Summary
描述了一种标准方案来研究HNSCC同系小鼠模型中IL-1α的抗肿瘤活性和相关毒性。
Abstract
细胞因子治疗是一种很有前途的免疫治疗策略，可以在癌症患者中产生强大的抗肿瘤免疫反应。促炎细胞因子白细胞介素-1α（IL-1α）已在多项临床前和临床研究中被评估为抗癌剂。然而，剂量限制性毒性，包括流感样症状和低血压，削弱了对这种治疗策略的热情。在这种情况下，基于聚酐纳米颗粒（NP）的IL-1α递送将代表一种有效的方法，因为这可能允许IL-1α的缓慢和受控释放，同时减少毒副作用。这里描述了头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）同系小鼠模型中负载IL-1α的聚酐NPs的抗肿瘤活性分析。将稳定表达HPV16 E6/E7的小鼠口咽上皮细胞与hRAS和荧光素酶（mEERL）细胞一起皮下注射到C57BL/6J小鼠的右胁中。一旦肿瘤在任何方向上达到3-4mm，就向小鼠腹膜内施用1.5%IL-1a - 负载20：80 1，8-双（对羧基苯氧基）-3，6-二氧杂辛烷：1，6-双（对羧基苯氧基）己烷（CPTEG：CPH）纳米颗粒（IL-1α-NP）制剂。连续测量肿瘤大小和体重，直到肿瘤大小或体重减轻达到安乐死标准。通过下颌下静脉穿刺采集血液样本以评估抗肿瘤免疫应答，并通过细胞因子多重测定法测定炎性细胞因子。切除肿瘤和腹股沟淋巴结，均质化成单细胞悬液，通过多色流式细胞术分析各种免疫细胞。这些标准方法将使研究人员能够研究免疫刺激NPs和其他免疫治疗剂用于癌症治疗的抗肿瘤免疫反应和潜在机制。
Introduction
癌症免疫疗法的新兴领域之一是使用炎性细胞因子来激活患者的免疫系统对抗其肿瘤细胞。几种促炎细胞因子（即干扰素-α（IFNα）、白细胞介素-2（IL-2）和白细胞介素-1（IL-1））可以产生显着的抗肿瘤免疫力，这引起了人们对探索抗肿瘤特性以及基于细胞因子的药物的安全性的兴趣。特别是白细胞介素-1α（IL-1α）是一种促炎细胞因子，称为炎症1的主细胞因子。自 1970 年代后期发现这种细胞因子以来，它已被研究为抗癌剂以及治疗化疗负面影响的造血药物2.在1980年代后期，进行了几项临床前和临床研究，以确定IL-1α3，4，5，6的抗癌作用。这些研究发现重组IL-1α（rIL-1α）对黑色素瘤、肾细胞癌和卵巢癌具有有希望的抗肿瘤活性。然而，通常观察到毒性，包括发热、恶心、呕吐、流感样症状和最严重的剂量限制性低血压。不幸的是，这些剂量相关的毒性抑制了进一步临床使用rIL-1α的热情。
为了解决IL-1α介导的毒性的关键问题，将研究允许通过表面侵蚀动力学控制IL-1α释放的聚酐纳米颗粒（NP）配方。这些NP制剂旨在获得IL-1α抗肿瘤特性的益处，同时减少剂量限制性副作用7。聚酐是FDA批准的聚合物，通过表面侵蚀降解，导致封装剂8，9，10，11，12的释放几乎为零级。据报道，含有1，8-双-（对羧基苯氧基）-3，6-二氧杂辛烷（CPTEG）和1，6-双（对羧基苯氧基）己烷（CPH）的两亲性聚酐共聚物是肿瘤学和免疫学研究中各种有效载荷的出色递送系统8，12。在以下方案中，20：80 CPTEG：CPH NPs将加载1.5wt.%rIL-1α（IL-1α-NPs）用于研究该细胞因子在HNSCC小鼠模型中的抗肿瘤活性和毒性。
