Summary
Här beskriver vi ett protokoll för finjustering av regioner av intresse (ROI) för Spatial Omics-teknik för att bättre karakterisera tumörmikromiljön och identifiera specifika cellpopulationer. För proteomikanalyser kan automatiserade anpassade protokoll styra ROI-valet, medan transkriptomikanalyser kan finjusteras med hjälp av ROI så små som 50 μm.
Abstract
Multiplexering möjliggör bedömning av flera markörer på samma vävnad samtidigt som det ger rumsligt sammanhang. Spatial Omics-teknik möjliggör både protein- och RNA-multiplexering genom att utnyttja fotoklyvbara oligomärkta antikroppar respektive sonder. Oligos klyvs och kvantifieras från specifika regioner över vävnaden för att belysa den underliggande biologin. Här visar studien att automatiserade anpassade antikroppsvisualiseringsprotokoll kan användas för att vägleda ROI-val i samband med rumsliga proteomikanalyser. Denna specifika metod visade inte acceptabel prestanda med rumsliga transkriptomikanalyser. Protokollet beskriver utvecklingen av en 3-plex immunofluorescerande (IF) analys för markörvisualisering på en automatiserad plattform, med hjälp av tyramidsignalförstärkning (TSA) för att förstärka den fluorescerande signalen från ett givet proteinmål och öka antikroppspoolen att välja mellan. Visualiseringsprotokollet automatiserades med hjälp av en noggrant validerad 3-plex-analys för att säkerställa kvalitet och reproducerbarhet. Dessutom utvärderades utbytet av DAPI mot SYTO-färgämnen för att möjliggöra avbildning av TSA-baserade IF-analyser på den rumsliga profileringsplattformen. Dessutom testade vi möjligheten att välja små ROI med hjälp av den rumsliga transkriptomikanalysen för att möjliggöra undersökning av mycket specifika intresseområden (t.ex. områden berikade för en viss celltyp). ROI med 50 μm och 300 μm diameter samlades in, vilket motsvarar cirka 15 celler respektive 100 celler. Prover gjordes till bibliotek och sekvenserades för att undersöka förmågan att detektera signaler från små ROI och profilspecifika regioner i vävnaden. Vi bestämde oss för att rumsliga proteomiktekniker drar stor nytta av automatiserade, standardiserade protokoll för att vägleda ROI-urval. Även om detta automatiserade visualiseringsprotokoll inte var kompatibelt med rumsliga transkriptomikanalyser, kunde vi testa och bekräfta att specifika cellpopulationer framgångsrikt kan detekteras även i små ROI med standardprotokollet för manuell visualisering.
Introduction
Framsteg inom multiplexeringstekniker fortsätter att ge bättre karakteriseringsverktyg för mål som finns i tumörer. Tumörmikromiljön (TME) är ett komplext system av tumörceller, infiltrerande immunceller och stroma, där rumslig information är avgörande för att bättre förstå och tolka mekanismer för interaktion mellan biomarkörer av intresse1. Med nya tekniker som GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) och 10x Visium kan flera mål detekteras och kvantifieras samtidigt inom sitt rumsliga sammanhang. Användningen av immunofluorescensprotokoll som underlättar vävnadsvisualisering kan ytterligare förbättra de rumsliga profileringsfunktionerna för dessa tekniker.
Den Spatial Omics-teknik vi fokuserat på för denna metodutveckling består av rumsliga proteomik- och transkriptomikanalyser där oligonukleotider är fästa vid antikroppar eller RNA-sonder via en UV-känslig fotokleaverbar länkare. Histologiska diabilder märks med dessa oligokonjugerade antikroppar eller sonder och avbildas sedan på den rumsliga profileringsplattformen. Därefter väljs ROI av olika storlekar och former för belysning, och de fotoklyvade oligonukleotiderna aspireras och samlas i en 96-brunnsplatta. De fotokleaverade oligonukleotiderna bereds för att kvantifieras med antingen nanosträng nCounter-systemet eller nästa generations sekvensering (NGS)2,3 (figur 1)4,5.
