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Biology

Protocolo de doble marcado de 5-etinil-2'-desoxiuridina/fosfo-histona H3 para el análisis de progresión del ciclo celular en células madre neurales de Drosophila

Published: May 4, 2021 doi: 10.3791/62642
Automatic Translation
1,2, 1
1Cell Biology, University of Bern, 2Department of life sciences and medicine, University of Luxembourg

Summary

El análisis del ciclo celular con etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) y fosfo-histona H3 (pH3) es un procedimiento de varios pasos que puede requerir una optimización extensa. Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe todos los pasos para este procedimiento, incluido el análisis de imágenes y la cuantificación para distinguir las células en diferentes fases del ciclo celular.

Abstract

El análisis de progresión del ciclo celular in vivo se realiza rutinariamente en estudios sobre genes que regulan la mitosis y la replicación del ADN. La 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) se ha utilizado para investigar la progresión replicativa/fase S, mientras que los anticuerpos contra la fosfo-histona H3 se han utilizado para marcar núcleos y células mitóticas. Una combinación de ambas etiquetas permitiría la clasificación de las fases G0/G1 (fase Gap), S (replicativa) y M (mitótica) y serviría como una herramienta importante para evaluar los efectos de los derribos de genes mitóticos o mutantes nulos en la progresión del ciclo celular. Sin embargo, los reactivos utilizados para marcar las células marcadas con EdU son incompatibles con varias etiquetas fluorescentes de anticuerpos secundarios. Esto complica la inmunotinción, donde se utilizan anticuerpos primarios y secundarios marcados para marcar las células mitóticas con pH3 positivo. Este artículo describe un protocolo paso a paso para el etiquetado dual de EdU y pH3 en células madre neurales larvales de Drosophila, un sistema utilizado ampliamente para estudiar los factores mitóticos. Además, se proporciona un protocolo para el análisis y cuantificación de imágenes para asignar células etiquetadas en 3 categorías distintas, G0 / G1, S, S>G2 / M (progresión de S a G2 / M) y M fases.

Introduction

El ciclo de división celular comprende una fase G1 (primera fase de brecha), una fase replicativa/S, una G2 (segunda fase de brecha) y una fase M (mitótica). Al pasar por estas fases, la célula sufre cambios dramáticos en la transcripción celular, la traducción y la reorganización de la maquinaria citoesquelética1,2. En respuesta a las señales ambientales y de desarrollo, las células pueden dejar de dividirse temporalmente y volverse inactivas (G0) o diferenciarse y dejar de dividirse permanentemente3. Otros escenarios, como el daño al ADN, pueden causar diferenciación prematura o apoptosis3,4. La respuesta a tales señales está mediada por puntos de control del ciclo celular, que actúan como un sistema de vigilancia para garantizar la integridad de los procesos celulares esenciales antes de que la célula se comprometa con la siguiente fase del ciclo de división5. Por lo tanto, los estudios sobre genes que regulan la replicación del ADN, los puntos de control y la maquinaria mitótica deben analizar los posibles defectos de progresión del ciclo celular que pueden ocurrir en las células mutantes o en el derribo de siRNA de estos genes. Además, tales análisis pueden emplearse para probar la salud celular general, así como las respuestas celulares al tratamiento farmacológico.

La 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) es un análogo de la timidina que se incorpora al ADN durante la replicación6. Este método se utilizó ampliamente para identificar células en fase S. Sin embargo, las células se someten a duros procedimientos de desnaturalización del ADN para permitir la detección de BrdU mediante el uso de anticuerpos anti-BrdU6. Este tratamiento severo puede dañar los epítopos celulares e impedir una mayor caracterización de la muestra a través de la inmunotinción. La incorporación de EdU y la posterior detección mediante una "reacción de clic" catalizada por cobre con colorantes de azida pequeños, permeables a las células y marcados fluorescentemente elimina la necesidad de procedimientos de desnaturalización severos7. Este método, por lo tanto, surgió como una alternativa más práctica a la incorporación de BrdU.

Además, pH3 se ha descrito como un marcador fiable para las células de fase mitóticas/M8. La histona H3 es una proteína histona central asociada al ADN que se fosforila alrededor de la fase G2 tardía a la fase M temprana y se desfosforila hacia el final de la anafase8. Se pueden utilizar varios anticuerpos comerciales para detectar pH3 utilizando protocolos estándar de inmunotinción. Por lo tanto, la tinción dual de EdU y pH3 permitiría la detección de células en fase S y fase M. Además, las células en la fase G1 y G2 temprana no se tiñen positivamente para ninguno de los marcadores.

