체포됩니다. 이것은 어떻게 든 세 번째 인스타 애벌레의 먹이 행동에 영향을 미치고 EdU 공급 프로토콜이 그러한 경우에 적합하지 않게 만들 수 있습니다.
사용 가능한 문헌을 연구하고 필수 단계의 표준화에 광범위하게 작업 한 후, 드로소필라 NBs에서 EdU / pH3 이중 라벨링에 대한 대체 접근 법을 제안했으며, 이는 EdU를 유충에 공급할 필요가 없습니다. 이전 연구는 NBs에서 세포 주기를 분석하기 위해 듀얼 EdU/pH3 염색을 사용했지만 상세한 프로토콜4를제시하지 않았다. 이렇게 하면 이 메서드를 구현하려는 랩에 불필요한 장애물이 있습니다. 또한 EdU 키트와의 다양한 시약과의 호환성을 평가하고 추가 최적화를 수행하는 것은 시간이 많이 소요되는 과정이 될 수 있습니다. 이 논문은 EdU가 항 pH3 항체를 사용하여 해부된 애벌레 뇌에 대한 EdU 편입 및 면역 염색을 포함하는 단계별 프로토콜을 제시하고, 공초점 현미경 검사법과 이미지 분석을 통해 NB를 G0/G1 단계, S단계, S>G2/M(S에서 G2/M로 진행) 및 M상에 할당합니다. 최적화가 필요한 단계는 설명되고 큰 데이터 집합의 이미지 분석을 위해 제공되는 팁이 설명되어 있습니다. 또한, 야생형 NB의 EdU/pH3 판독편은 Mms19P NB와 비교하여 분석되고 비교되며, 이는 최근 세포 주기지연(11)을나타내기 위해 보고된 것으로 보고되었다.
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Protocol
1. 클릭 - it EdU 분석시 시약 및 주식 준비
참고: 키트와 함께 제공된 키트 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표 및 표 1을 참조하십시오.
- 솔루션을 준비하기 전에 바이알을 실온으로 가져옵니다.
- 디메틸설프리산화물(DMSO, 성분 C)의 2mL를 추가하여 10mM EdU(성분 A) 스톡 솔루션을 준비한다. 잘 섞어서 -20°C에 보관하십시오.
- DMSO(성분 C)의 70μL을 추가하여 알렉사 플루오르 647-아지드(component B)의 작업 용액을 준비한다. 잘 섞어서 -20°C에 보관하십시오.
- 이 솔루션의 4mL을 36mL의 탈온화 물과 혼합하여 Click-iT EdU 반응 버퍼(component D)의 1x 용액을 준비합니다. 나머지 용액을 2-6°C에 저장합니다.
- 2mL의 탈온화된 물을 추가하여 Click-iT EdU 버퍼 첨가제(component F)의 10배 스톡(200 mg/mL)을 만듭니다. 잘 섞어서 -20°C에 보관하십시오.
- 2-6°C에서 호흐트스트 33342(성분 G)를 저장합니다. DMSO(성분 C)를 -20°C의 건조기에 저장합니다.
참고: 장갑은 DMSO 및 Hoechst를 처리하는 데 사용되어야 합니다.
2. 제3의 별애자 뇌와 EdU 의 해부
참고: 뇌 해부 프로토콜은 이전에12로설명되었습니다. 해부를 시작하기 전에 2.6 및 3.1에 설명된 대로 충분한 양의 EdU 및 PFA 솔루션이 준비되고 해동되는지 확인합니다.
- 25.6g Na2HPO4.7H20, 80g NaCl, 2g KCl, 2g KH2PO4 ~ 1L의 탈이온화된 물 2g을 추가하여 10배 인산염 완충식(PBS)을 준비한다. pH를 7.4로 조정한 후 탈이온수에서 1배 용액을 준비한다.
- 슈나이더스 해부 매체(SM)를 유리(3또는 9) 우울증 유리 반점 판의 2회 연속 우울증에 추가한다. 다음 연속 우울증에 1 배 PBS를 추가합니다.
- 집게 한 켤레를 사용하여, 방황 세 번째 별 애벌레를 선택하고 플라이 음식 잔류물을 청소하기 위해 PBS로 젖은 조직에 배치합니다. PBS와 우울증에 유충을 배치 하 고 SM과 연속 우울증에.