Cellfördelningar varierar inom vävnader, och förmågan att karakterisera specifika platser för celler med hjälp av utvalda markörer och olika ROI-storlekar är av stor betydelse för att fullt ut förstå vävnadsmiljön och identifiera specifika egenskaper. I Spatial Omics-tekniken som nämns här använder standardvisualiseringsprotokollet direkt konjugerade antikroppar och är ett manuellt protokoll. Standardmarkörerna för att skilja mellan tumör och stroma är panCytokeratin (panCK) och CD456,7, men ytterligare markörer är nödvändiga för att rikta in sig på specifika cellpopulationer av intresse. Dessutom saknar användningen av direkt konjugerade fluorescerande antikroppar förstärkning, vilket begränsar antikroppsselektionen till rikliga markörer. Dessutom är manuella analyser föremål för mer variation än automatiserade arbetsflöden8. Därför är det önskvärt att ha ett anpassningsbart, automatiserat och förstärkt visualiseringsprotokoll för ROI-val.
Här visar studien att TSA-teknik för rumsliga proteomikanalyser kan användas för visualiseringsprotokoll på en automatiserad plattform vilket resulterar i en mer riktad och standardiserad analys. Dessutom möjliggör TSA-baserade analyser användning av låguttryckande markörer, vilket ökar utbudet av mål som kan väljas för visualisering. En 3-plexanalys för panCK, FAP och Antibody X utvecklades med hjälp av en automatiserad plattform där panCK och FAP användes för att skilja mellan tumör respektive stroma. Antikropp X är ett stromalt protein som ofta förekommer i tumörer, men dess biologi och inverkan på antitumörimmunitet är inte helt förstådda. Att karakterisera immunkontextur i områden som är rika på antikropp X kan belysa dess roll i antitumörimmunitet och terapeutiskt svar, liksom dess potential som läkemedelsmål.
Medan anpassade automatiserade TSA-visualiseringspaneler visade sig vara framgångsrika för rumsliga proteomikanalyser, kunde tillämpningen av dessa analyser för rumsliga transkriptomikanalyser inte bekräftas. Detta beror troligen på reagenserna och protokollet som används för de automatiserade visualiseringsprotokollen, som verkar äventyra RNA-integriteten. Att erkänna att ett automatiserat märkningsprotokoll för visualiseringsmarkörer kan användas för rumsliga proteomikanalyser men inte för rumsliga transkriptomikanalyser ger viktig vägledning om Spatial Omics-teknikanalysdesign.
Dessutom visar studien att den rumsliga transkriptomikanalysen kan användas för att profilera mål i regioner så små som 50 μm i diameter, eller cirka 15 celler. Två roi:er av olika storlek valdes för att testa analysens förmåga att även upptäcka transkriptioner i små ROI:er. För varje region av intresse samlades oligos motsvarande 1 800 mRNA-mål in och gjordes till bibliotek enligt protokollet för rumslig profileringsplattform. Biblioteken indexerades individuellt, poolades därefter och sekvenserades. Detta möjliggjorde utvärderingen av både poolningseffektivitet och förmågan att identifiera specifika cellpopulationer i små ROI.
Detta dokument visar att för rumsliga proteomikanalyser kan ett automatiserat protokoll för att styra ROI-val på specifika markörer av intresse användas för att selektivt rikta in sig på förhör av relevanta vävnadsområden och karakterisera vävnadens rumsliga miljö. Dessutom visar vi att mindre ROI kan användas för rumsliga transkriptomiska analyser för att upptäcka och karakterisera specifika cellpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mänskliga vävnader förvärvades från kommersiella biobanker eller ackrediterade vävnadsbanker under garanti för att lämpligt godkännande från institutionella granskningsnämnden och informerat samtycke erhölls.
Protokollet utförs med Discovery Ultra och GeoMx Digital Spatial Profiler. Se materialförteckningen för mer information om reagenser, utrustning och programvara som används i detta protokoll.
1. Automatiserat visualiseringsprotokoll för rumsliga proteomikanalyser
- Programmera autostainer för att applicera fluorescerande visualiseringsantikroppar
- I autostainer-programvaran klickar du på hemknappen och väljer Protokoll. Klicka sedan på Skapa / redigera protokoll och välj RUO DISCOVERY Universal som procedur.
- Klicka på Första sekvensen > Deparaffinization > Depar v2. För Medeltemperatur väljer du 72 Deg C, klickar sedan på Förbehandling och väljer Cellkonditionering och CC1-reservoar. För mycket hög temperatur, välj 100 grader C, klicka sedan på CC1 8 min och fortsätt klicka tills CC1 64 min är valt.
- Klicka på Inhibitor > DISCOVERY Inhibitor, och för Inkubationstid, välj 8 minuter. Klicka sedan på Antikropp > High Temp Ab Incubation; för låg temperatur, välj 37 grader C; för Antikropp, välj antikroppsnummer från dispenseretiketten (Antikropp 6 i det här exemplet); för Plus inkubationstid, välj 32 minuter.
