Summary
I dette manuskript beskriver vi en simpel metode til vækst, rensning og titrering af den oncolytiske herpes simplex virus til præklinisk brug.
Abstract
Oncolytic virus (OVs), såsom oncolytic herpes simplex virus (oHSV), er en hastigt voksende behandlingsstrategi inden for kræft immunterapi. OVs, herunder oHSV, selektivt kopiere i og dræbe kræftceller (skåne sunde / normale celler), mens fremkalde anti-tumor immunitet. På grund af disse unikke egenskaber, oHSV-baserede behandlingsstrategier bliver i stigende grad anvendes til behandling af kræft, præklinisk og klinisk, herunder FDA-godkendte talimogene laherparevec (T-Vec). Vækst, rensning og titrering er tre væsentlige laboratorieteknikker for alle CV'er, herunder oHSV'er, før de kan anvendes til eksperimentelle undersøgelser. Dette papir beskriver en enkel trinvis metode til at forstærke oHSV i Vero-celler. Efterhånden som oHSV'er formere sig, producerer de en cytopatisk effekt (CPE) i Vero-celler. Når 90-100% af de inficerede celler viser en CPE, høstes de forsigtigt, behandles med benzonase og magnesiumchlorid (MgCl2), filtreres og underkastes rensning ved hjælp af saccharosegradientmetoden. Efter rensning bestemmes antallet af infektiøse oHSV (udpeget som plaquedannende enheder eller PPU'er) af en "plaque assay" i Vero-celler. Den heri beskrevne protokol kan anvendes til at forberede højtitler oHSV-bestand til in vitro-undersøgelser i cellekultur og in vivo-dyreforsøg.
Introduction
Oncolytic virus (OVs) er en ny og unik form for kræft immunterapi. CV'er selektivt kopiere i og lyse tumorceller (skåne normale / sunde celler)1, mens fremkalde anti-tumor immunitet2. Oncolytic herpes simplex virus (oHSV) er en af de mest omfattende undersøgt virus blandt alle OVs. Det er længst henne i klinikken, med Talimogene laherparepvec (T-VEC) er den første og eneste OV til at modtage FDA godkendelse i USA til behandling af avanceret melanom3. Ud over T-VEC testes mange andre gensplejsede oHSV'er præklinisk og klinisk i forskellige kræfttyper3,4,5,6,7,8. Den nuværende avancerede rekombinant DNA-bioteknologi har yderligere øget muligheden for at udvikle nye OHSV-kodning til terapeutiske transgener3,5. Et effektivt system af oHSV-formering, rensning og titerbestemmelse er kritisk, før nogen (nyudviklet) oHSV kan testes for in vitro- og in vivo-undersøgelser. Dette papir beskriver en simpel trinvis metode til oHSV-vækst (i Vero-celler), rensning (ved saccharose-gradientmetoden) og titrering (ved en oHSV-plakanalyse i Vero-celler) (Figur 1). Det kan let vedtages i enhver Biosafety Level 2 (BSL2) laboratorieindstilling for at opnå en viral bestand af høj kvalitet til prækliniske undersøgelser.