Las células madre neurales o neuroblastos (NB) de Drosophila ofrecen un modelo de células madre bien caracterizado en el que las células se dividen asimétricamente para producir una NB autorrenovadora idéntica y una célula madre ganglionar (GMC), que está destinada a la diferenciación9. Además, varias herramientas genéticas y anticuerpos específicos de NB hacen que este sistema sea adecuado para la manipulación genética y las imágenes de células vivas. En consecuencia, varios estudios han utilizado NB para estudiar genes que regulan las divisiones asimétricas y la determinación del destino celular9. Existen distintas poblaciones de NB en el cerebro central (CB) y el lóbulo óptico (OL) del cerebro larvario9; Se utilizaron NB CB para el estudio actual. Estas terceras larvas de CB NB son células grandes que también son adecuadas para estudiar los factores que regulan el ensamblaje del huso mitótico. Un protocolo para analizar los defectos de progresión del ciclo celular sería una herramienta vital en tales estudios.

Los protocolos publicados anteriormente empleaban kits comerciales, como Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, que proporcionan varios componentes de reacción y colorantes de azida etiquetados con una variedad de tintes Alexa Fluor para la incorporación y detección de EdU10. Sin embargo, los reactivos suministrados con tales kits no son compatibles con algunas etiquetas fluorescentes que a menudo se usan con anticuerpos secundarios. Este kit de detección EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit suministrado con el colorante de azida conjugada Alexa Fluor 647) se probó en NB larvales de Drosophila tercer instar, y se intentó la tinción conjunta con anticuerpos contra pH3 y Miranda, un marcador para NB. Además, se utilizaron anticuerpos secundarios marcados con Alexa Fluor 568 o Cy3 para la detección del etiquetado de Miranda en la membrana plasmática denbs 11. Sin embargo, la intensidad esperada de la señal y el patrón de tinción (resultados no publicados) no se observaron con estos anticuerpos secundarios cuando se realizó la inmunotinción después de la detección de EdU.

Para la incorporación de EdU, el protocolo descrito por Daul y sus colegas requirió la alimentación de las larvas con medio Kankel-White mezclado con EdU y azul de bromofenol (BPB)10. Las larvas se alimentaron de los alimentos con picos de EdU y BPB, que se podían ver por su color azul al ingerirlos en el intestino larvario. Aunque este método se utilizó para la incorporación de EdU en mms19 pérdida de función(Mms19P)tercera larva instar, las larvas mms19P aparentemente no se alimentaron ya que apenas se detectó color azul en el intestino larvario (resultados no publicados). Las larvas de Mms19P muestran deformidades drásticas del desarrollo y eventualmente se detienen en la tercera etapa de instar. Esto puede afectar de alguna manera el comportamiento de alimentación de las larvas de la tercera instar y hacer que el protocolo de alimentación EdU no sea adecuado para tales casos.

Después de estudiar la literatura disponible y trabajar extensamente en la estandarización de pasos esenciales, se propuso un enfoque alternativo para el doble etiquetado EdU / pH3 en Drosophila NBs, que no requiere alimentar EdU a las larvas. Un estudio previo empleó tinción dual EdU/pH3 para analizar el ciclo celular en NB, pero no presentó un protocolo detallado4. Esto presenta un obstáculo innecesario para los laboratorios que intentan implementar este método. Además, evaluar la compatibilidad de varios reactivos con el kit EdU y realizar una mayor optimización puede ser un proceso que consume mucho tiempo. Este artículo presenta un protocolo paso a paso que cubre la incorporación de EdU en cerebros larvales disecados e inmunotinción con anticuerpos anti-pH3, seguido de microscopía confocal y análisis de imágenes para asignar NB a cuatro categorías distintas: fase G0 / G1, fase S, S>G2 / M (progresión de S a G2 / M) y fase M. Se describen los pasos que necesitan optimización y se proporcionan consejos para el análisis de imágenes de grandes conjuntos de datos. Además, se analiza la lectura de EdU/pH3 en NB de tipo salvaje y se compara con los NB mms19P, que recientemente se informó que mostraban un retraso en el ciclo celular11.

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Protocol

1. Preparación de reactivos y existencias para el ensayo Click-it EdU

NOTA: Consulte la Tabla de materiales y la Tabla 1 para obtener detalles sobre el kit y los reactivos suministrados con el kit.

  1. Lleve los viales a temperatura ambiente antes de preparar las soluciones.
  2. Preparar una solución madre de EdU (componente A) de 10 mM añadiendo 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO, componente C). Mezclar bien y conservar a -20 °C.
  3. Prepare una solución de trabajo de Alexa Fluor 647-azide (componente B) agregando 70μL de DMSO (componente C). Mezclar bien y conservar a -20 °C.
  4. Prepare una solución 1x de tampón de reacción Click-iT EdU (componente D) mezclando 4 ml de esta solución con 36 ml de agua desionizada. Conservar la solución restante a 2-6 °C.
  5. Haga un stock 10x (200 mg/mL) del aditivo tampón Click-iT EdU (componente F) agregando 2 mL de agua desionizada. Mezclar bien y conservar a -20 °C.
  6. Guarde Hoechst 33342 (componente G) a 2-6 °C. Guarde DMSO (componente C) en un desecador a -20 °C.
    NOTA: Se deben usar guantes para manejar DMSO y Hoechst.