- 미세 한 쌍의 집게를 사용하여 애벌레의 하반신의 3/4을 제거하십시오.
- 한 쌍의 포셉으로 애벌레 입 후크를 부드럽게 잡고 다른 쪽 끝에는 다른 쪽 끝에 표피를 잡아 버프를 잡습니다.
- 입 후크 안쪽을 밀고 동시에 다른 쪽 끝에 있는 조직을 벗겨내어 애벌레 머리를 안쪽으로 돌립니다.
- 부착 된 상상력 디스크와 애벌레 뇌를 관찰. 뇌에 부착 된 다른 조직을 제거하고, SM과 다음 연속 우울증에 뇌를 전송.
- 10m EdU 스톡 솔루션을 해동합니다. 이 10m m 스톡을 SM에 희석하여 100 μM 솔루션을 준비하십시오.
- 이 100 μM EdU+SM 용액의 100 μL을 Pyrex 플레이트의 또 다른 우울증에 추가합니다. 25°C에서 2시간 동안 100 μM EdU+SM 용액의 100 μL에서 ~5-10개의 해부된 뇌를 배양한다.
참고: NB가 ~2h에서 한 번 분할됨에 따라 이 프로토콜은 하나의 전체 세포 주기를 분석하는 것을 목표로 합니다. 추가 단계에만 손상되지 않은 뇌를 사용하십시오. 해부 중에 손상된 뇌를 폐기하십시오.
3. 고정 및 면역 염색
- 연기 후드에 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비합니다.
- 자성 교반기위에 놓인 비커에 1x PBS의 80mL에 파라포름알데히드 파우더 4g을 넣고 60°C로 가열합니다. PFA를 용해하려면 1 N NaOH 몇 방울을 추가하십시오. pH를 확인하고 필요한 경우 1 M HCl몇 방울로 7.0으로 조정하십시오.
- 1배 PBS로 볼륨을 100mL로 조정합니다. PFA 용액을 알리쿼트하고 최대 1개월 동안 2-6°C에 보관하십시오. PFA 솔루션에 0.3% 비이온 세제(재료표참조)를 추가하여 애벌레 뇌와 같은 대형 조직을 효율적으로 고정합니다.
- EdU 가 통합 된 후, 뇌를 0.6 mL 미세 원심 분리기 튜브로 전송하여 4 % PFA를 함유합니다. 15 분 동안 누두에 실온에서 배양. 뇌가 튜브 의 바닥에 정착할 수 있도록 실험실 벤치에 튜브를 누릅니다.
- PFA를 제거하고 실온에서 PBS + 0.3 % 비 이온 세제 (PBST)로 3 번 세척하십시오. 각 세척이 견과류에 10분 이상 지속되도록 하십시오. 마지막 세척 후, PBST를 제거, 차단 용액을 추가 (PBST + 5 % 소 세럼 알부민), 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
- PBST에서 항 미란다 항체(1:250) 및 항 pH3 항체(1:200)를 희석시(동일한 튜브내의 두 항체). 차단 버퍼를 제거하고 1차 항체 용액을 추가합니다. 영양사에 2-6 °C에서 하룻밤 을 배양.
참고: 미란다는 CB NB에 존재하는 막 단백질입니다. CB영역(13)에서이러한 큰 둥근 세포를 식별하는 역할을 한다. - 1 차적인 항체 용액을 제거하고 PBST로 3 번 세척하십시오. 각 세척이 실온에서 영양사에서 10 분 동안 지속되도록하십시오.
- PBST에 1:500 희석 알렉사 플루어 488 안티 래빗과 알렉사 플루어 568 안티 래터를 추가하여 이차 항체 용액을 준비한다. PBST를 제거하고 해부된 뇌에 이차 항체 용액을 추가합니다. 어둠 속에서 2-6°C에서 하룻밤 동안 배양하고, 영양가에, PBST (단계 3.5)로 3 번 세척한다.
4. EdU 검출, DNA 염색 및 장착
- EdU 검출 칵테일을 준비하려면 1.5mL 튜브에 부품(표 2참조)을 혼합합니다.
