Summary
Для оценки противоопухолевых препаратов с использованием опухолевых органоидов (PDO), полученных от пациента, была разработана высокопроизводительная система анализа in vitro с использованием опухолевых органоидов (PDO), аналогичных раковым тканям, но непригодных для высокопроизводительных систем анализа in vitro с 96-луночными и 384-луночными пластинами.
Abstract
Ожидается, что опухолевые органоиды (PDO), полученные от пациента, будут доклинической моделью рака с лучшей воспроизводимостью заболевания, чем традиционные модели клеточных культур. PDO были успешно сгенерированы из различных опухолей человека, чтобы точно и эффективно воспроизвести архитектуру и функцию опухолевой ткани. Тем не менее, PDO не подходят для системы высокопроизводительного анализа in vitro (HTS) или клеточного анализа с использованием 96-луночных или 384-луночных пластин при оценке противоопухолевых препаратов, поскольку они неоднородны по размеру и образуют большие кластеры в культуре. Эти культуры и анализы используют внеклеточные матрицы, такие как Matrigel, для создания каркасов опухолевой ткани. Поэтому PDO имеют низкую пропускную способность и высокую стоимость, и было трудно разработать подходящую систему анализа. Для решения этой проблемы был создан более простой и точный HTS с использованием PDO для оценки эффективности противоопухолевых препаратов и иммунотерапии. Была создана HTS in vitro, которая использует PDO, установленные из солидных опухолей, культивируемых в 384-луночных пластинах. HTS также был разработан для оценки антителозависимой клеточной активности цитотоксичности для представления иммунного ответа с использованием PDO, культивируемых в 96-луночных пластинах.
Introduction
Линии раковых клеток человека широко распространены для изучения биологии рака и оценки противоопухолевых агентов. Однако эти клеточные линии не обязательно сохраняют первоначальные характеристики своей исходной ткани, поскольку их морфология, мутация генов и профиль экспрессии генов могут изменяться во время культивирования в течение длительных периодов времени. Кроме того, большинство из этих клеточных линий культивируются в монослое или используются в качестве мышиных ксенотрансплантатов, ни один из которых физически не представляет собой опухолевую ткань1,2. Таким образом, клиническая эффективность противоопухолевых средств может быть не такой же, как наблюдаемая в линиях раковых клеток. Поэтому были разработаны системы in vitro, такие как анализы ex vivo с использованием ксенотрансплантатов опухолей, полученных от пациента, или опухолевых органоидов (PDO) и моделей сфероидов опухолей, которые точно воспроизводят структуру и функцию опухолевых тканей. Все больше данных свидетельствуют о том, что эти модели предсказывают реакцию пациентов на противоопухолевые агенты, будучи непосредственно сопоставимыми с соответствующей раковой тканью. Эти системы in vitro были созданы для различных типов опухолевой ткани, и связанные с ними высокопроизводительные системы анализа (HTS) для скрининга лекарств также были разработаны3,4,5,6,7. Гетерогенные органоидные культуры ex vivo первичных опухолей, полученные от пациентов или полученных от пациента опухолевых ксенотрансплантатов, приобрели значительную популярность в последние годы из-за их простоты культивирования и способности поддерживать сложность клеток в стромальнойткани 8,9,10. Ожидается, что эти модели улучшат понимание биологии рака и облегчат оценку эффективности препарата in vitro.
