Summary
In questo manoscritto, descriviamo un semplice metodo di crescita, purificazione e titolazione del virus dell'herpes simplex oncolitico per uso preclinico.
Abstract
I virus oncolitici (OV), come il virus dell'herpes simplex oncolitico (oHSV), sono una strategia di trattamento in rapida crescita nel campo dell'immunoterapia oncologica. Gli OV, incluso l'oHSV, replicano selettivamente e uccidono le cellule tumorali (risparmiando cellule sane / normali) mentre inducono l'immunità antitumorale. A causa di queste proprietà uniche, le strategie di trattamento basate su oHSV sono sempre più utilizzate per il trattamento del cancro, preclinicamente e clinicamente, incluso il talimogene laherparevec (T-Vec) approvato dalla FDA. La crescita, la purificazione e la titolazione sono tre tecniche di laboratorio essenziali per qualsiasi VS, compresi gli OHSV, prima che possano essere utilizzati per studi sperimentali. In questo articolo viene descritto un semplice metodo passo-passo per amplificare l'oHSV nelle celle Vero. Man mano che gli oHSV si moltiplicano, producono un effetto citopatico (CPE) nelle cellule di Vero. Una volta che il 90-100% delle cellule infette mostra un CPE, vengono raccolte delicatamente, trattate con benzonasi e cloruro di magnesio (MgCl2),filtrate e sottoposte a purificazione utilizzando il metodo del gradiente di saccarosio. Dopo la purificazione, il numero di oHSV infettivi (designati come unità di formatura della placca o PFU) è determinato da un "saggio di placca" nelle cellule di Vero. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per preparare stock di oHSV ad alto titolo per studi in vitro sulla coltura cellulare e esperimenti su animali in vivo.
Introduction
I virus oncolitici (UV) sono una forma emergente e unica di immunoterapia oncologica. I televisori replicano selettivamente nelle cellule tumorali e lenalisi (risparmiando cellule normali / sane)1 mentre inducono l'immunità antitumorale2. Il virus dell'herpes simplex oncolitico (oHSV) è uno dei virus più studiati tra tutti gli UV. È più lontano lungo la clinica, con Talimogene laherparepvec (T-VEC) che è il primo e unico OV a ricevere l'approvazione della FDA negli Stati Uniti per il trattamento del melanoma avanzato3. Oltre al T-VEC, molti altri OHSV geneticamente modificati sono in fase di test preclinicamente e clinicamente in diversi tipidi cancro 3,4,5,6,7,8. L'attuale biotecnologia avanzata del DNA ricombinante ha ulteriormente aumentato la fattibilità dell'ingegneria di nuovi oHSV codificanti per transgeni terapeutici3,5. Un efficiente sistema di propagazione, purificazione e determinazione del tintore oHSV è fondamentale prima che qualsiasi oHSV (di nuova sviluppo) possa essere testato per studi in vitro e in vivo. Questo documento descrive un semplice metodo passo-passo di crescita oHSV (nelle cellule vero), purificazione (con il metodo del gradiente di saccarosio) e titolazione (mediante un saggio di placca oHSV nelle cellule Vero)(Figura 1). Può essere facilmente adottato in qualsiasi ambiente di laboratorio biosicurezza di livello 2 (BSL2) per ottenere uno stock virale di alta qualità per studi preclinici.
Vero, una linea di cellule renali di scimmia verde africana, è la linea cellulare più comunemente usata per la propagazione oHSV9,10,11,12,13 poiché le cellule vero hanno una via di segnalazione dell'interferone antiviraledifettosa 14. Altre linee cellulari con stimolatore inattivato di geni interferoni (STING) possono essere utilizzate anche per la crescita oHSV12,13. Questo protocollo utilizza cellule Vero per la crescita oHSV e il test della placca. Dopo la propagazione, le cellule infettate da oHSV vengono raccolte, lisciviate e sottoposte a purificazione, in cui le cellule lisciviate vengono prima trattate con nucleasi benzonasi per degradare il DNA delle cellule ospiti, prevenire l'aggregazione acido-proteina nucleica e ridurre la viscosità del lisato cellulare. Poiché la corretta attivazione della benzonasi richiede spesso Mg2+,in questo protocollo 15 viene utilizzato1-2 mM MgCl2. I detriti delle cellule ospiti del llysato cellulare trattato con benzonasio vengono ulteriormente eliminati mediante filtrazione seriale prima della centrifugazione ad alta velocità del gradiente di saccarosio. Un cuscino viscoso per la soluzione di saccarosio al 25% aiuta a garantire un tasso più lento di migrazione del virus attraverso lo strato di saccarosio, lasciando componenti correlati alle cellule ospiti nel supernatante, migliorando così la purificazione e limitando la perdita di virus nel pellet16. L'oHSV purificato viene quindi titolato sulle cellule Vero e le placche virali vengono visualizzate da Giemsa chemacchia 17 o colorazione X-gal (per la codifica LacZ oHSV)18.