Vero, en afrikansk grøn abe nyrecelle linje, er den mest almindeligt anvendte celle linje for oHSV formering9,10,11,12,13 som Vero celler har en defekt antiviral interferon signalering vej14. Andre cellelinjer med inaktiveret stimulator af interferongener (STING) signalering kan også bruges til oHSV vækst12,13. Denne protokol bruger Vero celler til oHSV vækst og plak assay. Efter formering høstes, lyses og renses oHSV-inficerede celler, hvori lyserede celler først behandles med benzonasekerner for at nedbryde værtscelle-DNA, forhindre nukleinsyreproteinsammenlægning og reducere viskositeten af cellelysatet. Da korrekt aktivering af benzonase ofte kræver Mg2+, anvendes 1-2 mM MgCl2 i denne protokol15. Værtscelleaffaldet fra benzonasebehandlet cellelyat elimineres yderligere ved seriefiltrering før højhastigheds-saccharose-gradient centrifugering. En tyktflydende 25% saccharoseopløsningspude hjælper med at sikre en langsommere virusmigration gennem saccharoselaget, hvilket efterlader værtscellerelaterede komponenter i supernatanten og forbedrer dermed rensningen og begrænser virustabet i pellet16. Den rensede oHSV er derefter titreret på Vero celler, og viral plaques visualiseres af Giemsa farvning17 eller X-gal farvning (for LacZ kodning oHSVs)18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) oHSV vækst
BEMÆRK: Sørg for institutionel godkendelse af biosikkerhedsudvalg, før du arbejder med oHSV. Denne undersøgelse blev gennemført i henhold til den godkendte IBC-protokol nr. Bevar BSL2 forholdsregler: blege alle pipetter, tips, rør og andre materialer, der kommer i kontakt med virus. Sprayhandsker med 70% isopropylalkohol, før hænderne forlader BSL2-cellekulturhætten. Vask altid hænder grundigt med sæbevand efter at have arbejdet med en virus.
- På dag -1, frø lav-passage Vero celler i 20 T-150 cm2 kolber med en densitet på 7-8 × 106 celler / kolbe i regelmæssig Vero celle medium.
BEMÆRK: Vero medium fremstilles ved at supplere Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) med 10% varmeinaktiveret føtal kalveserum (IFCS). - På dag 0 (celler er 80-90% sammenflydende), tilsæt oHSV inoculum på Vero celler.
- Forberedelse af virus inoculum
- Brug en mangfoldighed af infektion (MOI) på 0,01 (MOI kan variere fra 0,01 til 0,1 afhængigt af virusets replikeringskapacitet) til virusforstærkning. Brug formel (1) til at beregne mængden af virus (mL) for 20 kolber.
Mængde virus (mL) for 20 kolber = den nødvendige mængde virus (pfu)/titer af virusbestand (pfu/mL)(1) - Brug højglukose Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) suppleret med 1% IFCS til at forberede virusinoculumet (7 mL pr. T-150 cm2 kolbe, dvs. ~ 140 mL til 20 kolber). Tilsæt den nødvendige mængde oHSV til 140 ml højglukose DPBS/1% IFCS-opløsning, vortex i 1 min, og hold blandingen klar til tilsætning til Vero-celler.
- Brug en mangfoldighed af infektion (MOI) på 0,01 (MOI kan variere fra 0,01 til 0,1 afhængigt af virusets replikeringskapacitet) til virusforstærkning. Brug formel (1) til at beregne mængden af virus (mL) for 20 kolber.
- T-150 cm2 kolber vaskes 2x med DPBS med højt glukoseniveau suppleret med 1% IFCS (10 mL/vask). DPBS/1% IFCS aspireres, og der tilsættes 7 mL virus inoculum/T-150 cm2 kolbe.
- Kolberne rokkes forsigtigt i 5 minutter ved hjælp af en kolberocker med henblik på korrekt fordeling af inoculumet over Vero monolayer, og kolbøses derefter ved 37 °C i 1,5-2 timer. Sørg for, at inkubatorhylden er i niveau.
- Inoculumet fjernes, og DMEM tilsættes suppleret med 1% IFCS (25 mL/kolbe). Kolbøsser i 2-4 dage.
- Forberedelse af virus inoculum
- Kolberne kontrolleres dagligt for 90-100% CPE (se figur 2).
- Høst de oHSV-inficerede Vero-celler.
- Dyrknings-supernatanten (~20 mL) opsamles fra hver kolbe (lad ~5 mL være i hver kolbe) i 50 mL koniske centrifugerør eller mediebeholder.
- Brug en celleskraber til forsigtigt at skrabe cellerne fra bunden af kolberne.
BEMÆRK: Cellerne skal hurtigt komme ud af kolberne. - Der tilsættes ~15 mL af dyrknings-supernatanten (opsamlet i trin 1.4.1) til hver kolbe (hvilket bringer volumenet på ~ 20 mL i hver kolbe, dvs. 400 mL for 20 kolber) og vask forsigtigt bunden af kolberne et par gange ved hjælp af en 10 mL steril serologisk pipet.