- 마지막 세척 후 (단계 3.6), PBST를 제거하고 해부 된 뇌에 EdU 검출 칵테일을 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 누양자에서 배양하십시오. 어둠 속에서 PBST로 2회 10분 씩 씻으시다.
- DNA 염색의 경우, 5 μg/mL 용액을 준비하기 위해 PBST에서 Hoechst 33342 (성분 G) 1:2,000을 희석하십시오.
- 제2 세척 후 PBST를 제거하고 (단계 4.2), 해부 된 뇌에 5 μg / mL Hoechst 용액의 500 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 10분 동안 배양하십시오.
- 실험실 벤치에 튜브를 누르고 뇌가 정착하게하십시오. 튜브에서 PBST를 제거하지만 50-100 μL만 남깁니다.
- 200 μL 마이크로파이프 팁의 끝을 잘라 내고 뇌를 깨끗한 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮기십시오. 필터 용지 스트립으로 얼룩을 만들어 슬라이드에서 초과 PBST를 제거합니다. 필터 용지가 뇌에 닿지 않도록 주의하십시오.
- 뇌에 수용성, 비형광 장착 매체를 한 방울 넣고, 복부 신경 코드가 슬라이드에 직면하고, 로브가 위쪽으로 향하도록 뇌를 방향을 지정합니다. 뇌를 연속적으로 이미지화하는 것이 더 쉬워지도록 두뇌를 단일 파일로 정렬합니다.
- 뇌 위에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 슬라이드를 하룻밤 사이에 2-6 °C로 놓습니다.
참고: 마운팅 매체는 밤새 보관시 강화되어 매니큐어로 커버슬립을 밀봉할 필요가 없습니다.
5. 이미징
참고: 이 프로토콜에 사용되는 레이저 스캐닝 현미경 및 오일 침지 목표에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 획득 소프트웨어에서 63x 목표를 선택합니다.
- 접피스를 통해 조직을 쉽게 찾을 수 있도록 장착 된 뇌 바로 위에 덮개 슬립에 침지 오일 한 방울을 넣습니다.
- DAPI/Hoechst 33342 채널을 사용하여 접피스를 통해 뇌를 찾은 다음 소프트웨어의 획득 모드로 전환합니다.
- Hoechst 33342 (DNA), 알렉사 플루어 488 (pH3), 알렉사 플루어 568 (미란다), 알렉사 플루어 647 (EdU)을 이미지4 채널을 설정합니다. 선택한 염료에 대한 흥분 레이저 및 방출 필터를 자동으로 설정하는 염료 보조 도구를 사용합니다.
- 전체 뇌 엽을 포괄하도록 시야를 설정합니다. z-스택을 획득하여 뇌 엽의 전체 부피를 0.8 μm 간격으로 이미지합니다. 이미징 세션의 모든 이미지를 *.lif 라이브러리 형식으로 저장합니다.
6. 이미지 분석
참고: 다음 단계는 획득된 이미지의 분석과 G0/G1 상, S 상, S>G2/M(S에서 G2/M로 진행) 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 M 단계로 셀을 정렬하는 방법을 설명합니다.
- 다음 URL에서 피지 (피지는 ImageJ) 다운로드 : https://fiji.sc/. 피지를 열고, 다음 드래그 피지에 .lif 파일을 드롭.
참고 : 피지는 여러 플러그인과 함께 사전 설치 제공되는 ImageJ의버전입니다 14. 피지로 .lif 파일을 전송하면 .lif 파일을 처리하는 데 필요한 바이오 포맷 플러그인이 열립니다. 바이오 포맷 플러그인은 또한 다른 현미경 브랜드에서 생성 된 이미지 파일을 열어야한다, 예를 들어, 니콘 현미경에서 생성 된 nd2 파일. 이 플러그인피지와 사전 설치 온다. - 스택 보기 탭에서 데이터 브라우저를 선택하고 바이오 포맷 플러그인의 메모리 관리 탭에서 가상 스택을 사용합니다.