OBS: Detta protokoll har tre olika antikroppsnummer. Den första antikroppen är FAP, den andra är Pan-Cytokeratin och den tredje är Antikropp X. - Klicka på Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, välj sedan Gt Ig Block för Antikroppsblockering och för Inkubationstid väljer du 4 minuter. Välj sedan OMap anti-Rb HRP på Multimer HRP Reagens och för Inkubationstid väljer du 16 minuter. Klicka sedan på Cy5 och för lång inkubationstid väljer du 0 Hr 8 Min.
- Klicka på Dual Sequence och välj Antibody Denaturation, välj sedan Antibody Denature CC2-1, och för Very High Temperature, välj 100 Deg C. Se till att inkubationstiden är 8 min. Klicka sedan på DS-hämmare och välj Neutralisera.
- Klicka på DS Antikropp och välj 37 grader C för mycket låg temperatur. Välj sedan antikroppsnumret från dispenseretiketten (Antikropp 3 i det här exemplet) i Antikropp och för Plus inkubationstid väljer du 32 minuter.
- Klicka på DS Multimer HRP och välj DS Multimer HRP Blocker. Välj sedan Gt Ig Block för antikroppsblockering och för Inkubationstid väljer du 4 minuter. Välj sedan OMap anti-Ms HRP på Multimer HRP Reagens och för Inkubationstid väljer du 16 minuter. Klicka sedan på DS Rhodamine 6G, och för lång inkubationstid, välj 0 Hr 8 Min.
- Klicka på Triple Stain och välj TS Antibody Denaturering, välj sedan Antibody Denature CC2-2, och för Mycket hög temperatur, välj 100 Deg C. Se till att inkubationstiden är 8 min. Klicka sedan på TS-hämmare och välj TS Neutralisera.
- Klicka på TS Antikropp och för Mycket låg temperatur, välj 37 Deg C. Välj sedan antikroppsnumret från dispenseretiketten (Antikropp 7 i det här exemplet) i Antikropp och för Plus inkubationstid väljer du 32 minuter.
- Klicka på TS Multimer HRP och välj TS Multimer HRP Blocker. Välj sedan Gt Ig Block för antikroppsblockering och för Inkubationstid väljer du 4 minuter. Välj sedan OMap anti-Rb HRP på Multimer HRP Reagens och för Inkubationstid väljer du 16 minuter. Klicka sedan på TS FAM, och för Lång inkubationstid, välj 0 Hr 8 Min.
- Lägg till en rubrik i protokollet. Välj ett protokollnummer, lägg till en kommentar och klicka på Aktiv följt av Spara.
- Förbered bilder, skriv ut etiketter och starta autostainerkörningen
- Bakleverantör anskaffade FFPE (formalinfixerade, paraffininbäddade) mänskliga vävnadssektioner i en ugn inställd på 70 ° C i 20-60 minuter. Medan bilderna bakar skriver du ut etiketter genom att klicka på Skapa etikett i autostainer-programvaran. Klicka sedan på Protokoll, välj protokollnummer och klicka på Stäng/skriv ut. Lägg till relevant information på bildetiketten och klicka på Skriv ut.
- Ta ut glasrutschkanorna ur ugnen och låt dem svalna till rumstemperatur (RT). Använd de tidigare utskrivna protokolletiketterna på motsvarande bilder.
- Ladda påfyllningsbara antikroppsbehållare med antikroppar enligt antikroppsetikettnumret som tilldelats i steg 1.1. I detta protokoll, använd antikropp 6 för FAP vid 1 μg / ml, använd antikropp 3 för pan-cytokeratin vid 0,1 μg / ml och använd antikropp 7 för antikropp X vid 2,5 μg / ml. Späd varje antikropp i det angivna spädningsmedlet och fyll på de påfyllningsbara antikroppsdispensrarna.
- Samla blockering, detektion och förstärkning förfyllda reagensdispensrar som nämns ovan och placera dem på en reagensbricka. Ladda bilder i bildfacken (upp till 30 bilder per körning) och klicka på Löpning följt av Ja. Observera att DAPI inte används för nukleär motfärgning.
- Bekräfta körningens start genom att kontrollera körtiden på autostainer-programvaran. Protokollet tar ~ 11 timmar för slutförande och kan köras över natten.