以下程序的总体目标是评估IL-1α-NPs对HNSCC的抗肿瘤活性。所描述的程序，包括评估肿瘤生长和存活，可以应用于任何感兴趣的免疫调节剂。这些程序应在具有完整免疫系统的同系小鼠模型中进行13 ，以最大限度地提高临床相关性。IL-1α-NP毒性也将通过测量促炎细胞因子循环水平和动物体重的变化来评估。测定 体内 药物毒性的方法有很多种;然而，最广泛使用的方法涉及测量血清酶的器官毒性和这些器官的组织学变化。但是，要进行组织学分析，需要牺牲动物，这将影响实验的存活曲线。因此，该协议将包括用于从活小鼠收集血液以测量血清样品中的细胞因子的方案。收集的血清可用于测量任何所需的血清分析物的器官毒性。多色流式细胞术将用于了解肿瘤微环境中免疫细胞群的变化以及免疫细胞向淋巴结的迁移。其他方法可用于鉴定免疫细胞，包括保存部分的免疫组织化学和/或免疫荧光14。然而，这些技术在大量动物身上执行可能既耗时又乏味。总体而言，以下方法将使研究人员能够研究抗肿瘤免疫反应和免疫刺激剂用于癌症治疗的潜在机制。
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Protocol
本研究中使用的所有 体内 程序均已获得爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. HNSCC细胞系的制备与维护
注意：在本研究中，将使用HPV E6和E7以及hRas和荧光素酶（mEERL）稳定转化的小鼠口咽上皮细胞系。该细胞系由C57BL / 6J小鼠株开发而成，是Paola D. Vermeer博士（美国南达科他州南达科他州南达科他州桑福德医学院外科系）的礼物。
- 在预热（37°C）水浴中解冻冷冻的mEERL细胞小瓶，然后转移到含有温培养基的15 mL锥形管中（Dulbecco的改良鹰培养基[DMEM]补充有40.5%1：1 DMEM / Hams F12，10%胎牛血清[FBS]，0.1%庆大霉素，0.005%氢化可的松，0.05%转铁蛋白，0.05%胰岛素，0.0014%三碘甲状腺原氨酸和0.005%表皮生长因子）。
- 将锥形管在25°C下以277× g 离心5分钟以除去培养基。然后，将细胞沉淀重悬于3-5 mL新鲜培养基中，并将其转移到T-25细胞培养瓶中。为了从冷冻储存中获得最佳回收率，需要高密度平板细胞。
注意：使用T-25烧瓶是因为它们的尺寸较小，与T-75烧瓶相比，当细胞靠近时，从冷冻储存中恢复时间更快。 - 让细胞在37°C和5%CO2的加湿培养箱中生长，扩增至更大的烧瓶（即T-75或T-150），每3天传代一次。当有足够的细胞用于所需的植入所有小鼠时，取出烧瓶，丢弃培养基，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻冲洗细胞。然后，加入4mL（如果使用T150烧瓶）的0.25%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育2分钟。根据所使用的培养皿/烧瓶大小向上或向下缩放胰蛋白酶的量。
注意：细胞系的类型和融合程度可能会影响胰蛋白酶消化时间。长胰蛋白酶消化期会损害细胞，导致低活力。使用胰蛋白酶消化所需的最短时间。 - 在显微镜下，胰蛋白酶消化时分离的细胞自由移动。如果某些细胞仍然附着，请非常轻柔地敲击烧瓶以动员剩余的贴壁细胞。加入新鲜培养基（根据需要缩放培养基量）以停止胰蛋白酶反应，并将细胞悬液收集在 50 mL 锥形管中。在25°C下以277× g 离心5分钟以除去培养基。
- 将细胞重悬于新鲜培养基中并计数细胞。再次离心（如上所述），然后将冷PBS添加到细胞中，使终浓度为10×106 细胞/ mL。在注射到小鼠之前，将细胞悬液保持在冰上。
2. 肿瘤植入、药物治疗和测量
注意：实验动物被饲养在爱荷华大学的动物护理设施中，并遵循适当的无菌程序来处理它们。
- 用氯胺酮（80mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）混合物麻醉C57Bl / 6J小鼠。用电动剃须刀小心地剃除侧腹区域或所需的注射部位。
注意：请记住按照机构（或其他）规则和法规的要求记录受控物质的使用。 - 用乙醇垫消毒侧腹区域，并使用25-28G注射器皮下缓慢注射100μL（包含1 x 106 个细胞）的细胞悬液。注射前麻醉小鼠，以防止突然移动和细胞丢失。每次注射前，轻轻混合细胞悬液以防止细胞沉降到小瓶或锥形管的底部。
