Summary
I dette manuskriptet beskriver vi en enkel metode for vekst, rensing og titrering av det onkolytiske herpes simplex-viruset for preklinisk bruk.
Abstract
Onkolytiske virus (OVs), som onkolytisk herpes simplex virus (oHSV), er en raskt voksende behandlingsstrategi innen kreftimmunoterapi. OVer, inkludert oHSV, replikerer selektivt i og dreper kreftceller (sparer sunne / normale celler) mens de induserer anti-tumorimmunitet. På grunn av disse unike egenskapene blir oHSV-baserte behandlingsstrategier i økende grad brukt til behandling av kreft, preklinisk og klinisk, inkludert FDA-godkjent talimogene laherparevec (T-Vec). Vekst, rensing og titrering er tre viktige laboratorieteknikker for alle OVer, inkludert oHSVer, før de kan brukes til eksperimentelle studier. Dette dokumentet beskriver en enkel trinnvis metode for å forsterke oHSV i Vero-celler. Etter hvert som oHSVer multipliserer, produserer de en cytopatisk effekt (CPE) i Vero-celler. Når 90-100% av de infiserte cellene viser en CPE, blir de forsiktig høstet, behandlet med benzonase og magnesiumklorid (MgCl2), filtrert og utsatt for rensing ved hjelp av sukrosegradientsmetoden. Etter rensing bestemmes antall smittsomme oHSV (betegnet som plakkdannende enheter eller PFUer) av en "plakkanalyse" i Vero-celler. Protokollen som er beskrevet her, kan brukes til å forberede høytitrener oHSV-lager for in vitro-studier i cellekultur og in vivo dyreforsøk.
Introduction
Onkolytiske virus (OVer) er en fremvoksende og unik form for kreftimmunoterapi. OVer replikerer selektivt i og lyse tumorceller (sparer normale / sunne celler)1 mens de induserer anti-tumorimmunitet2. Onkolytisk herpes simplex virus (oHSV) er en av de mest omfattende studerte virus blant alle OVer. Det er lengst med i klinikken, med Talimogene laherparepvec (T-VEC) som den første og eneste OV som mottar FDA-godkjenning i USA for behandling av avansert melanom3. I tillegg til T-VEC blir mange andre genmodifiserte oHSVer testet preklinisk og klinisk i forskjellige krefttyper3,4,5,6,7,8. Den nåværende avanserte rekombinante DNA bioteknologi har ytterligere økt muligheten for å konstruere nye oHSVs koding for terapeutiske transgene (er)3,5. Et effektivt system for oHSV-forplantning, rensing og titerbestemmelse er avgjørende før noen (nyutviklet) oHSV kan testes for in vitro- og in vivo-studier. Dette dokumentet beskriver en enkel trinnvis metode for oHSV-vekst (i Vero-celler), rensing (ved sukrosegradientmetoden) og titrering (ved en oHSV-plakkanalyse i Vero-celler) (Figur 1). Det kan enkelt tas i bruk i alle Biosafety Level 2 (BSL2) laboratorieinnstillinger for å oppnå en høy kvalitet viral lager for prekliniske studier.