Серия новых PDO была недавно создана из различных типов опухолевой ткани, обозначенных как F-PDO, в рамках проекта трансляционных исследований Фукусимы. PDO образуют большие клеточные кластеры с морфологией, аналогичной морфологии исходной опухоли, и могут культивироваться в течение более шести месяцев11. Сравнительная гистология и всесторонний анализ экспрессии генов показали, что особенности PDO близки к особенностям их исходных опухолевых тканей даже после длительного роста в условиях культивирования. Кроме того, для каждого типа ПДО в 96-луночных и 384-луночных плитах был создан подходящий HTS. Эти анализы использовались для оценки нескольких молекулярных целевых агентов и антител. Здесь стандартные химиотерапевтические средства (паклитаксел и карбоплатин), используемые для лечения рака эндометрия, оценивались с использованием F-PDO, полученных от пациентки, которая не реагировала на паклитаксел и карбоплатин. Соответственно, ингибирующая рост клеток активность паклитаксела и карбоплатина в отношении этого ПДО была слабой (IC50: >10 мкМ). Кроме того, в предыдущих исследованиях сообщалось, что чувствительность некоторых F-PDO к химиотерапевтическим агентам и молекулярным таргетным агентам согласуется с клинической эффективностью11,12,13. Наконец, изменения в структуре PDO более высокого порядка, вызванные противоопухолевыми агентами, были проанализированы с использованием трехмерной системы анализа клеток12,13. Результаты оценки противоопухолевых средств с использованием HTS на основе PDO сопоставимы с клиническими результатами, полученными для этих агентов. Здесь представлен протокол для более простой и точной HTS, который может быть использован для оценки эффективности противоопухолевых агентов и иммунотерапии с использованием моделей PDO.
Protocol
Все эксперименты с использованием материалов человеческого происхождения были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и заранее одобрены комитетом по этике Медицинского университета Фукусимы (номера одобрения 1953 и 2192; даты утверждения 18 марта 2020 года и 26 мая 2016 года соответственно). Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов, которые предоставили клинические образцы, использованные в этом исследовании.
1. Культура ПДО
ПРИМЕЧАНИЕ: F-PDO образуют клеточные кластеры, которые демонстрируют различные гетерогенные морфологии и растут в культуре суспензии(рисунок 1). Кроме того, F-PDO можно культивировать более 6 месяцев и криоконсервировать для будущего использования.
- Размораживание хранящихся PDO (день 0)
- Оттаивание и посевные PDO (например, RLUN007, аденокарцинома легких) на 0 день(рисунок 1). Во-первых, добавьте 15 мл среды для PDO (см. Таблицу материалов),содержащей 1% добавки B-27 и 30 нг/мл эпидермального фактора роста, в стерильную 50 мл центрифужную трубку.
- После извлечения замороженного флакона из хранилища жидкого азота осторожно перемешайте PDO на водяной бане с температурой 37 °C в течение 2 минут. Затем достаньте флакон с водяной бани, протрите флакон 70% этанолом, а затем переместите флакон в шкаф биологической безопасности.
- Перенесите содержимое флакона в пробирку, содержащую 15 мл среды для ПДО. Смешайте PDO и среду, аккуратно пипетируя вверх и вниз пять раз с помощью передаточной пипетки объемом 3 мл. Центрифугируйте трубку при 200 х г в течение 3 мин при ~25 °C и выбросьте супернатант. Повторно суспендировать гранулу PDO в 5 мл свежей среды и переложить в колбу размером 25см2 (см. Таблицу материалов)с щадящим пипетированием. Наконец, культивируйте PDO в инкубаторе при 37 °C в 5% CO2.
- Меняйте среду два раза в неделю (дни 3-7). Центрифугировать суспензию PDO для осаждения клеточных кластеров и заменить 4 мл среды (80% объема). Повторно суспендировать клетки в свежей среде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство RLUN007 выглядят в виде клеточных кластеров диаметром 100-500 мкм. Когда цвет фенол-красного в среде изменится на желтый, как показано на рисунке 1А,заменяйте среду чаще. Если среда желтеет на следующий день после замены, и каждый кластер клеток сливается, образуя более крупные кластеры диаметром >500 мкм, проход с разделенным соотношением 1:2. - Субкультура (дни 8-28) ПДО
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая сложность фактического измерения количества одиночных ячеек, время прохождения определяется на основе соответствующей плотности кластера клеток и размера гранулы PDO после центрифугирования(рисунок 1B). В случае RLUN007 объем гранулы PDO достигает 30 мкл (насыщенная плотность в 25см2 колбах) примерно через 2 недели после оттаивания.- Для переноса из одной колбы 25см2 в две колбы 25см2 (P1) переложите суспензию PDO в центрифужную трубку и центрифугу при 200 х г в течение 2 мин при приблизительно 25 °C. Оцените объем гранулы PDO и выбросьте супернатант. Повторное суспендирование гранулы PDO с использованием пипетки 5 мл в 5 мл свежей среды. Пипетка осторожно поднимается и опускается пять раз на низкой скорости. Затем переложите половину объема суспензии PDO (2,5 мл) в две колбы и добавьте 2,5 мл свежей среды в каждую колбу. Культивируйте клетки при 37 °C в 5% CO2.