참고: 8-10 개의 뇌에서 z 스택이있는 Lif 파일은 종종 300-400 메가 바이트 크기입니다. RAM이 낮은 컴퓨터에서이러한 파일을 몇 개 열면 ImageJ에서 사용 가능한 RAM이 빠르게 고갈되고 추가 이미지 처리를 방지할 수 있습니다. 가상 스택은 '읽기 전용'이며 처리를 위해 높은 RAM이 필요하지 않으며 피지에 큰 데이터 집합을 로드하는 데 이상적인 옵션입니다. - ImageJ에 표시되는 멀티채널 이미지를 관찰합니다. 이미지 | 색상 | 채널 도구를 사용하여 메뉴 표시줄에서 채널의 색상을 변경합니다. 미란다 로 표시된 NB를 CB 영역에서 큰 둥근 셀로 관찰한다.
- NB를 두 번 계산하지 않도록 각 NB 위에 타원 도구를 사용하여 관심 영역(ROI)을 그립니다.
- ImageJ 메뉴 바에서 | 도구 | 분석 ROI 매니저. 현재 z 단면에 모든 NB를 표시하고 각 셀을 표시한 후 t를 누릅니다.
- 현재 z 단면의 모든 NB가 표시되면 채널을 pH3 및 EdU로 변경하고 EdU 양성 NB, pH3 양성 NB, EdU 및 pH3 모두에 대해 긍정적으로 염색하는 NB및 NB를 두 마커모두에 대해 염색하지 않는 수를 수동으로 계산합니다.
- 후속 z 섹션에서 NB를 검색하고 이전 ROI를 삭제하고 새 ROI를 추가하여 다른 스택에서 NB를 계산합니다.
- 다음 열로 스프레드시트를 준비: 1. EdU-pH3-: 이 섹션은 세포 주기의 G0/G1 단계에 있는 이중 음수 세포를 나타낸다; 2. EdU +: 이 범주의 세포는 EdU를 통합하고 DNA 복제 (S-phase)를 겪고 있습니다. 3. EdU+ pH3+: 이러한 이중 양성 세포는 S 단계를 완료하고 G2 또는 M 단계로 진행했습니다. 4. pH3+: 이 NB는 미토시스를 겪고 있습니다.
- 각 로브에 대해 위의 4가지 범주에 존재하는 NB의 백분율을 계산합니다. 각 범주의 NB 백분율에 대해 풀로 된 데이터를 보여주는 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 막대 그래프를 준비합니다.
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Representative Results
이중 로브 드로소필라 제3성급 애벌레 뇌는 근본적인 세포 및 발달 과정을 연구하는 모델 시스템으로 활용되고 있다9. 현재 연구의 초점은 CB 영역의 EdU-및 pH3 표지 된 NBs에서 세포 주기 진행의 분석을위한 프로토콜을 제시하는 것이었다(도 1). CB NB는 I 형 및 유형 II로 세분화되며 특성 비대칭 분할 패턴9을표시합니다. 각 유형 I NB 사업부는 자체 갱신할 수 있는 NB와 차별화9에대한 운명이 있는 또 다른 GMC를 생성합니다. 대조적으로, 타입 II NB는 2GMC9를스스로 갱신하고 생성하는 대중 교통 증폭, 미숙한 신경 전구 세포 (INP)를 생성합니다. OL 지역에는 뚜렷한 NB 인구가 존재하지만, 이 연구는 NB 특이적 마커로 크고 쉽게 식별할 수 있는 CB NB에 초점을 맞췄습니다.
이 연구를 위해 미란다는 CB NB(그림2)를식별하고 분석하는 데 사용되었습니다. 미란다는 또한 OL에서 그밖 세포 인구를 얼룩그러나, CB NBs는 그들의 큰 크기 및 CB 위치13때문에 미란다로 확인될 수 있습니다. 다른 보다 구체적인 마커는 또한 NB 자체 갱신을 조절하는 전사 인자인 Deadpan과 같은 CB NB를 라벨링하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, pH3와 EdU 가 모두 크로마틴을 표시함에 따라 멤브레인 마커 미란다는 pH3 및 EdU로 표시된 NB를 쉽게 시각화하고 분석할 수 있도록 사용되었습니다. EdU 는 면역 스테인닝 및 이미지 분석에 의한 추가 특성화, 후속 검출 및 추가 특성화가 복잡한 절차입니다. 최적의 염색 및 이미징 상태를 결정하기 위해 각 단계를 표준화하는 것이 중요합니다. 일부 게시된 보고서에는 EdU/pH3 라벨링 전략이 있지만 이러한 보고서는 최적화 및 이미지 분석 단계에 대해 자세히 설명하지 않습니다. 그림 1에 설명된 워크플로는 EdU 통합에서 이미지 분석까지단계를 요약합니다.
