Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

High-Throughput In Vitro Assay ved hjælp af patient-afledte tumor organoider

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62668
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2, 2, 3, 2, 2
1FUJIFILM Wako Bio Solutions Corporation, 2Medical-Industrial Translational Research Center, Fukushima Medical University, 3Department of Bioregulation and Pharmacological Medicine, Fukushima Medical University

Summary

En meget præcis in vitro high-throughput assay system blev udviklet til at evaluere anticancer narkotika ved hjælp af patient-afledt tumor organoider (BOB'er), svarende til kræft væv, men er uegnede til in vitro high-throughput assay systemer med 96-brønd og 384-brønd plader.

Abstract

Patient-afledt tumor organoider (PDO'er) forventes at være en præklinisk kræft model med bedre reproducerbarhed af sygdom end traditionelle cellekultur modeller. PDO'er er med succes blevet genereret fra en række menneskelige tumorer til at generobre arkitekturen og funktionen af tumorvæv præcist og effektivt. Men, PDO'er er uegnede til en in vitro high-throughput assay system (HTS) eller celle analyse ved hjælp af 96-brønd eller 384-brønd plader, når de vurderer anticancer narkotika, fordi de er heterogene i størrelse og danne store klynger i kultur. Disse kulturer og analyser bruger ekstracellulære matricer, såsom Matrigel, til at skabe tumorvæv stilladser. Derfor har PDO'er en lav gennemløb og høje omkostninger, og det har været vanskeligt at udvikle et passende analysesystem. For at løse dette problem blev der etableret en enklere og mere præcis HTS ved hjælp af PDO'er til at evaluere styrken af anticancermedicin og immunterapi. En in vitro HTS blev oprettet, der bruger BOB'er etableret fra solide tumorer kultiveret i 384-brønd plader. Der blev også udviklet en HTS til vurdering af antistofafhængig cellulær cytotoksicitetsaktivitet for at repræsentere immunresponset ved hjælp af PDO'er, der dyrkes i 96-brøndsplader.

Introduction

Human cancer cellelinjer er almindeligt accepteret til at studere biologi kræft og evaluere kræftmidler. Men disse cellelinjer ikke nødvendigvis bevare de oprindelige karakteristika for deres kildevæv, fordi deres morfologi, genmutation, og genekspression profil kan ændre sig under kultur over lange perioder. Desuden dyrkes de fleste af disse cellelinjer i et monolag eller bruges som murin xenografts, hvoraf ingen fysisk repræsenterer tumorvæv1,2. Således kan den kliniske effekt af kræftmidler ikke være den samme som den, der observeres i kræftcellelinjer. Derfor er der udviklet in vitro-systemer, såsom ex vivo-analyser ved hjælp af patientafledte tumor-xenografts eller patient-afledte tumororganoider (PDO'er) og tumorspheroidmodeller, der nøjagtigt gengiver tumorvævets struktur og funktion. Stigende evidens tyder på, at disse modeller forudsiger patienternes reaktion på kræftmidler ved at være direkte sammenlignelige med det tilsvarende kræftvæv. Disse in vitro-systemer er blevet etableret for forskellige tumorvævstyper, og tilknyttede high-throughput assay systemer (HTS) til lægemiddelscreening er også blevet udviklet3,4,5,6,7. Heterogene ex vivo organoid kulturer af primære tumorer fremstillet af patienter eller patient-afledt tumor xenografts har fået betydelig trækkraft i de seneste år på grund af deres lethed af kultur og evne til at opretholde kompleksiteten af celler i stromal væv8,9,10. Disse modeller forventes at øge forståelsen af kræftens biologi og lette evalueringen af lægemiddeleffektivitet in vitro.