2. Disección de cerebros larvales de tercer instar e incorporación de EdU

NOTA: El protocolo para las disecciones cerebrales ha sido descrito previamente12. Antes de comenzar las disecciones, asegúrese de que se preparan y descongelan cantidades suficientes de las soluciones de EdU y PFA como se describe en los puntos 2.6 y 3.1.

  1. Prepare 10x solución salina tamponada con fosfato (PBS) agregando 25.6 g Na2HPO4.7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl y 2 g KH2PO4 a 1 L de agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 y, posteriormente, prepare una solución 1x en agua desionizada.
  2. Agregue el medio de disección (SM) de Schneiders a dos depresiones consecutivas de una placa de vidrio de vidrio (3 o 9). Agregue 1x PBS a la siguiente depresión consecutiva.
  3. Usando un par de fórceps, recoja las larvas errantes del tercer instar y colóquelas en un tejido humedecido con PBS para limpiar los residuos de alimentos para moscas. Coloque la larva en la depresión con PBS y luego en la depresión consecutiva con SM.
  4. Usando un par de fórceps finos, retire3/4 de la parte inferior del cuerpo de la larva.
    1. Agarre suavemente los ganchos bucales larvales con un par de fórceps y sostenga la cutícula en el otro extremo con el otro par de fórceps.
    2. Gire la cabeza de la larva al revés empujando hacia adentro los ganchos de la boca y simultáneamente despegando el tejido en el otro extremo.
  5. Observe el cerebro larvario con discos imaginales adjuntos. Elimine otros tejidos adheridos al cerebro y transfiera el cerebro a la siguiente depresión consecutiva con SM.
  6. Descongele la solución de stock EdU de 10 mM. Prepare una solución de 100 μM diluyendo este caldo de 10 mM en SM.
  7. Añadir 100 μL de esta solución EdU+SM de 100 μM en otra depresión en la placa Pyrex. Incubar ~5-10 cerebros disecados en 100 μL de solución EdU+SM de 100 μM durante 2 h a 25 °C.
    NOTA: Como los NB se dividen una vez en ~ 2 h, este protocolo tiene como objetivo analizar un ciclo celular completo. Solo use cerebros intactos para pasos posteriores. Deseche los cerebros que se dañan durante la disección.

3. Fijación e inmunotinción

  1. Prepare una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) en una campana extractora de humos.
    1. Añadir 4 g de polvo de paraformaldehído a 80 ml de 1x PBS en un vaso de precipitados colocado en un agitador magnético y calentar a 60 °C. Para disolver el PFA, agregue unas gotas de 1 N NaOH. Compruebe el pH y ajuste a 7.0 con unas gotas de 1 M HCl si es necesario.
    2. Ajuste el volumen a 100 ml con 1x PBS. Alícuota la solución de PFA y guárdela a 2-6 °C durante un máximo de 1 mes. Agregue detergente no iónico al 0,3% (consulte la Tabla de materiales)a la solución de PFA para una fijación eficiente de tejidos grandes como el cerebro larvario.
  2. Después de la incorporación de EdU, transfiera los cerebros a tubos de microcentrífuga de 0,6 ml que contengan 4% de PFA. Incubar a temperatura ambiente en un nutator durante 15 min. Golpee el tubo en el banco de laboratorio para que los cerebros se asienten en la parte inferior del tubo.
  3. Retire el PFA y lave 3 veces con PBS + 0.3% detergente no iónico (PBST) a temperatura ambiente. Asegúrese de que cada lavado dure al menos 10 minutos en un nutator. Después del último lavado, retire el PBST, agregue la solución de bloqueo (PBST + 5% de albúmina sérica bovina) e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
  4. Diluir el anticuerpo anti-Miranda (1:250) y el anticuerpo anti pH3 (1:200) en PBST (ambos anticuerpos en el mismo tubo). Retire el tampón de bloqueo y agregue la solución de anticuerpos primarios. Incubar durante la noche a 2-6 °C en un nutator.
    NOTA: Miranda es una proteína de membrana presente en los CB NB. Sirve para identificar estas grandes células redondas en la región CB13.
  5. Retire la solución primaria de anticuerpos y lávese 3 veces con PBST. Asegúrese de que cada lavado dure 10 minutos en un nutator a temperatura ambiente.
  6. Prepare la solución de anticuerpos secundarios agregando 1:500 Alexa Fluor 488 anti-Conejo diluido y Alexa Fluor 568 anti-Rata en PBST. Retire el PBST y agregue la solución secundaria de anticuerpos a los cerebros disecados. Incubar durante la noche a 2-6 °C en la oscuridad, en un nutator, y lavar 3 veces con PBST (paso 3.5).