우리는 최근에 일반적인 미토성 진행을 위해 NBs에 의해 요구되는 Mms19 유전자를 특징으로한다 11. 살아있는 세포 이미징 분석을 통해 기능성 Mms19가 부족한 NB는 미토시스를 완성하는 데 야생형 NB의 2배정도 걸리는 것으로 나타났다. 이는 EdU/pH3 분석에 명확하게 반영되어 Mms19P NBs의 상당히 높은 비율이 야생형 NBS(도 3A)에비해 M-phase에 있는 것으로 나타났다. Mms19:eGFP 융합 단백질을 Mms19P 배경에서 발현하여 표현불량(11,15)을구출하는 것으로 나타났다. 이는 M-phase에서 세포의 비율이 Mms19:eGFP 발현에 따라 야생형 수준으로 구조되었다는 것을 여기서 세포 주기 진행 분석결과와 잘 연관되었다(도3A,B).
그림 1: EdU/pH3 듀얼 라벨링을 위한 간소화된 워크플로우입니다. 세 번째 인스타 애벌레 뇌는 2시간 동안 100 μM EdU로 해부되고 배양되었다. 그 후, 뇌 조직은 PFA로 고정되었고 미란다와 pH3에 대한 항체로 면역 염색되었다. 염색된 두뇌의 심상은 공초점 현미경에 얻어지고 다른 세포 주기 단계에 세포를 할당하기 위하여 ImageJ/Fiji와 추가 처리되었습니다. 약어: EdU = 5-에티닐-2'-데옥시리딘; pH3 = 인-히스톤 H3; PFA = 파라포름알데히드; SM = 슈나이더스 해부 매체; PBS = 인산염 완충식식염; PBST = PBS + 0.3% 비이온 세제; BSA = 소 세럼 알부민. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: G1/G0에 셀 할당; S; S>G2/M 및 M 단계. 세포는 전체 세포 주기를 완료하기 위해 G1, S, G2 및 M 단계를 통해 진행됩니다. 세 번째 인스타 애벌레 뇌에서 CB NBs미란다 (빨간색), EdU (회색), pH3 (녹색)로 표시되었고, DNA는 Hoechst 33342 (파란색)로 표시되었다. 표지된 NB는 ImageJ에서분석되었고(A) EdU도 pH3(G1/G0) 또는(B)EdU(Sphase),(C)EdU 및 pH3(S>G2/M) 및(D)pH3(M상)에 대해 긍정적으로 염색되었는지 여부에 따라 4개의 뚜렷한 단계에 할당되었다. 야생 형 뇌에서만 개별 NB의 예가 여기에 표시됩니다. 스케일 바 = 5 μm. 약어: CB = 중앙 뇌; NBs = 신경 폭발; EdU = 5-에티닐-2'-데옥시리딘; pH3 = 인-히스톤 H3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NB 세포 주기 상 분포에 Mms19P의 효과. (A)야생형(w;++) NB를 분석한 결과~ 25%의 NB가 M-phase에 있는 것으로 나타났다. 그러나 Mms19P NB에서 이 비율은 거의 40%로 증가했습니다. Mms19:eGFP 발현Mms19P 배경은 Mms19P 표현형을 구출하는 것으로 알려져 있으며, 이 배경에서 M상 NB의 비율은 야생형과 비슷했다. (B)세포 주기 상 G1/G0, S, S>G2/M 및 M에 대응하는 4가지 범주에서 의 NB의 백분율은 야생 유형에 걸쳐 비교되었다; Mms19P및 Mms19:eGFP, Mms19P 유전자형. M-위상 및 G1/G0 단계의 비율은 야생 형 NB에 비해 Mms19P NBs에서 상당히 다릅니다. 대조적으로, Mms19에 있는 NBs의 세포 주기 분포::eGFP, Mms19P 두뇌는 야생 모형에서 찾아낸 것과 비교됩니다. 통계적 유의성은 던의 사후 시험을 사용하여 비교된 크루스칼-월리스 테스트 및 여러 컬럼을 사용하여 계산되었다. (p<0.001). 이 그림은 11에서수정되었습니다. 약어: NBs = 신경 폭발; eGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; WT = 야생 형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 양/볼륨 |