En række nye BOB'er blev for nylig skabt fra forskellige typer tumorvæv, udpeget som F-BOB, under Fukushima Translational Research Project. PDO'erne danner store celleklynger med en morfologi svarende til kildetumoren og kan dyrkes i mere end seks måneder11. Den komparative histologi og omfattende genekspression analyser viste, at funktionerne i PDO'er er tæt på dem af deres kilde tumorvæv, selv efter langvarig vækst under kulturforhold. Desuden blev der etableret en passende HTS for hver type BOB i 96-brønd og 384-brønd plader. Disse analyser blev brugt til at evaluere flere molekylære målrettede stoffer og antistoffer. Her blev standard kemoterapi (paclitaxel og carboplatin), der anvendes til endometriecancer, evalueret ved hjælp af F-PDO'er, der stammer fra en patient, der ikke reagerede på paclitaxel og carboplatin. Derfor var den cellevækst hæmmende aktivitet af paclitaxel og carboplatin mod denne BOB svag (IC50: >10 μM). Derudover har tidligere forskning rapporteret, at nogle F-BOB'ers følsomhed over for kemoterapeutiske agenser og molekylære målrettede midler er i overensstemmelse med den kliniske effekt11,12,13. Endelig blev ændringer i den højere ordensstruktur af PDF-filer forårsaget af kræftmidler analyseret ved hjælp af et tredimensionelt celleanalysesystem12,13. Resultaterne af evalueringen af kræftmidler ved hjælp af en BOB-baseret HTS kan sammenlignes med de kliniske resultater, der er opnået for disse stoffer. Her præsenteres en protokol for en enklere og mere præcis HTS, der kan bruges til at evaluere styrken af anticancermidler og immunterapi ved hjælp af BOB-modellerne.

Protocol

Alle forsøg med materialer, der stammer fra mennesker, blev udført i henhold til Helsinki-erklæringen og godkendt på forhånd af Fukushima Medical Universitys etiske komité (godkendelsesnumrene 1953 og 2192; godkendelsesdatoer henholdsvis 18. marts 2020 og 26. maj 2016). Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter, der leverede de kliniske prøver, der blev anvendt i denne undersøgelse.

1. PDO'ernes kultur

BEMÆRK: F-BOB'er danner celleklynger, der udviser en række heterogene morfologier og vokser i suspensionskultur (Figur 1). Desuden kan F-PDO'er dyrkes i mere end 6 måneder og kan cryopreserved til fremtidig brug.

  1. Optøning af lagrede PDF-filer (dag 0)
    1. Optønings- og frø-BOB'er (f.eks. RLUN007, lungeadenocarcinom) på dag 0 (figur 1). For det første tilsættes 15 mL medium til BOB'er (se materialetabel),der indeholder 1 % af B-27-tillægget og 30 ng/mL epidermal vækstfaktor til et sterilt 50 mL centrifugerør.
    2. Når det frosne hætteglas er fjernet fra opbevaring af flydende nitrogen, skal bob'erne forsigtigt omrøres i et 37 °C vandbad i 2 min. Fjern derefter hætteglasset fra vandbadet, tør hætteglasset af med 70% ethanol, og flyt derefter hætteglasset ind i et biologisk sikkerhedsskab.
    3. Indholdet af hætteglasset overføres til røret, der indeholder 15 mL medium til BOB'er. Bland PDO'er og medium ved forsigtigt pipetter op og ned fem gange med en 3 mL overførsel pipette. Centrifuge røret ved 200 x g i 3 min ved ~ 25 °C og kassér supernatanten. Brug PDO-pelleten i 5 mL frisk medium og overføres til en 25 cm2 kolbe (se Materialetabel)med skånsom pipettering. Endelig dyrkes PDO'erne i en inkubator ved 37 °C i 5 % CO2.
  2. Skift medium to gange om ugen (dag 3-7). Centrifuge BOB suspensionen til at udfælde celle klynger, og erstatte 4 mL af mediet (80% volumen). Brug cellerne igen i det friske medium.
    BEMÆRK: Størstedelen af RLUN007 vises som celleklynger, der har en diameter på 100-500 μm. Når farven på phenol rød i mediet skifter til gul som vist i figur 1A, erstatte mediet oftere. Hvis mediet bliver gult dagen efter udskiftningen, og hver celleklynge fusionerer for at danne større klynger, der er > 500 μm i diameter, skal passagen passere med et splitforhold på 1:2.
  3. Subkultur (dage 8-28) af BOB'er
    BEMÆRK: I betragtning af vanskeligheden ved faktisk at måle antallet af enkeltceller bestemmes tidspunktet for passagen ud fra en passende celleklyngetæthed og størrelsen af BOB-pelleten efter centrifugering (Figur 1B). For RLUN007 når PDO-pelletens volumen op på 30 μL (mættet densitet i 25 cm2 kolber) ca. 2 uger efter optøning.
    1. Ved overførsel fra en 25 cm2 kolbe til to 25 cm2 kolber (P1) overføres BOB-suspensionen til et centrifugerør og centrifuge ved 200 x g i 2 min ved ca. 25 °C. Vurder mængden af BOB-pelleten, og kassér supernatanten. Brug PDO-pelleten igen ved hjælp af en 5 mL pipette i 5 mL frisk medium. Pipette forsigtigt op og ned fem gange ved lav hastighed. Derefter overføres halvdelen af volumenet af BOB-suspensionen (2,5 mL) til to kolber, og der tilsættes 2,5 mL frisk medium til hver kolbe. Kultur cellerne ved 37 °C i 5% CO2.
    2. Ved overførsel fra to 25 cm2 kolber til en 75 cm2 kolbe (P2) overføres BOB-suspensionen fra to kolber til to centrifugrør og centrifugerer BOB ved 200 x g i 2 min ved ca. 25 °C. Vurder derefter mængden af BOB-pelleten og genbrugspillen i 2,5 mL frisk medium (pr. rør). Derefter kombineres BOB-suspensionen i det ene rør med den i det andet og overfør den til en 75 cm2 kolbe indeholdende 10 mL frisk medium. Kultur cellerne ved 37 °C i 5% CO2. De subkulturelle BOB'er overføres fra to 25 cm2 kolber til en 75 cm2 kolbe ca. 1 uge efter den første passage (figur 1C).