Vero, en afrikansk grønn ape nyrecellelinje, er den mest brukte cellelinjen for oHSV-forplantning9,10,11,12,13 da Vero-celler har en defekt antiviral interferonsignaleringsvei14. Andre cellelinjer med inaktivert stimulator av interferongener (STING) signalering kan også brukes til oHSV vekst12,13. Denne protokollen benytter Vero-celler for oHSV-vekst og plakkanalyse. Etter forplantning høstes, lyser og utsettes oHSV-infiserte celler for rensing, hvor lysede celler først behandles med benzonasekjernen for å forringe vertscelle-DNA, forhindre nukleinsyreproteinaggregering og redusere viskositeten til cellelysatet. Som riktig aktivering av benzonase krever ofte Mg2 +, 1-2 mM MgCl2 brukes i denne protokollen15. Vertscellerester fra benzonasebehandlet cellelysat elimineres ytterligere ved seriell filtrering før høyhastighets sukrosegradient sentrifugering. En viskøs 25% sukrose løsning pute bidrar til å sikre en langsommere grad av virusmigrering gjennom sukroselaget, slik at vertscellerelaterte komponenter blir igjen i supernatanten, og dermed forbedrer rensing og begrenser virustap ipellets 16. Den rensede oHSV titreres deretter på Vero-celler, og virale plakk visualiseres av Giemsa-flekker17 eller X-gal farging (for LacZ-koding av oHSVer)18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) oHSV vekst
MERK: Sørg for godkjenning av institusjonell biosikkerhetskomité før du arbeider med oHSV. Denne studien ble utført under godkjent IBC-protokoll nr. Vedlikehold BSL2 forholdsregler: bleke alle pipetter, spisser, rør og andre materialer som kommer i kontakt med viruset. Spray hansker med 70% isopropylalkohol før hendene forlater BSL2 cellekulturhetten. Vask alltid hendene grundig med såpevann etter å ha jobbet med et virus.
- På dag -1, frø lavpassasje Vero celler i 20 T-150 cm2 kolber med en tetthet på 7-8 × 106 celler / kolbe i vanlig Vero celle medium.
MERK: Vero medium fremstilles ved å supplere Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) med 10 % varmeinaktivert fosterkalvserum (IFCS). - På dag 0 (cellene er 80-90% konfluensa), legg til oHSV-inoculum på Vero-cellene.
- Fremstilling av virusinoculum
- Bruk et multiplisitet av infeksjon (MOI) på 0,01 (MOI kan variere fra 0,01 til 0,1 avhengig av replikeringskapasiteten til viruset) for virusforsterkning. Bruk formelen (1) til å beregne mengden virus (ml) for 20 kolber.
Mengde virus (ml) for 20 kolber = nødvendig mengde virus (pfu)/titer av viruslager (pfu/ml)(1) - Bruk høyglukose Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) supplert med 1% IFCS for å forberede virusets inokulum (7 ml per T-150 cm2 kolbe, dvs. ~ 140 ml for 20 kolber). Tilsett den nødvendige mengden oHSV til 140 ml høyglukose DPBS / 1% IFCS-løsning, virvel i 1 min, og hold blandingen klar for tilsetning til Vero-celler.
- Bruk et multiplisitet av infeksjon (MOI) på 0,01 (MOI kan variere fra 0,01 til 0,1 avhengig av replikeringskapasiteten til viruset) for virusforsterkning. Bruk formelen (1) til å beregne mengden virus (ml) for 20 kolber.
- Vask T-150 cm2 kolber 2x med høyglukose DPBS supplert med 1% IFCS (10 ml / vask). Aspirer DPBS/1% IFCS og tilsett 7 ml virusinokulum/T-150 cm2 kolbe.
- Gyng forsiktig kolber i 5 minutter ved hjelp av en kolbe rocker for riktig fordeling av inokulum over Vero monolayer, og inkuber deretter kolber ved 37 °C i 1,5-2 timer. Pass på at inkubatorhyllen er i vater.
- Fjern inokulumet og tilsett DMEM supplert med 1% IFCS (25 ml / kolbe). Inkuber kolber i 2-4 dager.
- Fremstilling av virusinoculum
- Kontroller kolbeene daglig for 90-100% CPE (se figur 2).
- Høst de oHSV-infiserte Vero-cellene.
- Samle kulturen supernatant (~ 20 ml) fra hver kolbe (la ~ 5 ml i hver kolbe) i 50 ml koniske sentrifugerør eller mediebeholder.
- Bruk en celleskraper til å skrape cellene forsiktig fra bunnen av kolber.
MERK: Cellene skal raskt komme ut av kolbe. - Legg ~15 ml av kulturen supernatant (samlet i trinn 1.4.1) til hver kolbe (som bringer volumet på ~ 20 ml i hver kolbe, det vil si 400 ml for 20 kolber) og vask forsiktig bunnen av kolber noen ganger ved hjelp av en 10 ml steril serologisk rør.