- Nästa dag, se till att körningen slutförs genom att observera gröna blinkande lampor på glidbrickans slitsar. Ta sedan bort bilderna från instrumentet och skölj bilderna kraftigt i 1x reaktionsbuffert tills den flytande täckglaslösningen är helt borttagen.
- Protokoll för rumslig profileringsplattform för proteomikanalys
- Följ det rumsliga proteomikprotokollet som anges i anteckningen nedan. Inkludera följande ändringar i protokollet för att aktivera 3-plex automatiserad märkningsprocedur.
- Utför steg 1.2.1-1.2.6 dagen innan du startar det rumsliga proteomikprotokollet och gå direkt till antigenhämtningssteget i det rumsliga proteomikprotokollet efter att ha utfört steg 1.2.6. Utelämna visualiseringsproceduren som beskrivs i proteomikprotokollet för rumslig profilering.
- Byt ut SYTO 13 mot SYTO 64 vid 5000 nM för att möjliggöra fluoroforintegration. Späd SYTO 64 i 1x TBS och inkubera i en fuktighetskammare i 15 minuter.
- När du ställer in skanningsparametrarna i den rumsliga profileringsplattformen väljer du filter och fokuseringskanaler enligt fluoroforerna som används i visualiseringspanelen för att möjliggöra 3-plex-integration. Använd FITC för DISCOVERY FAM och ställ in exponeringen på 200 ms, använd Cy3 för DISCOVERY Rhodamine 6G och ställ in exponeringen på 200 ms, använd Texas Red för SYTO 64 och ställ in exponeringen på 50 ms (ange detta som fokuskanal) och slutligen, använd Cy5 för DISCOVERY Cy5, ställ in exponeringen på 200 ms, och spara ändringar.
OBS: Detaljerade instruktioner för det rumsliga profileringsproteomicsprotokollet finns på den officiella webbplatsen Fliken Support genom att välja Dokumentation > användarmanualer. Här letar du efter proteinprotokollet för nCounter med Bond RX.
2. ROI-val för rumsliga transkriptomikanalyser
- Grädda FFPE-cellpelletspartierna i en ugn inställd på 70 °C i 20-60 min. Följ NGS-protokollet för den rumsliga profileringsplattformen som anges i anteckningen nedan och skanna bilder på den rumsliga profileringsplattformen och välj storlekar på 50 μm och 300 μm. Följande rekommendation är markerad för den rumsliga transkriptomikanalysen:
- När du förbereder biblioteket, om olika storlekar av ROI har valts, samlar du ihop ROI:er av liknande storlekar för att skapa ett bibliotek per storlek. Detta för att säkerställa att tillräckliga sekvenseringsdjup uppnås för alla roi:er utan partiskhet från storlek.
OBS: Detaljerade instruktioner för den rumsliga profileringsplattformen finns på den officiella webbplatsens supportflik genom att välja Dokumentation > användarmanualer. Här letar du efter RNA-protokollet för NGS-applikationer som använder Bond RX.
- När du förbereder biblioteket, om olika storlekar av ROI har valts, samlar du ihop ROI:er av liknande storlekar för att skapa ett bibliotek per storlek. Detta för att säkerställa att tillräckliga sekvenseringsdjup uppnås för alla roi:er utan partiskhet från storlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Automatiserat visualiseringsprotokoll för att vägleda ROI-val
I det här dokumentet presenterar vi användningen av ett automatiserat, anpassat TSA-baserat IF-protokoll för att visualisera vävnaden och välja specifika ROI. Visualiseringspanelens utveckling med melanom och human normal hud som kontrollvävnader bestod av epitopstabilitetstestning, finjustering av markörintensiteter och genomblödningsbedömning genom att lämna en ut kontroller. För att testa om antikropparnas epitopstabilitet påverkas av repetitiva elueringssteg bedömdes FAP- och Antikropp X-signaler kvalitativt efter märkning i varje position av 3-plexen. Antikropp X-signalen förblev konsekvent i alla positioner, medan FAP-signalintensiteten minskade efter en eluering (figur 2). Tidigare interna studier visade att panCK-epitopen är stabil under en 3-plex-analys. Därför valdes FAP för att vara i 1: a positionen i 3-plex, panCK placerades i 2:a och Antikropp X i 3:e positionen. Eftersom FAP-signalen totalt sett var svagare jämfört med Antikropp X och panCK, parades FAP ihop med den ljusare fluoroforen, Cy5.