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Protocol
1) crescita oHSV
NOTA: Garantire l'approvazione del comitato istituzionale per la biosicurezza prima di lavorare con oHSV. Questo studio è stato condotto nell'ambito del protocollo IBC n. 18007 approvato. Mantenere le precauzioni BSL2: sbiancare tutte le pipette, le punte, i tubi e altri materiali che entrano in contatto con il virus. Spruzzare guanti con 70% di alcol isopropile prima che le mani lascino il cappuccio di coltura cellulare BSL2. Lavarsi sempre accuratamente le mani con acqua di sapone dopo aver lavorato con un virus.
- Il giorno -1, semina cellule Vero a basso passaggio in 20 T-150 cm2 fiasche ad una densità di 7-8 × 106 cellule / pallone nel normale mezzo cellulare Vero.
NOTA: Vero medium viene preparato integrando il mezzo aquila modificato (DMEM) di Dulbecco con siero di vitello fetale inattivato al 10% (IFCS). - Il giorno 0 (le cellule sono confluenti all'80-90% ), aggiungere l'inoculo oHSV sulle cellule di Vero.
- Preparazione dell'inoculo del virus
- Utilizzare una molteplicità di infezione (MOI) di 0,01 (MOI può variare da 0,01 a 0,1 a seconda della capacità di replicazione del virus) per l'amplificazione del virus. Utilizzare la formula (1) per calcolare la quantità di virus (mL) per 20 contenitori.
Quantità di virus (mL) per 20 fiasche = quantità di virus necessaria (pfu)/titolo di stock virale (pfu/mL)(1) - Utilizzare la salina tamponata con fosfato (DPBS) ad alto glucosio di Dulbecco integrata con 1% di IFCS per preparare l'inoculo del virus (7 ml per pallone T-150 cm2, cioè ~ 140 mL per 20 mambi). Aggiungere la quantità richiesta di oHSV a 140 mL di soluzione IFCS ad alto glucosio DPBS/1%, vortice per 1 minuto e mantenere la miscela pronta per l'aggiunta alle cellule Vero.
- Utilizzare una molteplicità di infezione (MOI) di 0,01 (MOI può variare da 0,01 a 0,1 a seconda della capacità di replicazione del virus) per l'amplificazione del virus. Utilizzare la formula (1) per calcolare la quantità di virus (mL) per 20 contenitori.
- Lavare il T-150 cm2 fiasche 2x con DPBS ad alto glucosio integrato con 1% IFCS (10 mL/ lavaggio). Aspirare il DPBS/1% IFCS e aggiungere 7 ml di inoculo virale/T-150 cm2 pallone.
- Dondolare delicatamente i mazzi per 5 minuti utilizzando un rocker per la corretta distribuzione dell'inoculo sul monostrato Vero, quindi incubare i contenitori a 37 °C per 1,5-2 ore. Assicurarsi che lo scaffale dell'incubatore sia livellato.
- Rimuovere l'inoculo e aggiungere DMEM integrato con 1% IFCS (25 mL/pallone). Incubare i contenitori per 2-4 giorni.
- Preparazione dell'inoculo del virus
- Controllare quotidianamente i contenitori per il 90-100% di CPE (vedere figura 2).
- Raccogli le cellule Vero infettate da oHSV.
- Raccogliere il supernatante di coltura (~20 mL) da ogni pallone (lasciare ~5 mL in ogni pallone) in tubi di centrifuga conica da 50 ml o contenitore di supporti.
- Utilizzare un raschietto per celle per raschiare delicatamente le cellule dal fondo dei contenitori.