BEMÆRK: Rør ikke kraftigt. Tilstræbe at holde alle celler intakte. - Cellerne (+ medium) opsamles i 50 mL koniske centrifugerør på is (brug 8 rør til at holde 400 mL høstede celler fra 20 kolber).
- Cellerne drejes ved 300 g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten aspirerer.
- Tilføj 1,25 mL (50%) af virusbuffer (VB) og 1,25 mL (50%) af dyrknings-supernatant (opsamlet i trin 1.4.1) til hvert centrifugerør og suspendere hver pellet grundigt. De re-ophængte celler overføres fra otte 50 mL centrifugerør til et 50 mL konisk centrifugerør.
BEMÆRK: Se præparatet af VB-opløsning i tabel 1. VB-opløsningen filtreres og steriliseres ved hjælp af et mediesteriliseringsfilter. Der anvendes 0,5 mL VB + 0,5 mL supernatant pr. T-150 cm2 kolbe til genophæng, dvs. - Fastfrys de genindslæmmede celler med tøris/100% ethanol, og opbevar ved -80 °C.
2) oHSV rensning
- Snap-freeze (i tøris og 100% ethanol)/optøning (i et 37 °C varmt vandbad) cellerne efterfulgt af vandbadning i 1 min. i i alt 3 cyklusser for at sikre korrekt lysis af cellerne til at frigive virus i supernatanten.
BEMÆRK: Udfør sonikering i 1 min ved hjælp af 40 kHz, 120 V-effekt. Hvis en tunable sonicator ikke er tilgængelig, skal du bruge en ultralyd vandbad sonicator. Tag en 50 μL aliquot til titrering i afsnit 3, som vil hjælpe med at identificere, hvilket af de følgende trin der er ansvarlig for potentielt virustab under rensningsproceduren. - Cellelysatet behandles med benzonasekerne (175 enheder/mL) + 2 mM MgCl2 (1 M lager = 2 μL/mL), hvirvelstrøm og inkuberes i 30 min ved 37 °C. Røret anbringes på is, og følgende trin udføres ved 4 °C.
- Pellet cellerester ved lav hastighed centrifugering.
- Drej cellelyset ved 300 g i 10 min.
- Supernatanten opsamles i et nyt 50 mL konisk centrifugerør (ophæng cellepillen igen i 0,5 mL VB, betegne det som pellet-1 og opbevares ved 4 °C til brug i trin 2.3.5; se figur 1).
- Spin supernatanten (opnået i trin 2.3.2) igen ved 500 g i 10 min.
- Supernatanten opsamles i et nyt 50 mL konisk centrifugerør (ophæng cellepillen igen i 0,5 mL VB, betegne det som pellet-2 og opbevares ved 4 °C til brug i trin 2.3.5; se figur 1).
- Kombiner den re-suspenderede pellet-1 (fra 2.3.2) og pellet-2 (fra 2.3.4) til en ny 1,7 mL centrifuge rør, vortex / sonicate (vandbad) 2x, og spin på 400 g i 10 min. Opsaml supernatanten og kombiner den med den supernatant, der opnås i trin 2.3.4; se figur 1).
BEMÆRK: Udfør sonikering i 1 min ved hjælp af 40 kHz, 120 V-effekt for at forhindre viral sammenlægning før filtreringsproceduren i trin 2.4. Tag en 50 μL aliquot af den kombinerede supernatant til titrering i afsnit 3.
- Den kombinerede supernatant (~21 mL, dvs. 20 mL fra 1.4.6, 0,5 mL fra 2.3.2 og 0,5 mL fra 2.3.4) filtreres ved hjælp af følgende filtreringsmetode i 3 trin.
- 21 mL af supernatanten trækkes med en 10 mL sprøjte (5-7 mL hver gang for nem passage gennem filteret) og passerer den gennem et sterilt 5 μm polyvinyliden difluorid (PVDF) membranfilter placeret på et nyt 50 mL konisk centrifugerør (mærket som TUBE 1).
- Der tilsættes 1 mL VB til et 50 mL konisk centrifugerør, der tømmes i 2.4.1 (for at indsamle den resterende spormængde af virus-supernatant), vortex, og der føres gennem samme 5 μm PVDF-filter placeret på TUBE 1 (hvilket bringer det samlede antal til 22 mL filtrat). Fortsæt til trin 2.4.2.
- 22 mL af filtratet trækkes fra TUBE 1 (som i 2.4.1) og passerer det gennem et sterilt 0,8 μm blandet cellulosester (MCE) membranfilter placeret på et nyt 50 mL konisk centrifugerør (mærket som TUBE 2).
- Der tilsættes 1 mL VB til TUBE 1 tømt i trin 2.4.2, vortex, og send det gennem det samme 0,8 μm MCE-filter placeret på TUBE 2 (hvilket bringer det samlede antal til 23 mL filtrat). Fortsæt til trin 2.4.3.
- Der trækkes 23 mL filtrat fra TUBE 2 (som i 2.4.1) og passerer det gennem et sterilt 0,45 μm PVDF-filter placeret på et nyt 50 mL konisk centrifugerør (mærket som TUBE 3).
- Der tilsættes 1 mL VB til TUBE 2, der tømmes i trin 2.4.3, vortex, og den føres gennem det samme 0,45 μm PVDF-filter, der er placeret på TUBE 3 (hvilket bringer det samlede antal til 24 mL filtrat).
BEMÆRK: Tag en 50 μL aliquot af filtratet til titrering i punkt 3.
- Der tilsættes 1 mL VB til TUBE 2, der tømmes i trin 2.4.3, vortex, og den føres gennem det samme 0,45 μm PVDF-filter, der er placeret på TUBE 3 (hvilket bringer det samlede antal til 24 mL filtrat).
- 21 mL af supernatanten trækkes med en 10 mL sprøjte (5-7 mL hver gang for nem passage gennem filteret) og passerer den gennem et sterilt 5 μm polyvinyliden difluorid (PVDF) membranfilter placeret på et nyt 50 mL konisk centrifugerør (mærket som TUBE 1).
- Højhastigheds centrifugering ved hjælp af saccharosegradientmetoden
BEMÆRK: En fast vinkel F13-14x50cy rotor blev brugt i denne protokol. Både rotoren og centrifuge skal være ved 4 °C, før de fortsætter med følgende trin.- Der tilsættes 10 ml af en iskold, sterilfiltreret 25% saccharoseopløsning (fremstillet ved opløsning af 25 g saccharosepulver i 100 ml hanks afbalancerede saltopløsning) i et nyt 50 ml konisk centrifugerør.
- Langsomt (3 mL/min) tilsættes 24 mL virusfiltrat (fremstillet ved trin 2.4.3.1) oven på saccharoselaget. Vær omhyggelig med at opretholde separate lag af virusfiltrat og saccharoseopløsningen.
BEMÆRK: Op til 30 ml af viruslaget kan tilsættes over 10 ml saccharoseopløsning. - Røret centrifuges i 90 minutter ved 22.620 g ved 4 °C.
- Supernatanten og saccharoselaget fjernes fra det 50 mL koniske centrifugerør.
BEMÆRK: Viruspillen skal være hvidlig. Der udtages en 50 μL aliquot af supernatanten og en 50 μL aliquot af saccharoselaget til titrering i punkt 3.
- Ophæng pelletlen igen i 10% glycerol/PBS-opløsning.
- Der tilsættes 1 mL steril 10% glycerol (fortyndet i PBS) til det 50 mL koniske centrifugerør for at dække pelleten.
BEMÆRK: Mængden af den genophængte blanding kan variere (f.eks. 0,8-1,2 mL) afhængigt af pelletstørrelsen. En mindre mængde ville give en højere koncentration af virus. - Placer det 50 mL koniske centrifugerør på is i 2-4 timer. I løbet af denne periode, sonicate / vortex pellet hver 15 min i 30 s for at hjælpe løsne / re-suspendere pellet.
- Opsamling af den re-suspenderede pellet (1 mL på 10% glycerol/PBS + pellet størrelse vil bringe det samlede volumen til ~ 1,3 mL) i en 2 mL mikrocentrifuge rør. [Valgfrit: Tilsæt yderligere 0,3 mL på 10% glycerol/PBS til det samme 50 mL koniske centrifugerør for at indsamle den resterende spormængde af pellet, pipet op og ned, og kombiner med den re-suspenderede pellet i trin 2.6.3 for at bringe det samlede volumen til ~ 1,6 mL.]
- Hvis suspensionen i trin 2.6.3 er uklar eller overskyet (på grund af cellerester), centrifuge røret ved 500 g i 10 minutter, overføre supernatanten til et nyt 2 mL mikrocentrifugerør og fortsætte til trin 2.6.4.
- Tag en 50 μL aliquot for oHSV titrering i afsnit 3. Resten af opløsningen (250 μL/aliquot) til sterile mikrocentrifugerør med skruehætter (forseglet godt til langtidsopbevaring), fastfrysning og opbevares ved -80 °C, indtil den er taget i brug (klar til eksperimentel undersøgelse, når oHSV-titeren er bestemt).
BEMÆRK: Alle materialer, der kommer i kontakt med virusset, skal bleges eller behandles med ultraviolet stråling, før de fjernes fra emhætten eller bortskaffes.
- Der tilsættes 1 mL steril 10% glycerol (fortyndet i PBS) til det 50 mL koniske centrifugerør for at dække pelleten.
3. oHSV titrering og plakanalyse
- Frø 1,7-1,8 x 105 Vero celler / godt i en 6-brønd cellekultur plade i Vero celle medium (DMEM med 10% IFCS; se trin 1,1).
BEMÆRK: Sørg for, at cellerne er homogent fordelt over hele brønden; hvirvel ikke pladen, hvilket kan forårsage akkumulering af celler midt i brøndene. For at forhindre hvirvlende, langsomt rock pladen i hånden lodret, derefter vandret, og derefter forsigtigt placere pladen i inkubatoren. - Den næste dag (når cellerne når 70-80% sammenløb), aspirere kulturmediet, og tilsæt 1 mL/brønd af høj glukose PBS suppleret med 1% IFCS. Lad pladen stå i cellekulturhætten, indtil trin 3.3 er færdigt.
- Virusset fortyndes serielt i 5 mL polypropylenrør ved hjælp af PBS/1% IFCS (Figur 3).
BEMÆRK: Brug den 50 μL aliquot, der er indsamlet i trin 2.6.4, til seriel fortynding. I1. rør (10-3 fortynding) tilsættes 2 μL af virusset i 1998 μL PBS/1%IFCS, vortex. I 2nd tube (10-5 fortynding), tage 10 μL fra 1st rør i 990 μL PBS/1% IFCS, vortex. I3-rorrøret (10-6 fortynding) tages 100 μL fra 2ndrøret i 900 μL PBS/1% IFCS, vortex; fortsætte denne 10-fold serielle fortynding indtil 10-9 fortynding. Se oplysningerne i figur 3. - Aspirat PBS/1% IFCS, og tilsæt 0,7 mL/brønd af den serielt fortyndede virus (fra 10-5 til 10-9) til Vero-celler.
BEMÆRK: Lad ikke cellerne tørre. - Sten forsigtigt pladen på en vippe i 5 minutter ved stuetemperatur (for at sikre homogen fordeling af virus inoculum).
- Pladen inkuberes i 1,5 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: I denne inkubationsperiode skal der fremstilles 1:1000 fortynding af human immunglobulin G (IgG) i DMEM suppleret med 1% IFCS. For en 6-brønds plade skal du forberede 12,5 mL, så 2 mL/brønd kan bruges i trin 3.7. Juster fortyndingen for at tage højde for lotvariationer i det menneskelige IgG. - Fjern virus inoculum fra brøndene, og tilsæt 2 mL/ brønd på 0,1% human IgG (for at neutralisere oHSV i kulturmediet og forhindre dannelsen af sekundære plaques) i DMEM suppleret med 1% IFCS. Pladen inkuberes ved 37 °C i 3-4 dage.
BEMÆRK: Klare plaques dannes normalt om 3 dage. - Fastgørelses- og farvningsplader
- Supernatanten fjernes, og cellerne fastgøres i ren methanol (1 mL/brønd) i 5 min. Fjern methanolen, og lad pladerne lufttørre.
- Fortynd Giemsa plet (1:5) med deioniseret vand, og tilsæt 1 mL af den fortyndede Giemsa plet per brønd. Inkubat pladen ved stuetemperatur i 10-15 min.
- Fjern pletten, skyl med vand fra hanen, og lad pladerne lufttørre.
- Tæl plaketterne ved hjælp af et dissekerende mikroskop.
- Valgfrit for oHSV'er med lacZ-udtryk:
- Fjern supernatanten, og fastgør cellerne med koldt 0,2% glutaraldehyd/2% paraformaldehyd i 5-10 minutter ved stuetemperatur.
- Den fiksative opløsning fjernes, og cellerne vaskes 3x med PBS.
- X-gal-opløsning til cellerne (1 mL/brønd) tilsættes, og pladen inkuberes ved 37 °C i 2 timer.
BEMÆRK: X-gal pletten skal tilberedes frisk på farvningsdagen; langtidsopbevaring kan føre til farveudsævning. Se præparatet af X-gal opløsning i tabel 1. - Fjern X-gal pletten, og vask pladen med vand fra hanen i 1 min.
- Modplet med neutral rød opløsning (1 mL/brønd) i 2 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Se forberedelse af neutral rød opløsning i tabel 1. - Vask pladen med postevand i 1 min. pladerne lufttørres.
- Tæl blå plaques ved hjælp af et dissekerende mikroskop (Figur 4).
- Beregne titer ved hjælp af formel (2)
Titer i pfu/mL (plaquedannende enheder) = Antal plaques/0,7 mL × fortyndingsfaktor (2)
BEMÆRK: Hvis der f.eks. findes 25 plaques i fortyndingsbrønden 10-9, er titeren 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/mL. Dette er den endelige oHSV-titer af aliquots tilberedt i trin 2.6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kort oversigt over hele protokollen er afbildet i figur 1, som repræsenterer de kritiske skridt, der er involveret i vækst, rensning og titrering af oHSV. CPE i Vero celler kan påvises så tidligt som 4 timer efter HSV infektion19. Figur 2 viser CPE i Vero-celler på tre forskellige tidspunkter efter oHSV-infektion. CPE-niveauet øges med tiden. I denne protokol observeres 90-100% CPE normalt inden for 48 timer efter lavMOI oHSV-podning (hvilket er det bedste tidspunkt at høste celler til rensning). Det kan dog tage op til 4 dage afhængigt af oHSV MOI podet i trin 1.2 og/eller oHSV's replikationspotentiale. Ud over denne periode kan celler med CPE lyseres, hvilket fører til frigivelse af virus i supernatanten. For at opnå en høj viral titer er det således vigtigt at høste CPE-ramte celler, når de er intakte. En anden vigtig faktor, der bidrager til den endelige virustiker, er antallet eller størrelsen af de vævskulturkolber, der anvendes til oHSV-forstærkning. Figur 3 viser processen med seriel fortynding (10-3 til 10-9) af en given virusbestand (opnået i trin 2.6.4), der kræves til titerbestemmelse ved plakanalysen. For oHSV'er med lacZ-udtryk kan virale plaques visualiseres ved X-gal farvning (Figur 4). I denne protokol blev der anvendt 20 T-150 cm2 vævskulturkolber, for hvilke der kan forventes 1,3-1,6 mL oHSV-lager med en titer på 1 ×10 10 pfu/mL.
Figur 1: En skematisk præsentation af de vigtigste skridt, der er involveret i oHSV vækst, rensning, og plak analyse. Forkortelser: oHSV = oncolytic herpes simplex virus; CPE = cytopatisk effekt; VB = Virusbuffer; HBSS = Hanks afbalancerede saltopløsning; PBS = fosfat-bufferet saltvand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Cytopatisk effekt i Vero-celler efter oHSV-infektion. Vero celler blev podet med oHSV kodning for mCherry (vist i rød fluorescens) på en MOI på 0,01 og afbildet (10x forstørrelse) ved 36, 48 og 72 timer post-virus infektion. CPE identificeres ved afrunding af de oHSV-inficerede celler (angivet med sorte pile). Skalastænger = 200 μm. Forkortelse: oHSV = oncolytic herpes simplex virus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: En seriel fortynding af en oHSV-bestand til plaque assays. Se også trin 3.3 i protokollen. Forkortelse: oHSV = oncolytic herpes simplex virus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Et repræsentativt billede af X-gal-farvede plaques ved 72 timers post-oHSV infektion. Ufortyndet (øvre brønd) og fortyndet (1:10; lavere brønd) oHSV-inficerede cellekultur supernatants føjet til Vero celler (70-80% sammenflydende), efterfulgt af X-gal farvning protokol beskrevet i punkt 3.8.5 (undtagen modstivning med neutral rød). Repræsentative billeder af en X-gal-farvede virus plaque (fra venstre panel) er præsenteret i midten (4x; skala barer = 1000 μm) og højre (10x; skala barer = 200 μm) paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Opløsningssammensætning | |
| Forberedelse af virusbuffer | kvantitet |
| 1 M natriumchlorid | 15 mL |
| 1 M Tris-hydrochlorid | 3 mL |
| Renset vand | 132 mL |
| justere pH til 6,8 | |
| Fremstilling af X-gal opløsning (~6,5 ml for en 6-brønds plade) | |
| 250 mM kaliumferricid | 130 μL |
| 250 mM kaliumferrocyanid | 130 μL |
| 1 M magnesiumchlorid | 13 μL |
| X-gal foropløset (20 mg/mL) i dimethylsulfoxid (DMSO) | 162,5 μL |
| Pbs | 6064,5 μL |
| Forberedelse af neutral rød opløsning til en 6-brønds plade | |
| Neutral rød løsning | 100 μL |
| methanol | 1 mL |
| Renset vand | 7 mL |
Tabel 1: Opløsningssammensætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen starter med væksten af oHSV i lav-passage Vero celler. Sammenløbet af Vero celle monolayer bør ~ 80% på tidspunktet for virus podning som tilgroede celler kan udvikle stramme fiber strukturer, der kan reducere oHSV indrejse i Vero celler20. Når 90-100% CPE er observeret, fjernes dyrknings-supernatanten, cellerne høstes, genbruges i VB/supernatant (se trin 1.4.6), snap-frosne og opbevares ved -80 °C til senere rensning. Blaho og kolleger ansat en lidt anden metode til høst og opbevaring af inficerede Vero celler. Kolberne med celler og dyrkningsmedier (suppleret med 1% kvægserumalbumin og PBS med kalium) opbevares f.eks. Cellerne høstes derefter, blandes med steril mælk og opbevares ved -80 °C indtilrensning 20. I dette tilfælde fungerer steril mælk som stabilisator, og det blev påvist, at titeren af en virusbestand er dramatisk højere, når den opbevares i steril mælk / medium end i medium alene20. I en anden undersøgelse viste en direkte sammenligning mellem forskellige stabilisatorer (herunder steril mælk), der anvendes til opbevaring af flere herpesvirus ved -80 °C, imidlertid ingen signifikant indvirkning på de endelige virustitler21. Her blev cellepillen suspenderet igen i VB, der bestod af Tris-buffer saltvand (pH 6,8) og 10% glycerol som opbevaringsstabilisator, hvilket normalt giver en høj virustitel (som skitseret i trin 3.10) til eksperimentelle undersøgelser.