Den automatiserade 3-plexen optimerades med lämna en ut-kontroll, där varje markör utelämnades från 3-plex-protokollet en gång för att bekräfta att det inte fanns någon genomblödning i angränsande kanaler (figur 3).
Fluoroforerna som används på den automatiserade färgningsplattformen testades på den rumsliga profileringsplattformen för att bekräfta att filtren är kompatibla med TSA-fluoroforerna i 3-plex-visualiseringspanelen. Eftersom 3-plex-protokollet använder FITC, Cy3 och Cy5, och DAPI-kanalen används för UV-klyvning på den rumsliga profileringsplattformen, måste en kärnmotfläck i Texas Red-kanalen användas. Två olika kärnfärger, SYTO 59 och SYTO 64, testades och färgämnena visade en distinkt kärnsignal i kolonvävnader. SYTO 59 visade dock också en viss genomblödningssignal i Cy5-kanalen medan Cy5-kanalen var ren när SYTO 64 användes (figur 4). Därför var SYTO 64 det föredragna valet för kärndetektering.
Ytterligare tester av SYTO 64 visade att detta färgämne inte var fotostabilt och fotoblektes snabbt under avbildning. När signalen har blekts fokuserar bildsystemet på bakgrunden, vilket kan tolkas som en ospecifik signal (figur 5). Att öka koncentrationen av kärnfärgämnet för att öka signalintensiteten hjälpte till att minimera problemet.
Vävnader märkta med panCK / CD45 manuellt visualiseringsprotokoll, som använder direkt konjugerade antikroppar, jämfördes med vävnader märkta med panCK / FAP / Antibody X automatiserade anpassade visualiseringsprotokoll. Båda protokollen delar panCK som en gemensam markör, och signalen var jämförbar mellan de två protokollen (figur 6).
För att säkerställa att ett modifierat visualiseringsprotokoll inte har någon inverkan på den uppströms rumsliga proteomikanalysen jämförde vi de antalsvärden som erhållits efter insamling av rumslig profileringsplattform och bearbetning av räkningsplattform när vi använde det manuella visualiseringsprotokollet panCK/CD45. Detta använder direkt konjugerade antikroppar eller 3-plex automatiserat anpassat visualiseringsprotokoll, som använder TSA. Fyra vävnader för kolorektal cancer (CRC) märktes med panCK/CD45 manuellt visualiseringsprotokoll eller 3-plex automatiserat anpassat visualiseringsprotokoll i kombination med den rumsliga proteomikanalysen. Liknande ROI valdes för varje protokoll, och räkningsdata för motsvarande ROI jämfördes med hjälp av hushållningsnormalisering för S6 och Histone. Liknande trender observerades mellan dessa ROI som visas i log2-värmekartan (figur 7A), med ett Spearman R-värde på 0,88 för alla markörer som ingår i den rumsliga proteomikanalysen (figur 7B). Av de 31 antikroppar som användes i analyserna hade 23 antikroppar ett Spearman R-värde högre än eller lika med 0,5.
Eftersom rumslig proteomik och transkriptomiska protokoll skiljer sig åt utvärderade vi om det automatiserade visualiseringsprotokollet också kunde tillämpas på rumsliga transkriptomikanalyser. Det automatiserade visualiseringsprotokollet kräver att IHC-analysen utförs före RNA-detektering, medan det ursprungliga manuella protokollet upptäcker RNA först innan visualiseringsprotokollet tillämpas. Det automatiserade visualiseringsprotokollet med 3-plex testades sida vid sida med CK/CD45 manuella visualiseringsprotokoll i kombination med den rumsliga transkriptomikanalysen. Sekvenseringsdata för det automatiserade visualiseringsprotokollet Quartile 3 (Q3) med 3-plex, normaliserat på programvaran för rumslig profilering, presenterade lägre värden jämfört med CK/CD45 manuella visualiseringsprotokoll (figur 8A), vilket också återspeglas av de låga Spearman R-värdena på 0,15 (figur 8B). Dessutom observerades en förlust av dynamiskt omfång vid användning av det automatiserade protokollet för 3-plexvisualisering (figur 8C).
Denna förlust av antal med det automatiserade visualiseringsprotokollet indikerar att detta protokoll äventyrar RNA-integriteten och att detektering av RNA innan visualiseringsanalysen utförs är nödvändig för att bevara RNA-kvaliteten. Eftersom denna automatiserade visualiseringspanel kräver att proteindelen utförs före RNA-detektion är detta protokoll inte lämpligt för RNA-analyser.
Storlek på ROI-val i rumsliga transkriptomikanalyser
För att bättre förstå effekten av ROI-storlek på RNA-datautmatning jämfördes RNA-antal av olika storlek ROI. Den rumsliga transkriptomikanalysen utfördes på SUDHL1- och JURKAT-cellinjer för att minimera skillnader som är inneboende i vävnader. Cirkulära ROI med en diameter på 50 μm och 300 μm valdes och jämfördes med varandra med hjälp av Q3-normalisering på programvaran för rumslig profilering. RNA-räkningar för utvalda mål på olika cellinjer var jämförbara mellan de två ROI-storlekarna efter normalisering (figur 9A, B).
Bild 1: Arbetsflöde för digital rumslig profilering. (A) Objektsglas är märkta med antikroppar (spatial proteomics-analys) eller sonder (spatial transcriptomics-analys) samt visualiseringsmarkörer. (B) Bilder placeras på den rumsliga profileringsplattformen för att avbilda och välja ROI. (C) Oligos klyvs av UV-ljus och samlas i en 96-brunnsplatta. Den här processen upprepas för varje ROI som väljs. (D) Proverna bearbetas och data genereras med hjälp av räkningsplattformen eller en sequencer. Denna siffra har modifierats från Nanostring technologies webbplats 4,5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Epitopisk stabilitet. (AC) Antikropp X och (D-F) FAP testade på human normal hud respektive melanom. Varje markör i (A,D) 1st, (B,E) 2 nd och (C,F) 3rd position av en 3-plex. Antikropp X är stabil i alla positioner, medan (D) FAP visar minskande signalintensitet efter (E-F) en respektive två elueringar. Antikropp X i grönt, FAP i rött, DAPI i grått. Skalstrecken är på 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Lämna en ut kontroller för 3-plex automatiserat anpassat visualiseringsprotokoll på mänskliga bukspottkörtelvävnader. För alla bilder är Antibody X avbildad i grönt, panCK i cyan och FAP i rött. Den första raden visar (A) 3-plex och de enskilda kanalerna för (B) Antikropp X i FITC, (C) panCK i Cy3 och (D) FAP i Cy5. Den andra raden visar den utelämnande kontrollen 3-plex för (E) Antikropp X och (F-H) de enskilda kanalerna för varje markör. Den tredje raden visar lämna en ut kontroll 3-plex för (I) panCK och (J-L) de enskilda kanalerna för varje markör. Den fjärde raden visar lämna en ut kontroll 3-plex för (M) FAP och (N-P) de enskilda kanalerna för varje markör. Ingen genomblödning observerades i någon av utelämnande kontrollerna, vilket indikeras av brist på signal i motsvarande kanaler när de testades (F) utan FAP, (K) utan panCK och (P) utan antikropp X. Skalstrecken är vid 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: SYTO-färgämnestestning. Texas Red channel visar kärnsignalen i Colon för (A) SYTO 59 med genomblödning till (B) Cy5-kanal (röd). Texas Red channel visar kärnsignalen i Colon för (D) SYTO 64 utan genomblödning till (E) Cy5-kanal. Texas Red- och Cy5-kanaler i Colon visas tillsammans för att visa (C) genomblödning av SYTO 59 och (F) ingen genomblödning för SYTO 64. Skalstrecken är på 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: SYTO 64 fotostabilitet. Kolonprover märkta med SYTO 64 (A) före och (B) efter fotoblekning. Bild B visar den ospecifika signalen som blir mer synlig efter kärnsignalförlust. Skalstrecken är på 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Jämförelse av panCK-märkning . panCK-signal på kolorektal cancer (CRC) prover med (A) panCK / CD45 manuellt visualiseringsprotokoll och (B) panCK / FAP / Antibody X automatiserat visualiseringsprotokoll. Inga skillnader i panCK-signal observerades mellan de två protokollen. Skalstrecken är på 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Jämförelse av antalsvärden för den rumsliga proteomikanalysen med hjälp av två olika visualiseringsprotokoll på liknande avkastning på fyra CRC-vävnader. (A) Log 2 Värmekarta över alla markörer som ingår i den rumsliga proteomikanalysen som jämför det manuella panCK / CD45-protokollet (svart) med det automatiserade 3-plex-protokollet (grått). (B) Log 2 Spearman-korrelation för alla markörer ger ett R-värde på 0,88. Statistisk analys utfördes med hjälp av GraphPad Prism 7 Software eller med Python programmeringsspråk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Jämförelse av antalsvärden för den rumsliga transkriptomikanalysen med hjälp av två olika visualiseringsprotokoll. (A) Logg 2 Värmekarta över utvalda mål som ingår i den rumsliga transkriptomikanalysen som jämför det manuella panCK/CD45-protokollet (svart) med det automatiserade 3-plexprotokollet (grått). (B) Log 2 Spearman-korrelation för alla markörer ger ett R-värde på 0,15. (C) Medelvärdet (blått) och standardavvikelsen där det dynamiska området går förlorat i det automatiserade 3-plex-protokollet. Statistisk analys utfördes med hjälp av GraphPad Prism 7 Software eller med Python programmeringsspråk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Jämförelse av RNA-antalsvärden för den rumsliga transkriptomikanalysen på cellpellets. Jämförbara resultat observerades för ROI med en diameter på 50 μm (svart) och 300 μm (grå) för utvalda mål på (A) SUDHL1 och (B) JURKAT-cellinjer. Ingen signifikant skillnad observerades med hjälp av t-test. Medelvärde och standardavvikelse som visas för n = 3 avkastningar per storlek. Statistisk analys utfördes med hjälp av GraphPad Prism 7 Software. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hittills används direkt konjugerade fluorescerande antikroppar i ett manuellt protokoll oftast som visualiseringspaneler för rumslig proteomik eller rumslig transkriptomikanalys 9,10. Användningen av direkt konjugerade fluorescerande antikroppar kan dock vara utmanande för mindre rikliga markörer, vilket begränsar valet av lämpliga antikroppar. Detta protokoll visar att märkning av visualiseringsmarkörer kan automatiseras på en automatiserad färgningsplattform med TSA-teknik för att stödja rumsliga proteomikanalyser. Detta möjliggör mer flexibilitet i anpassningen av visualiseringspaneler, vilket möjliggör ett mer riktat ROI-urval och förvärv av relevanta biologiska data från specifika områden i en vävnad. TSA-tekniken möjliggör också visualisering av markörer med låg förekomst och ökar därmed antalet potentiella lämpliga antikroppar. Dessutom säkerställer automatisering av visualiseringsprotokollet reproducerbarhet och kvalitet på märkningsproceduren.
Att utveckla en 3-plex IF-analys kräver noggrann bedömning av markör/ fluoroforsignalintensiteter på lämpliga kontrollvävnader. Det rekommenderas att titrera antikroppskoncentrationer för att få det bästa signal-brusförhållandet, vilket hjälper till att minimera genomblödning i intilliggande kanaler. Dessutom bör epitopstabiliteten för varje markör av intresse testas för att säkerställa att epitopen inte påverkas av upprepade elueringssteg. När ordningen på antikroppar i panelen har bekräftats måste analysen finjusteras med hjälp av lämna en ut-kontroll. Här utelämnas en specifik markör i panelen, och motsvarande kanal i den förvärvade bilden granskas för genomblödning och korsprat.
Det visades här att TSA-baserade analyser kan avbildas på den rumsliga profileringsplattformen och att DAPI-alternativ måste användas för kärnfärgning. Vi testade SYTO-färgämnen och bestämde att när vi bestämmer vilket SYTO-färgämne som ska användas måste signalen bedömas noggrant för att undvika genomblödning i intilliggande kanaler. En annan begränsning av användningen av SYTO-färgämnen är att vissa SYTO-färgämnen fotobleks snabbare, såsom SYTO 64 och SYTO 83 (interna data), vilket kan påverka kärnkvantifiering. Därför bör ljusexponering av de färgade bilderna undvikas så mycket som möjligt. Andra grupper har visat användningen av SYTO 1311,12, som är mer fotostabil (interna data) och kan användas i en panel så länge markörerna av intresse tilldelas fluoroforer som är kompatibla med det valda kärnfärgämnet.