2. Væksthæmning HTS

BEMÆRK: Anticancermidlernes vækst hæmmende aktivitet mod BOB'er evalueres ved at måle det intracellulære ATP-indhold, som vist i figur 2. Dette trin udføres ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt analysesæt til celle levedygtighed (se Materialetabel).

  1. På dag 0 dyrkes PDO'erne (f.eks. RLUN007) i kolber, indtil der er et tilstrækkeligt antal celleklynger til rådighed til analysen. En dag før såning overføres BOB-suspensionen fra en 75 cm2 kolbe til et 15 mL rør og centrifuge ved 200 x g i 2 min for at måle BOB pillevolumen. Derefter genbruges BOB-pelleten i 15 mL frisk medium og overfør den tilbage til en 75 cm2 kolbe. Kultur cellerne ved 37 °C i 5% CO2.
    BEMÆRK: Den krævede BOB pelletvolumen afhænger af hver BOB's fortyndingshastighed og antallet af 384 brøndplader, der anvendes til analysen. For RLUN007 er en 200 μL celle pellet volumen nødvendig for såning i ti 384-brønd plader.
  2. På dag 1 (24 timer efter ændring af mediet) hakkes de PDO'er, der anvender cellefragmenterings- og spredningsudstyr (se Materialetabel) med en filterholder, der indeholder et 70 μm mesh-filter. Fortynd derefter 15 mL af BOB-suspensionen med 10x. Frø 40 μL af BOB-suspensionen i 384-brønd ultra-lav vedhæftet fil spheroid (rundbundet) mikroplader (se Materialetabel) ved hjælp af en celleaffjedring dispenser (se Materialetabel).
    BEMÆRK: Ved udskæring af celleklynger anbefales det at anvende udstyr til kommercielt tilgængelig cellefragmentering og spredning (se Materialetabel).
  3. Ved 24 timer efter såning (dag 2) behandles PDO'erne med 0,04 μL testmiddelopløsninger ved endelige koncentrationsintervaller på 20 μM til 1,0 nM (10 serielle fortyndinger) ved hjælp af en væskebehandler (se materialetabel).
  4. På dag 8 (144 timer efter behandling af teststoffet) tilsættes intracellulært ATP-målereagens til testtjerne. Pladerne blandes med en røremaskine, og inkuber i 10 min ved 25 °C. Mål det intracellulære ATP-indhold som luminescens ved hjælp af en pladelæser (se Materialetabel).
  5. For at beregne cellens levedygtighed skal du dividere mængden af ATP i testtjerne med mængden i de kontroltj brønde, der indeholder køretøjet, med baggrunden trukket fra. For at beregne vækstraten over 6 dage skal du dividere mængden af ATP i køretøjets kontrol brønde med den i køretøjets kontrol brønde 24 timer efter såning.
  6. 50 % hæmmende koncentration (IC50)og området under kurven (AUC) ud fra dosisresponskurverne ved hjælp af biologisk dataanalysesoftware (se Materialetabel). Z-faktoren er en dimensionsløs parameter, der varierer fra 1 (uendelig adskillelse) til <0, defineret som Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, hvor σc+, σc-, μc+og μc- er standardafvigelserne (σ) og gennemsnit (μ) af de høje (c+) og lave (c−) kontrollerhenholdsvis 14.