Det er vigtigt at fjerne alle cellulære og medierelaterede komponenter fra den genophængte pellet for at opnå en virusbestand af høj kvalitet. Fjernelse af ikke-virale partikler er afgørende for at undgå potentielle immunreaktioner under in vivo-forsøg. Der er beskrevet flere metoder til virusrensning , herunder centrifugering22, forskellige gradientmetoder23, filtrering24og affinitetskromatografi25. Selv om denne protokol er baseret på højhastighedsdifugering ved hjælp af en saccharosegradientmetode, har andre anvendt en række andre gradueringsmetoder, såsom iodixanol11,26, Percoll27og Ficoll-Nycodenz23. Disse gradientmetoder adskiller virusset ved massefylde og kræver isolering af båndet fra gradienten i stedet for saccharosepuden, hvor virusset er pelleteret. Saccharose-gradientmetoden giver en skånsom tilgang til separate viruspartikler, fordi den minimerer risikoen for at forstyrre virale kuvertproteiner, samtidig med at viral infektivitet bevares. På trods af disse fordele kan den koncentrerede saccharoseopløsnings høje osmolaritet dehydrere de virale partikler; Derfor blev iodixanolgradientmetoden udviklet for at overvinde denne ulempe. Iodixanolgradientmetoden kræver imidlertid ultracentrifuge og indsamling af virionsbåndet. Andre faktorer, der skal tages i betragtning under oHSV-rensning, er hastighed og tidspunkt for centrifugering og valg af den virusbuffer, der anvendes til langtidsopbevaring. Denne protokol har den begrænsning, at renheden af oHSV ikke er bekræftet; Der blev dog fundet et stort antal funktionelle viruspartikler i en given renset oHSV-bestand ved titrering på Vero-celler (se afsnit 3).
oHSV danner plaketter på Vero-celler (Figur 4). De virale plaques kan identificeres ved Giemsa farvning, hvilket er en nem og bekvem metode. Giemsa pletter Vero celler, forlader viral plaques gennemsigtig eller tom, der let kan visualiseres (blotte øjne) og tælles ved hjælp af en dissekere mikroskop. Mens overlejring af medierne med agarose eller methylcellulose er almindeligt anvendt under plaque dannelse (i trin 3.7) for at forhindre spredning af virus og sekundære infektioner og plak haler28, brugen af menneskelige IgG at neutralisere oHSV i kulturen supernatant er lettere og mere bekvemt. For oHSV'er, der udtrykker lacZ, kan plaques visualiseres ved X-gal farvning (Figur 4), mens fluorescerende mikroskopi anvendes til fluorescerende protein (dvs. grøn fluorescerende protein) -udtrykke oHSVs18. Yderligere analyse for at detektere oHSV-inficerede celler omfatter immun-histokemisk eller -fluorescens med oHSV-specifikke antistoffer29 eller laserbaseret scanning af nær-infrarød fluorophore-konjugeret oHSV-specifikke antistoffer30.
Der er kritiske foranstaltninger, der skal følges for at opnå en god virus bestand såsom at opretholde sterilitet for at forhindre mikrobielle (bakterier, gær, eller skimmel) forurening og sunde Vero celler. Da kuverten af oHSV er ekstremt termofølsom20, skal oHSV-bestanden håndteres i et kryobeskyttende middel som 10% glycerol. Samlet set kan denne protokol let anvendes og praktiseres i et laboratorium indstilling, men kan ikke være nyttige for storstilet virus produktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SDR er en co-opfinder på patenter vedrørende oncolytic herpes simplex virus, der ejes og forvaltes af Georgetown University og Massachusetts General Hospital, som har modtaget royalties fra Amgen og ActiVec Inc. og er på Scientific Advisory Board of EG 427. De andre forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning i Saha lab blev delvist støttet af midler fra DOD (W81XWH-20-1-0702) og Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin og Melissa R.M. Humphrey blev delvist støttet af NIH (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J.
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