- Для переноса из двух колб размером25 см2 в одну колбу размером 75см2 (P2) переложите суспензию PDO из двух колб в две центрифужные трубки и центрифугируйте PDO при 200 x g в течение 2 мин при приблизительно 25 °C. Далее оценивают объем гранулы ПДО и повторно суспендируют гранулу в 2,5 мл свежей среды (на пробирку). После этого смешайте суспензию PDO в одной пробирке с суспензией в другой и переложите ее в колбу размером75 см2, содержащую 10 мл свежей среды. Культивируйте клетки при 37 °C в 5% CO2. Перенесите субкультируемые PDO из двух колбразмером 25 см2 в одну колбу размером75 см2 примерно через 1 неделю после первого прохода(рисунок 1C).
2. Ингибирование роста HTS
ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибирующая рост активность противоопухолевых агентов в отношении ФДО оценивается путем измерения внутриклеточного содержания АТФ, как показано на фиг.2. Этот этап выполняется с использованием коммерчески доступного набора для анализа жизнеспособности клеток (см. Таблицу материалов).
- На 0-й день культивируйте PDO (например, RLUN007) в колбах до тех пор, пока для анализа не будет доступно достаточное количество клеточных кластеров. За день до посева перенесите суспензию PDO из колбы75 см2 в трубку 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 2 мин для измерения объема гранул PDO. Затем повторно суспендируйте гранулу PDO в 15 мл свежей среды и переложите ее обратно в колбу размером75 см2. Культивируйте клетки при 37 °C в 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый объем гранул PDO зависит от скорости разбавления каждого PDO и количества 384-луночных пластин, используемых для анализа. Для RLUN007 для посева в десять пластин с 384 скважинами необходимо 200 мкл объема гранул. - На 1-й день (24 ч после смены среды) измельчите PDO с помощью оборудования для фрагментации и диспергирования ячеек (см. Таблицу материалов)с фильтродержателем, содержащим сетчатый фильтр 70 мкм. Затем разбавьте 15 мл суспензии PDO в 10 раз. Засейте 40 мкл суспензии PDO в 384-луночные сверхнизкие сфероидные (круглодонные) микропластины (см. Таблицу материалов)с помощью дозатора клеточной суспензии (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измельчения клеточных кластеров рекомендуется использовать коммерчески доступное оборудование для фрагментации и дисперсии ячеек (см. Таблицу материалов). - Через 24 ч после посева (день 2) обработать ПДО 0,04 мкл растворов испытуемого агента в конечных диапазонах концентраций от 20 мкМ до 1,0 нМ (10 последовательных разведений) с помощью жидкого обработчика (см. Таблицу материалов).
- На 8-й день (144 ч после обработки исследуемым веществом) добавляют внутриклеточный реагент для измерения АТФ в исследуемые скважины. Перемешайте пластины с помощью миксера и инкубируйте в течение 10 мин при 25 °C. Измерьте внутриклеточное содержание АТФ в виде люминесценции с помощью пластинчатого считывателя (см. Таблицу материалов).
- Для расчета жизнеспособности ячейки разделите количество АТФ в испытательных скважинах на количество в контрольных скважинах, содержащих транспортное средство, с вычитанием фона. Для расчета темпов роста в течение 6 дней разделите количество СПС в контрольных колодцах транспортного средства на количество сПС в контрольных колодцах транспортного средства через 24 ч после посева.