NOTA: Le cellule dovrebbero uscire rapidamente dai contenitori. - Aggiungere ~15 mL del supernatante di coltura (raccolto nel passaggio 1.4.1) a ciascun pallone (che porta il volume di ~ 20 mL in ogni pallone, cioè 400 mL per 20 fiasche) e lavare delicatamente il fondo dei mazzi di lino alcune volte utilizzando un tubo sierologico sterile da 10 ml.
NOTA: Non pipet vigorosamente. Cerca di mantenere intatte tutte le cellule. - Raccogliere le cellule (+ mezzo) in tubi di centrifuga conica da 50 ml su ghiaccio (utilizzare 8 tubi per contenere 400 ml di cellule raccolte da 20 contenitori).
- Ruotare le cellule a 300 g per 10 min a 4 °C e aspirare il supernatante.
- Aggiungere 1,25 mL (50%) di Virus Buffer (VB) e 1,25 mL (50%) di coltura supernatante (raccolto nel passaggio 1.4.1) ad ogni tubo di centrifuga e sospendere accuratamente ogni pellet. Trasferire le celle risostillate da otto tubi di centrifuga da 50 ml a un tubo di centrifuga conica da 50 ml.
NOTA: fare riferimento alla preparazione della soluzione VB nella tabella 1. Sterilizzare il filtro della soluzione VB utilizzando un filtro di sterilizzazione multimediale. Utilizzare 0,5 ml di VB + 0,5 mL di supernatante per pallone T-150 cm2 per la nuova sospensione, cioè per 20 mambi (20 mL), utilizzare 10 ml di VB e 10 ml di supernatante di coltura. - Congelare le cellule ri-sospese utilizzando ghiaccio secco / 100% etanolo e conservare a -80 °C.
2) purificazione oHSV
- Snap-freeze (nel ghiaccio secco e 100% di etanolo)/scongelamento (in un bagno d'acqua calda a 37 °C) le cellule seguite da bagno d'acqua-sonicazione per 1 minuto per un totale di 3 cicli per garantire una corretta lisi delle cellule per rilasciare virus nel supernatante.
NOTA: Eseguire la sonicazione per 1 minuto utilizzando 40 kHz, 120 V di potenza. Se non è disponibile un sonicatore tonnibile, utilizzare un sonicatore ad ultrasuoni per il bagno d'acqua. Prendere un'aliquota di 50 μL per la titolazione nella sezione 3, che aiuterà a identificare quale delle seguenti misure è responsabile di una potenziale perdita di virus durante la procedura di purificazione. - Trattare il lisato cellulare con Benzonasi Nucleasi (175 unità/mL) + 2 mM MgCl2 (1 M stock = 2 μL/mL), vortice e incubare per 30 min a 37 °C. Posizionare il tubo sul ghiaccio ed eseguire i seguenti passaggi a 4 °C.
- Pellettizzazione dei detriti cellulari mediante centrifugazione a bassa velocità.
- Ruotare il lysate cellulare a 300 g per 10 min.
- Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (sospendere di nuovo il pellet di cella in 0,5 ml di VB, designarlo come pellet-1 e conservare a 4 °C per l'uso nella fase 2.3.5; vedere figura 1).
- Ruotare nuovamente il supernatante (ottenuto nel passaggio 2.3.2) a 500 g per 10 min.
- Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (sospendere di nuovo il pellet di cella in 0,5 ml di VB, designarlo come pellet-2 e conservare a 4 °C per l'uso nella fase 2.3.5; vedere figura 1).
- Unire il pellet-1 ri-sospeso (da 2.3.2) e pellet-2 (da 2.3.4) in un nuovo tubo di centrifuga da 1,7 ml, vortice / sonicato (bagno d'acqua) 2x e girare a 400 g per 10 minuti. Raccogliere il supernatante e combinarlo con il supernatante ottenuto al passaggio 2.3.4; cfr. figura 1).
NOTA: Eseguire la sonicazione per 1 minuto utilizzando 40 kHz, potenza di 120 V per prevenire l'aggregazione virale prima della procedura di filtrazione nel passaggio 2.4. Prendere un'aliquota di 50 μL del supernatante combinato per la titolazione nella sezione 3.
- Filtrare il supernatante combinato (~21 mL, cioè 20 mL da 1.4.6, 0.5 mL da 2.3.2 e 0.5 mL da 2.3.4) utilizzando il seguente metodo di filtrazione in 3 passaggi.
- Esegnare 21 ml del supernatante utilizzando una siringa da 10 ml (5-7 ml ogni volta per un facile passaggio attraverso il filtro) e passarlo attraverso un filtro sterile a membrana in polivinilidene da 5 μm (PVDF) posto su un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (etichettato come TUBE 1).
- Aggiungere 1 ml di VB a un tubo di centrifuga conico da 50 mL svuotato in 2.4.1 (per raccogliere la quantità residua di supernatante virus), vortice, e passare attraverso lo stesso filtro PVDF da 5 μm posto su TUBE 1 (portando il totale a 22 ml di filtrato). Procedere al passaggio 2.4.2.
- Estraere 22 ml del filtrato da TUBE 1 (come in 2.4.1) e passarlo attraverso un filtro sterile a membrana in cellulosa mista (MCE) da 0,8 μm posto su un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (etichettato come TUBE 2).
- Aggiungere 1 mL di VB a TUBE 1 svuotato nel passaggio 2.4.2, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro MCE da 0,8 μm posto su TUBE 2 (portando il totale a 23 ml di filtrato). Procedere al passaggio 2.4.3.
- Esegnare 23 ml di filtrato da TUBE 2 (come in 2.4.1) e passarlo attraverso un filtro PVDF sterile da 0,45 μm posto su un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 mL (etichettato come TUBE 3).
- Aggiungere 1 ml di VB a TUBE 2 svuotato nel passaggio 2.4.3, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro PVDF da 0,45 μm posto su TUBE 3 (portando il totale a 24 ml di filtrato).
NOTA: Prendere un'aliquota di 50 μL del filtrato per la titolazione nella sezione 3.
- Aggiungere 1 ml di VB a TUBE 2 svuotato nel passaggio 2.4.3, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro PVDF da 0,45 μm posto su TUBE 3 (portando il totale a 24 ml di filtrato).
- Esegnare 21 ml del supernatante utilizzando una siringa da 10 ml (5-7 ml ogni volta per un facile passaggio attraverso il filtro) e passarlo attraverso un filtro sterile a membrana in polivinilidene da 5 μm (PVDF) posto su un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (etichettato come TUBE 1).
- Centrifugazione ad alta velocità con il metodo del gradiente di saccarosio
NOTA: In questo protocollo è stato utilizzato un rotore ad angolo fisso F13-14x50cy. Sia il rotore che la centrifuga devono essere a 4 °C prima di procedere con i seguenti passaggi.- Aggiungere 10 ml di una soluzione di saccarosio al 25% ghiacciata e filtrata sterile (preparata sciogliendo 25 g di polvere di saccarosio in 100 ml di soluzione salina bilanciata di Hank) in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml.
- Lentamente (3 mL/min) aggiungere 24 mL del filtrato virale (ottenuto dal gradino 2.4.3.1) sopra lo strato di saccarosio. Fare attenzione a mantenere strati separati del filtrato del virus e della soluzione di saccarosio.
NOTA: Fino a 30 mL dello strato virale possono essere aggiunti oltre 10 mL della soluzione di saccarosio. - Centrifugare il tubo per 90 min a 22.620 g a 4 °C.
- Rimuovere il supernatante e lo strato di saccarosio dal tubo di centrifuga conica da 50 ml.
NOTA: Il pellet del virus deve essere biancastro. Prendere un'aliquota di 50 μL del supernatante e un'aliquota di 50 μL dello strato di saccarosio per la titolazione nella sezione 3.
- Sospendere di nuovo il pellet in soluzione di glicerolo/PBS al 10%.
- Aggiungere 1 ml di glicerolo sterile al 10% (diluito in PBS) al tubo di centrifuga conica da 50 ml per coprire il pellet.
NOTA: La quantità della miscela ri-sospesa può variare (come 0,8-1,2 mL) a seconda delle dimensioni del pellet. Un volume minore darebbe una maggiore concentrazione di virus. - Posizionare il tubo di centrifuga conica da 50 ml sul ghiaccio per 2-4 ore. Durante questo periodo, sonicare /vortice il pellet ogni 15 minuti per 30 s per aiutare a spodestare / sospendere il pellet.