4. Detección de EdU, tinción de ADN y montaje

  1. Para preparar el cóctel de detección EdU, mezcle los componentes (véase la Tabla 2)en un tubo de 1,5 ml.
  2. Después del último lavado (paso 3.6), retire pbST y agregue el cóctel de detección de EdU a los cerebros disecados. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min en un nutator. Lavar 2 veces con PBST durante 10 min cada una, en la oscuridad.
  3. Para la tinción de ADN, diluya Hoechst 33342 (componente G) 1:2.000 en PBST para preparar una solución de 5 μg/ml.
  4. Retire el PBST después del segundo lavado (paso 4.2) y agregue 500 μL de solución de Hoechst de 5 μg/ml a los cerebros disecados. Incubar en la oscuridad durante 10 min. Retire Hoechst, y lave una vez con PBST durante 10 min.
  5. Golpee el tubo en el banco del laboratorio y deje que los cerebros se asienten. Retire el PBST del tubo, pero deje atrás solo 50-100 μL.
  6. Corte el extremo de una punta de micropipeta de 200 μL y transfiera cuidadosamente los cerebros a un portaobjetos de vidrio limpio. Elimine el exceso de PBST de la diapositiva secando con tiras de papel de filtro. Tenga cuidado de no dejar que el papel de filtro toque los cerebros.
  7. Coloque una gota de medio de montaje soluble en agua y no fluorescente en los cerebros y oriente los cerebros de tal manera que el cordón nervioso ventral se enfrente al tobogán y los lóbulos hacia arriba. Organice los cerebros en un solo archivo para que sea más fácil obtener imágenes de los cerebros en serie.
  8. Coloque suavemente un cobertor en la parte superior de los cerebros. Coloque el tobogán a 2-6 °C durante la noche.
    NOTA: El medio de montaje se endurece durante el almacenamiento durante la noche para que no sea necesario sellar la cubierta con esmalte de uñas.

5. Imágenes

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el microscopio de barrido láser y el objetivo de inmersión en aceite utilizado en este protocolo.

  1. En el software Adquisición, seleccione el objetivo 63x.
  2. Coloque una gota de aceite de inmersión en la cubierta justo encima de los cerebros montados para que sea más fácil localizar el tejido a través del ocular.
  3. Usando el canal DAPI/Hoechst 33342, encuentre el cerebro a través del ocular y luego cambie al modo de adquisición en el software.
  4. Configure 4 canales para obtener imágenes de Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) y Alexa Fluor 647 (EdU). Utilice la herramienta de asistente de tinte, que configura automáticamente los láseres de excitación y los filtros de emisión para los tintes seleccionados.
  5. Establezca el campo de visión de tal manera que abarque todo el lóbulo del cerebro. Imagine todo el volumen del lóbulo cerebral adquiriendo pilas z espaciadas a 0,8 μm de distancia. Almacene todas las imágenes de una sesión de imágenes en un formato de biblioteca *.lif.

6. Análisis de imágenes

NOTA: Los siguientes pasos describen el análisis de las imágenes adquiridas y cómo clasificar las células en fase G0/G1, fase S, S>G2/M (progresión de S a G2/M) y fase M utilizando el software ImageJ.