- 将细胞悬液放入注射器后，从顶部去除所有气泡和死区。以缓慢而稳定的方式注射细胞悬液。不要在多只小鼠身上使用相同的针头。始终使用额外的细胞悬液以应对意外丢失。
- 将动物放在各自的笼子里并监测它们，直到它们从麻醉中恢复过来。在麻醉期间，动物有体温过低的风险;因此，提供补充热量或将小鼠彼此靠近以保持温暖（如果饲养在同一笼子中）。
- 当肿瘤在任何方向上达到3mm时，随机化治疗组中的小鼠（按肿瘤大小和/或重量），然后开始药物治疗。在第4天和第9天腹膜内（ip）注射含有3.75μgrIL-1α /小鼠的NPs15 的小鼠。每天或每隔一天测量并记录肿瘤体积（（长x宽2）/ 2）和小鼠体重，直到肿瘤大小或小鼠达到安乐死标准。
注意：即使有经验丰富的研究人员，也很难在所有小鼠中植入相同大小的肿瘤。根据肿瘤大小和小鼠体重将动物随机分为实验组。
3. 采血和血清分离
注意：从下颌下静脉采血是一种简单有效的技术，可以从有意识的动物或麻醉下的动物身上采血。在这项研究中，在麻醉下从动物身上收集血液。
- 如上所述，用注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。
- 用非惯用手抓住肩膀上的松弛皮肤，用 18 G 针或采血针刺穿下颌下静脉，略微位于下颌骨后面（该区域有白点）。
- 刺穿静脉以确保血液立即流动。将 200-300 μL 血液（取决于小鼠体重）收集到 1.5 mL 聚丙烯微量离心管或血清分离管中。采血后，对穿刺部位施加轻微的压力，直到出血停止。将小鼠放回各自的笼子并观察，直到它们从麻醉中恢复过来。
注意：不要在一次收集或24小时内收集超过小鼠体重的1%。 - 让收集的血液在室温下凝结20-30分钟。将试管放在冰上，直到它们准备好离心。
- 在4°C下以1540× g 离心凝血15分钟。
- 在不干扰红细胞的情况下收集上层（血清）。储存在-80°C直至使用。
4. 采集血清的多路复用
- 解冻血清或血浆样品，同时将其保存在冰上。
- 在4°C下以1540× g 离心样品5分钟以沉淀任何细胞碎片，并小心地从顶部收集血清层。
- 在室温下取出多重试剂盒。
注意：有几种市售的多重试剂盒专为特定细胞因子、趋化因子或生长因子而设计。此外，还可以根据感兴趣的蛋白质定制试剂盒。 - 按照制造商的方案进行测定以检测细胞因子。
注意：大多数多重试剂盒使用磁珠结合捕获的抗体。因此，在洗涤过程中必须使用自动或手持式磁力清洗机。否则，磁珠将从板上洗掉，并且没有足够的事件来读取。
5.肿瘤和腹股沟淋巴结的采集及单细胞悬液的制备
- 用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。为确保完全镇静，请使用踏板反射（用力捏脚趾）。如果小鼠没有反应，则通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
- 将每只小鼠放在背上，在腹部皮肤上喷洒70%乙醇。使用镊子和剪刀从小鼠左侧切出肿瘤，从右侧切出淋巴结。如果肿瘤很大，切成小块并服用500-600毫克组织。对于淋巴结，收集整个器官。
注意：腹股沟区域两侧有两个淋巴结。根据实验目标，可以从同一侧分离淋巴结和肿瘤。但是，如果肿瘤变得非常大，则不容易从同一侧收集淋巴结。 - 将组织放在含有 3-5 mL RPMI 培养基的相应解离管上。使用自动解离器均质组织。
注意：可以使用其他自动或手持式均质机。 - 匀浆后，通过 70 μm 过滤器将细胞悬液转移到 50 mL 锥形管中。在25°C下以277× g 离心5分钟以除去培养基。将细胞洗涤并重悬于1-2 mL冷PBS中。
6. 单细胞悬浮液的FACS染色
- 使用0.4%台盼蓝染色剂在血细胞计数器中计数活细胞。计算获得2-3百万个细胞所需的体积，并将它们转移到相应的FACS管中。
- 使用活性染料在活细胞上门禁;否则，可能会发生抗体与死细胞的非特异性结合，从而产生假阳性结果。
注意：在该实验中，僵尸染料用于活细胞和死细胞染色。几种可固定和不可固定的染料（例如碘化丙啶）是市售的。 - 离心（277× g 在25°C下5分钟）计数的细胞。倒出上清液并将细胞重悬到 300 μL PBS 中。加入 0.5-1 μL 僵尸染料/管。在室温下在黑暗中孵育20分钟。
- 离心（277 x g 在25°C下5分钟）并用1-2mL FACS缓冲液洗涤细胞，并将其重悬于200μLFACS缓冲液中。
- 加入 Fc 受体阻滞剂（每 200 μL 2 μL 或根据制造商的方案）并将细胞孵育 10 分钟。
- 离心（277× g 在25°C下5分钟）并用1-2mL FACS缓冲液洗涤细胞。加入抗体混合物，并在4°C下在黑暗中孵育30分钟。
- 孵育后，离心（277× g 在25°C下5分钟）并用1-2mL FACS缓冲液洗涤细胞。加入 300-400 μL 2% 多聚甲醛溶液并重悬固定。将此步骤中的细胞在4°C下储存几天或立即通过多色流式细胞仪分析。
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Representative Results
本研究研究了聚酐IL-1α在HNSCC同系小鼠模型中的抗肿瘤活性。重组IL-1α（rIL-1α）显着减缓了mEERL肿瘤的生长（图1A），尽管在治疗小鼠中观察到体重减轻，并且在治疗停止后恢复（图1B）。与盐水或空白-NPs相比，IL-1α-NPs没有诱导显着的抗肿瘤作用（图1A），并且伴随着一些体重减轻，尽管不如rIL-1α突出（图1B）。用rIL-1α处理的小鼠比其他治疗组存活时间明显更长（图1C）。此外，与其他治疗组相比，rIL-1α处理的小鼠中IL-1α，IL-1β和IFN-γ的循环水平更高（图2A-C）。这些结果表明，IL-1α-NP在抗肿瘤功效方面的改进是有保证的。
图 1：rIL-1α 对肿瘤生长、存活和体重的影响。 携带mEERL HNSCC肿瘤的雄性C57BL / 6J小鼠（n = 10-11只小鼠/治疗组）在第1天和第5天用rIL-1α（3.75μgrIL-1α），IL-1α-NP（0.25mg含有3.75μgrIL-1α的NPs），Blank-NP（0.25mgNPs）和100μL盐溶液（CON）腹膜处理。显示的是平均肿瘤体积（A），正常体重（B）和生存曲线（C）的变化。误差线表示平均值的标准误差。*P < 0.05 与其他治疗组相比。 请点击此处查看此图的大图。
图2：rIL-1α对循环细胞因子的影响。 在第二次给药后从小鼠亚群（n = 4只小鼠/治疗组）收集血液样品，并通过多重测定分析循环细胞因子水平。图中显示了IL-1α（A），IL-1β（B）和IFN-γ（C）的循环水平。误差线表示平均值的标准误差。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议将允许任何研究人员在 体内 肿瘤小鼠模型系统中研究抗肿瘤活性和免疫调节药物的一些潜在机制。在这里，使用了同源皮下肿瘤模型，该模型与原位模型相比具有几个优点，包括其技术上简单的方案，易于监测肿瘤生长，更少的动物发病率和更高的可生产性。皮下肿瘤模型也可以通过在左翼和右翼注射肿瘤细胞来修改为双侧肿瘤模型。在这种双侧肿瘤模型中，可以对肿瘤内的一个肿瘤进行放疗或药物治疗，并且可以监测远隔反应。原位HNSCC小鼠模型虽然更具临床相关性，但技术上难以生成，难以监测肿瘤生长，并且由于小鼠无法进食和饮水，口腔中的肿瘤负荷通常导致过早安乐死。