- Raccogliere il pellet ri-sospeso (1 ml di glicerolo/PBS + la dimensione del pellet porterà il volume totale a ~ 1,3 ml) in un tubo di microcentrifugo da 2 ml. [Facoltativo: aggiungere altri 0,3 ml di glicerolo/PBS al 10% di glicerolo/PBS allo stesso tubo di centrifuga conico da 50 mL per raccogliere la quantità di traccia rimanente del pellet, pipetta su e giù e combinare con il pellet ri-sospeso nel passaggio 2.6.3 per portare il volume totale a ~1,6 mL.]
- Se la sospensione nel passaggio 2.6.3 è torbida o torbida (a causa di detriti cellulari), centrifugare il tubo a 500 g per 10 minuti, trasferire il supernatante su un nuovo tubo di microcentrifugo da 2 ml e procedere al passaggio 2.6.4.
- Prendere un'aliquota di 50 μL per la titolazione oHSV nella sezione 3. Aliquotare il resto della soluzione (250 μL/aliquota) in tubi sterili a microcentrifugo con tappi a vite (ben sigillati per lo stoccaggio a lungo termine), congelare a scatto e conservare a -80 °C fino all'uso (pronto per studi sperimentali una volta determinato il titolo oHSV).
NOTA: Tutti i materiali che entrano in contatto con il virus devono essere sbiancati o trattati con radiazioni ultraviolette prima di essere rimosso dalla cappa o dallo smaltimento.
- Aggiungere 1 ml di glicerolo sterile al 10% (diluito in PBS) al tubo di centrifuga conica da 50 ml per coprire il pellet.
3. titolazione oHSV e dosaggio della placca
- Seme 1,7-1,8 x 105 cellule Vero/pozzo in una piastra di coltura cellulare a 6 porri nel mezzo cellulare Vero (DMEM con 10% IFCS; vedere fase 1.1).
NOTA: Assicurarsi che le cellule siano distribuite in modo omogeneo in tutto il pozzo; non ruotare la piastra, che può causare accumulo di cellule nel mezzo dei pozzi. Per evitare vorticosi, scuotere lentamente la piastra a mano verticalmente, quindi orizzontalmente, quindi posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore. - Il giorno successivo (quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza), aspirano il mezzo di coltura e aggiungono 1 mL / pozzo di PBS ad alto glucosio integrato con 1% IFCS. Lasciare la piastra nella cappa di coltura cellulare fino al completamento del passaggio 3.3.
- Diluire serialmente il virus in tubi in polipropilene da 5 ml utilizzando PBS/1% IFCS (Figura 3).
NOTA: Utilizzare l'aliquota di 50 μL raccolta nel passaggio 2.6.4 per la diluizione seriale. Nel tubo 1st (diluizione10-3), aggiungere 2 μL del virus nel 1998 μL di PBS/1%IFCS, vortice. Nel secondo tubo(diluizione 10-5), prendere 10 μL dal tubo 1st in 990 μL di PBS/1% IFCS, vortice. Nel tubo 3rd (10-6 diluizione), prendere 100 μL dal 2° tubo in 900 μL di PBS/1% IFCS, vortice; continuare questa diluizione seriale di 10 volte fino alladiluizione 10-9. Vedere i dettagli nella figura 3. - Aspirare PBS/1% IFCS e aggiungere 0,7 mL/pozza del virus diluito serialmente (a partire da 10-5 a 10-9) alle cellule Vero.
NOTA: Non lasciare asciugare le cellule. - Dondolare delicatamente la piastra su un rocker per 5 minuti a temperatura ambiente (per garantire una distribuzione omogenea dell'inoculo del virus).
- Incubare la piastra per 1,5 ore a 37 °C.
NOTA: Durante questo periodo di incubazione, preparare la diluizione 1:1000 dell'immunoglobulina umana G (IgG) in DMEM integrata con 1% IFCS. Per una piastra a 6 po porsi, preparare 12,5 mL in modo che 2 mL / pozzo possano essere utilizzati nel passaggio 3.7. Regolare la diluizione per tenere conto delle variazioni di lotto nell'IgG umano. - Rimuovere l'inoculo virale dai pozzi e aggiungere 2 mL/pozzo dello 0,1% di IgG umano (per neutralizzare l'oHSV nel terreno di coltura e prevenire la formazione di placche secondarie) in DMEM integrato con 1% IFCS. Incubare la piastra a 37 °C per 3-4 giorni.