3. HTS med et cellepluknings- og billedbehandlingssystem til væksthæmning

BEMÆRK: Hvis der er en stor afvigelse (når variationskoefficienten [CV] ved analysen er mere end 20 %) i dataene ved hjælp af protokol 2, kan BOB'er af den valgte størrelse sås i 96-brønds- eller 384-brøndplader ved hjælp af et cellepluknings- og billedbehandlingssystem (figur 2). Protokollen er den samme som den, der er beskrevet i trin 2.1 og 2.2 i forrige afsnit. Dette trin udføres ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt cellepluknings- og billedbehandlingssystem (se Materialetabel).

  1. På dag 1 skal du indstille en 384-godt ultralav fastgørelsesspheroidmikroplade med 40 μL medium/samt en destinationsplade på cellepluknings- og billedbehandlingssystemet.
  2. Fyld plukkammeret (se Materialetabel) med 6 mL kulturmedium og centrifuge ved 1.500 x g i 2 min for at fjerne luftbobler. Føj de PDO'er, der er suspenderet i mediet (BOB-pillevolumen, 4 μL) til plukkammeret og indstillet på systemet.
  3. Stå kammeret i mindst 1 minut, efterfulgt af spredning, således at celleklyngerne bosætter sig i bunden af kammeret; derefter udføre scanning af kammeret.
  4. Angiv plukstørrelsen til 140-160 μm (område 15.386-20.000 μm2) på systemet til automatisk valg af celleklynger. Kontroller derefter kvaliteten af de markerede celleklynger på de scannede billeder, og overfør ti celleklynger pr. brønd ved hjælp af pluktip (se Materialetabel) til destinationspladen.
  5. Udfør protokoltrinnene fra trin 2.3 og fremefter.

4. HTS for antistofafhængig cellulær cytotoksicitet

BEMÆRK: Dette trin udføres ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt system (se Materialetabel), som er et elektrisk impedansmålerinstrument. Det bruges til at evaluere cytolyse af PDO'er ved antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) med monoklonale antistoffer og naturlige dræberceller (NK) (Figur 3). NK-celler produceres af perifere blodmonnukleare celler ved hjælp af NK-celleproduktionssættet (se Materialetabel), efter producentens anvisninger.

  1. Måling af ADCC-aktivitet
    1. På dag 0 skal du belægge en 96-brøndsplade (se Materialetabel) med 50 μL 10 μg/mL fibronectinopløsning (0,5 μg/brønd) ved 4 °C natten over.
    2. På dag 1, efter fjernelse af fibronectinopløsningen, tilsættes 50 μL af kulturmediet til hver brønd for at måle baggrundens impedans.
    3. Før såning tilsættes 5 mL cellekulturafkoblingsreagens (se Materialetabel) til BOB'erne (RLUN007: 100 μL af BOB-pelleten i en 75 cm2 kolbe) og inkuberes i en CO2-inkubator ved 37 °C i 20 min for at sprede PDO'erne. Hvis du vil stoppe trypsinisering, skal du tilsætte 5 mL medium, centrifuge og fjerne dissociationsreagensen. Skyl PDO'erne med frisk medium, og filtrer gennem en 40 μm cellesnive (se Materialetabel).
    4. Tæl antallet af celler ved hjælp af en celle levedygtighedsanalysator (se Materialetabel).
    5. Overfør BOB-affjedringen til et reservoir, og bland ved hjælp af en multikanal pipettor. Tilsæt BOB suspension i brønde på 5 x 104 celler / brønd i en 96-brønd plade. Hver brønd indeholder et endeligt volumen på 100 μL. Placer derefter pladen i et biologisk sikkerhedsskab ved ca. 25 °C i 30 min.
    6. Pladen overføres til instrumentet i en CO 2-inkubator ved 37 °C. Registrer ændringer i impedanssignalerne hvert 15. minut som celleindekset.
    7. Optø NK-cellerne i et 37 °C vandbad samme dag som BOB-såningen. Cellerne overføres fra hætteglasset til et 15 mL rør, der indeholder 10 mL medium til NK-celler (se Materialetabel) og centrifuge ved 300 x g i 5 min ved ca. 25 °C. Kassér supernatanten og genbrug cellepillen i 10 mL frisk medium. Efter celleoptælling justeres celletætheden til 1 x 106 celler/mL og overføres til en 75 cm2 kolbe. Kultur NK-cellerne i en 5% CO 2-inkubator ved 37 °C.
    8. På dag 2 forberedes antistofopløsningerne (fosfatbuffered saltvand) ved 10 gange den endelige koncentration i sterile V-bund 96-brønds plader.
    9. 60 μL medium fra hver brønd, og der tilsættes 10 μL trastuzumab- eller cetuximabopløsning (10 μg/mL, 1 μg/mL og 0,1 μg/mL) til PDO'erne. Overfør pladerne tilbage til instrumentet i en inkubator, og registrer celleindekset i 1 time.
    10. Overfør NK-celleaffjedringen til et 50 mL-rør, og tæl cellenummeret. Centrifugere cellerne ved 300 x g i 5 min og justere NK celletæthed til 1 x 106 celler / mL og 2 x 106 celler / mL med medium for BOB'er.
    11. Der tilsættes 50 μL NK-celleaffjedring til effektorcellerne (NK) ved et målcelleforhold (RLUN007) på 1:1 eller 2:1. De endelige koncentrationer af antistofferne er 1 μg/mL, 0,1 μg/mL og 0,01 μg/mL. Pladen holdes på ca. 25 °C i 15 min, og sæt pladerne tilbage på instrumentet.
  2. Dataindsamling og -analyse
    1. Konverter celleindekset til procentviseværdier ved hjælp af analysesoftware (se Materialetabel).
    2. Den procent cytolyse refererer til procentdelen af målceller dræbt af NK celler versus målceller (BOB'er) alene som en kontrol. Træk celleindeksene for brøndene, der kun indeholder NK-celler, fra indekset for prøvetjerne på hvert tidspunkt. Normaliser hver værdi til celleindekset umiddelbart før tilsætning af antistoffer. Konverter det normaliserede celleindeks til procentcytolyse ved hjælp af følgende ligning: % cytolyse = (1 - normaliseret celleindeks [prøve brønde]) / normaliseret celleindeks (mål alene brønde) x 100.