  1. Descargue Fiji (Fiji es ImageJ) desde la siguiente URL: https://fiji.sc/. Abra Fiji, luego arrastre y suelte los archivos .lif en Fiji.
    NOTA: Fiji es una versión de ImageJ que viene preinstalada con varios plugins14. La transferencia de archivos .lif a Fiji abrirá el complemento Bio-formats, que es necesario para procesar los archivos .lif. El complemento Bio-formats también es necesario para abrir archivos de imagen generados a partir de otras marcas de microscopios, por ejemplo, archivos nd2 generados a partir de un microscopio Nikon. Este plugin viene preinstalado con Fiji.
  2. Seleccione Explorador de datos en la pestaña de visualización de la pila y use la pila virtual en la pestaña de administración de memoria en el complemento de bioformatos.
    NOTA: Los archivos Lif con pilas z de 8-10 cerebros a menudo tienen un tamaño de 300-400 megabytes. En computadoras con poca RAM, abrir algunos de estos archivos puede agotar rápidamente la RAM disponible en ImageJ y evitar cualquier procesamiento de imágenes adicional. La pila virtual es de "solo lectura", no necesita una gran cantidad de RAM para el procesamiento y es una opción ideal para cargar grandes conjuntos de datos en Fiji.
  3. Observe la imagen multicanal que se muestra en ImageJ. Cambie el color de los canales desde la barra de menús mediante la herramienta Imagen | color | canales. Observe los NB marcados con Miranda como células redondas grandes en la región CB.
  4. Dibuje una región de interés (ROI) utilizando la herramienta de elipse sobre cada NB para evitar contar el NB dos veces.
    1. En la barra de menús de ImageJ,seleccione analizar | herramientas | Gestor de ROI. Marque todos los NB en la sección z actual y presione t después de marcar cada celda.
  5. Una vez que todos los NB en la sección z actual estén marcados, cambie los canales a pH3 y EdU, y cuente manualmente el número de NB positivos para EdU, NB positivos para pH3, NB que se tiñen positivamente tanto para EdU como para pH3, y NB que no se tiñen para ambos marcadores.
  6. Busque NB en secciones z posteriores, elimine ROI antiguos y agregue rois nuevos para contar NB en diferentes pilas.
  7. Preparar una hoja de cálculo con las siguientes columnas: 1. EdU- pH3-: esta sección representa las celdas doblemente negativas que se encuentran en la fase G0/G1 del ciclo celular; 2. EdU+: las células de esta categoría han incorporado EdU y están en proceso de replicación del ADN (fase S); 3. EdU+ pH3+: estas células duales positivas han completado la fase S y han progresado a la fase G2 o M; 4. pH3+: estos NB están sufriendo mitosis.
  8. Calcule los porcentajes de NB presentes en todas las 4 categorías anteriores para cada lóbulo. Prepare un gráfico de barras utilizando el software de hoja de cálculo que muestre los datos agrupados para los porcentajes de NB en cada categoría.

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Representative Results

El cerebro larvario bilobulado de Drosophila tercer instar se ha utilizado como sistema modelo para estudiar los procesos celulares y de desarrollo fundamentales9. El objetivo del presente estudio fue presentar un protocolo para el análisis de la progresión del ciclo celular en NB marcados con EdU y pH3 de la región CB(Figura 1). Los CB NB se subdividen en tipo I y tipo II, y muestran el patrón de división asimétrica característico9. Cada división NB tipo I genera un NB, que es capaz de autorrenovarse, y otro GMC que está destinado a la diferenciación9. Por el contrario, los NB de tipo II generan células progenitoras neurales (INP) inmaduras que amplifican el tránsito y se autorrenovan y generan 2 GMC9. Aunque existe una población distinta de NB en la región OL, este estudio se centró en los CB NB, que son grandes y fácilmente identificables con marcadores específicos de NB.

Para este estudio, Miranda fue utilizado para identificar y analizar cbNBs (Figura 2). Aunque Miranda también tiñe otras poblaciones celulares en el OL, los CB NB se pueden identificar con Miranda debido a su gran tamaño y ubicación CB13. Otros marcadores más específicos también se pueden usar para etiquetar CB NB, como Deadpan, que es un factor de transcripción que regula la autorrenovación de NB. Sin embargo, como tanto el pH3 como la EdU marcan la cromatina, se utilizó el marcador de membrana Miranda para facilitar la visualización y el análisis de nbis marcados con pH3 y EdU. La incorporación de EdU, la detección posterior y la caracterización posterior mediante inmunotinción y análisis de imágenes es un procedimiento complejo. Es importante estandarizar cada paso para determinar las condiciones óptimas de tinción e imágenes. Aunque algunos informes publicados presentan estrategias de etiquetado EdU/pH3, estos informes no detallan los pasos de optimización y análisis de imágenes. El flujo de trabajo descrito en la Figura 1 resume los pasos desde la incorporación de EdU hasta el análisis de imágenes.

Recientemente caracterizamos el gen Mms19, que es requerido por los NB para la progresión mitótica normal11. A través de análisis de imágenes de células vivas, se demostró que los NB que carecen de Mms19 funcional tardan el doble de tiempo que los NB de tipo salvaje en terminar la mitosis. Esto se reflejó claramente en el análisis EdU/pH3 en el que se encontró que una proporción significativamente mayor de NB Mms19P estaba en la fase M en comparación con los NB de tipo salvaje (Figura 3A). Se ha demostrado que la expresión de la proteína de fusión Mms19::eGFP en el fondo de Mms19P rescata defectos fenotípicos11,15. Esto se correlacionó bien con los resultados del análisis de progresión del ciclo celular en el que la proporción de células en fase M fue rescatada a niveles de tipo salvaje en la expresión de Mms19::eGFP en el fondo de Mms19P (Figura 3A,B).