MERK: Ikke rør kraftig. Ta sikte på å holde alle celler intakte. - Samle cellene (+ medium) i 50 ml koniske sentrifugerør på is (bruk 8 rør for å holde 400 ml høstede celler fra 20 kolber).
- Snurr cellene ved 300 g i 10 min ved 4 °C og aspirer supernatanten.
- Tilsett 1,25 ml (50 %) virusbuffer (VB) og 1,25 ml (50 %) kultur supernatant (samlet i trinn 1.4.1) til hvert sentrifugerør og re-suspendere hver pellet grundig. Overfør de re-suspenderte cellene fra åtte 50 ml sentrifugerør til ett 50 ml konisk sentrifugerør.
MERK: Se fremstillingen av VB-oppløsningen i tabell 1. Filtrer-steriliser VB-oppløsningen ved hjelp av et mediesteriliseringsfilter. Bruk 0,5 ml VB + 0,5 ml supernatant per T-150 cm2 kolbe for re-suspensjon, det vil si for 20 kolber (20 ml), bruk 10 ml VB og 10 ml kultur supernatant. - Frys de re-suspenderte cellene med tørris/100% etanol og oppbevar ved -80 °C.
2) oHSV rensing
- Snap-freeze (i tørris og 100% etanol)/tine (i et 37 °C varmtvannsbad) cellene etterfulgt av vannbad-sonikering i 1 min i totalt 3 sykluser for å sikre riktig lysis av cellene for å frigjøre virus i supernatanten.
MERK: Utfør sonikering i 1 min ved hjelp av 40 kHz, 120 V strøm. Hvis en justerbar soniker ikke er tilgjengelig, bruk en ultralyd vannbad soniker. Ta en 50 μL aliquot for titrering i avsnitt 3, som vil bidra til å identifisere hvilke av følgende trinn som er ansvarlige for potensielt virustap under renselsesprosedyren. - Behandle cellelyset med Benzonase Nuclease (175 enheter/ml) + 2 mM MgCl2 (1 M lager = 2 μL/ml), virvel og inkuber i 30 minutter ved 37 °C. Plasser røret på isen og utfør følgende trinn ved 4 °C.
- Pellet celleavfallet ved lavhastighets sentrifugering.
- Snurr cellelyset på 300 g i 10 min.
- Samle supernatanten i et nytt konisk sentrifugerør på 50 ml (re-suspender cellepelleten i 0,5 ml VB, angi den som pellet-1, og oppbevar den ved 4 °C for bruk i trinn 2.3.5; se figur 1).
- Spinn supernatanten (oppnådd i trinn 2.3.2) igjen på 500 g i 10 min.
- Samle supernatanten i et nytt konisk sentrifugerør på 50 ml (re-suspendere cellepelleten i 0,5 ml VB, angi den som pellet-2, og oppbevar den ved 4 °C for bruk i trinn 2.3.5; se figur 1).
- Kombiner den re-suspenderte pellets-1 (fra 2,3,2) og pellet-2 (fra 2,3,4) i et nytt 1,7 ml sentrifugerrør, virvel/sonikering (vannbad) 2x, og spinn på 400 g i 10 minutter. Samle supernatanten og kombiner den med supernatanten oppnådd i trinn 2.3.4; se figur 1).
MERK: Utfør sonikering i 1 min ved hjelp av 40 kHz, 120 V strøm for å forhindre viral aggregering før filtreringsprosedyren i trinn 2.4. Ta en 50 μL aliquot av den kombinerte supernatanten for titrering i avsnitt 3.
- Filtrer den kombinerte supernatanten (~21 ml, dvs. 20 ml fra 1,4,6, 0,5 ml fra 2,3,2 og 0,5 ml fra 2,3,4) ved hjelp av følgende 3-trinns filtreringsmetode.