Medan automatiserade TSA-baserade fluorescerande analyser fungerade bra för visualisering i kombination med rumsliga proteomikanalyser, bestämdes det här att kombinationen av ett 3-plex automatiserat visualiseringsprotokoll med ett rumsligt transkriptomikprotokoll resulterade i förlust av dynamiskt omfång, vilket kan bero på de hårdare protokollförhållandena för att lägga till extra antigenhämtnings- / elueringssteg som kan påverka RNA-integriteten. Därför bör det automatiserade visualiseringsprotokollet 3-plex endast anpassas för proteomikanalyser, vilket är en begränsning och kräver alternativa visualiseringsmetoder för RNA-baserade analyser. Som ett alternativ till visualisering med samma bild kan seriella sektioner färgade med markörer av intresse överlagras för att underlätta ROI-val13. Dessutom beskriver litteraturen användningen av in situ-hybridisering på intilliggande bilder för att styra ROI-val 14. Dessa tillvägagångssätt kan dock begränsas av vävnadstillgänglighet, sektion-till-sektion-variabilitet och cell-till-cell-registreringar.
Vi testade också användbarheten av olika ROI-storlekar för rumsliga transkriptomikanalyser. Genom att använda små roi:er på 50 μm kan forskaren samla in data från specifika regioner vilket möjliggör en mer detaljerad avläsning av utvalda celler eller intresseområden. Begränsningar med att välja små ROI är att antalet celler som finns kanske inte är tillräckligt rikligt för att få räkningsvärden som kan särskiljas från bakgrunden. Ett alternativ är att välja rena cellpopulationer för att fånga mindre rikliga mål. ROI-valet för enskilda celler begränsas dock av högt signal-brusförhållande15. Dessutom är det viktigt att överväga ROI-storlekar för biblioteksförberedelser om roi:er av olika storlek samlas in i ett enda experiment. Om ROI-storlekarna skiljer sig avsevärt kan det vara fördelaktigt att slå samman ROI:er enligt deras storlekar och skapa separata bibliotek för att förhindra att stora ROI:er överrepresenteras i ett bibliotek. Detta kommer också att säkerställa att varje ROI får tillräcklig sekvenseringstäckning beroende på dess storlek.
Andra faktorer att tänka på när du utför Spatial Omics-experiment är att data kan visa variationer på grund av glid-till-bild-variabilitet, och lägre uttryck för vissa mål kan ge bakgrund och skillnader i korrelationsvärden. Adekvata kontroller och normaliseringsmetoder måste beaktas vid planering av experiment och utvärdering av data. För rumsliga proteomikanalyser på nCounter är normalisering till hushållningsmål eller till den negativa kontrollen IgG de föredragna metoderna enligt intern erfarenhet och leverantörsrekommendationer där korrelationen mellan hushållningsmålen eller till den negativa kontrollen IgG behöver utvärderas16. Beroende på vilka vävnader som används måste dock den bästa normaliseringen definieras för varje studie17,18. Till exempel säger litteraturen att för bröstcancer Spatial Omics-studier har GAPDH, som vanligtvis används för att normalisera till hushållningsmål, varit mindre överensstämmande än S6 och Histone19. Därför har S6 och Histone varit de rekommenderade hushållningsmålen för normalisering i bröstcancervävnader19.
För rumsliga transkriptomikanalyser måste normaliseringsstrategier definieras beroende på studiedesign (t.ex. vävnadstyper och ROI-urval). Vissa strategier som används i RNA-Seq, till exempel övre kvartil eller trimmat medelvärde av M-värden (TMM) normalisering, kan tillämpas för att normalisera sekvenserade data19,20.
Rumsliga transkriptomikanalyser ger information om tusentals mål och blir allt vanligare för att utforska hela transkriptomet, där specifika TME-fack väljs och analyseras i samband med enkärnig RNA-seq20 eller encellig RNA-sekvensering21. Vi visade att visualiseringsprotokoll för att styra ROI-val för att bedöma den rumsliga fördelningen av mål kan automatiseras för rumsliga proteomikanalyser men inte för rumsliga transkriptomikanalyser. Dessutom presenterar vi att ROI så små som 50 μm kan väljas för att möjliggöra en mer djupgående undersökning av en viss vävnadsregion. Framtida tillämpningar av denna teknik kommer att förbättra förståelsen för tumörmikromiljön.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan och Sandra Rost är anställda och aktieägare i Genentech, medlem i Roche Group. Andra företag som ingår i Roche producerar reagenser och instrument som används i detta manuskript. Ciara Martin är heltidsanställd på NanoString Technologies Inc, som producerar reagenser och instrument som används i detta manuskript.
Acknowledgments
Författarna erkänner Thomas Wu för bearbetning av NGS-filer. Vi tackar James Ziai för resultatdiskussionerna och manuskriptgranskningen och Meredith Triplet och Rachel Taylor för intern manuskriptrevision.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