- Рассчитать значения 50% ингибирующей концентрации (IC50)и площади под кривой (AUC) из кривых доза-реакция с использованием программного обеспечения для анализа биологических данных (см. Таблицу материалов). Z-фактор является безразмерным параметром, который колеблется от 1 (бесконечное разделение) до <0, определяемый как Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, где σc+, σc-, μc+ и μc- являются стандартными отклонениями (σ) и средними (μ) высоких (c+) и низких (c−) контролей14соответственно.
3. HTS с системой отбора и визуализации клеток для ингибирования роста
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии большого отклонения (когда коэффициент вариации [CV] при анализе составляет более 20%) в данных с использованием протокола 2, PDO выбранного размера могут быть засеяны в 96-луночные или 384-луночные пластины с использованием системы отбора и визуализации клеток(фиг.2). Протокол аналогичен описанному в шагах 2.1 и 2.2 предыдущего раздела. Этот этап выполняется с использованием коммерчески доступной системы отбора и визуализации клеток (см. Таблицу материалов).
- На 1-й день установите 384-луночную сверхнизкую сфероидную микропластину с 40 мкл среды/колодца в качестве целевой пластины на системе отбора и визуализации ячеек.
- Заполните камеру сбора (см. Таблицу материалов)6 мл питательной среды и центрифугой при 1 500 х г в течение 2 мин для удаления пузырьков воздуха. Добавьте PDO, взвешенные в среде (объем гранул PDO, 4 мкл), в камеру отбора и установите на систему.
- Выдерживают камеру не менее 1 минуты с последующим диспергированием, чтобы кластеры клеток осели на дне камеры; затем выполните сканирование камеры.
- Установите размер подбора 140-160 мкм (площадь 15,386-20,000мкм2)на системе автоматического отбора кластеров ячеек. Затем проверьте качество выбранных кластеров клеток на отсканированных изображениях и перенесите десять кластеров клеток на скважину с помощью подсказок по подбору (см. Таблица материалов)в целевую пластину.
- Выполните шаги протокола, начиная с шага 2.3.
4. HTS для антителозависимой клеточной цитотоксичности
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется с использованием коммерчески доступной системы (см. Таблицу материалов),которая представляет собой прибор для измерения электрического импеданса. Он используется для оценки цитолиза PDO по антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) с моноклональными антителами и естественными клетками-киллерами (NK)(рисунок 3). NK-клетки получают из мононуклеарных клеток периферической крови с использованием набора для производства NK-клеток (см. Таблицу материалов)в соответствии с инструкциями производителя.
- Измерение активности ADCC
- На 0-й день покрыть 96-луночную пластину (см. Таблицу материалов)50 мкл раствора фибронектина 10 мкг/мл (0,5 мкг/лунка) при 4 °C в течение ночи.
- На 1-й день, после удаления раствора фибронектина, добавляют 50 мкл культуральной среды в каждую лунку для измерения фонового импеданса.
- Перед посевом добавляют 5 мл реагента диссоциации клеточной культуры (см. Таблицу материалов)в PDO (RLUN007: 100 мкл гранулы PDO в колбе 75 см2) и инкубируют в инкубатореCO2 при 37 °C в течение 20 мин для диспергирования PDO. Чтобы остановить трипсинизацию, добавляют 5 мл среды, центрифугу и удаляют диссоциационный реагент. Промыть PDO свежей средой и процедить через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм (см. Таблицу материалов).
- Подсчитайте количество ячеек с помощью анализатора жизнеспособности клеток (см. Таблицу материалов).
- Переложите суспензию PDO в резервуар и перемешайте с помощью многоканального пипетка. Добавьте суспензию PDO в скважины с ячейками 5 x10 4 ячейками/лункой в 96-луночной пластине. Каждая скважина содержит конечный объем 100 мкл. Затем поместите пластину в шкаф биологической безопасности при температуре приблизительно 25 °C в течение 30 мин.