- Trekk 21 ml av overnatanten ved hjelp av en 10 ml sprøyte (5-7 ml hver gang for enkel passasje gjennom filteret) og før den gjennom et sterilt 5 μm polyvinylendifluorid (PVDF) membranfilter plassert på et nytt 50 ml konisk sentrifugerør (merket som TUBE 1).
- Tilsett 1 ml VB i et konisk sentrifugerør på 50 ml tømt i 2,4,1 (for å samle den gjenværende spormengden av virus supernatant), virvel og passere gjennom samme 5 μm PVDF filter plassert på RØR 1 (bringe totalen til 22 ml filtrat). Fortsett til trinn 2.4.2.
- Trekk 22 ml av filtratet fra RØR 1 (som i 2.4.1) og før det gjennom et sterilt 0,8 μm blandet cellulosestere (MCE) membranfilter plassert på et nytt 50 ml konisk sentrifugerør (merket som TUBE 2).
- Tilsett 1 ml VB i RØR 1 tømt i trinn 2.4.2, virvel, og før det gjennom det samme 0,8 μm MCE-filteret plassert på RØR 2 (bringer totalen til 23 ml filtrat). Fortsett til trinn 2.4.3.
- Trekk 23 ml filtrat fra RØR 2 (som i 2.4.1) og før det gjennom et sterilt 0,45 μm PVDF-filter plassert på et nytt konisk sentrifugerør på 50 ml (merket som TUBE 3).
- Tilsett 1 ml VB i RØR 2 tømt i trinn 2.4.3, virvel, og før det gjennom det samme 0,45 μm PVDF-filteret plassert på RØR 3 (bringer totalen til 24 ml filtrat).
MERK: Ta en 50 μL aliquot av filtratet for titrering i avsnitt 3.
- Tilsett 1 ml VB i RØR 2 tømt i trinn 2.4.3, virvel, og før det gjennom det samme 0,45 μm PVDF-filteret plassert på RØR 3 (bringer totalen til 24 ml filtrat).
- Trekk 21 ml av overnatanten ved hjelp av en 10 ml sprøyte (5-7 ml hver gang for enkel passasje gjennom filteret) og før den gjennom et sterilt 5 μm polyvinylendifluorid (PVDF) membranfilter plassert på et nytt 50 ml konisk sentrifugerør (merket som TUBE 1).
- Høyhastighets sentrifugering ved hjelp av sukrosegradientmetoden
MERK: En fast vinkel F13-14x50cy rotor ble brukt i denne protokollen. Både rotoren og sentrifugen må være ved 4 °C før du fortsetter med følgende trinn.- Tilsett 10 ml av en iskald, sterilfiltrert 25% sukroseoppløsning (fremstilt ved å oppløse 25 g sukrosepulver i 100 ml Hanks balanserte saltløsning) i et nytt 50 ml konisk sentrifugerør.
- Sakte (3 ml/min) tilsett 24 ml av virusfiltratet (hentet fra trinn 2.4.3.1) på toppen av sukroselaget. Pass på å opprettholde separate lag av viruset filtrat og sukroseoppløsningen.
MERK: Opptil 30 ml av viruslaget kan tilsette over 10 ml av sukroseløsningen. - Sentrifuger røret i 90 min ved 22 620 g ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og sukroselaget fra det koniske sentrifugerøret på 50 ml.
MERK: Viruspelleten skal være hvitaktig. Ta en 50 μL aliquot av supernatanten og en 50 μL aliquot av sukroselaget for titrering i avsnitt 3.
- Re-suspendere pellet i 10% glyserol / PBS løsning.
- Tilsett 1 ml steril 10% glyserol (fortynnet i PBS) til det koniske sentrifugerøret på 50 ml for å dekke pellet.
MERK: Mengden av den re-suspenderte blandingen kan variere (for eksempel 0,8-1,2 ml) avhengig av pelletsstørrelsen. Et mindre volum ville gi en høyere konsentrasjon av virus. - Plasser det koniske sentrifugerøret på 50 ml på is i 2-4 timer. I løpet av denne perioden, sonikere / virvel pellet hver 15 min i 30 s for å hjelpe løsne / re-suspendere pellet.