Figure 1
Figura 1: Un flujo de trabajo simplificado para el etiquetado dual EdU/pH3. Los cerebros larvales del tercer instar fueron diseccionados e incubados con 100 μM EdU durante 2 h. Posteriormente, el tejido cerebral se fijó con PFA e inmunoteñó con anticuerpos contra Miranda y pH3. Las imágenes de los cerebros teñidos se obtuvieron en un microscopio confocal y se procesaron con ImageJ / Fiji para asignar células a diferentes fases del ciclo celular. Abreviaturas: EdU = con 5-etinil-2'-desoxiuridina; pH3 = fosfo-histona H3; PFA = paraformaldehído; SM = medio de disección de Schneiders; PBS = solución salina tamponada con fosfato; PBST = PBS + 0,3% detergente no iónico; BSA = albúmina sérica bovina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Asignación de células a G1/G0; S; Fases S>G2/M y M. Las células progresan a través de las fases G1, S, G2 y M para completar un ciclo celular completo. Los NB CB de los cerebros larvales del tercer instar errante se marcaron con Miranda (rojo), EdU (gris), pH3 (verde) y el ADN se etiquetó con Hoechst 33342 (azul). Los NB etiquetados se analizaron en ImageJ y se asignaron a 4 fases distintas en función de si se tiñeron positivamente para (A) ni EdU ni pH3 (G1 / G0), (B) solo EdU (fase S), (C) tanto EdU como pH3 (S>G2 / M), y (D) solo pH3 (fase M). Aquí se muestran ejemplos de NB individuales solo de cerebros de tipo salvaje. Barras de escala = 5 μm. Abreviaturas: CB = cerebro central; NB = neuroblastos; EdU = con 5-etinil-2'-desoxiuridina; pH3 = fosfo-histona H3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Efecto de Mms19P en la distribución de fases del ciclo celular NB. (A) Tras el análisis de los NB de tipo salvaje (w;+;+), se encontró que ~ 25% de NB estaban en fase M. En mms19P NB, sin embargo, esta proporción aumentó a casi el 40%. Se sabe que la expresión mms19::eGFP en el fondo Mms19P rescata fenotipos Mms19P, y la proporción de NB de fase M en este fondo fue comparable a la de tipo salvaje. (B) Se compararon los porcentajes de NB en 4 categorías diferentes correspondientes a las fases del ciclo celular G1/G0, S, S>G2/M y M en todos los tipos silvestres; Mms19P, y Mms19::eGFP, Mms19P genotipos. La proporción de fases M y G1/G0 difiere considerablemente en los NB mms19P en comparación con los NB de tipo salvaje. En contraste, la distribución del ciclo celular de los NB en los cerebros Mms19::eGFP, Mms19P son comparables a la que se encuentra en el tipo salvaje. La significación estadística se calculó mediante la prueba de Kruskal-Wallis y se compararon múltiples columnas utilizando la prueba posterior de Dunn; (P<0.001). Esta cifra ha sido modificada a partir de 11. Abreviaturas: NB = neuroblastos; eGFP = proteína fluorescente verde mejorada; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivo Cantidad/volumen
EdU (componente A) 5 mg
Alexa Fluor 647 – azida (componente B) 1 vial
Dimetilsulfóxido (DMSO, componente C) 4 ml
Búfer de reacción Click-iT EdU (componente D) 4 ml (solución 10x)
Sulfato de cobre (CuSO4, componente E) 100 mM; 1 vial
Aditivo tampón Click-iT EdU (componente F) 400 mg
Hoechst 33342 (componente G) 10 mg/ml en agua, 35 μL

Tabla 1: Componentes del kit EdU. Componentes provistos con el Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit y las respectivas cantidades/volúmenes. Abreviatura: EdU = con 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Componentes de reacción Volumen (ml)
1x búfer de reacción Click-iT (preparado en el paso 1.4) 430
CuSO4 (componente E) 20
Alexa Fluor 647 – azida (componente B, preparado en el paso 1.3) 1.2
Aditivo tampón de reacción (componente F, preparado en la etapa 1.5) 50
Volumen total ~500

Tabla 2: Preparación del cóctel de detección EdU. El cóctel de detección EdU se preparó mezclando los volúmenes indicados de los componentes del kit (preparados en la sección 2). Abreviatura: EdU = con 5-etinil-2'-desoxiuridina.

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Discussion

La incorporación de EdU y su posterior reacción de 'clic' con azida permeable a células presenta ventajas prácticas de esta técnica sobre el método BrdU utilizado anteriormente7. Sin embargo, esta reacción es catalizada por iones Cu(I), y varios colorantes pueden ser inestables en presencia de este catalizador de cobre, como lo aconseja claramente el fabricante del kit Click-it EdU. Cuando se realizaron experimentos de inmunotinción después de ejecutar el paso de detección de EdU, no se observó la intensidad de señal esperada con los tintes de canal rojo, Alexa Fluor 568 y Cy3. Sin embargo, el protocolo funcionó cuando se completaron las reacciones de inmunotinción antes del paso de detección de EdU. Con este protocolo, se utilizaron cuatro canales para visualizar Hoechst, pH3, Miranda y EdU.

Otro paso optimizado en este protocolo fue la absorción de EdU por cerebros disecados en lugar de alimentar a las larvas con moscas con picos de EdU. Como el ciclo celular completo de Drosophila NB dura aproximadamente 2-2.5 h16, la absorción de EdU por parte de los cerebros durante 2.5 h, como en este protocolo, permite el seguimiento de un ciclo celular completo de NB. Las células que no se tiñen positivamente para EdU o pH3 son células en reposo. En el caso de una tercera larva instar en la que los NB se están dividiendo activamente, estas células en reposo probablemente estarían en la fase G1 del ciclo celular. Sin embargo, desde el embrión tardío hasta el segundo instar temprano, los NB se vuelven temporalmente inactivos17. En estas primeras etapas del desarrollo, la tinción doble negativa probablemente representaría una fase G0 / inactiva.

Los NB sometidos a replicación de ADN deben teñirse positivamente para EdU, mientras que las células que han progresado desde la fase S (incorporación de EdU) hasta la fase G2 o M tardía deben teñirse positivamente tanto para EdU como para pH3. Sin embargo, la caracterización de la fase G2 sería difícil con este protocolo, ya que las células G2 tempranas no se tiñen positivamente para EdU o pH3. Sin embargo, las células que han incorporado EdU y han progresado a G2 temprano también se tiñen positivamente para EdU y podrían complicar el análisis de la fase G2. Varios fármacos que inhiben la replicación del ADN causan la detención del ciclo celular en la fase S18,19,20. Este protocolo podría ser una herramienta conveniente para analizar e identificar el efecto de tales tratamientos farmacológicos, ya que las células bloqueadas en fase S no progresarían a la fase M y la fracción de células doblemente positivas de EdU, pH3, disminuiría o incluso estaría ausente en este caso.

En un estudio publicado recientemente, evaluamos el efecto del gen Mms19 sobre la progresión mitótica en NBs11. A través de imágenes de células vivas, demostramos un retraso dramático de los NB mms19P en la progresión de la fase M. Mientras que los NB de tipo salvaje completan la fase M en ~ 10 minutos, los NB mms19P tardaron alrededor del doble de tiempo en terminar la fase M11. En consecuencia, este protocolo de doble etiquetado EdU / pH3 también reflejó un retraso mitótico, ya que observamos casi 1,5 veces más NB que se tiñen positivamente para pH3 en cerebros Mms19P en comparación con cerebros de tipo salvaje. Por lo tanto, los datos de este protocolo EdU son comparables con los resultados directos de imágenes de células vivas. Como tales enfoques directos de células vivas consumen mucho tiempo y necesitan una optimización extensa, este protocolo podría utilizarse para realizar una detección inicial rápida de dichos mutantes del ciclo celular para comprender los defectos en etapas específicas. Una vez que se identifica una fase de interés, esto podría ser seguido por ensayos de visualización celular directa.

La duración de las fases del ciclo celular puede variar considerablemente entre los diferentes tipos de células y las etapas de desarrollo. Por ejemplo, en el desarrollo de embriones de Drosophila, la regulación a la baja de las quinasas mitóticas da como resultado una duración prolongada de la fase S, mientras que en las células destinadas a la diferenciación, como los progenitores neurales cerebrales del hurón(Mustela putorius furo),la duración de la fase S es marcadamente corta21,22. Por lo tanto, el tiempo de etiquetado de pulsos EdU debe optimizarse en función de la longitud de las fases S y G en el tipo de célula dado. La duración del pulso EdU también dependería de los objetivos experimentales, por ejemplo, un pulso corto es suficiente para medir la fracción de células actualmente en la fase S, mientras que un pulso más largo permite el análisis de la progresión de las células a través de la fase S.

La optimización extensa del pulso EdU también puede permitir la estimación de la fase S, como lo demostraron elegantemente Pereira y sus colegas23. Estos investigadores demostraron un nuevo método basado en la citometría de flujo en el que las células HCT116 fueron marcadas con pulsos con EdU durante períodos de tiempo incrementales. Los autores demostraron que la intensidad fluorescente máxima de EdU se obtiene cuando el tiempo de pulsación coincide con la longitud de la fase S23. Además, el análisis de la progresión temporal de las células marcadas con EdU también permitió la cuantificación de las fases G1 y G2/M. Aunque el protocolo actual para el doble etiquetado EdU/pH3 permite el análisis de defectos de fase S y M, no es posible medir la duración precisa de las fases con este protocolo. El protocolo descrito por Pereira y sus colegas podría ser una alternativa adecuada para ensayos que requieren la determinación de la duración de la fase del ciclo celular. La adaptación de este protocolo con un etiquetado de pH3 adicional también puede resultar en una mayor sensibilidad en la detección de células de fase M.