Representative Results

En meget præcis HTS blev udviklet ved hjælp af BOB'er og 384-brønd mikroplader til at evaluere anticancer agenter, og udviklingen af en HTS for hver BOB blev tidligere rapporteret10,11,12,13. HTS'ens resultater blev evalueret ved at beregne CV'erne og Z'-faktoren. Z'-faktoren er en bredt accepteret metode til validering af assaykvalitet og -ydeevne, og analysen er velegnet til HTS, hvis denne værdi er >0,514. Kontrol datum punkter i 384-brønd plade assay ved hjælp af RLUN007 viste ringe variation, med CV-værdier på 5,8% og beregnede Z'-faktorer på 0,83, som vist i figur 4. Disse resultater tyder på, at denne analyse har høj ydeevne for HTS. For at undersøge PDO'ernes følsomhed over for kræftmidler ved hjælp af HTS blev væksthæmning vurderet ved hjælp af RLUN007 behandlet med otte kræftmidler, specifikt epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) hæmmere (afatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib og rociletinib) og paclitaxel, som er standard kliniske behandlinger for ikke-småcellet lungekræft, og mitomycin C som en positiv kontrol. IC50- og AUC-værdierne for kræftmidlet for hver BOB er vist i figur 4. RLUN007 udviste høj følsomhed (IC50 < 2 μM, AUC < 282) for alle EGFR-hæmmere og andre kræftmidler. Sigmoid kurver beregnet for alle data viste, at vækst hæmmende aktivitet af anticancer agenter kunne måles nøjagtigt.

Cellepluknings- og billedbehandlingssystemet bruges, når dataene varierer betydeligt ved hjælp af ovenstående metode. Cellepluknings- og billeddannelsessystemet, som vælger celleklynger nøjagtigt uden at beskadige dem, giver mulighed for nøjagtige HTS-analyser ved at justere celleklyngens størrelse for at udelukke cellerester fra analysesystemet. Da systemet ikke blev brugt, var CV-værdien 26,0%, og Z'-faktorværdien var 0,23 (data ikke vist). CV- og Z'-faktorværdierne blev dog forbedret med henholdsvis 6,4 % og 0,81 ved hjælp af systemet.