- Перенесите пластину на инструмент в инкубаторе CO2 при 37 °C. Записывайте изменения сигналов импеданса каждые 15 минут в качестве индекса ячейки.
- Разморозьте NK-клетки на водяной бане с температурой 37 °C в тот же день, что и посев PDO. Перенос клеток из флакона в трубку объемом 15 мл, содержащую 10 мл среды для NK-клеток (см. Таблицу материалов)и центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при приблизительно 25 °C. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 10 мл свежей среды. После подсчета клеток отрегулируйте плотность ячейки до 1 x10 6 клеток/мл и перенесите в колбу размером75 см2. Культивируйте NK-клетки в инкубаторе 5% CO2 при 37 °C.
- На 2-й день готовят растворы антител (фосфатно-буферный физиологический раствор) в 10-кратной конечной концентрации в стерильных V-образных 96-луночных пластинах.
- Удалите 60 мкл среды из каждой лунки и добавьте 10 мкл трастузумаба или раствора цетуксимаба (10 мкг/мл, 1 мкг/мл и 0,1 мкг/мл) к PDO. Переложите пластины обратно на прибор в инкубатор и запишите индекс ячейки в течение 1 ч.
- Переложите суспензию NK-ячейки в трубку объемом 50 мл и подсчитайте номер ячейки. Центрифугируйте ячейки при 300 x g в течение 5 мин и отрегулируйте плотность NK-клеток до 1 x10 6 ячеек/мл и 2 x10 6 ячеек/мл со средой для PDO.
- Добавьте 50 мкл суспензии NK-клеток к эффекторным (NK) клеткам при соотношении клеток-мишеней (RLUN007) 1:1 или 2:1. Конечные концентрации антител составляют 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл и 0,01 мкг/мл. Держите пластину при температуре приблизительно 25 °C в течение 15 минут и верните пластины к инструменту.
- Сбор и анализ данных
- Преобразуйте индекс ячейки в процентные значения цитолиза с помощью аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
- Процент цитолиза относится к проценту клеток-мишеней, убитых NK-клетками, по сравнению с клетками-мишенями (PDO) только в качестве контроля. Вычтите клеточные индексы скважин, содержащих только NK-ячейки, из индекса пробных скважин в каждой точке времени. Нормализуйте каждое значение к клеточному индексу непосредственно перед добавлением антител. Преобразуйте нормализованный индекс клетки в процент цитолиза, используя следующее уравнение: % цитолиза = (1 - нормализованный индекс клеток [образцовые скважины]) / нормализованный индекс клеток (только целевые скважины) x 100.
Representative Results
Высокоточный HTS был разработан с использованием PDO и 384-луночных микропластин для оценки противоопухолевых агентов, а о разработке HTS для каждого PDO ранее сообщалось10,11,12,13. Производительность HTS оценивалась путем расчета CV и Z'-фактора. Z'-фактор является широко распространенным методом для проверки качества и производительности анализа, и анализ подходит для HTS, если это значение составляет >0,514. Контрольные исходные точки в 384-луночном пластинчатом анализе с использованием RLUN007 показали небольшую изменчивость, со значениями CV 5,8% и расчетными Z'-множителями 0,83, как показано на рисунке 4. Эти результаты показывают, что этот анализ имеет высокую производительность для HTS. Чтобы исследовать чувствительность PDO к противоопухолевым агентам с использованием HTS, ингибирование роста оценивали с использованием RLUN007, получавшего восемь противоопухолевых агентов, в частности, ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (афатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, лапатиниб, осимертиниб и роцилетиниб) и паклитаксел, которые являются стандартными клиническими методами лечения немелкоклеточного рака легкого, и митомицин С в качестве положительного контроля. Значения IC50 и AUC противоопухолевых агентов для каждого PDO показаны на рисунке 4. RLUN007 показал высокую чувствительность (IC50 < 2 мкМ, AUC < 282) для всех ингибиторов EGFR и других противоопухолевых агентов. Сигмовидные кривые, рассчитанные для всех данных, показали, что ингибирующая рост активность противоопухолевых агентов может быть точно измерена.