细胞的制备是在所有小鼠中形成对称和相似大小的肿瘤的重要步骤。细胞制备不良导致细胞活力降低，并极大地影响小鼠肿瘤的产生。建议肿瘤细胞处于早期传代数和80%-90%的汇合度内。较高的传代次数和汇合度会影响细胞活力，从而影响肿瘤的产生。细胞也应在制备后尽快注射，因为如果在PBS中保存超过20-30分钟，活力会降低。如果需要将大量小鼠植入肿瘤，建议将保存在培养基中的细胞制备储备溶液，并在PBS中为较小的动物组制备可注射细胞悬液。
在制备用于注射的肿瘤细胞后，方案中有几个关键步骤需要仔细维护。与皮下腔相比，将肿瘤细胞注射到皮下空间可以产生不同的肿瘤生长模式和大小。因此，应仔细注意针头放置，以确保肿瘤形成一致。针头选择也很重要。如果针头比癌细胞小，较小的针头可能会对细胞施加压力，导致活力降低。如果针头非常大，可能会伤害动物并导致细胞从注射部位泄漏。即使对于具有正确针头尺寸的经验丰富的研究人员，注射部位也可能存在细胞泄漏，导致肿瘤小或没有肿瘤。重要的是，研究人员使用正确的肿瘤注射技术和最佳针头尺寸，以减少肿瘤细胞损失并提高肿瘤细胞植入过程中的准确性和精度。肿瘤测量应使用游标卡尺（手动或电子）仔细进行。最佳做法是与肿瘤长度和宽度测量的方向保持一致，以减少变异性。在整个研究中由同一研究人员进行肿瘤测量可以减少变异性。
正如预期的那样，接受rIL-1α的小鼠在治疗期间体重减轻，这支持先前的发现15，16。虽然减肥是评估毒性的一种简单直接的方法，但还有其他毒理学终点可以利用。评估血细胞计数（白细胞、红细胞和血小板计数）和肝酶水平（天冬氨酸转氨酶、丙氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶）可提供有关药物毒性的宝贵信息。此外，可以处死一部分小鼠，并且可以对器官（肝，肾，胰腺，肺等）进行组织病理学分析。全身炎症通常用作毒性的指标。在这里，使用18G针通过下颌下静脉穿刺药物治疗后在小鼠中分析了许多循环促炎细胞因子。对小鼠进行下颌下静脉穿刺需要来自多次重复手术的技能。如果穿刺太深，可能会导致耳朵出血和内部组织损伤。然而，如果针头穿透的距离不够远，则可能收集的血液量不足。针头的替代品是使用一次性出血采血针。市售有不同种类的出血采血柳叶刀，其长度不同。研究人员应使用合适的柳叶刀尺寸，以确保最佳的血液采集和对动物的人道待遇。对于该程序，显示了三种细胞因子的结果（图2A-C）。在rIL-1α处理的小鼠中观察到的循环促炎细胞因子（包括IL-1α，IL-1β和IFN-γ的增加可能与在该治疗组中观察到的急性体重减轻有关（图1B）。
最后，描述了小鼠肿瘤和淋巴结单细胞悬液的分离和制备方案。这种方法对于那些寻求检测由于药物治疗引起的免疫细胞活化和募集变化的人很有用。在解剖肿瘤时，应尽可能消除脂肪组织、皮肤、头发和其他碎屑。通常，肿瘤体积应大于30mm3 ，以具有足够的细胞用于流式细胞术。但是，如果肿瘤非常大，则可能难以制备单细胞悬液。大肿瘤在放入解离管之前应切成小块。该过程应快速完成，以获得最佳的活细胞。此外，大肿瘤使得在肿瘤侧找到腹股沟淋巴结变得困难。在这种情况下，可以从对面部位收集腹股沟淋巴结。一旦获得单细胞悬液，就可以用不同的抗体染色并通过多色流式细胞术进行分析。
总体而言，这些方案为研究免疫调节药物的抗肿瘤活性以及循环细胞因子和免疫细胞群的相关变化提供了一种有效的方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国优异审查奖#I01BX004829的部分支持。退伍军人事务部，生物医学实验室研究与发展服务，并通过爱荷华大学霍顿综合癌症中心获得Mezhir奖计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
References
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