For at undersøge cytolyse af PDO'er med ADCC-aktivitet ved hjælp af det elektriske impedansmålerinstrument, som overvåger antallet, morfologien og fastgørelsen af celler i lang varighed, blev ændringer i impedanssignaler vurderet ved hjælp af RLUN007 behandlet med antistofferne (trastuzumab og cetuximab) og NK-celler som effektorceller i en 96-brønds plade. Sammenlignet med kontrollen, der kun består af målceller, steg procentcytolyset med tiden. Den nåede op på 45 % eller 75 % efter 6 timer ved et E:T-forhold på 1:1 (Figur 5A, C) eller 2:1 ( Figur5B,D) uden antistofferne. NK cellemedieret cytolyse ved hjælp af trastuzumab var ca. 60% og 90% i et forhold på 1:1 (Figur 5A, 1 μg/mL) og 2:1 (Figur 5B, 1 μg/mL), henholdsvis ved 6 h. I modsætning hertil havde cetuximab en dosisafhængig indvirkning på NK-cellemedieret cytolyse (Figur 5C, D). Ved den højeste koncentration af cetuximab blev RLUN007 destrueret med henholdsvis 90 % og 100 % i et forhold på henholdsvis 1:1 og 2:1 (figur 5C,D). Virkningen af trastuzumab var svagere end cetuximab, med kun 60% cytotoksicitet. Disse resultater tyder på, at BOB assay system kan evaluere ADCC aktivitet ved hjælp af real-time impedans-baseret teknologi.

Figure 1
Figur 1: Kritiske punkter for BOB-kultur. (A) Farveændring i mediet. (B) Måling af mængden af BOB'er fra pelletstørrelsen ved at fore et centrifugerør, der indeholder PDO'erne med rør, der er markeret ved niveauer for bob-tæthed på 50-200 μL. (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Resumé af den protokol, der anvendes til at skabe et analysesystem med høj kapacitet ved hjælp af 384-brønd mikroplader. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Resumé af protokollen for analyse med høj gennemløb af ADCC-aktivitet. ADCC, antistofafhængig cellulær cytotoksicitet; NK, naturlig morder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Analysesystem med høj gennemløb til væksthæmning med kræftmidler. Dosis-respons kurve af RLUN007 til kræftmidler. De hakkede PDO'er blev sået i 384-brøndsplader. Disse blev behandlet i 6 dage med ti forskellige koncentrationer af kræftmidler (mellem 10 μM og 1,5 nM). Dataene repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelse af trelicatforsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Analyse med høj gennemløb for ADCC-aktivitet. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuximab. (A,C) Et 1:1-forhold mellem RLUN007 og effektorceller. (B,D) Cytolyse med et forhold på RLUN007: effektorceller på 1:2. Aktiviteten blev målt 12 timer efter tilsætning af effektorcellerne. Dataene præsenteres som middel ± standardafvigelse af tre replikatprøver. ADCC, antistofafhængig cellulær cytotoksicitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Det unikke ved BOB'er er, at de ikke er enzymatisk adskilt i enkelte celler under kultur eller analyse og opretholder celleklynger i kultur. Derfor kan antallet af celler ikke tælles nøjagtigt under et mikroskop. For at løse dette problem bestemmes antallet af celler visuelt ved at fore et centrifugerør, der indeholder cellerne med rør markeret med niveauer for 50-200 μL (Figur 1B). Desuden, fordi det er vanskeligt at måle pellet volumen af celle klynger dyrkes i en 25 cm2 kolbe visuelt, tidspunktet for passagen blev bestemt ved hjælp af medium farveændring fra rød til gul og den mærkbare stigning i enkeltceller eller vragrestercompareret med tidspunktet for passaging som indikatorer (Figur 1A, C). Dette er pointen med passaging for BOB'er. Mængden af BOB pellets måles visuelt efter centrifugering ved hver medium ændring. Når pelletvolumenet holder op med at stige, og mediet bliver gult dagen efter medium udskiftning, anses mediet for at være mættet med densitet, og der udføres passaging. Pelletvolumen defineres for hver BOB. Hvis PDO'erne ikke formerer sig, ændres mængden af medium fra 80% til 50% på tidspunktet for medium udveksling, og tætheden af BOB'er øges i kulturen.

Der blev udviklet en HTS, der er egnet til BOB'er. Dens gennemløb er mindst ti til tyve 384-brønd plader udført ved hjælp af en 75 cm2 kolbe BOB, og antallet af plader forarbejdet om dagen er mindst 50. Desuden er resultaterne af HTS's evaluering af forskellige kræftlægemidler ved hjælp af BOB'er allerede blevet rapporteret.