- Samle re-suspendert pellet (1 ml 10% glyserol / PBS + pelletsstørrelsen vil bringe det totale volumet til ~ 1,3 ml) i et 2 ml mikrosenterrifugerør. [Valgfritt: Legg til ytterligere 0,3 ml 10 % glyserol/PBS i samme koniske sentrifugerør på 50 ml for å samle den gjenværende spormengden av pellet, pipet opp og ned, og kombiner med den re-suspenderte pelletsen i trinn 2.6.3 for å bringe det totale volumet til ~ 1,6 ml.]
- Hvis suspensjonen i trinn 2.6.3 er uklar eller overskyet (på grunn av celleavfall), sentrifugerer røret på 500 g i 10 minutter, overfør supernatanten til et nytt 2 ml mikrosenterrør, og fortsett til trinn 2.6.4.
- Ta en 50 μL aliquot for oHSV-titrering i avsnitt 3. Aliquot resten av løsningen (250 μL/ aliquot) i sterile mikrocentrifuge rør med skruehett (forseglet godt for langvarig lagring), snap-freeze, og lagre ved -80 °C til bruk (klar for eksperimentelle studier når oHSV-titeren er bestemt).
MERK: Alle materialer som kommer i kontakt med viruset må blekes eller behandles med ultrafiolett stråling før de fjernes fra hetten eller avhending.
- Tilsett 1 ml steril 10% glyserol (fortynnet i PBS) til det koniske sentrifugerøret på 50 ml for å dekke pellet.
3. oHSV-titrering og plakkanalyse
- Frø 1,7-1,8 x 105 Vero-celler/brønn i en 6-brønns cellekulturplate i Vero cellemedium (DMEM med 10% IFCS; se trinn 1.1).
MERK: Pass på at cellene er homogent fordelt gjennom brønnen; Ikke virvle platen, noe som kan føre til opphopning av celler midt i brønnene. For å unngå virvlende, gyng platen langsomt for hånd vertikalt, deretter horisontalt, og plasser deretter platen forsiktig i inkubatoren. - Neste dag (når cellene når 70-80% samløp), aspirerer kulturmediet og tilsetter 1 ml / brønn med høyglukose PBS supplert med 1% IFCS. La platen stå i cellekulturhetten til trinn 3.3 er fullført.
- Fortynn viruset serielt i 5 ml polypropylenrør ved hjelp av PBS/1 % IFCS (figur 3).
MERK: Bruk 50 μL aliquot samlet i trinn 2.6.4 for seriell fortynning. I 1m rør (10-3 fortynning), tilsett 2 μL av viruset i 1998 μL PBS/1%IFCS, virvel. I det andrerøret (10-5 fortynning) tar du 10 μL fra 1 m rør i 990 μL PBS/1% IFCS, virvel. I 3 rd-røret (10-6 fortynning), ta 100 μL fradet andre røret i 900 μL PBS / 1% IFCS, virvel; fortsett denne 10 ganger serielle fortynning til10-9 fortynning. Se detaljene i figur 3. - Aspirer PBS/1% IFCS, og tilsett 0,7 ml/brønn av det serie fortynnede viruset (fra10-5 til 10-9) til Vero-celler.
MERK: Ikke la cellene tørke. - Gyng platen forsiktig på en rocker i 5 min ved romtemperatur (for å sikre homogen fordeling av virusets inoculum).
- Inkuber platen i 1,5 timer ved 37 °C.
MERK: I løpet av denne inkubasjonsperioden, forberede 1:1000 fortynning av human immunoglobulin G (IgG) i DMEM supplert med 1% IFCS. For en 6-brønns plate, lag 12,5 ml slik at 2 ml/brønn kan brukes i trinn 3.7. Juster fortynning for å gjøre rede for partivariasjoner i den menneskelige IgG. - Fjern virusets inokulum fra brønnene, og tilsett 2 ml/brønn på 0,1 % menneskelig IgG (for å nøytralisere oHSV i kulturmediet og forhindre dannelse av sekundære plakk) i DMEM supplert med 1 % IFCS. Inkuber platen ved 37 °C i 3-4 dager.