NOTA: Le placche chiare di solito si formano in 3 giorni. - Piastre di fissaggio e colorazione
- Rimuovere il supernatante e fissare le cellule in metanolo puro (1 mL / pozzo) per 5 minuti. Rimuovere il metanolo e lasciare asciugare le piastre all'aria.
- Diluire la macchia di Giemsa (1:5) con acqua deionizzata e aggiungere 1 mL della macchia diluita di Giemsa per pozzo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
- Rimuovere la macchia, risciacquare con acqua del rubinetto e lasciare asciugare all'aria le piastre.
- Contare le placche usando un microscopio sezionato.
- Facoltativo per oHSV con espressione lacZ:
- Rimuovere il supernatante e fissare le cellule con glutaraldeide fredda dello 0,2% /2% di paraformaldeide per 5-10 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione fissante e lavare le celle 3 volte con PBS.
- Aggiungere la soluzione X-gal alle cellule (1 mL/pozzo) e incubare la piastra a 37 °C per 2 ore.
NOTA: La macchia X-gal deve essere preparata appena il giorno della colorazione; conservazione a lungo termine potrebbe portare allo sbiadimento del colore. Vedere la preparazione della soluzione X-gal nella tabella 1. - Rimuovere la macchia X-gal e lavare la piastra con acqua del rubinetto per 1 minuto.
- Contro-macchia con soluzione Neutra Rossa (1 mL/pozzo) per 2 min a temperatura ambiente.
NOTA: Vedere preparazione della soluzione rossa neutra nella tabella 1. - Lavare il piatto con acqua del rubinetto per 1 minuto; lasciare asciugare le piastre all'aria.
- Contare le placche blu utilizzando un microscopio sezionato (Figura 4).
- Calcolare il carattere utilizzando la formula (2)
Timone in pfu/mL (unità di formatura della placca) = Numero di placche/0,7 mL × fattore di diluizione (2)
NOTA: Ad esempio, se 25 placche si trovano nel pozzo didiluizione 10 -9, il titolo è 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/mL. Questo è il giacimento finale di aliquote oHSV preparato nella fase 2.6.4.
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Representative Results
Una breve panoramica dell'intero protocollo è illustrata nella figura 1, che rappresenta i passaggi critici coinvolti nella crescita, purificazione e titolazione di oHSV. Cpe nelle cellule vero può essere rilevato già 4 h infezione post-HSV19. La figura 2 mostra cpe nelle cellule Vero in tre diversi punti di tempo a seguito dell'infezione da oHSV. Il livello del CPE è aumentato nel tempo. In questo protocollo, il 90-100% cpe è solitamente osservato entro 48 h dall'inoculazione di oHSV a basso MOI (che è il momento migliore per raccogliere le cellule per la purificazione). Tuttavia, possono essere necessario fino a 4 giorni a seconda del MOI oHSV inoculato nel passaggio 1.2 e/o del potenziale di replica dell'oHSV. Oltre questo periodo, le cellule con CPE possono essere lese, portando al rilascio del virus nel supernatante. Pertanto, per ottenere un giamettitore virale elevato, è fondamentale raccogliere le cellule colpite dal CPE quando sono intatte. Un altro fattore importante che contribuisce al formicolio del virus finale è il numero o la dimensione dei contenitori di coltura tissutale utilizzati per l'amplificazione oHSV. La figura 3 illustra il processo di diluizione seriale (da 10-3 a 10-9) di un dato stock virale (ottenuto nella fase 2.6.4) richiesto per la determinazione del titolo mediante test della placca. Per gli oHSV con espressione lacZ, le placche virali possono essere visualizzate mediante colorazione X-gal (Figura 4). In questo protocollo sono stati utilizzati 20 contenitori di coltura tissutale T-150 cm2, per i quali si possono attendere 1,3-1,6 mL di stock di oHSV con un titer di 1 ×10 10 pfu/mL.
Figura 1: Presentazione schematica dei principali passi coinvolti nella crescita, nella purificazione e nel dosaggio della placca. Abbreviazioni: oHSV = virus oncolitico dell'herpes simplex; CPE = effetto citopatico; VB = Buffer virus; HBSS = Soluzione salina bilanciata di Hank; PBS = salina tamponata da fosfati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetto citopatico nelle cellule vero dopo l'infezione da oHSV. Le cellule vero sono state inoculate con codifica oHSV per mCherry (mostrato in fluorescenza rossa) ad un MOI di 0,01 e immagini (ingrandimento 10x) a 36, 48 e 72 h di infezione post-virus. Il CPE è identificato arrotondando le cellule infettate da oHSV (indicate da frecce nere). Barre di scala = 200 μm. Abbreviazione: oHSV = virus dell'herpes simplex oncolitico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Diluizione seriale di uno stock di oHSV per i saggi di placca. Vedere anche il passaggio 3.3 del protocollo. Abbreviazione: oHSV = virus dell'herpes simplex oncolitico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine rappresentativa delle placche macchiate di X-gal a 72 ore dopo l'infezione da OHSV. Supernanti di coltura cellulare infetti da OHSV non diluiti (pozzo superiore) e diluiti (1:10; pozzo inferiore) aggiunti alle cellule Vero (70-80% confluenti), seguiti dal protocollo di colorazione X-gal descritto nella sezione 3.8.5 (esclusa la contro-colorazione con il rosso neutro). Immagini rappresentative di una placca virale macchiata di X-gal (dal pannello sinistro) sono presentate nei pannelli centrali (4x; scale bars = 1000 μm) e destro (10x; scale bars = 200 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Composizione della soluzione | |
| Preparazione del tampone del virus | quantità |
| 1 M Cloruro di sodio | 15 mL |
| 1 M Tris-cloridrato | 3 mL |
| Acqua purificata | 132 mL |
| regolare il pH a 6,8 | |
| Preparazione della soluzione X-gal (~6,5 mL per una piastra a 6 pozze) | |
| Ferricianuro di potassio da 250 mM | 130 μL |
| Ferrocianuro di potassio da 250 mM | 130 μL |
| 1 M Cloruro di magnesio | 13 μL |
| X-gal pre-sciolto (20 mg/mL) nel dimetil solfossido (DMSO) | 162,5 μL |
| Pbs | 6064,5 μL |
| Preparazione della soluzione Neutral Red per una piastra a 6 pozzi | |
| Soluzione Rossa Neutra | 100 μL |
| metanolo | 1 mL |
| Acqua purificata | 7 mL |
Tabella 1: Composizione della soluzione.
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Discussion
Il protocollo inizia con la crescita di oHSV nelle cellule vero a basso passaggio. La confluenza del monostrato a cellule Vero dovrebbe essere ~80% al momento dell'inoculazione del virus in quanto le cellule invase possono sviluppare strutture fibrose strette che possono ridurre l'ingresso di oHSV nelle cellule Vero20. Una volta osservato il 90-100% cpe, il supernatante della coltura viene rimosso, le cellule vengono raccolte, rimescolate in VB /supernatante (vedi passaggio 1.4.6), congelate a scatto e conservate a -80 °C per una successiva purificazione. Blaho e colleghi utilizzavano un metodo leggermente diverso di raccolta e conservazione delle cellule di Vero infette. Ad esempio, i contenitori contenenti le cellule e i mezzi di coltura (integrati con l'1% di albumina di siero bovino e PBS con potassio) sono inizialmente conservati a -80 °C per almeno 15 minuti, seguiti da un lento riscaldamento dei contenitori a temperatura ambiente. Le cellule vengono quindi raccolte, mescolate con latte sterile e conservate a -80 °C fino alla purificazione20. In questo caso, il latte sterile agisce come stabilizzatore, ed è stato dimostrato che il titolo di uno stock virale è drammaticamente più alto quando viene conservato in latte sterile / mezzo che nel solo mezzo20. Tuttavia, in un altro studio, un confronto diretto tra diversi stabilizzatori (compreso il latte sterile) utilizzati per lo stoccaggio di diversi herpesvirus a -80 °C non ha mostrato alcun impatto significativo sui titolo del virus finale21. Qui, il pellet cellulare è stato ri-sospeso in VB costituito con tris-tampone salino (pH 6.8) e 10% glicerolo come stabilizzatore di stoccaggio, che di solito dà un titolo ad alto virus (come descritto nel passaggio 3.10) per studi sperimentali.
È fondamentale rimuovere tutti i componenti cellulari e multimediali dal pellet ri-sospeso per ottenere uno stock di virus di alta qualità. La rimozione di particelle non virali è fondamentale per evitare potenziali reazioni immunitarie durante esperimenti in vivo. Sono stati descritti diversi metodi di purificazione del virus, tra cui la centrifugazione22,diversi metodigradienti 23,filtrazione 24e cromatografia diaffinità 25. Sebbene questo protocollo sia basato sulla centrifugazione ad alta velocità utilizzando un metodo gradiente di saccarosio, altri hanno utilizzato una varietà di altri metodi gradienti, come iodixanolo11,26, Percoll27e Ficoll-Nycodenz23. Questi metodi di gradiente separano il virus per densità e richiedono l'isolamento della banda dal gradiente, invece del cuscino di saccarosio in cui il virus viene pellettato. Il metodo del gradiente di saccarosio offre un approccio delicato alle particelle virali separate perché riduce al minimo il rischio di interrompere le proteine virali dell'involucro mantenendo l'infettività virale. Nonostante questi vantaggi, l'elevata osmolarità della soluzione concentrata di saccarosio potrebbe disidratare le particelle virali; pertanto, il metodo del gradiente di iodixanolo è stato sviluppato per superare questo inconveniente. Tuttavia, il metodo del gradiente iodixanolo richiede ultracentrifugo e raccolta della banda virione. Altri fattori che devono essere considerati durante la purificazione oHSV sono la velocità e il tempo di centrifugazione e la scelta del tampone virale utilizzato per lo stoccaggio a lungo termine. Questo protocollo ha la limitazione che la purezza di oHSV non è confermata; tuttavia, un elevato numero di particelle di virus funzionali è stato trovato in un dato stock oHSV purificato per titolazione sulle cellule di Vero (vedi sezione 3).
oHSV forma placche sulle cellule di Vero (Figura 4). Le placche virali possono essere identificate dalla colorazione Giemsa, che è un metodo facile e conveniente. Giemsa macchia le cellule di Vero, lasciando le placche virali trasparenti o vuote che possono essere facilmente visualizzate (ad occhio nudo) e contate utilizzando un microscopio sezionante. Durante la sovrapposizione del supporto con agarosio o metilcellulosa è comunemente usato durante la formazione della placca (nel passaggio 3.7) per prevenire la diffusione del virus e infezioni secondarie e code di placca28, l'uso di IgG umano per neutralizzare l'oHSV nella coltura supernatante è più facile e conveniente. Per gli oHSV che esprimono lacZ, le placche possono essere visualizzate mediante colorazione X-gal (Figura 4), mentre la microscopia fluorescente viene utilizzata per le proteine fluorescenti (cioè le proteine fluorescenti verdi) che esprimono oHSV18. Ulteriori test per rilevare cellule infettate da oHSV includono immuno-istochimica o -fluorescenza con anticorpi specifici dell'OHSV29 o scansione laser di anticorpi oHSV coniugati con fluoroforo vicino all'infrarosso30.
Ci sono misure critiche che devono essere seguite per ottenere un buon stock di virus come mantenere la sterilità per prevenire la contaminazione microbica (batteri, lievito o muffa) e cellule Vero sane. Poiché l'involucro di oHSV è estremamentetermosensibile 20, il materiale oHSV deve essere maneggiato in un crioprotettivo come il 10% di glicerolo. Nel complesso, questo protocollo può essere facilmente utilizzato e praticato in un ambiente di laboratorio, ma potrebbe non essere utile per la produzione di virus su larga scala.
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Disclosures
SDR è co-inventore di brevetti relativi a virus simplex dell'herpes oncolytic, di proprietà e gestito dalla Georgetown University e dal Massachusetts General Hospital, che hanno ricevuto royalties da Amgen e ActiVec Inc. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca nel laboratorio saha è stata supportata in parte da fondi del DIPARTIMENTO (W81XWH-20-1-0702) e della Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin e Melissa R.M. Humphrey erano parzialmente supportati da NIH (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
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