Ved udførelse af HTS behandles tilstopning af maskefilteret forårsaget af mincing af F-BOB'erne ved hjælp af cellefragmenterings- og spredningsudstyret i første omgang ved at ændre filterets maskestørrelse til 100 μm. Det næste skridt er at reducere mængden af BOB-suspensionen, der påføres glasbeholderen. Ved tilberedning af teststofopløsninger til HTS opløses lavdybtryksforbindelser normalt i dimethylsulfoxid, og antistofferne opløses i fosfatbufferet saltvand. Det relevante opløsningsmiddel anvendes som teststof, og kontroldataene indhentes fra det anvendte opløsningsmiddel.

Følgende er en beskrivelse af, hvordan man skal håndtere variabilitet i analysedataene. Hvis der er stor variation i dataene i testen ved hjælp af 384-brøndsplader, skal analysepladen ændres til et 96-brønds pladeformat. PDO fortyndingsfaktoren (antal såede celleklynger) undersøges også efter såning af pladen. Endelig kan cellepluknings- og billedbehandlingssystemet bruges til at vælge størrelsen af PDO'er til analysen. Før du føjer PDO'er til kammeret, skal enkelte celler og små celleklynger fjernes ved centrifugering ved lav hastighed for at kunne genkende PDO'er korrekt. Hvis enkelte celler eller små celleklynger er synlige, efter at der er føjet PDO'er til kammeret, kan der udføres flere dispersioner for at fjerne de enkelte celler. Dernæst, selvom cellepluknings- og billeddannelsessystemet har en funktion, der gør det muligt at holde pladen varm, bruges denne funktion ikke på grund af fordampningen af kulturmediet, når systemet arbejder i lang tid. Endelig er mængden af celleklynger ukendt, fordi den genkendes af et planarbillede. Hvis to eller flere BOB'er overlapper hinanden, kan en enkelt BOB desuden ikke genkendes korrekt. Det er dog muligt at fjerne uønskede PDF-filer ved hjælp af fjernfunktionen ved at kontrollere dem på det scannede billede efter flytningen.

Den elektriske impedans måleinstrument er generelt anvendes til klæbende mål kræftceller til at overvåge ændringer i impedans under cellespredning. Derfor registreres der ikke en ændring i celleindekset for ikke-klæbende PDF-filer. I et forsøg på at løse dette problem er det nødvendigt at undersøge såningsbetingelserne såsom BOB-tæthedsgrad og enzymatisk behandling (celle dissociationenzym og behandlingstid) afhængigt af typen af BOB. Brøndene i pladen skal også være belagt med en passende ekstracellulær matrix til såning af PDO'er. PDO'er er seedet uden enzymatisk behandling, afhængigt af typen af BOB. RLUN007 blev brugt til at måle impedansen ved at så BOB'erne på en 96-brønds plade efter at have spredt dem ved enzymatisk behandling. RLUN007 blev behandlet med cellekulturens dissociationsreagens i 20 min ved 37 °C for at sprede cellerne og fastgøre dem til brøndene på en 96-brønds plade. I betragtning af at dissocierede RLUN007-celler straks danner aggregater, er det ønskeligt at frø på pladerne lige efter filtrering ved hjælp af en si. Efter at have overført celleaffjedringen fra røret til et reservoir blev reservoiret forsigtigt flyttet fra højre til venstre to til tre gange og pipetted op og ned fem gange før såning på pladen. Suspensionen blev også blandet med hver tilføjelse til brønden. Pladen blev derefter placeret i et biologisk sikkerhedsskab i 30 min (til BOB' er) eller 15 min (for NK-celler) for at give cellerne mulighed for at fordele jævnt i brønden. Det andet vigtige punkt er, at behandling med antistoffer og NK-celler skal tideres til at forekomme, før celleindekset når et plateau, og værdien ikke er mindre end 0,5. I tilfælde af RLUN007 er det optimale tidspunkt at starte analysen 20-22 timer efter plating, og cellenummeret til såning er 5 x 104 celler / brønd.

Generelt bruger kulturen og analyserne for tumororganoider ekstracellulære matricer som Matrigel til at skabe tumorvævsstillad eller enzymer som trypsin og kollagenase for at forstyrre organoiderne3,4,5,6,7. Fordelen ved denne metode er, at der ikke kræves ekstracellulær matrix eller enzymatisk behandling under kultur og analyse (bortset fra analyser ved hjælp af det elektriske impedansmålerinstrument), hvilket reducerer arbejdsbehov og omkostninger betydeligt. Desuden er denne metode relativt let at tilpasse sig HTS-analysesystemer og forskellige målesystemer. Men brugen af en ekstracellulær matrix er ønskeligt for nogle forskningsformål, fordi det kan fungere som et stillads for celler og påvirke morfogenese, differentiering, og homøostase i væv.