MERK: Klare plakk dannes vanligvis om 3 dager. - Feste- og fargeplater
- Fjern supernatanten, og fest cellene i ren metanol (1 ml / brønn) i 5 min. Fjern metanolen, og la platene lufttørke.
- Fortynn Giemsa-flekken (1:5) med deionisert vann, og tilsett 1 ml av den fortynnede Giemsa-flekken per brønn. Inkuber platen ved romtemperatur i 10-15 min.
- Fjern flekken, skyll med vann fra springen, og la platene lufttørke.
- Tell plakkene ved hjelp av et dissekeringsmikroskop.
- Valgfritt for oHSVer med lacZ-uttrykk:
- Fjern supernatanten, og fest cellene med kaldt 0,2% glutaraldehyd / 2% paraformaldehyd i 5-10 min ved romtemperatur.
- Fjern den fikseringsløsningen, og vask cellene 3x med PBS.
- Tilsett X-gal-oppløsning i cellene (1 ml/brønn), og inkuber platen ved 37 °C i 2 timer.
MERK: X-gal-flekken skal tilberedes ferskt på fargingsdagen; Langsiktig lagring kan føre til falming av farge. Se fremstilling av X-gal-oppløsning i tabell 1. - Fjern X-gal-flekken, og vask platen med vann fra springen i 1 min.
- Motflekk med nøytral rød oppløsning (1 ml/brønn) i 2 min ved romtemperatur.
MERK: Se tilberedning av nøytral rød oppløsning i tabell 1. - Vask platen med vann fra springen i 1 min; la platene lufttørke.
- Telle blå plakk ved hjelp av et dissekeringsmikroskop (figur 4).
- Beregne titeret ved hjelp av formelen (2)
Titer i pfu/ml (plakkdannende enheter) = Antall plakk/0,7 ml × fortynningsfaktor (2)
MERK: For eksempel, hvis 25 plakk finnes i10-9 fortynningsbrønnen, er titeret 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/ml. Dette er den siste oHSV-titeren av aliquots utarbeidet i trinn 2.6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kort oversikt over hele protokollen er avbildet i figur 1, som representerer de kritiske trinnene som er involvert i vekst, rensing og titrering av oHSV. CPE i Vero celler kan påvises så tidlig som 4 h post-HSV infeksjon19. Figur 2 viser CPE i Vero-celler ved tre ulike tidspunkter etter oHSV-infeksjon. Nivået på CPE økes over tid. I denne protokollen observeres vanligvis 90-100% CPE innen 48 timer lav-MOI oHSV-inokulering (som er den beste tiden å høste celler for rensing). Det kan imidlertid ta opptil fire dager, avhengig av oHSV MOI inokulert i trinn 1.2 og/eller oHSVs replikeringspotensial. Utover denne perioden kan celler med CPE lyses, noe som fører til frigjøring av viruset i supernatanten. For å oppnå en høy viral titer er det derfor viktig å høste CPE-berørte celler når de er intakte. En annen viktig faktor som bidrar til den endelige virustitren er antall eller størrelse på vevskulturflasker som brukes til oHSV-forsterkning. Figur 3 viser prosessen med seriell fortynning (10-3 til 10-9) av en gitt virusbestand (oppnådd i trinn 2.6.4) som kreves for titerbestemmelse av plakkanalysen. For oHSVer med lacZ-uttrykk kan virale plakk visualiseres av X-gal-farging (figur 4). I denne protokollen ble det brukt 20 T-150 cm2 vevskulturflasker, hvorav 1,3-1,6 ml oHSV-lager med en titer på 1 ×10 10 pfu / ml kan forventes.
Figur 1: En skjematisk presentasjon av store trinn involvert i oHSV-vekst, rensing og plakkanalysen. Forkortelser: oHSV = onkolytisk herpes simplex virus; CPE = cytopatisk effekt; VB = Virusbuffer; HBSS = Hanks balanserte saltløsning; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Cytopatisk effekt i Vero-celler etter oHSV-infeksjon. Vero-celler ble inokulert med oHSV-koding for mCherry (vist i rød fluorescens) ved en MOI på 0,01 og avbildet (10x forstørrelse) ved 36, 48 og 72 timer etter virusinfeksjon. CPE identifiseres ved avrunding av de oHSV-infiserte cellene (indikert med svarte piler). Skalastenger = 200 μm. Forkortelse: oHSV = onkolytisk herpes simplex virus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: En seriell fortynning av en oHSV-bestand for plakkanalyser. Se også trinn 3.3 i protokollen. Forkortelse: oHSV = onkolytisk herpes simplex virus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Et representativt bilde av X-gal-farget plakk ved 72 timers post-oHSV-infeksjon. Ufortynnet (øvre brønn) og fortynnet (1:10; lavere brønn) oHSV-infiserte cellekulturovernatanter tilsatt Vero-celler (70-80% konfluent), etterfulgt av X-gal fargingsprotokoll beskrevet i pkt. 3.8.5 (unntatt motfarging med Neutral Red). Representative bilder av en X-gal-farget virusplakk (fra venstre panel) presenteres i de midterste (4x; skalastengene = 1000 μm) og høyre (10x; skalastenger = 200 μm) paneler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsningssammensetning | |
| Utarbeidelse av virusbuffer | kvantitet |
| 1 M natriumklorid | 15 ml |
| 1 M Tris-hydroklorid | 3 ml |
| Renset vann | 132 ml |
| justere pH til 6,8 | |
| Tilberedning av X-gal-oppløsning (~6,5 ml for én 6-brønnsplate) | |
| 250 mM kalium ferricyanid | 130 μL |
| 250 mM kalium ferrocyanid | 130 μL |
| 1 M Magnesiumklorid | 13 μL |
| X-gal pre-oppløst (20 mg/ml) i dimetylsulfoksid (DMSO) | 162,5 μL |
| Pbs | 6064,5 μL |
| Tilberedning av nøytral rød oppløsning for en 6-brønns plate | |
| Nøytral rød løsning | 100 μL |
| metanol | 1 ml |
| Renset vann | 7 ml |
Tabell 1: Løsningssammensetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen starter med veksten av oHSV i veroceller med lav passasje. Sammenløpet av Vero-cellemonolayeren bør være ~ 80% på tidspunktet for virusinokulering, da overgrodde celler kan utvikle tette fibrøse strukturer som kan redusere oHSV-oppføring i Vero-celler20. Når 90-100% CPE er observert, fjernes kulturen supernatant, celler høstes, resuspenderes i VB / supernatant (se trinn 1.4.6), snap-frossen og lagres ved -80 °C for senere rensing. Blaho og kollegene brukte en litt annen metode for høsting og lagring av infiserte Vero-celler. For eksempel lagres kolber som inneholder cellene og kulturmediene (supplert med 1% bovint serumalbumin og PBS med kalium) i utgangspunktet ved -80 °C i minst 15 minutter, etterfulgt av en langsom oppvarming av kolber ved romtemperatur. Cellene høstes deretter, blandes med steril melk og lagres ved -80 °C til rensing20. I dette tilfellet fungerer steril melk som en stabilisator, og det ble demonstrert at titeret til en virusbestand er dramatisk høyere når den lagres i steril melk / medium enn i medium alene20. Men i en annen studie viste en direkte sammenligning mellom forskjellige stabilisatorer (inkludert steril melk) som brukes til lagring av flere herpesvirus ved -80 °C ingen signifikant innvirkning på de endelige virustitrene21. Her ble cellepellet suspendert i VB utgjorde tris-buffer saltvann (pH 6.8) og 10% glyserol som lagringsstabilisator, som vanligvis gir en høy virustiter (som skissert i trinn 3.10) for eksperimentelle studier.