Система отбора и визуализации клеток используется, когда данные значительно различаются с использованием вышеуказанной методологии. Система сбора и визуализации клеток, которая точно выбирает кластеры клеток, не повреждая их, позволяет проводить точные анализы HTS, выравнивая размер кластера клеток, чтобы исключить клеточный мусор из системы анализа. Когда система не использовалась, значение CV составляло 26,0%, а значение Z'-фактора — 0,23 (данные не показаны). Тем не менее, значения CV и Z'-фактора были улучшены на 6,4% и 0,81 соответственно с использованием системы.
Для исследования цитолиза PDO с активностью ADCC с использованием прибора измерения электрического импеданса, который контролирует количество, морфологию и прикрепление клеток в течение длительного времени, изменения сигналов импеданса оценивали с использованием RLUN007, обработанных антителами (трастузумаб и цетуксимаб) и NK-клетками в качестве эффекторных клеток в 96-луночной пластине. По сравнению с контролем, состоящим только из клеток-мишеней, процент цитолиза увеличивался со временем. Он достигал 45% или 75% через 6 ч при соотношении E:T 1:1(Рисунок 5A,C)или 2:1(Рисунок 5B,D)без антител. NK-клеточный цитолиз с использованием трастузумаба составлял приблизительно 60% и 90% в соотношении 1:1(Фиг.5А,1 мкг/мл) и 2:1(Фиг.5В,1 мкг/мл), соответственно, через 6 ч. Напротив, цетуксимаб оказывал дозозависимое влияние на NK-клеточный цитолиз (Рисунок 5C,D). При наибольшей концентрации цетуксимаба RLUN007 разрушали на 90% и 100% в соотношении 1:1 и 2:1 соответственно (Рисунок 5C,D). Эффект трастузумаба был слабее, чем у цетуксимаба, с цитотоксичностью всего 60%. Эти результаты показывают, что система анализа PDO может оценивать активность ADCC с использованием технологии на основе импеданса в режиме реального времени.
Рисунок 1:Критические точки для культуры PDO. (A) Изменение цвета в среде. (B)Измерение количества PDO от размера гранул путем прокладки центрифужной трубки, содержащей PDO, с трубками, маркированными на уровнях 50-200 мкл.(C)плотность PDO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Краткое изложение протокола, используемого для создания высокопроизводительной системы анализа с использованием 384-луночных микропластин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Краткое изложение протокола для высокопроизводительного анализа активности ADCC. ADCC, антителозависимая клеточная цитотоксичность; НК, природный убийца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Высокопроизводительная система анализа для ингибирования роста противоопухолевыми средствами. Кривая доза-реакция RLUN007 на противоопухолевые средства. Измельченные PDO были посеяны в плиты из 384 скважин. Их лечили в течение 6 дней десятью различными концентрациями противоопухолевых агентов (от 10 мкМ до 1,5 нМ). Данные представляют собой среднее ± стандартного отклонения трехкратных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Высокопроизводительный анализ активности ADCC. (А,Б) Трастузумаб. (C,D) Цетуксимаб. (А,С) Соотношение RLUN007 к эффекторным клеткам 1:1. (Б,Д) Цитолиз с соотношением RLUN007: эффекторные клетки 1:2. Активность измеряли через 12 ч после добавления эффекторных клеток. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения трех реплицированных образцов. ADCC, антителозависимая клеточная цитотоксичность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Уникальной характеристикой PDO является то, что они не ферментативно разделены на отдельные клетки во время культуры или анализа и поддерживают клеточные кластеры в культуре. Поэтому количество клеток не может быть точно подсчитано под микроскопом. Для решения этой задачи количество клеток определяют визуально путем облицовки центрифужной трубки, содержащей ячейки с трубками, маркированными уровнями по 50-200 мкл(рисунок 1В). Кроме того, поскольку визуально трудно измерить объем гранул клеточных кластеров, культивируемых в колбе25 см2, время прохождения определяли с помощью изменения цвета среды от красного до желтого и заметного увеличения одиночных клеток или мусора, сравнимого со временем прохождения в качестве индикаторов(рисунок 1A,C). Это точка прохода для PDO. Количество гранул PDO измеряется визуально после центрифугирования при каждом изменении среды. Когда объем гранул перестает увеличиваться, а среда желтеет на следующий день после замены среды, среда считается насыщенной плотностью, и выполняется пассаж. Объем гранул определяется для каждого PDO. Если ПДО не размножаются, количество среды изменяется с 80% до 50% в момент обмена средой, а плотность ПДО в культуре увеличивается.
Была разработана HTS, подходящая для PDO. Его пропускная способность составляет не менее десяти-двадцати 384-луночных пластин, выполненных с использованием одной колбы PDOобъемом 75 см2, а количество плит, обрабатываемых в день, составляет не менее 50. Кроме того, уже сообщалось о результатах оценки различных противоопухолевых препаратов ХТШ с использованием ФДО.
При выполнении HTS засорение сетчатого фильтра, вызванное измельчением F-PDO с использованием оборудования фрагментации и дисперсии ячеек, устраняется первоначально путем изменения размера сетки фильтра до 100 мкм. Следующим шагом является уменьшение объема суспензии PDO, наносимой на стеклянный сосуд. При приготовлении растворов исследуемых веществ для HTS низкомолекулярные соединения обычно растворяют в диметилсульфоксиде, а антитела растворяют в фосфатно-буферном физиологическом растворе. В качестве исследуемого вещества используется соответствующий растворитель, а контрольные данные получают из используемого растворителя.
Ниже приведено описание того, как бороться с изменчивостью данных анализа. При больших различиях в данных при испытании с использованием 384-луночных пластин, пробирная пластина должна быть заменена на 96-луночную пластину. Коэффициент разбавления PDO (количество засеянных клеточных кластеров) также исследуется после посева пластины. Наконец, система отбора и визуализации клеток может быть использована для выбора размера PDO для анализа. Перед добавлением PDO в камеру одиночные ячейки и кластеры небольших ячеек должны быть удалены с помощью низкоскоростного центрифугирования, чтобы иметь возможность правильно распознавать PDO. Если одиночные ячейки или небольшие кластеры ячеек видны после добавления PDO в камеру, можно выполнить несколько дисперсий для удаления отдельных ячеек. Далее, хотя система отбора и визуализации клеток имеет функцию, которая позволяет держать пластину в тепле, эта функция не используется из-за испарения питательной среды, когда система работает в течение длительного периода времени. Наконец, объем клеточных кластеров неизвестен, потому что он распознается планарным изображением. Кроме того, если два или более PDO перекрываются, один PDO не может быть распознан правильно. Тем не менее, можно удалить нежелательные PDO с помощью функции удаления, проверив их на отсканированном изображении после перемещения.
Прибор для измерения электрического импеданса обычно используется для адгезивных раковых клеток-мишеней для мониторинга изменений импеданса во время пролиферации клеток. Поэтому изменение клеточного индекса неадгезивных PDO не обнаруживается. В попытке решить эту проблему необходимо исследовать условия посева, такие как плотность PDO и ферментативная обработка (фермент диссоциации клеток и время обработки) в зависимости от типа PDO. Колодцы в пластине также должны быть покрыты соответствующим внеклеточным матриксом для посева PDO. PDO высеваются без ферментативной обработки, в зависимости от типа PDO. RLUN007 использовался для измерения импеданса путем посева PDO на 96-луночную пластину после их диспергирования ферментативной обработкой. RLUN007 обрабатывали реагентом диссоциации клеточной культуры в течение 20 мин при 37 °C для диспергирования клеток и прикрепления их к колодцам 96-луночной пластины. Учитывая, что диссоциированные клетки RLUN007 сразу образуют агрегаты, желательно сеять на пластины сразу после фильтрации с помощью ситечка. После переноса клеточной суспензии из трубки в резервуар резервуар резервуара осторожно перемещали справа налево два-три раза и пипетировали вверх и вниз пять раз перед посевом на пластину. Подвеска также смешивалась с каждым дополнением к колодцу. Затем пластину помещали в шкаф биологической безопасности на 30 мин (для PDO) или 15 мин (для NK-клеток), чтобы ячейки могли равномерно распределяться в лунке. Второй важный момент заключается в том, что лечение антителами и NK-клетками должно быть приурочено к тому, чтобы происходить до того, как клеточный индекс достигнет плато и значение будет не менее 0,5. В случае RLUN007 оптимальное время начала анализа составляет 20-22 ч после нанесения покрытия, а количество клеток для посева составляет 5 х 104 клетки/лунка.
В целом, культура и анализы для опухолевых органоидов используют внеклеточные матрицы, такие как Matrigel, для создания каркасов опухолевой ткани или ферменты, такие как трипсин и коллагеназа, для разрушения органоидов3,4,5,6,7. Преимущество этого метода заключается в том, что при культивировании и анализе не требуется внеклеточного матрикса или ферментативной обработки (за исключением анализов с использованием прибора измерения электрического импеданса), что значительно снижает трудозатраты и затраты. Кроме того, этот метод относительно легко адаптировать к системам анализа HTS и различным измерительным системам. Тем не менее, использование внеклеточного матрикса желательно для некоторых исследовательских целей, потому что он может действовать как каркас для клеток и влиять на морфогенез, дифференцировку и гомеостаз в тканях.
В этом исследовании для оценки ингибиторов EGFR использовались PDO (RLUN007) с мутацией EGFR (L858R), которая клинически чувствительна к ингибиторам EGFR и высокой экспрессией гена EGFR (данные не показаны). Было продемонстрировано, что чувствительность RLUN007 к ингибиторам EGFR была выше, чем у других F-PDO13, полученных из рака легких(рисунок 4). Таким образом, HTS с использованием PDO, которые сохраняют характеристики опухолевой ткани, превосходит оценку потенциальных противоопухолевых агентов и предоставляет возможности для оценки лекарств и достижений в персонализированной медицине. Хотя HTS подходит для первоначального скрининга агентов, он не воспроизводит микроокружение опухоли и, следовательно, не может оценить эффективность лекарств in vivo. Таким образом, система in vitro, которая может имитировать опухолевую ткань человека in vivo путем совместной культивирования с сосудистыми эндотелиальными клетками и другими стромальными клетками или технологией «орган на чипе» в отсутствие животных моделей, в настоящее время находится в стадии разработки.
Disclosures
Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation является дочерней компанией Fujifilm Wako Pure Chemicals, коммерческого владельца носителей F-PDO и F-PDO путем передачи лицензии.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить пациентов, которые предоставили клинические образцы, используемые в этом исследовании. Это исследование поддерживается грантами Программы трансляционных исследований префектуры Фукусима.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
| 40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
| Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
| ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
| CELL HANDLER | Yamaha Motor | - | Cell picking and imaging system |
| CellPet FT | JTEC | - | Cell fragmentation and dispersion equipment |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
| Echo 555 | Labcyte | - | Liquid handler |
| EnSpire | PerkinElmer | - | Plate reader |
| E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
| Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
| F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | - | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
| Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
| Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
| Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
| Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
| Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | - | Cell viability analyzer |
| xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | - | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
| xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | - | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |
References
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Palechor-Ceron, N., et al. Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks. Cells. 8 (11), 1327 (2019).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Inoue, A., et al. Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research. Cancers (Basel). 11 (9), 1321 (2019).
- Hum, N. R., et al. Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo. Cancers (Basel). 12 (3), 690 (2020).
- Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).
- Takahashi, N., et al. An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids. Cells. 8 (5), 481 (2019).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
