Summary
En este manuscrito, describimos un método simple de crecimiento, de purificación, y de titulación del virus oncolítico del simplex de herpes para el uso preclínico.
Abstract
Los virus oncolíticos (OVs), tales como el virus oncolítico del simplex de herpes (oHSV), son una estrategia de tratamiento de rápido crecimiento en el campo de la inmunoterapia del cáncer. Los OVs, incluyendo oHSV, replican selectivamente adentro y matan a las células cancerosas (ahorrando las células sanas/normales) mientras que inducen inmunidad antitumores. Debido a estas propiedades únicas, las estrategias oHSV-basadas del tratamiento se están utilizando cada vez más para el tratamiento del cáncer, preclínico y clínico, incluyendo el laherparevec del talimogene aprobado por la FDA (T-Vec). El crecimiento, la purificación y la titulación son tres técnicas de laboratorio esenciales para cualquier OVs, incluyendo oHSVs, antes de que puedan ser utilizados para estudios experimentales. Este papel describe un método paso a paso simple para amplificar el oHSV en células de Vero. A medida que los oHSV se multiplican, producen un efecto citopático (CPE) en las células Vero. Una vez que el 90-100% de las células infectadas muestran un CPE, se cosechan suavemente, se tratan con benzonasa y cloruro de magnesio (MgCl2),se filtran y se someten a purificación utilizando el método de gradiente de sacarosa. Después de la purificación, el número de oHSV infeccioso (designado como unidades formadores de placa o PKU) se determina mediante un "ensayo de placa" en las células Vero. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para preparar la acción del oHSV del alto-título para los estudios ines vitro en cultivo celular y experimentos animales in vivo.
Introduction
Los virus oncolíticos (OVs) son una forma emergente y única de inmunoterapia contra el cáncer. Los OVs se replican selectivamente en y lisean las células tumorales (ahorrando células normales/sanas)1 mientras se induce la inmunidad antitumoral2. El virus del herpes simple oncolítico (oHSV) es uno de los virus más ampliamente estudiados entre todos los OVs. Está más lejos a lo largo de la clínica, con Talimogene laherparepvec (T-VEC) siendo el primer y único OV en recibir la aprobación de la FDA en los EE.UU. para el tratamiento del melanoma avanzado3. Además de T-VEC, muchos otros oHSVs genéticamente modificados se están probando preclínica y clínicamente en diferentes tipos de cáncer3,4,5,6,7,8. La actual biotecnología avanzada del ADN recombinante ha aumentado aún más la viabilidad de la ingeniería de nuevos oHSV que codifican para transgenes terapéuticos3,5. Un sistema eficiente de propagación, purificación y determinación de títulos de oHSV es crítico antes de que cualquier oHSV (recientemente desarrollado) pueda probarse para estudios in vitro e in vivo. Este papel describe un método simple paso a paso del crecimiento del oHSV (en células de Vero), de la purificación (por el método del sacarosa-gradiente), y de la titulación (por un análisis de la placa del oHSV en células de Vero) (cuadro 1). Se puede adoptar fácilmente en cualquier entorno de laboratorio de nivel 2 de bioseguridad (BSL2) para lograr un stock viral de alta calidad para estudios preclínicos.
Vero, una línea celular de riñón de mono verde africano, es la línea celular más comúnmente utilizada para la propagación del oHSV9,10,11,12,13 ya que las células vero tienen una vía de señalización de interferón antiviral defectuosa14. Otras líneas celulares con estimulador inactivado de genes de interferón (STING) también se pueden utilizar para el crecimiento de oHSV12,13. Este protocolo utiliza las células de Vero para el crecimiento del oHSV y el análisis de la placa. Después de la propagación, las células infectadas por oHSV se cosechan, se lisan y se someten a purificación, en donde las células lisadas primero se tratan con ncleasa benzonasa para degradar el ADN de la célula huésped, prevenir la agregación ácido nucleico-proteína y reducir la viscosidad del lisato celular. Como la activación adecuada de la benzonasa a menudo requiere Mg2 +,1-2 mM MgCl2 se utiliza en este protocolo15. Los restos de la célula huésped del lisato de células tratadas con benzonasa se eliminan aún más mediante filtración en serie antes de la centrifugación de gradiente de sacarosa de alta velocidad. Un cojín viscoso de solución de sacarosa al 25% ayuda a asegurar una tasa más lenta de migración del virus a través de la capa de sacarosa, dejando los componentes relacionados con la célula huésped en el sobrenadante, mejorando así la purificación y limitando la pérdida de virus en el pellet16. El oHSV purificado se titula en las células Vero, y las placas virales se visualizan mediante la tinción de Giemsa17 o X-gal (para la codificación LacZ oHSVs)18.
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Protocol
1) crecimiento del oHSV
NOTA: Asegurar la aprobación del comité institucional de bioseguridad antes de trabajar con oHSV. Este estudio se realizó bajo el Protocolo IBC aprobado nº 18007. Mantenga las precauciones de BSL2: blanquee todas las pipetas, puntas, tubos y otros materiales que entren en contacto con el virus. Rocíe guantes con alcohol isopropílico al 70% antes de que las manos salgan de la campana de cultivo celular BSL2. Siempre lávese bien las manos con agua jabonosa después de trabajar con un virus.
- En el día -1, semillas de células Vero de bajo paso en 20 frascos T-150 cm2 a una densidad de 7-8 × 106 células/matraz en medio celular Vero regular.
NOTA: El medio Vero se prepara complementando el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con suero de ternero fetal inactivado por calor al 10% (IFCS). - En el día 0 (las células son 80-90% confluentes), añadir oHSV inóculo en las células Vero.
- Preparación del virus inóculo
- Utilice una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 (MOI puede variar de 0,01 a 0,1 dependiendo de la capacidad de replicación del virus) para la amplificación del virus. Utilice la fórmula (1) para calcular la cantidad de virus (ml) para 20 matraces.
Cantidad de virus (ml) para 20 matraces = cantidad de virus necesaria (pfu)/título de la población de virus (pfu/mL)(1) - Utilice solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco de alta glucosa suplementada con IFCS al 1% para preparar el inóculo del virus (7 mL por matraz T-150 cm2, es decir, ~ 140 mL para 20 matraces). Agregue la cantidad requerida de oHSV a 140 mL de solución DPBS/IFCS de alta glucosa/1%, vórtice durante 1 minuto y mantenga la mezcla lista para su adición a las células Vero.
- Utilice una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 (MOI puede variar de 0,01 a 0,1 dependiendo de la capacidad de replicación del virus) para la amplificación del virus. Utilice la fórmula (1) para calcular la cantidad de virus (ml) para 20 matraces.
- Lavar los matraces T-150 cm2x con DPBS de alto contenido de glucosa suplementados con IFCS al 1% (10 mL/lavado). Aspirar el DPBS/1% IFCS y añadir 7 mL de inóculo del virus/T-150 cm2 matraz.
- Mezcle suavemente los matraces durante 5 min utilizando un balancín de matraz para la correcta distribución del inóculo sobre la monocapa de Vero, y luego incube los frascos a 37 °C durante 1,5-2 h. Asegúrese de que el estante de la incubadora esté nivelado.
- Retirar el inóculo y añadir DMEM suplementada con IFCS al 1% (25 mL/matraz). Incubar los frascos durante 2-4 días.
- Preparación del virus inóculo
- Compruebe los frascos diariamente para 90-100% CPE (véase el cuadro 2).
- Cosechar las células vero infectadas por el oHSV.
- Recoja el sobrenadante de cultivo (~ 20 mL) de cada matraz (deje ~ 5 mL en cada matraz) en tubos de centrífuga cónicos de 50 ml o contenedor de medios.
- Utilice un raspador de células para raspar las células de la parte inferior de los frascos suavemente.
NOTA: Las células deben salir rápidamente de los frascos. - Añadir ~15 mL del sobrenadante de cultivo (recogido en el paso 1.4.1) a cada matraz (que aporta el volumen de ~20 mL en cada matraz, es decir, 400 mL para 20 matraces) y lavar suavemente el fondo de los matraces unas cuantas veces utilizando una pipeta serológica estéril de 10 ml.
NOTA: No pipetee vigorosamente. Trate de mantener todas las células intactas. - Recoja las células (+ medio) en tubos de centrífuga cónicos de 50 ml sobre hielo (use 8 tubos para contener 400 ml de células cosechadas de 20 matraces).
- Gire las células a 300 g durante 10 min a 4 °C y aspire el sobrenadante.
- Agregue 1.25 mL (50%) de Búfer de virus (VB) y 1,25 mL (50%) de sobrenadante de cultivo (recogido en el paso 1.4.1) a cada tubo de centrífuga y volver a suspender cada pellet a fondo. Transfiera las células re-suspendidas de ocho tubos centrífugos de 50 mL a un tubo de centrífuga cónica de 50 mL.
Nota: Consulte la preparación de la solución VB en la tabla 1. Esterilice la solución VB utilizando un filtro de esterilización de medios. Utilizar 0,5 ml de VB + 0,5 ml de sobrenadante por matraz T-150 cm2 para la re-suspensión, es decir, para 20 matraces (20 mL), utilizar 10 mL de VB y 10 ml de sobrenadante de cultivo. - Congele a presión las células re-suspendidas usando hielo seco/etanol al 100% y guárdelo a -80 °C.
2) purificación del oHSV
- Snap-freeze (en hielo seco y 100% etanol)/descongelación (en un baño de agua caliente de 37 °C) las células seguidas de baño de agua-sonicación durante 1 min durante un total de 3 ciclos para asegurar la lisis adecuada de las células para liberar virus en el sobrenadante.
NOTA: Realice la sonicación durante 1 minuto con 40 kHz, 120 V de potencia. Si un sonicador sintonizable no está disponible, utilice un sonicador de baño de agua ultrasónico. Tome una alícuota de 50 μL para la titulación en la sección 3, que ayudará a identificar cuál de los siguientes pasos es responsable de la posible pérdida del virus durante el procedimiento de purificación. - Trate el lisiado celular con benzonasa nucleasa (175 unidades/mL) + 2 mM MgCl2 (1 M stock = 2 μL/mL), vórtice e incube durante 30 min a 37 °C. Coloque el tubo sobre hielo y realice los siguientes pasos a 4 °C.
- Pellet de los restos de la célula por centrifugación de baja velocidad.
- Gire el lysate de la célula en 300 g por 10 minutos.
- Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo centrífugo cónico de 50 mL (volver a suspender el pellet celular en 0,5 mL de VB, designarlo como pellet-1, y almacenarlo a 4 °C para su uso en el paso 2.3.5; ver Figura 1).
- Girar el sobrenadante (obtenido en el paso 2.3.2) de nuevo a 500 g durante 10 min.
- Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo centrífugo cónico de 50 mL (vuelva a suspender el pellet celular en 0,5 mL de VB, designarlo como pellet-2 y conservarlo a 4 °C para su uso en el paso 2.3.5; ver Figura 1).
- Combine el pellet-1 re-suspendido (de 2.3.2) y pellet-2 (de 2.3.4) en un nuevo tubo de centrífuga de 1.7 mL, vórtice / sonicado (baño de agua) 2x, y gire a 400 g durante 10 min. Recoger el sobrenadante y combinarlo con el sobrenadante obtenido en el paso 2.3.4; consulte la figura 1).
NOTA: Realice la sonicación durante 1 minuto utilizando 40 kHz, 120 V de potencia para evitar la agregación viral antes del procedimiento de filtración en el paso 2.4. Tome una alícuota de 50 μL del sobrenadante combinado para su titulación en la sección 3.
- Filtre el sobrenadante combinado (~ 21 mL, es decir, 20 mL de 1.4.6, 0.5 mL de 2.3.2 y 0.5 mL de 2.3.4) utilizando el siguiente método de filtración de 3 pasos.
- Extraiga 21 ml del sobrenadante utilizando una jeringa de 10 ml (5-7 ml cada vez para facilitar el paso a través del filtro) y pásalo a través de un filtro de membrana estéril de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 5 μm colocado en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 ml (etiquetado como TUBO 1).
- Añadir 1 mL de VB a un tubo de centrífuga cónica de 50 mL vaciado en 2.4.1 (para recoger la traza restante de sobrenadante de virus), vórtice, y pasar a través del mismo filtro PVDF de 5 μm colocado en el TUBO 1 (llevando el total a 22 mL de filtrado). Continúe con el paso 2.4.2.
- Extraiga 22 mL del filtrado del TUBO 1 (como en 2.4.1) y pásalo a través de un filtro de membrana estéril de éster de celulosa mixta (MCE) de 0,8 μm colocado en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 mL (etiquetado como TUBO 2).
- Añadir 1 mL de VB al TUBO 1 vaciado en el paso 2.4.2, vórtice, y pasarlo a través del mismo filtro MCE de 0,8 μm colocado en el TUBO 2 (llevando el total a 23 mL de filtrado). Continúe con el paso 2.4.3.
- Extraiga 23 mL de filtrado del TUBO 2 (como en 2.4.1) y pásalo a través de un filtro de PVDF estéril de 0,45 μm colocado en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 mL (etiquetado como TUBO 3).
- Añadir 1 mL de VB al TUBO 2 vaciado en el paso 2.4.3, vórtice, y pasarlo a través del mismo filtro PVDF de 0,45 μm colocado en el TUBO 3 (llevando el total a 24 mL de filtrado).
NOTA: Tome una alícuota de 50 μL del filtrado para su titulación en la sección 3.
- Añadir 1 mL de VB al TUBO 2 vaciado en el paso 2.4.3, vórtice, y pasarlo a través del mismo filtro PVDF de 0,45 μm colocado en el TUBO 3 (llevando el total a 24 mL de filtrado).
- Extraiga 21 ml del sobrenadante utilizando una jeringa de 10 ml (5-7 ml cada vez para facilitar el paso a través del filtro) y pásalo a través de un filtro de membrana estéril de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 5 μm colocado en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 ml (etiquetado como TUBO 1).
- Centrifugación de alta velocidad mediante el método de gradiente de sacarosa
NOTA: En este protocolo se utilizó un rotor F13-14x50cy de ángulo fijo. Tanto el rotor como la centrífuga deben estar a 4 °C antes de continuar con los siguientes pasos.- Añadir 10 mL de una solución de sacarosa al 25% helada y filtrada estérilmente (preparada disolviendo 25 g de polvo de sacarosa en 100 mL de solución salina balanceada de Hank) en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 mL.
- Lentamente (3 mL/min) añadir 24 mL del filtrado del virus (obtenido del paso 2.4.3.1) sobre la capa de sacarosa. Tenga cuidado de mantener capas separadas del filtrado del virus y la solución de sacarosa.
NOTA: Se pueden añadir hasta 30 mL de la capa de virus a más de 10 mL de la solución de sacarosa. - Centrifugar el tubo durante 90 min a 22.620 g a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y la capa de sacarosa del tubo de centrífuga cónica de 50 mL.
NOTA: El pellet del virus debe ser blanquecino. Tomar una alícuota de 50 μL del sobrenadante y una alícuota de 50 μL de la capa de sacarosa para su titulación en la sección 3.
- Vuelva a suspender el pellet en solución de glicerol/PBS al 10%.
- Añadir 1 mL de glicerol estéril al 10% (diluido en PBS) al tubo de centrífuga cónica de 50 mL para cubrir el pellet.
NOTA: La cantidad de la mezcla re-suspendida puede variar (como 0.8-1.2 mL) dependiendo del tamaño del pellet. Un volumen más pequeño daría una mayor concentración de virus. - Coloque el tubo de centrífuga cónica de 50 mL sobre hielo durante 2-4 h. Durante este período, sonicar / vórtice el pellet cada 15 min durante 30 s para ayudar a desalojar / volver a suspender el pellet.
- Recoja el pellet re-suspendido (1 mL de glicerol al 10% / PBS + el tamaño del pellet llevará el volumen total a ~ 1.3 mL) en un tubo de microcentrífuga de 2 mL. [Opcional: Agregue otros 0.3 mL de glicerol/PBS al mismo tubo de centrífuga cónica de 50 mL para recoger la cantidad de traza restante del pellet, pipeteo hacia arriba y hacia abajo, y combine con el pellet re-suspendido en el paso 2.6.3 para llevar el volumen total a ~ 1.6 mL.]
- Si la suspensión del paso 2.6.3 está turbia o turbia (debido a los restos de la célula), centrifugar el tubo a 500 g durante 10 min, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 mL y proceder al paso 2.6.4.
- Tome una alícuota de 50 μL para la titulación de oHSV en la sección 3. Alícuota el resto de la solución (250 μL/alícuota) en tubos estériles de microcentrífuga con tapas de rosca (bien selladas para almacenamiento a largo plazo), congelación a presión y conservación a -80 °C hasta su uso (listo para estudios experimentales una vez que se determine el título de oHSV).
NOTA: Todos los materiales que entran en contacto con el virus deben blanquearse o tratarse con radiación ultravioleta antes de retirarse de la campana o desederarse.
- Añadir 1 mL de glicerol estéril al 10% (diluido en PBS) al tubo de centrífuga cónica de 50 mL para cubrir el pellet.
3. Titulación del oHSV y ensayo de placa
- Semilla 1.7-1.8 x 105 células Vero/pozo en una placa de cultivo celular de 6 pozos en medio celular Vero (DMEM con IFCS al 10%; ver paso 1.1).
NOTA: Asegúrese de que las células están distribuidas homogéneamente en todo el pozo; no gire la placa, lo que puede causar la acumulación de células en el medio de los pozos. Para evitar el remolino, mezcle lentamente la placa con la mano verticalmente, luego horizontalmente, y luego coloque suavemente la placa en la incubadora. - Al día siguiente (cuando las células alcanzan una confluencia del 70-80%), aspirar el medio de cultivo y añadir 1 mL/pozo de PBS de alto contenido de glucosa suplementados con IFCS al 1%. Deje la placa en la campana del cultivo celular hasta que se complete el paso 3.3.
- Diluir en serie el virus en tubos de polipropileno de 5 mL utilizando PBS/IFCS al 1% (Figura 3).
NOTA: Utilice la alícuota de 50 μL recogida en el paso 2.6.4 para la dilución en serie. En el tubo de 1pt (dilución de10 -3), añadir 2 μL del virus en 1998 μL de PBS/1%IFCS, vórtice. En el2º tubo (10-5 de dilución), tomar 10 μL del tubo de1º en 990 μL de PBS/1% IFCS, vórtice. En el3º tubo (10-6 de dilución), tomar 100 μL del2º tubo en 900 μL de PBS/1% IFCS, vórtice; continúe esta dilución en serie de 10 veces hasta la dilución de 10-9. Consulte los detalles en la Figura 3. - Aspirar PBS/1% IFCS, y añadir 0,7 mL/pozo del virus diluido en serie (a partir de 10-5 a 10-9)a las células Vero.
NOTA: No deje que las células se sequen. - Mezcle suavemente la placa en un balancín durante 5 min a temperatura ambiente (para asegurar una distribución homogénea del inóculo del virus).
- Incubar la placa durante 1,5 h a 37 °C.
NOTA: Durante este período de incubación, prepare la dilución 1:1000 de la inmunoglobulina humana G (IgG) en DMEM complementada con ifcs del 1%. Para una placa de 6 pozos, prepare 12.5 mL para que se puedan usar 2 mL/pozo en el paso 3.7. Ajuste la dilución para tener en cuenta las variaciones de lote en la IgG humana. - Retire el inóculo del virus de los pocillos, y agregue 2 mL/pocillo de IgG humano al 0,1% (para neutralizar el oHSV en el medio de cultivo y prevenir la formación de placas secundarias) en DMEM complementado con IFCS al 1%. Incubar la placa a 37 °C durante 3-4 días.
NOTA: Las placas claras generalmente se forman en 3 días. - Placas de fijación y tinción
- Retire el sobrenadante y fije las células en metanol puro (1 mL/pocillo) durante 5 min. Retire el metanol y deje que las placas se sequen al aire.
- Diluya la tinción de Giemsa (1:5) con agua desionizada, y agregue 1 mL de la tinción de Giemsa diluida por pozo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10-15 min.
- Retire la mancha, enjuague con agua del grifo y deje que las placas se sequen al aire.
- Cuente las placas usando un microscopio de disección.
- Opcional para oHSVs con expresión lacZ:
- Retire el sobrenadante y fije las células con glutaraldehído frío al 0.2% / paraformalídehído al 2% durante 5-10 min a temperatura ambiente.
- Retire la solución fijadora y lave las células 3x con PBS.
- Añadir la solución X-gal a las células (1 mL/pozo) e incubar la placa a 37 °C durante 2 h.
NOTA: La tinción X-gal debe prepararse recién el día de la tinción; el almacenamiento a largo plazo podría conducir al desvanecimiento del color. Ver la preparación de la solución X-gal en la Tabla 1. - Retire la mancha X-gal y lave la placa con agua del grifo durante 1 min.
- Contra-mancha con solución de Rojo Neutro (1 mL/pocillo) durante 2 min a temperatura ambiente.
NOTA: Ver preparación de la solución de Rojo Neutro en la Tabla 1. - Lavar el plato con agua del grifo durante 1 min; deje que las placas se sequen al aire.
- Contar las placas azules utilizando un microscopio de disección (Figura 4).
- Calcular el título mediante fórmula (2)
Título en pfu/mL (unidades formadoras de placa) = Número de placas/0,7 mL × factor de dilución (2)
NOTA: Por ejemplo, si se encuentran 25 placas en el pozo de dilución10-9, el título es 25/0.7 × 109 = 35.7 × 109 = 3.57 × 1010 pfu/mL. Este es el título final de oHSV de alícuotas preparado en el paso 2.6.4.
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Representative Results
Una breve descripción de todo el protocolo se representa en la Figura 1,que representa los pasos críticos involucrados en el crecimiento, purificación y titulación del oHSV. CPE en las células de Vero se puede detectar tan pronto como 4 h post-infección por el VHS19. La Figura 2 muestra el CPE en células Vero en tres puntos de tiempo diferentes después de la infección por oHSV. El nivel del CPE se aumenta en un plazo. En este protocolo, el 90-100% CPE se observa generalmente dentro de 48 h de la inoculación del oHSV del bajo-MOI (que es el mejor tiempo de cosechar las células para la purificación). Sin embargo, puede tomar hasta 4 días dependiendo del MOI de oHSV inoculado en el paso 1.2 y/o del potencial de replicación del oHSV. Más allá de este período, las células con CPE pueden ser lisiadas, lo que lleva a la liberación del virus en el sobrenadante. Por lo tanto, para obtener un título viral alto, es fundamental cosechar las células afectadas por CPE cuando están intactas. Otro factor importante que contribuye al título final del virus es el número o tamaño de los frascos de cultivo de tejidos utilizados para la amplificación del oHSV. La Figura 3 representa el proceso de dilución en serie (10-3 a 10-9)de una cepa de virus dada (obtenida en el paso 2.6.4) requerida para la determinación del título por el ensayo de placa. Para los oHSV con expresión de lacZ, las placas virales pueden visualizarse mediante tinción X-gal(Figura 4). En este protocolo, se utilizaron 20 matraces de cultivo de tejidos T-150 cm2, para los que se pueden esperar 1,3-1,6 mL de cepa de oHSV con un título de 1 ×10 10 pfu/mL.
Figura 1:Una presentación esquemática de los principales pasos involucrados en el crecimiento del oHSV, la purificación y el ensayo de placa. Abreviaturas: oHSV = virus oncolítico del herpes simple; CPE = efecto citopático; VB = Búfer de virus; HBSS = Solución salina balanceada de Hank; PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Efecto citopático en las células Vero después de la infección por oHSV. Las células de Vero fueron inoculadas con la codificación del oHSV para el mCherry (mostrado en fluorescencia roja) en un MOI de 0,01 y la imagen (aumento 10x) en la infección del poste-virus de 36, 48, y 72 h. El CPE es identificado por el redondeo de las células oHSV-infectadas (indicadas por las flechas negras). Barras de escala = 200 μm. Abreviatura: oHSV = virus oncolítico del herpes simple. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Una dilución en serie de una culata de oHSV para ensayos de placa. Consulte también el paso 3.3 del protocolo. Abreviatura: oHSV = virus oncolítico del herpes simple. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4: Una imagen representativa de placas teñidas de X-gal a las 72 h después de la infección por oHSV. Sobrenadantes de cultivo celular infectados con oHSV sin diluir (pocillo superior) sin diluir (pocillo superior) sin diluir (70-80% confluentes), seguidos del protocolo de tinción X-gal descrito en la sección 3.8.5 (excluyendo la contramansación con rojo neutro). Las imágenes representativas de una placa de virus teñida de X-gal (del panel izquierdo) se presentan en los paneles central (4x; barras de escala = 1000 μm) y derecho (10x; barras de escala = 200 μm). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| Composición de la solución | |
| Preparación del búfer de virus | cantidad |
| 1 M Cloruro de sodio | 15 mL |
| 1 M Tris-clorhidrato | 3 mL |
| Agua purificada | 132 mL |
| ajustar el pH a 6,8 | |
| Preparación de la solución X-gal (~ 6.5 mL para una placa de 6 pozos) | |
| Ferricianuro de potasio de 250 mM | 130 μL |
| Ferrocianuro de potasio de 250 mM | 130 μL |
| 1 M Cloruro de magnesio | 13 μL |
| X-gal pre-disuelto (20 mg/mL) en dimetil sulfóxido (DMSO) | μL de 162,5 |
| Pbs | 6064,5 μL |
| Preparación de la solución neutral de rojo para una placa de 6 pocillos | |
| Solución de red neutra | 100 μL |
| metanol | 1 mL |
| Agua purificada | 7 mL |
Tabla 1: Composición de la solución.
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Discussion
El protocolo comienza con el crecimiento de oHSV en células Vero de paso bajo. La confluencia de la monocapa celular Vero debe ser de ~80% en el momento de la inoculación del virus, ya que las células cubiertas de vegetación pueden desarrollar estructuras fibrosas apretadas que pueden reducir la entrada de oHSV en las células Vero20. Una vez que se observa un 90-100% de CPE, se elimina el sobrenadante del cultivo, se cosechan las células, se resuspensan en VB/sobrenadante (véase el paso 1.4.6), se congelan a presión y se almacenan a -80 °C para su posterior purificación. Blaho y sus colegas emplearon un método ligeramente diferente de recolección y almacenamiento de células Vero infectadas. Por ejemplo, los matraces que contienen las células y los medios de cultivo (complementados con albúmina sérica bovina al 1% y PBS con potasio) se almacenan inicialmente a -80 °C durante al menos 15 min, seguidos de un calentamiento lento de los matraces a temperatura ambiente. Las células se cosechan, se mezclan con leche estéril y se almacenan a -80 °C hasta la purificación20. En este caso, la leche estéril actúa como estabilizador, y se demostró que el título de una cepa de virus es dramáticamente mayor cuando se almacena en leche/medio estéril que en medio solo20. Sin embargo, en otro estudio, una comparación directa entre diferentes estabilizadores (incluyendo leche estéril) utilizados para el almacenamiento de varios herpesvirus a -80 °C no mostró ningún impacto significativo en los títulos finales del virus21. Aquí, el pellet celular se volvió a suspender en VB constituido con solución salina Tris-tampón (pH 6,8) y glicerol al 10% como estabilizador de almacenamiento, lo que suele dar un título de virus alto (como se describe en el paso 3.10) para estudios experimentales.
Es fundamental eliminar todos los componentes celulares y relacionados con los medios de comunicación de la pastilla re-suspendida para obtener una acción de virus de alta calidad. La eliminación de partículas no virales es crucial para evitar posibles reacciones inmunitarias durante los experimentos in vivo. Se han descrito varios métodos de purificación de virus, incluyendo la centrifugación22,diferentes métodos de gradiente23,filtración24y cromatografía de afinidad25. Aunque este protocolo se basa en la centrifugación de alta velocidad utilizando un método de gradiente de sacarosa, una variedad de otros métodos de gradiente han sido utilizados por otros, como el iodixanol11,26,Percoll27y Ficoll-Nycodenz23. Estos métodos de gradiente separan el virus por densidad y requieren el aislamiento de la banda del gradiente, en lugar del cojín de sacarosa donde el virus se peletó. El método del sacarosa-gradiente ofrece un acercamiento suave a separar partículas virales porque reduce al mínimo el riesgo de interrumpir proteínas virales de la envoltura mientras que conserva infectividad viral. A pesar de estas ventajas, la alta osmolaridad de la solución concentrada de sacarosa podría deshidratar las partículas virales; por lo tanto, el método del gradiente del iodixanol fue desarrollado para superar esta desventaja. Sin embargo, el método de gradiente de iodixanol requiere ultracentrífuga y la recolección de la banda de virión. Otros factores que deben tenerse en cuenta durante la purificación del oHSV son la velocidad y el tiempo de centrifugación y la elección del búfer de virus utilizado para el almacenamiento a largo plazo. Este protocolo tiene la limitación de que la pureza del oHSV no está confirmada; sin embargo, se encontró un gran número de partículas de virus funcionales en una determinada población purificada de oHSV por titulación en células Vero (ver sección 3).
El oHSV forma placas en las células Vero(Figura 4). Las placas virales se pueden identificar por la coloración de Giemsa, que es un método fácil y conveniente. Giemsa tiñe las células de Vero, dejando las placas virales transparentes o vacías que pueden ser fácilmente visualizadas (a simple vista) y contadas utilizando un microscopio de disección. Mientras que la superposición de los medios con agarosa o metilcelulosa se utiliza comúnmente durante la formación de la placa (en el paso 3.7) para prevenir la propagación del virus y las infecciones secundarias y colas de placa28, el uso de IgG humana para neutralizar el oHSV en el sobrenadante de cultivo es más fácil y más conveniente. Para los oHSV que expresan lacZ, lasplacas se pueden visualizar por tinción de X-gal(Figura 4),mientras que la microscopía fluorescente se utiliza para la proteína fluorescente (es decir, proteína fluorescente verde)-que expresa oHSVs18. Los ensayos adicionales para detectar células infectadas por oHSV incluyen inmunohistoquímica o fluorescencia con anticuerpos específicos de oHSV29 o escaneo basado en láser de anticuerpos específicos de oHSV conjugados con fluoróforos del infrarrojo cercano30.
Hay medidas críticas que se deben seguir para lograr una buena acción de virus, como mantener la esterilidad para prevenir la contaminación microbiana (bacterias, levadura o moho) y las células Vero sanas. Como la envoltura de oHSV es extremadamente termosensible20,la culata de oHSV debe manipularse en un crioprotector como el glicerol al 10%. En general, este protocolo se puede emplear y practicar fácilmente en un entorno de laboratorio, pero puede no ser útil para la producción de virus a gran escala.
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Disclosures
SDR es coinventor de patentes relacionadas con los virus oncolíticos del herpes simple, propiedad y gestionado por la Universidad de Georgetown y el Hospital General de Massachusetts, que han recibido regalías de Amgen y ActiVec Inc. y forma parte del Consejo Asesor Científico de EG 427. Los otros autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación en el laboratorio Saha fue apoyada en parte por fondos del DOD (W81XWH-20-1-0702) y la Fundación Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin y Melissa R.M. Humphrey fueron parcialmente apoyados por los NIH (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
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