Det er viktig å fjerne alle cellulære og medierelaterte komponenter fra den suspenderte pelletsen for å få et viruslager av høy kvalitet. Fjerning av ikke-virale partikler er avgjørende for å unngå potensielle immunreaksjoner under in vivo-eksperimenter. Flere metoder for virusrensing er beskrevet, inkludert sentrifugering22, forskjellige gradientmetoder23, filtrering24og affinitetskromatografi25. Selv om denne protokollen er basert på høyhastighets sentrifugering ved hjelp av en sukrosegradientmetode, har en rekke andre gradientmetoder blitt brukt av andre, for eksempel iodixanol11,26, Percoll27og Ficoll-Nycodenz23. Disse gradientmetodene skiller viruset med tetthet og krever isolasjon av båndet fra gradienten, i stedet for sukroseputen der viruset er pelletert. Sukrosegradientmetoden gir en skånsom tilnærming til separate viruspartikler fordi den minimerer risikoen for å forstyrre virale konvoluttproteiner samtidig som viral infektivitet beholdes. Til tross for disse fordelene kan den høye osmolariteten til den konsentrerte sukroseløsningen dehydrere viruspartiklene; Derfor ble jodxanol gradient metoden utviklet for å overvinne denne ulempen. Imidlertid krever jodloksanol gradientmetoden ultracentrifuge og samling av virionbåndet. Andre faktorer som må vurderes under oHSV-rensing er hastighet og tid for sentrifugering og valg av virusbuffer som brukes til langsiktig lagring. Denne protokollen har begrensningen at renheten til oHSV ikke er bekreftet. Imidlertid ble et høyt antall funksjonelle viruspartikler funnet i en gitt renset oHSV-bestand ved titrering på Vero-celler (se avsnitt 3).
oHSV danner plakk på Vero-celler (figur 4). De virale plakkene kan identifiseres av Giemsa-farging, som er en enkel og praktisk metode. Giemsa flekker Vero-celler, slik at de virale plakkene er gjennomsiktige eller tomme som lett kan visualiseres (blotte øye) og telles ved hjelp av et dissekerende mikroskop. Mens overlegg av media med agarose eller metylcellulose ofte brukes under plakkdannelse (i trinn 3.7) for å forhindre spredning av viruset og sekundære infeksjoner og plakkhaler28, er bruken av menneskelig IgG for å nøytralisere oHSV i kulturen supernatant enklere og mer praktisk. For oHSVer som uttrykker lacZ,kan plakk visualiseres ved X-gal farging (figur 4), mens fluorescerende mikroskopi brukes til fluorescerende protein (dvs. grønt fluorescerende protein)-uttrykkende oHSVs18. Ytterligere analyser for å oppdage oHSV-infiserte celler inkluderer immuno-histokjemisk eller -fluorescens med oHSV-spesifikke antistoffer29 eller laserbasert skanning av nær-infrarød fluorofor-konjugert oHSV-spesifikke antistoffer30.
Det er kritiske tiltak som må følges for å oppnå en god virusbestand som å opprettholde sterilitet for å forhindre mikrobiell (bakterier, gjær eller mugg) forurensning og sunne Vero-celler. Siden konvolutten til oHSV er ekstremt termosensitiv20, bør oHSV-lageret håndteres i et kryopreotektant som 10% glyserol. Totalt sett kan denne protokollen enkelt brukes og praktiseres i et laboratorium, men er kanskje ikke nyttig for storskala virusproduksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SDR er en medoppfinner på patenter relatert til onkolytiske herpes simplex virus, eid og administrert av Georgetown University og Massachusetts General Hospital, som har mottatt royalties fra Amgen og ActiVec Inc. og er i Scientific Advisory Board i EG 427. De andre forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning i Saha-laboratoriet ble delvis støttet av midler fra DOD (W81XWH-20-1-0702) og Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin og Melissa R.M. Humphrey ble delvis støttet av NIH (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J.
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