| EdU(구성 요소 A) | 5 mg |
| 알렉사 플루어 647 – 아지드 (성분 B) | 바이알 1개 |
| 디메틸설프리산화물(DMSO, 성분 C) | 4 mL |
| 클릭-iT EdU 반응 버퍼(구성 요소 D) | 4mL (10x 용액) |
| 구리 황산염 (CuSO4,성분 E) | 100 mM; 바이알 1개 |
| 클릭-iT EdU 버퍼 첨가제(구성 요소 F) | 400 mg |
| Hoechst 33342 (구성 요소 G) | 물 10 mg/mL, 35 μL |
표 1: EdU 키트 구성 요소. 클릭-iT EdU 알렉사 플루어 세포 증식 키트및 각각의 양/볼륨과 함께 제공되는 구성 요소입니다. 약어: EdU = 5-에티닐-2'-데옥시리딘.
| 반응 구성 요소 | 볼륨(mL) |
| 1x 클릭-iT 반응 버퍼(1.4단계에서 준비) | 430 |
| CuSO4(구성 요소 E) | 20 |
| 알렉사 플루어 647 – 아지드 (구성 요소 B, 단계 1.3에서 제조) | 1.2 |
| 반응 버퍼 첨가제(성분 F, 1.5단계에서 제조) | 50 |
| 총 볼륨 | ~500 |
표 2: EdU 검출 칵테일 준비. EdU 검출 칵테일은 키트 성분의 표시된 볼륨을 혼합하여 제조하였다(섹션 2에서 제조). 약어: EdU = 5-에티닐-2'-데옥시리딘.
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Discussion
EdU 통합 및 세포 투과성 아지드와의 후속 '클릭' 반응은 이전7에서사용된 BrdU 방법에 비해 이 기술의 실질적인 이점을 제시한다. 그러나, 이러한 반응은 Cu(I) 이온에 의해 촉매화되고, 여러 염료는 이 구리 촉매의 존재에서 불안정할 수 있으며, 이는 클릭-it EdU 키트 제조업체의 권고와 같이. EdU 검출 단계를 실행한 후 면역 염색 실험이 수행되었을 때, 예상 신호 강도는 적색 채널 염료, 알렉사 플루서 568 및 Cy3로 관찰되지 않았다. 그러나, 프로토콜은 EdU 검출 단계 전에 면역 염색 반응이 완료될 때 작동했습니다. 이 프로토콜을 사용하면 Hoechst, pH3, Miranda 및 EdU를 시각화하는 데 4개의 채널이 사용되었습니다.
이 프로토콜의 또 다른 최적화된 단계는 EdU 스파이크 플라이 푸드를 애벌레에게 먹이는 것과 는 반대로 해부된 뇌에 의한 EdU의 섭취였습니다. 전체 Drosophila NB 세포 주기는 약 2-2.5 h16동안지속되기 때문에, 이 프로토콜에서와 같이 2.5 h에 대한 뇌에 의한 EdU 섭취량은 EdU 또는 pH3에 대해 긍정적으로 얼룩지지 않는 NBs 세포의 1개의 전체 세포 주기를 추적할 수 있게 한다. NB가 적극적으로 분할되는 것을 본 제 3 의 인스타 애벌레의 경우, 이러한 휴식 세포는 세포 주기의 G1 단계에 있을 가능성이 가장 높습니다. 그러나, 늦은 배아에서 초기 두 번째 인스타 단계에, NBs는 일시적으로 정지17된다. 이러한 초기 발달 단계에서, 이중 음수 염색은 대부분 G0/정지 단계를 나타낼 것입니다.