I denne undersøgelse blev BOB'er (RLUN007) med en EGFR-mutation (L858R), der er klinisk følsomme over for EGFR-hæmmere og højt udtryk for EGFR-genet (ikke vist data) anvendt til at evaluere EGFR-hæmmere. Det blev påvist, at RLUN007's følsomhed over for EGFR-hæmmere var højere end hos andre lungekræft-afledte F-PDO'er13 (figur 4). Således er en HTS ved hjælp af PDO'er, som bevarer tumorvævets egenskaber, overlegen til evaluering af potentielle kræftmidler og giver muligheder for lægemiddelvurdering og fremskridt inden for personlig medicin. Selvom HTS er egnet til den indledende screening af midler, reproducerer det ikke tumormikromiljøet og kan derfor ikke evaluere effekten af lægemidler in vivo. Derfor er et in vitro-system, der kan efterligne human tumorvæv in vivo ved co-kultur med vaskulære endotelceller og andre stromale celler eller organ-on-a-chip-teknologi i mangel af dyremodeller, nu under udvikling.

Disclosures

Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation er et datterselskab af Fujifilm Wako Pure Chemicals, den kommercielle ejer af F-BOB og F-BOB medier ved licensoverførsel.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke de patienter, der leverede de kliniske prøver, der anvendes i denne forskning. Denne forskning er støttet af tilskud fra Translational Research Program af Fukushima Prefecture.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate Corning 4516 Plates for HTS
40-µm Cell Strainer Corning 352340
AdoptCell-NK kit Kohjin Bio 16030400 Kit for NK cell production
Cancer Cell Expansion Media plus Fujifilm Wako Pure Chemical 032-25745 Medium for F-PDO
ALyS505N-175 Cell Science & Technology institute 10217P10 Medium for NK cells
CELL HANDLER Yamaha Motor - Cell picking and imaging system
CellPet FT JTEC - Cell fragmentation and dispersion equipment
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9683 Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent
Echo 555 Labcyte - Liquid handler
EnSpire PerkinElmer - Plate reader
E-plate VIEW 96 Agilent 300601020 Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System
Fibronectin Solution Fujifilm Wako Pure Chemical 063-05591 Plate coating for xCELLigence RTCA System
F-PDO Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International - The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International
Morphit software, version 6.0 The Edge Software Consultancy Biological data analysis software
Multidrop Combi ThermoFisher Scientific 5840300 Cell suspension dispenser
Precision Chamber Yamaha Motor JLE9M65W230 Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER
Precision Tip Yamaha Motor JLE9M65W300 Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER
RLUN007 Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International Lung tumor derived F-PDO
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604021 Cell culture dissociation reagent
Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask Corning 4616 Culture flask for PDO
Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask Corning 3814 Culture flask for PDO
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System Beckman coulter - Cell viability analyzer
xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 ACEA Bioscience - Analysis software for xCELLigence RTCA System
xCELLigence RTCA System ACEA Bioscience - Electrical impedance measuring instrument for cytolysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).
  2. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  3. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
  4. Palechor-Ceron, N., et al. Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks. Cells. 8 (11), 1327 (2019).
  5. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  6. Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).
  7. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  8. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  9. Inoue, A., et al. Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research. Cancers (Basel). 11 (9), 1321 (2019).
  10. Hum, N. R., et al. Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo. Cancers (Basel). 12 (3), 690 (2020).
  11. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).
  12. Takahashi, N., et al. An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids. Cells. 8 (5), 481 (2019).
  13. Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
  14. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Tags

Kræftforskning Patient-afledt tumor organoider kræft modeller anticancer agenter molekylære målrettede lægemidler antistof stof kræft immunterapi antistof-afhængige cellulære cytotoksicitet high-throughput in vitro assay impedans-baserede celle analysator
High-Throughput <em>In Vitro</em> Assay ved hjælp af patient-afledte tumor organoider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Higa, A., Takahashi, N., Hiyama, G., … More

Higa, A., Takahashi, N., Hiyama, G., Tamura, H., Hoshi, H., Shimomura, K., Watanabe, S., Takagi, M. High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids. J. Vis. Exp. (172), e62668, doi:10.3791/62668 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter