Summary
يوصف بروتوكول قياسي لدراسة النشاط المضاد للأورام والسمية المرتبطة ب IL-1α في نموذج فأر متزامن من HNSCC.
Abstract
العلاج بالسيتوكين هو استراتيجية علاجية مناعية واعدة يمكن أن تنتج استجابات مناعية قوية مضادة للأورام لدى مرضى السرطان. تم تقييم السيتوكين الالتهابي إنترلوكين -1 ألفا (IL-1α) كعامل مضاد للسرطان في العديد من الدراسات قبل السريرية والسريرية. ومع ذلك ، فإن السمية التي تحد من الجرعة ، بما في ذلك الأعراض الشبيهة بالإنفلونزا وانخفاض ضغط الدم ، قد أضعفت الحماس لهذه الاستراتيجية العلاجية. سيمثل تسليم IL-1α القائم على الجسيمات النانوية متعددة الهيدريد (NP) نهجا فعالا في هذا السياق لأن هذا قد يسمح بإطلاق بطيء وخاضع للرقابة ل IL-1α بشكل منهجي مع تقليل الآثار الجانبية السامة. هنا يتم وصف تحليل للنشاط المضاد للأورام ل NPs polyanhydride المحملة ب IL-1α في نموذج الفأر الجيني لسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC). تم حقن الخلايا الظهارية الفموية البلعومية التي تعبر بثبات عن فيروس الورم الحليمي البشري 16 E6 / E7 مع خلايا hRAS و luciferase (mEERL) تحت الجلد في الجناح الأيمن للفئران C57BL / 6J. بمجرد وصول الأورام إلى 3-4 مم في أي اتجاه ، تم إعطاء تركيبة الجسيمات النانوية IL-1a 1.5٪ المحملة 20:80 1،8-مكرر (p-carboxyphenoxy) -3،6-dioxaoctane: 1،6-bis (p-carboxyphenoxy) hexane (CPTEG: CPH) تركيبة الجسيمات النانوية (IL-1α-NP) للفئران داخل الصفاق. تم قياس حجم الورم ووزن الجسم بشكل مستمر حتى وصل حجم الورم أو فقدان الوزن إلى معايير القتل الرحيم. تم أخذ عينات الدم لتقييم الاستجابات المناعية المضادة للأورام عن طريق بزل الوريد تحت الفك السفلي ، وتم قياس السيتوكينات الالتهابية من خلال مقايسات السيتوكينات المتعددة. تم استئصال الورم والغدد الليمفاوية الأربية وتجانسها في تعليق أحادي الخلية لتحليل الخلايا المناعية المختلفة من خلال قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. ستسمح هذه الطرق القياسية للباحثين بدراسة الاستجابة المناعية المضادة للأورام والآلية المحتملة ل NPs المناعية وعوامل العلاج المناعي الأخرى لعلاج السرطان.
Introduction
أحد المجالات الناشئة في العلاج المناعي للسرطان هو استخدام السيتوكينات الالتهابية لتنشيط الجهاز المناعي للمرضى ضد الخلايا السرطانية. يمكن للعديد من السيتوكينات المسببة للالتهابات (أي إنترفيرون ألفا (IFNα) وإنترلوكين -2 (IL-2) وإنترلوكين -1 (IL-1)) تكوين مناعة كبيرة مضادة للأورام ، مما أثار الاهتمام باستكشاف الخصائص المضادة للأورام بالإضافة إلى سلامة الأدوية القائمة على السيتوكين. إنترلوكين -1 ألفا (IL-1α) على وجه الخصوص ، هو السيتوكين الالتهابي المعروف باسم السيتوكين الرئيسي للالتهاب1. منذ اكتشاف هذا السيتوكين في أواخر 1970s ، تم التحقيق فيه كعامل مضاد للسرطان وكذلك دواء مكون للدم لعلاج الآثار السلبية للعلاج الكيميائي2. خلال أواخر 1980s ، أجريت العديد من الدراسات قبل السريرية والسريرية لتحديد الآثار المضادة للسرطان من IL-1α3،4،5،6. وجدت هذه الدراسات نشاطا واعدا مضادا للأورام ل IL-1α المؤتلف (rIL-1α) ضد سرطان الجلد وسرطان الخلايا الكلوية وسرطان المبيض. ومع ذلك ، لوحظت السميات ، بما في ذلك الحمى والغثيان والقيء والأعراض الشبيهة بالإنفلونزا ، وانخفاض ضغط الدم الأكثر حدة الذي يحد من الجرعة. لسوء الحظ ، أدت هذه السمية المرتبطة بالجرعة إلى تثبيط الحماس لمزيد من الاستخدام السريري ل rIL-1α.
لمحاولة معالجة القضية الحرجة المتمثلة في السمية بوساطة IL-1α ، سيتم التحقيق في تركيبات الجسيمات النانوية متعددة الأنهيدريد (NP) التي تسمح بالإطلاق الخاضع للرقابة ل IL-1α بواسطة حركية تآكل السطح. تهدف تركيبات NP هذه إلى جني فوائد الخصائص المضادة للأورام ل IL-1α مع تقليل الآثار الجانبية التي تحد من الجرعة7. Polyanhydrides هي بوليمرات معتمدة من إدارة الغذاء والدواء تتحلل من خلال تآكل السطح مما يؤدي إلى إطلاق ما يقرب من الصفر من العوامل المغلفة8،9،10،11،12. تم الإبلاغ عن أن البوليمرات المشتركة متعددة الهيدريد البرمائية التي تحتوي على 1،8-مكرر - (p-carboxyphenoxy) -3،6-dioxaoctane (CPTEG) و 1،6-مكرر (p-carboxyphenoxy) الهكسان (CPH) ، هي أنظمة توصيل ممتازة لمختلف الحمولات في علم الأورام والبحوث القائمة على المناعة 8،12. في البروتوكول التالي 20:80 CPTEG: CPH NPs المحملة ب 1.5٪ بالوزن٪ rIL-1α (IL-1α-NPs) سيتم استخدامها لدراسة النشاط المضاد للأورام وسمية هذا السيتوكين في نموذج فأر من HNSCC.
الهدف العام من الإجراءات التالية هو تقييم النشاط المضاد للأورام ل IL-1α-NPs على HNSCCs. يمكن تطبيق الإجراءات الموصوفة ، بما في ذلك تقييم نمو الورم والبقاء على قيد الحياة ، على أي عامل تعديل مناعي ذي أهمية. يجب تنفيذ هذه الإجراءات في نموذج فأر syngeneic مع نظام مناعي سليم13 لتحقيق أقصى قدر من الأهمية السريرية. كما سيتم تقييم سمية IL-1α-NP عن طريق قياس التغيرات في مستويات السيتوكينات المسببة للالتهابات ووزن الحيوان. هناك العديد من الطرق لتحديد سمية الدواء في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن الطرق الأكثر استخداما تتضمن قياس إنزيمات المصل لسمية الأعضاء والتغيرات النسيجية في تلك الأعضاء. ومع ذلك ، لإجراء التحليلات النسيجية ، يجب التضحية بالحيوان ، مما سيؤثر على منحنيات البقاء على قيد الحياة في التجربة. لذلك ، سيتضمن هذا البروتوكول بروتوكولا لجمع الدم من الفئران الحية لقياس السيتوكينات في عينات المصل. يمكن استخدام المصل الذي تم جمعه لقياس أي تحليلات مصل مرغوبة لسمية الأعضاء. سيتم استخدام قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان لفهم التغيرات في عدد الخلايا المناعية في البيئة المكروية للورم وهجرة الخلايا المناعية إلى العقدة الليمفاوية. يمكن استخدام طرق أخرى لتحديد الخلايا المناعية ، بما في ذلك الكيمياء المناعية و / أو التألق المناعي للأقسامالمحفوظة 14. ومع ذلك ، يمكن أن تستغرق هذه التقنيات وقتا طويلا ومملة لأدائها على عدد كبير من الحيوانات. بشكل عام ، ستسمح الطرق التالية للباحثين بدراسة الاستجابة المناعية المضادة للأورام والآليات المحتملة لعوامل التحفيز المناعي لعلاج السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات في الجسم الحي المستخدمة في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة أيوا.
1. إعداد وصيانة خط خلايا HNSCC
ملاحظة: في هذه الدراسة ، سيتم استخدام خط الخلايا الظهارية الفموية البلعومية للفأر الذي تم تحويله بثبات مع فيروس الورم الحليمي البشري E6 و E7 مع hRas و luciferase (mEERL). تم تطوير خط الخلايا هذا من سلالة الماوس C57BL / 6J وكان هدية من الدكتورة باولا دي فيرمير (قسم الجراحة ، كلية الطب بجامعة ساوث داكوتا سانفورد ، ساوث داكوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية).
- قم بإذابة قارورة مجمدة من خلايا mEERL في حمام مائي مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) ثم انقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على وسائط استزراع دافئة (وسط النسر المعدل من Dulbecco [DMEM] مكمل بنسبة 40.5٪ 1: 1 DMEM / Hams F12 ، 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] ، 0.1٪ جنتاميسين ، 0.005٪ هيدروكورتيزون ، 0.05٪ ترانسفيرين ، 0.05٪ أنسولين ، 0.0014٪ ثلاثي يودوثيرونين ، و 0.005٪ عامل نمو البشرة).
- قم بالطرد المركزي للأنبوب المخروطي عند 277 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة الوسائط. ثم, أعد تعليق حبيبات الخلية في وسائط جديدة 3-5 مل وانقلها إلى قارورة زراعة الخلايا T-25. للاسترداد الأمثل من التخزين المجمد ، خلايا لوحة في كثافة عالية.
ملاحظة: تم استخدام قوارير T-25 بسبب صغر حجمها ، مما يؤدي إلى أوقات استرداد أسرع من التخزين المجمد عندما تكون الخلايا على مقربة مقارنة بقوارير T-75. - دع الخلايا تنمو في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، وتتوسع إلى قوارير أكبر (أي T-75 أو T-150) ، وتمر كل 3 أيام. عندما يكون هناك ما يكفي من الخلايا للزرع المطلوب في جميع الفئران ، قم بإزالة القوارير ، وتخلص من الوسائط ، واشطف الخلايا برفق باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). ثم أضف 4 مل (في حالة استخدام قوارير T150) من 0.25٪ تربسين-EDTA ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. قم بقياس كمية التربسين لأعلى أو لأسفل حسب حجم الطبق / القارورة المستخدمة.
ملاحظة: قد يؤثر نوع خط الخلية ودرجة الالتقاء على أوقات التربسين. يمكن أن تؤدي فترات التربسين الطويلة إلى إتلاف الخلايا مما يؤدي إلى انخفاض قابليتها للحياة. استخدم الحد الأدنى من الوقت اللازم للتريبسين. - تحت المجهر ، تتحرك الخلايا المنفصلة على التربسين بحرية. إذا كانت بعض الخلايا لا تزال ملتصقة ، فاضغط برفق على الدورق لتعبئة الخلايا الملتصقة المتبقية. أضف وسائط جديدة (كمية كبيرة من الوسائط حسب الرغبة) لإيقاف تفاعل التربسين وجمع تعليق الخلية في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 277 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة الوسائط.
- أعد تعليق الخلايا في وسائط جديدة وعد الخلايا. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى (كما هو موضح أعلاه) ، ثم أضف PBS البارد إلى الخلايا لعمل تركيز نهائي من 10 × 106 خلايا / مل. حافظ على تعليق (معلقات) الخلية على الثلج قبل الحقن للفئران.
2. زرع الورم والعلاج من تعاطي المخدرات والقياس
ملاحظة: تم الاحتفاظ بالحيوانات التجريبية في مرفق رعاية الحيوان في جامعة أيوا واتبعت الإجراءات المعقمة المناسبة للتعامل معها.
- تخدير الفئران C57Bl/6J بمزيج الكيتامين (80 ملغ/كغ) وزيلازين (10 ملغ/كغم). احلق بعناية منطقة الخاصرة أو موقع الحقن المطلوب باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
ملاحظة: تذكر أن توثق استخدام المواد الخاضعة للرقابة كما هو مطلوب بموجب القواعد واللوائح المؤسسية (أو غيرها). - تطهير منطقة الجناح مع وسادة الإيثانول وحقن ببطء 100 ميكرولتر (تحتوي على 1 × 106 خلايا) من تعليق الخلية تحت الجلد باستخدام حقنة 25-28 غرام. تخدير الفئران قبل الحقن لمنع الحركات المفاجئة وفقدان الخلايا. قبل كل حقنة ، امزج معلق الخلية برفق لمنع الخلايا من الاستقرار في قاع القارورة أو الأنبوب المخروطي.
- بعد تناول تعليق الخلية في المحقنة ، قم بإزالة جميع الفقاعات والمساحة الميتة من الأعلى. حقن تعليق الخلية بطريقة بطيئة وثابتة. لا تستخدم نفس الإبرة على الفئران المتعددة. قم دائما بعمل معلقات خلوية إضافية لحساب الفقد العرضي.
- ضع الحيوان في أقفاصه الخاصة وراقبه حتى يتعافى من التخدير. أثناء التخدير ، تكون الحيوانات معرضة لخطر انخفاض حرارة الجسم. لذلك ، قم بتوفير حرارة إضافية أو ضع الفئران بالقرب من بعضها البعض للتدفئة (إذا كانت موجودة في نفس القفص).
- عندما تصل الأورام إلى 3 مم في أي اتجاه ، قم بتوزيع الفئران بشكل عشوائي (حسب حجم الورم و / أو الوزن) في مجموعات العلاج ثم ابدأ العلاج الدوائي. حقن الفئران داخل الصفاق (i.p.) مع NPs15 التي تحتوي على 3.75 ميكروغرام rIL-1α / الماوس في اليومين 4 و 9. قياس وتسجيل حجم الورم ((الطول × العرض 2) /2) ووزن الفأر يوميا أو كل يومين حتى يصل حجم الورم أو الفئران إلى معايير القتل الرحيم.
ملاحظة: حتى مع وجود باحث متمرس ، من الصعب زرع الورم بنفس الحجم في جميع الفئران. توزيع الحيوانات عشوائيا على مجموعات تجريبية بناء على حجم الورم ووزن الفأر.
3. جمع الدم وفصل المصل
ملاحظة: جمع الدم من الوريد تحت الفك السفلي هو تقنية سهلة وفعالة تسمح بجمع الدم من الحيوانات الواعية أو الحيوانات تحت التخدير. لهذه الدراسة ، تم جمع الدم من الحيوانات عندما كانت تحت التخدير.
- تخدير الفئران بحقن مزيج الكيتامين / الزيلازين كما ذكر أعلاه.
- أمسك الجلد المترهل على الكتف باستخدام اليد غير المهيمنة وثقب الوريد تحت الفك السفلي بإبرة أو إبرة 18 جم ، خلف الفك السفلي قليلا (بقعة بيضاء في تلك المنطقة).
- ثقب الوريد لضمان تدفق الدم على الفور. اجمع 200-300 ميكرولتر من الدم (حسب وزن الفأر) في أنبوب طرد مركزي دقيق من مادة البولي بروبيلين سعة 1.5 مل أو أنبوب فاصل المصل. بعد جمع الدم ، اضغط برفق على موقع البزل حتى يتوقف النزيف. أعد الفئران إلى أقفاصها وراقبها حتى تتعافى من التخدير.
ملاحظة: لا تجمع أكثر من 1٪ من وزن جسم الفأر في مجموعة واحدة أو على مدى 24 ساعة. - دع الجلطة الدموية المجمعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. ضع الأنابيب على الثلج حتى تصبح جاهزة للطرد المركزي.
- جهاز طرد مركزي للدم المتخثر عند 1540 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- جمع الطبقة العليا (المصل) دون إزعاج خلايا الدم الحمراء. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. مضاعفة المصل الذي تم جمعه
- قم بإذابة عينات المصل أو البلازما مع الاحتفاظ بها على الثلج.
- قم بالطرد المركزي للعينات عند 1540 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لترسيب أي حطام خلوي وجمع طبقة المصل بعناية من الأعلى.
- أخرج مجموعة تعدد الإرسال في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: هناك العديد من مجموعات تعدد الإرسال المتاحة تجاريا والتي تم تصميمها لسيتوكينات أو كيموكينات أو عوامل نمو معينة. أيضا ، من الممكن تخصيص المجموعة بناء على البروتين محل الاهتمام. - قم بإجراء الفحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للكشف عن السيتوكينات.
ملاحظة: تستخدم معظم مجموعات تعدد الإرسال حبات مغناطيسية لربط الجسم المضاد الذي تم التقاطه. لذلك ، من الضروري استخدام غسالة مغناطيسية آلية أو محمولة باليد أثناء الغسيل. خلاف ذلك ، سوف تغسل الخرز المغناطيسي من اللوحة ، ولن يكون لدى المرء ما يكفي من الأحداث لأخذ القراءة.
5. جمع الورم والعقدة الليمفاوية الأربية وإعداد تعليق خلية واحدة
- تخدير الفئران بمزيج الكيتامين / الزيلازين. لضمان التخدير الكامل ، استخدم منعكس الدواسة (قرصة إصبع القدم الثابتة). إذا لم تستجب الفئران ، فقم بالقتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
- ضع كل فأر على ظهره ورش 70٪ من الإيثانول على جلد منطقة البطن. استخدم الملقط والمقص لقطع الورم من الجانب الأيسر للفئران والعقدة الليمفاوية من الجانب الأيمن. إذا كان الورم كبيرا ، مقطعة إلى قطع صغيرة واتخاذ 500-600 ملغ من الأنسجة. للعقدة الليمفاوية ، وجمع العضو كله.
ملاحظة: هناك نوعان من العقد الليمفاوية على جانبي المنطقة الأربية. اعتمادا على الأهداف التجريبية ، يمكن عزل العقدة الليمفاوية والورم من نفس الجانب. ومع ذلك ، إذا أصبح الورم كبيرا جدا ، فلن يكون من السهل جمع العقدة الليمفاوية من نفس الجانب. - ضع الأنسجة على أنابيب التفكيك المعنية التي تحتوي على 3-5 مل من وسائط RPMI. تجانس الأنسجة باستخدام جهاز فك آلي.
ملاحظة: يمكن استخدام مجانسات آلية أو محمولة أخرى. - بعد التجانس ، انقل تعليق الخلية من خلال مرشح 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 277 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة الوسائط. اغسل وأعد تعليق الخلايا في 1-2 مل من PBS البارد.
6. تلطيخ FACS لتعليق أحادي الخلية
- استخدم 0.4٪ تلطيخ أزرق تريبان لحساب الخلايا القابلة للحياة في مقياس الدم. احسب الحجم المطلوب للحصول على 2-3 مليون خلية ونقلها إلى أنبوب FACS المعني.
- استخدام صبغة الصلاحية للبوابة على الخلايا الحية ؛ خلاف ذلك ، قد يحدث ارتباط غير محدد للجسم المضاد بالخلايا الميتة يمكن أن يؤدي إلى نتيجة إيجابية كاذبة.
ملاحظة: تم استخدام صبغة الزومبي لتلطيخ الخلايا الحية والميتة في هذه التجربة. تتوفر تجاريا العديد من الأصباغ القابلة للتثبيت وغير القابلة للتثبيت (مثل يوديد البروبيديوم). - جهاز طرد مركزي (277 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية) الخلايا المعدودة. صب المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا إلى 300 ميكرولتر من PBS. أضف 0.5-1 ميكرولتر من صبغة / أنبوب الزومبي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام.
- أجهزة الطرد المركزي (277 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية) وغسل الخلايا ب 1-2 مل من المخزن المؤقت FACS وإعادة تعليقها إلى 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
- أضف مانع مستقبلات Fc (2 ميكرولتر لكل 200 ميكرولتر أو وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق.
- جهاز طرد مركزي (277 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية) وغسل الخلايا ب 1-2 مل من مخزن FACS. يضاف كوكتيل الأجسام المضادة ويحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
- بعد الحضانة ، يتم طرد مركزي (277 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية) وغسل الخلايا بمخزن مؤقت 1-2 مل من FACS. أضف 300-400 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد 2٪ وأعد تعليقه للتثبيت. قم بتخزين الخلايا في هذه الخطوة لبضعة أيام عند 4 درجات مئوية أو قم بتحليلها على الفور بواسطة مقياس التدفق الخلوي متعدد الألوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة ، تم التحقيق في النشاط المضاد للأورام لبولي أنهيدريد IL-1α في نموذج فأر سينجيني من HNSCC. أدى IL-1α المؤتلف (rIL-1α) إلى إبطاء نمو ورم mEERL بشكل كبير (الشكل 1A) ، على الرغم من ملاحظة فقدان الوزن في الفئران المعالجة ، والذي تم استعادته بعد انسحاب العلاج (الشكل 1B). لم تحفز IL-1α-NPs تأثيرا مضادا للأورام بشكل كبير مقارنة بالمحلول الملحي أو NPs الفارغة (الشكل 1 أ) وكانت مصحوبة ببعض فقدان الوزن ، على الرغم من أنها لم تكن بارزة مثل rIL-1α (الشكل 1B). نجت الفئران المعالجة ب rIL-1α لفترة أطول بكثير من مجموعات العلاج الأخرى (الشكل 1C). بالإضافة إلى ذلك ، كانت المستويات المنتشرة من IL-1α و IL-1β و IFN-γ أعلى في الفئران المعالجة ب rIL-1α مقارنة بمجموعات العلاج الأخرى (الشكل 2A-C). تشير هذه النتائج إلى أن التحسينات في IL-1α-NP فيما يتعلق بفعالية مضاد الأورام لها ما يبررها.
الشكل 1: تأثير rIL-1α على نمو الورم والبقاء على قيد الحياة ووزن الجسم. تم علاج ذكور الفئران C57BL / 6J (ن = 10-11 فئران / مجموعة علاج) تحمل أورام mEERL HNSCC في اليوم الأول واليوم 5 باستخدام rIL-1α (3.75 ميكروغرام من rIL-1α) ، IL-1α-NP (0.25 مجم من NPs تحتوي على 3.75 ميكروغرام من rIL-1α) ، Blank-NP (0.25 مجم من NPs) ، و 100 ميكرولتر من محلول ملحي (CON). تظهر التغيرات في متوسط حجم الورم (A) وأوزان الجسم الطبيعية (B) ومنحنيات البقاء على قيد الحياة (C). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. * p < 0.05 مقارنة بمجموعات العلاج الأخرى. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تأثير rIL-1α على السيتوكينات المتداولة. تم جمع عينات الدم من مجموعة فرعية من الفئران (ن = 4 فئران / مجموعة علاج) بعد إعطاء الدواء الثاني وتحليلها لتعميم مستويات السيتوكين عن طريق مقايسة تعدد الإرسال. تظهر المستويات المتداولة من IL-1α (A) و IL-1β (B) و IFN-γ (C). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سيسمح هذا البروتوكول لأي باحث بدراسة النشاط المضاد للأورام وبعض الآليات الأساسية للأدوية المعدلة للمناعة في نظام نموذج فأر الورم في الجسم الحي . هنا ، تم استخدام نموذج الورم تحت الجلد الجيني ، والذي له العديد من المزايا على نماذج تقويم العظام ، بما في ذلك بروتوكوله المباشر تقنيا ، والمراقبة السهلة لنمو الورم ، وتقليل معدلات الإصابة بالأمراض الحيوانية ، وقابلية إنتاج أعلى. يمكن أيضا تعديل نماذج الورم تحت الجلد إلى نموذج ورم ثنائي عن طريق حقن الخلايا السرطانية على كل من الجناح الأيسر والأيمن. في نموذج الورم الثنائي هذا ، يمكن إعطاء العلاج الإشعاعي أو الأدوية لورم واحد داخل الورم ، ويمكن مراقبة الاستجابات الأبسكوبية. نماذج الفئران HNSCC Orthotopic ، على الرغم من أنها أكثر صلة سريريا ، إلا أنها تمثل تحديا تقنيا لتوليدها ، ويصعب مراقبة نمو الورم ، وغالبا ما يؤدي عبء الورم في تجويف الفم إلى القتل الرحيم المبكر بسبب عدم قدرة الفئران على تناول الطعام والشراب.
يعد تحضير الخلايا خطوة مهمة لتشكيل أورام متناظرة ومماثلة الحجم في جميع الفئران. يؤدي الإعداد السيئ للخلايا إلى انخفاض صلاحية الخلايا ويؤثر بشكل كبير على توليد الورم في الفئران. يوصى بأن تكون الخلايا السرطانية في رقم مرور مبكر وضمن التقاء 80٪ -90٪. يؤثر ارتفاع عدد المرور والالتقاء على بقاء الخلية وبالتالي توليد الورم. يجب أيضا حقن الخلايا في أقرب وقت ممكن بعد التحضير حيث يتم تقليل الصلاحية إذا تم الاحتفاظ بها في PBS بعد 20-30 دقيقة. إذا كانت هناك حاجة إلى زرع عدد كبير من الفئران بالأورام ، فمن المستحسن عمل محلول مخزون من الخلايا المحفوظة في الوسائط وإعداد معلقات الخلايا القابلة للحقن في PBS لمجموعة أصغر من الحيوانات.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي يجب الحفاظ عليها بعناية بعد تحضير الخلايا السرطانية للحقن. يمكن أن يؤدي حقن الخلايا السرطانية إلى الفضاء تحت الجلد إلى إنتاج أنماط وأحجام مختلفة لنمو الورم مقارنة بالمساحة تحت الجلد. لذلك ، يجب إيلاء اهتمام دقيق لوضع الإبرة لتشكيل ورم متسق. اختيار الإبرة مهم أيضا. إذا كانت الإبرة أصغر من الخلية السرطانية ، فقد تؤدي الإبر الأصغر إلى إجهاد الخلايا مما يؤدي إلى تقليل قابليتها للحياة. إذا كانت الإبرة كبيرة جدا ، فقد تؤذي الحيوان وتؤدي إلى تسرب الخلايا من موقع الحقن. حتى بالنسبة للباحثين ذوي الخبرة الذين لديهم حجم الإبرة الصحيح ، قد يكون هناك تسرب للخلايا في موقع الحقن مما يؤدي إلى ورم صغير أو معدوم. من المهم أن يستخدم الباحثون التقنية الصحيحة لحقن الورم وحجم الإبرة الأمثل من أجل تقليل فقدان الخلايا السرطانية وزيادة الدقة والدقة أثناء زرع الخلايا السرطانية. يجب إجراء قياسات الورم بعناية باستخدام الفرجار الورني (اليدوي أو الإلكتروني). أفضل الممارسات هي أن تكون متسقة مع اتجاه قياس طول الورم وعرضه لتقليل التباين. قياس الورم من قبل نفس الباحث طوال الدراسة يمكن أن يقلل من التباين.