DNA 복제를 받고 있는 NB는 EdU를 위해 긍정적으로 얼룩져야 하는 반면, S 단계(EdU 통합)에서 후반 G2 또는 M 상으로 진행된 세포는 EdU와 pH3 모두에 대해 긍정적으로 얼룩져야 합니다. 그러나, 초기 G2 세포가 EdU 또는 pH3에 대해 긍정적으로 얼룩지지 않기 때문에 G2 단계의 특성화는 이 프로토콜로 어려울 것이다. 그러나, EdU를 통합하고 초기 G2로 진행된 세포는 또한 EdU를 위해 긍정적으로 얼룩지고 G2 단계의 분석을 복잡하게 할 수 있었습니다. DNA 복제를 억제하는 몇몇약은 S-phase18,19,20에서세포 주기 체포를 일으키는 원인이 된다. 이 프로토콜은 S상 차단 세포가 M-phase로 진행되지 않을 것이고 EdU의 분획, pH3 이중 양성 세포의 분획으로 진행되지 않을 것이기 때문에 이러한 약물 치료의 효과를 분석하고 식별하는 편리한 도구가 될 수 있으며, pH3 이중 양성 세포는 이 경우에 감소되거나 결석할 수 있다.
최근에 발표된 연구에서, 우리는 Mms19 유전자가 NBs11의미토성 진행에 미치는 영향을 평가하였다. 살아있는 세포 화상 진찰을 통해, 우리는 M-위상 진행에 있는 Mms19P NBs의 극적인 지연을 보여주었습니다. 야생형 NB가 ~10분 만에 M-Phase를 완성하는 동안 Mms19P NB는 M-Phase11을완료하는 데 약 2배의 시간이 걸렸습니다. 이에 따라, 이 EdU/pH3 이중 라벨링 프로토콜은 야생형 뇌에 비해 Mms19P 뇌에서 pH3에 대해 긍정적으로 염색하는 많은 NBs만큼 거의 1.5배나 관찰됨에 따라 미토틱 지연을 반영했습니다. 따라서 이 EdU 프로토콜의 데이터는 직접 라이브 셀 이미징 결과와 비교됩니다. 이러한 직접, 라이브 셀 접근법은 시간이 많이 걸리고 광범위한 최적화가 필요하며, 이 프로토콜은 특정 단계에서 결함을 이해하기 위해 이러한 세포 주기 돌연변이의 신속한 초기 스크리닝을 수행하는 데 활용될 수 있다. 관심의 단계가 확인되면, 이것은 직접 세포 시각화 에세이에 의해 후속 될 수있다.
세포 주기 단계의 기간은 다른 세포 모형 및 발달 단계 사이에서 상당히 변화할 수 있습니다. 예를 들어, 드로소필라 배아를 개발할 때, 미토성 키나아제의 다운규제는 S 단계의 연장된 지속시간을 초래하며,페렛(Mustela putorius furo)뇌 신경 전조자 와 같은 분화를 위해 포동하는 세포에서, S상 지속 기간은 현저하게 짧은21,22이다. 따라서 EdU 펄스 라벨링 시간은 주어진 세포 유형의 S 및 G 상의 길이에 따라 최적화되어야 합니다. EdU 펄스의 지속 시간은 또한 실험 목표에 따라 달라집니다, 예를 들어, 짧은 펄스는 S-phase에 있는 세포의 현재 분획을 측정하기에 충분하고, 더 긴 펄스는 S 상을 통해 세포의 진행의 분석을 가능하게 합니다.
EdU 펄스의 광범위한 최적화는 페레이라와동료(23)가우아하게 입증한 바와 같이 S 단계의 추정을 허용할 수 있다. 이 연구원은 HCT116 세포가 증분 기간 동안 EdU로 펄스 표지된 새로운 유동 세포측정 기반 방법을 시연했습니다. 저자는 펄스 시간이 S 단계23의길이와 일치할 때 EdU의 최대 형광 강도가 얻어진다는 것을 보여주었습니다. 더욱이, EdU 표지된 세포의 시간적 진행을 분석함으로써 G1 및 G2/M 상도 정량화할 수 있게 되었다. EdU/pH3 듀얼 라벨링에 대한 현재 프로토콜은 S 및 M 상 결함을 분석할 수 있지만 이 프로토콜을 사용하여 위상의 정확한 지속 시간을 측정할 수는 없습니다. Pereira와 동료에 의해 기술된 프로토콜은 세포 주기 상 길이의 측정을 요구하는 분석에 적합한 대안일 수 있었습니다. 추가 pH3 라벨링으로 이 프로토콜을 조정하면 M 상 세포 검출에 더 높은 감도가 발생할 수도 있습니다.