Además del enfoque EdU/pH3, el método del indicador del ciclo celular basado en biquitina (FUCCI) tambiénse ha utilizado para estudiar la progresión del ciclo celular en células de mamíferos, así como en tejidos de Drosophila24,25. Este sistema utiliza dos proteínas marcadas fluorescentemente, geminina y Cdt1, que contienen motivos para la ubiquitinación específica y la degradación proteasómica por APC/C y SCFSkp2,respectivamente. Como APC/C solo está activo desde el final de la mitosis hasta G1 y SCFSkp2 está activo en las fases S y G2, la degradación específica de la etapa del ciclo celular de la geminina marcada fluorescentemente y Cdt1 permite la determinación de la fase24del ciclo celular. Un método 'Fly-FUCCI' ligeramente modificado para los tejidos de Drosophila se basa, en cambio, en la ciclina B y E2F1 marcadas fluorescentemente, que se degradan por APC / C (durante la mitosis) y CRL4Cdt2 (durante el inicio de la fase S), respectivamente25. Un estudio previo que caracteriza la diferenciación prematura de los NB larvales de Drosophila en respuesta a la aneuploidía analizó los defectos del ciclo celular por los métodos Fly-FUCCI y EdU/pH34. La aneuploidía induce la diferenciación prematura de los NB y, por lo tanto, una alta fracción de nbes salen del ciclo celular.

Esto se reflejó con precisión tanto en fly-FUCCI como en los datos de EdU/pH34. Los datos obtenidos del método EdU/pH3 son, por lo tanto, también comparables con otros métodos de seguimiento del ciclo celular como el Fly-FUCCI. Fly-FUCCI es una herramienta poderosa, y todas las existencias de moscas con marcadores fluorescentes impulsados ubicuamente o marcadores fusionados a promotores específicos de tejidos están disponibles en los centros de existencias. Sin embargo, el uso de estas construcciones para analizar defectos del ciclo celular en mutantes nulos o con derribo de siRNA implicaría una recombinación genética para crear un stock de moscas que transporta los elementos FUCCI, los impulsores específicos del tejido, una mutación específica o un siRNA de interés. Este proceso retrasaría el experimento real durante varias semanas, mientras que el método EdU / pH3 se puede aplicar fácilmente a las líneas de mosca con un fondo genético nulo. Alternativamente, para los derribos de siRNA, se puede utilizar un cruce de un solo paso entre un stock de controlador y un stock de siRNA para el análisis de EdU / pH3.

Un inconveniente de este enfoque es la tubería de imágenes y análisis de imágenes, que implica la cuantificación manual de una gran cantidad de células de varias muestras de cerebro. Recientemente, se ha presentado un enfoque de citometría de flujo como una alternativa de alto rendimiento a un ensayo convencional basado en microscopía para el análisis del ciclo celular26. El análisis rápido de miles de células al mismo tiempo con este enfoque es ventajoso, y la capacidad de detectar múltiples marcadores permite la cuantificación de tipos de células específicas. Aunque se puede utilizar fácilmente con líneas celulares cultivadas, este protocolo puede ser difícil de aplicar a muestras de tejido grandes como el cerebro larvario de Drosophila. Sin embargo, se han publicado algunos protocolos que describen la disociación del tejido cerebral y el análisis de NB larvales aisladas por citometría de flujo27,28. Otros enfoques innovadores en esta dirección pueden presentar nuevas oportunidades para el análisis del ciclo celular de alto rendimiento en los tejidos de Drosophila.

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Disclosures

Los autores han declarado que no existen intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (subvención del proyecto 31003A_173188; www.snf.ch) y la Universidad de Berna (www.unibe.ch) a BS. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) Bloomington stock center #15477 P-element insertion in the third exon of Mms19
 +; Mms19::eGFP, Mms19p Generated in house eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118 Bloomington stock center #3605 wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies Dilution
Rat anti-Miranda Abcam Ab197788 1/250
Rabbit anti-pH3 Cell Signaling 9701 1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3 Jackson Immuno 112-165-167 1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 Invitrogen A11077 1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A27034 1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium Polysciences Inc 18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 Thermo Fischer Scientific C10340
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fischer Scientific 21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V Merck 10735078001
Triton X-100 Fischer Scientific 9002-93-1 non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej) https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X) Leica microsystems
PRISM Graph pad software Version 5
Microsoft Excel Microsoft office 2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper

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References

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Biología Número 171
Protocolo de doble marcado de 5-etinil-2'-desoxiuridina/fosfo-histona H3 para el análisis de progresión del ciclo celular en células madre neurales <em>de Drosophila</em>
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Chippalkatti, R., Suter, B. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62642, doi:10.3791/62642 (2021).

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