كما هو متوقع ، فقدت الفئران التي تتلقى rIL-1α الوزن أثناء العلاج ، مما يدعم النتائج السابقة15,16. على الرغم من أن فقدان الوزن هو طريقة بسيطة ومباشرة لتقييم السمية ، إلا أن هناك نقاط نهاية سمية أخرى يمكن استخدامها. يوفر تقييم عدد خلايا الدم (خلايا الدم البيضاء وخلايا الدم الحمراء وعدد الصفائح الدموية) ومستويات إنزيم الكبد (ناقلة أمين الأسبارتات ، ألانين أمينوترانسفيراز ، والفوسفاتيز القلوي) معلومات قيمة حول سمية الدواء. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التضحية بمجموعة فرعية من الفئران ، ويمكن إجراء تحليل نسيجي للأعضاء (الكبد والكلى والبنكرياس والرئة ، إلخ). غالبا ما يستخدم الالتهاب الجهازي كمؤشر على السمية. هنا ، تم تحليل عدد من السيتوكينات المسببة للالتهابات المنتشرة في الفئران بعد العلاج بالعقاقير عن طريق بزل الوريد تحت الفك السفلي باستخدام إبرة 18 G. يتطلب بزل الوريد تحت الفك السفلي على الفئران مهارة تأتي من العديد من تكرار الإجراء. إذا كان البزل عميقا جدا ، فقد يتسبب في نزيف من الأذن وتلف الأنسجة الداخلية. في حين أنه إذا لم يتم اختراق الإبرة بعيدا بما فيه الكفاية ، فقد يتم جمع كمية غير كافية من الدم. بدائل الإبر هي استخدام إبر النزيف القابل للتصرف. هناك أنواع مختلفة من إبر النزيف المتوفرة تجاريا والتي تختلف في طولها. يجب على الباحثين استخدام حجم إبرة وخز مناسب لضمان جمع الدم الأمثل والمعاملة الإنسانية للحيوانات. بالنسبة لهذا الإجراء ، يتم عرض نتائج ثلاثة سيتوكينات (الشكل 2A-C). من المحتمل أن تترافق الزيادة في السيتوكينات المسببة للالتهابات المنتشرة بما في ذلك IL-1α و IL-1β و IFN-γ التي لوحظت في الفئران المعالجة ب rIL-1α مع فقدان الوزن الحاد (الشكل 1B) الذي لوحظ في مجموعة العلاج هذه.
أخيرا ، تم وصف بروتوكول لعزل وإعداد معلقات أحادية الخلية لورم الفئران والغدد الليمفاوية. هذه الطريقة مفيدة لأولئك الذين يسعون إلى اكتشاف التغيرات في تنشيط الخلايا المناعية وتجنيدها بسبب العلاج بالعقاقير. أثناء تشريح الأورام ، يجب التخلص من الأنسجة الدهنية والجلد والشعر وغيرها من الحطام قدر الإمكان. عادة ، يجب أن يكون حجم الورم أكبر من 30 مم3 للحصول على خلايا كافية لقياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، إذا كان الورم كبيرا جدا ، فقد يكون من الصعب تحضير معلقات أحادية الخلية. يجب تقطيع الأورام الكبيرة إلى قطع صغيرة قبل وضعها في أنبوب التفكك. يجب أن تتم العملية بسرعة للحصول على خلايا مثالية قابلة للحياة. بالإضافة إلى ذلك ، تجعل الأورام الكبيرة العثور على العقدة الليمفاوية الأربية على جانب الورم أمرا صعبا. في هذه الحالة ، يمكن جمع العقدة الليمفاوية الأربية من الموقع المقابل. بمجرد الحصول على معلقات أحادية الخلية ، يمكن تلطيخها بأجسام مضادة مختلفة وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان.
بشكل عام ، توفر هذه البروتوكولات طريقة فعالة لدراسة النشاط المضاد للأورام للأدوية المعدلة للمناعة ، والتغيرات المرتبطة بها في السيتوكينات المنتشرة ومجموعات الخلايا المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل #I01BX004829 جائزة مراجعة الاستحقاق من الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) قسم شؤون المحاربين القدامى ، خدمة البحث والتطوير في المختبرات الطبية الحيوية وبدعم من برنامج جائزة Mezhir من خلال مركز هولدن الشامل للسرطان في جامعة أيوا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
References
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