EdU/pH3 접근법 외에도, fluorescent ubiquitin-세포 주기 지표 (FUCCI) 방법은 또한 Drosophila 조직24,25에서포유류 세포에서 세포 주기 진행을 연구하기 위하여 이용되고 있다. 이 시스템은 각각 APC/C 및 SCFSkp2에의한 특정 유비퀴티온 및 프로테아소말 분해를 모티브로 하는 두 개의 형광 태그 단백질인 제민과 Cdt1을 활용합니다. APC/C는 S 및G2 단계에서 활성을 통해 미토시스말부터 활성상태이기 때문에, 형광태그제민 및 Cdt1의 세포주기-단계별 특이적 분해는 세포 주기24단계의측정을 가능하게 한다. 드로소필라 조직을 위한 약간 수정된 'Fly-FUCCI' 방법은 APC/C(미토시스 중) 및 CRL4Cdt2(S-phase 개시 중)에 의해 저하되는 형광 태그Cyclin B 및 E2F1에 각각25를의존합니다. 이전 연구는 플라이-FUCCI 및 EdU/pH3 방법에 의해 분석된 세포 주기 결함에 대한 응답으로 드로소필라 애벌레 NB의 조기 분화를 특징으로 하는4. Aneuploidy는 NB의 조기 분화를 유도하고, 따라서, NBs의 높은 분수는 세포 주기를 종료합니다.
이는 플라이-FUCCI 및 EdU/pH3 데이터4모두에 정확하게 반영되었습니다. EdU/pH3 방법에서 얻은 데이터는 플라이-FUCCI와 같은 다른 세포 주기 추적 방법과도 비교할 수 있다. Fly-FUCCI는 강력한 도구이며, 유비쿼터스 구동 형광 마커 또는 조직 별 프로모터에 융합 된 마커가있는 모든 플라이 스톡은 주식 센터에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 구조를 사용하여 null 돌연변이또는 siRNA 녹다운으로 세포 주기 결함을 분석하는 것은 FUCCI 요소, 조직 별 동인, 특정 돌연변이 또는 관심있는 siRNA를 운반하는 플라이 스톡을 만드는 유전 적 재조합을 수반할 것이다. 이 과정은 몇 주 동안 실제 실험을 지연시킬 것이고, EdU/pH3 방법은 유전 적 널 배경으로 플라이 라인에 쉽게 적용될 수 있습니다. 또는, siRNA 넉다운의 경우, EdU/pH3 분석에 대해 드라이버 스톡과 siRNA 스톡 간의 1단계 크로스를 활용할 수 있다.
이 접근의 한 가지 단점은 여러 뇌 샘플에서 많은 수의 세포의 수동 정량화를 포함하는 이미징 및 이미지 분석 파이프 라인입니다. 최근에는 세포주기 분석을 위한 종래의 현미경 기반분석법(26)에대한 고처리량 대안으로 유동 세포측정 접근법이 제시되고 있다. 이 접근법과 동시에 수천 개의 세포의 신속한 분석은 유리하며 여러 마커를 검출하는 능력이 특정 세포 유형의 정량화를 가능하게합니다. 배양 된 세포주와 쉽게 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 Drosophila 애벌레 뇌와 같은 큰 조직 샘플에 적용하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 혈류세포측정제 27,28에의해 고립된 애벌레 NB의 뇌 조직 해리 및 분석을 설명하는 몇 가지프로토콜이발표되었다. 이 방향에 있는 추가 혁신적인 접근은 Drosophila 조직에 있는 높은 처리량 세포 주기 분석을 위한 새로운 기회를 제시할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 존재하지 않는다고 선언했다.
Acknowledgments
이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (프로젝트 보조금 31003A_173188; www.snf.ch)과 베른 대학 (www.unibe.ch)에서 BS에 자금을 지원했습니다. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 작성에 아무런 역할이 없었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
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