Summary
En standardprotokoll er beskrevet for å studere antitumoraktiviteten og tilhørende toksisitet av IL-1α i en syngen musemodell av HNSCC.
Abstract
Cytokinbehandling er en lovende immunterapeutisk strategi som kan produsere robuste antitumorimmunresponser hos kreftpasienter. Det proinflammatoriske cytokinet interleukin-1 alfa (IL-1α) har blitt evaluert som et anticancermiddel i flere prekliniske og kliniske studier. Imidlertid har dosebegrensende toksisitet, inkludert influensalignende symptomer og hypotensjon, dempet entusiasmen for denne terapeutiske strategien. Polyanhydrid nanopartikkel (NP) -basert levering av IL-1α vil representere en effektiv tilnærming i denne sammenheng, da dette kan tillate en langsom og kontrollert frigjøring av IL-1a systemisk samtidig som toksiske bivirkninger reduseres. Her beskrives en analyse av antitumoraktiviteten til IL-1a-belastede polyanhydrid-NP i en hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) syngen musemodell. Murine orofaryngeale epitelceller som stabilt uttrykker HPV16 E6/E7 sammen med hRAS og luciferase (mEERL) celler ble injisert subkutant i høyre flanke av C57BL/6J mus. Når svulster nådde 3-4 mm i hvilken som helst retning, ble en 1,5% IL-1a - lastet 20:80 1,8-bis (p-karboksyphenoksy) -3,6-dioksaoktan: 1,6-bis (p-karboksyphenoksy) heksan (CPTEG: CPH) nanopartikkel (IL-1a-NP) formulering administrert til mus intraperitonealt. Tumorstørrelse og kroppsvekt ble kontinuerlig målt inntil tumorstørrelse eller vekttap nådde eutanasikriteriene. Blodprøver ble tatt for å evaluere antitumorimmunresponser ved submandibulær venepunktur, og inflammatoriske cytokiner ble målt gjennom cytokinmultipleksanalyser. Tumor- og lyskelymfeknuter ble resektert og homogenisert til en encellesuspensjon for å analysere ulike immunceller gjennom flerfarget flowcytometri. Disse standardmetodene vil tillate etterforskere å studere antitumorimmunresponsen og potensiell mekanisme for immunostimulerende NP og andre immunterapimidler for kreftbehandling.
Introduction
Et av de fremvoksende områdene av kreftimmunterapi er bruken av inflammatoriske cytokiner for å aktivere pasientens immunsystem mot deres tumorceller. Flere proinflammatoriske cytokiner (dvs. interferon-alfa (IFNα), interleukin-2 (IL-2) og interleukin-1 (IL-1)) kan montere signifikant antitumorimmunitet, noe som har generert interesse for å utforske antitumoregenskapene, samt sikkerheten til cytokinbaserte legemidler. Spesielt Interleukin-1 alfa (IL-1α) er et proinflammatorisk cytokin kjent som mestercytokinet av betennelse1. Siden oppdagelsen av dette cytokinet på slutten av 1970-tallet har det blitt undersøkt som et kreftmiddel samt et hematopoietisk legemiddel for å behandle de negative effektene av kjemoterapi2. I løpet av slutten av 1980-tallet ble det utført flere prekliniske og kliniske studier for å bestemme anticancer effekter av IL-1α 3,4,5,6. Disse studiene fant lovende antitumoraktivitet av rekombinant IL-1α (rIL-1α) mot melanom, nyrecellekarsinom og ovariekarsinom. Toksisitet, inkludert feber, kvalme, oppkast, influensalignende symptomer og mest alvorlig dosebegrensende hypotensjon ble imidlertid ofte observert. Dessverre dempet disse doserelaterte toksisitetene entusiasmen for videre klinisk bruk av rIL-1α.
For å forsøke å løse det kritiske problemet med IL-1a-mediert toksisitet, vil polyanhydrid nanopartikkel (NP) formuleringer som muliggjør kontrollert frigjøring av IL-1a ved overflateerosjonskinetikk bli undersøkt. Disse NP-formuleringene er ment å høste fordelene av antitumoregenskapene til IL-1α samtidig som dosebegrensende bivirkningerreduseres 7. Polyanhydrider er FDA-godkjente polymerer som nedbrytes gjennom overflateerosjon, noe som resulterer i nesten nullordens frigjøring av innkapslede midler 8,9,10,11,12. Amfifile polyanhydrid-kopolymerer som inneholder 1,8-bis-(p-karboksyphenoksy)-3,6-dioksaoktan (CPTEG) og 1,6-bis-(p-karboksyphenoksy) heksan (CPH), har blitt rapportert å være gode leveringssystemer for ulike nyttelaster i onkologi og immunologibasert forskning 8,12. I den følgende protokollen 20:80 CPTEG: CPH NP lastet med 1,5 vekt% rIL-1α (IL-1a-NP) vil bli brukt til å studere antitumoraktiviteten og toksisiteten til dette cytokinet i en musemodell av HNSCC.
Det overordnede målet med følgende prosedyrer er å vurdere antitumoraktiviteten til IL-1a-NP på HNSCCs. De beskrevne prosedyrene, inkludert vurdering av tumorvekst og overlevelse, kan brukes på ethvert immunmodulerende middel av interesse. Disse prosedyrene bør utføres i en syngen musemodell med et intakt immunsystem13 for å maksimere klinisk relevans. IL-1a-NP-toksisitet vil også bli vurdert ved å måle endringer i sirkulerende nivåer av proinflammatoriske cytokiner og dyrevekt. Det er mange metoder for å bestemme in vivo legemiddeltoksisitet; Imidlertid involverer de mest brukte metodene måling av serumenzymer for organtoksisitet og histologiske endringer i disse organene. For å utføre histologiske analyser må dyret imidlertid ofres, noe som vil påvirke forsøkets overlevelseskurver. Derfor vil denne protokollen inneholde en protokoll for innsamling av blod fra levende mus for måling av cytokiner i serumprøver. Det oppsamlede serumet kan brukes til måling av eventuelle ønskede serumanalytter for organtoksisitet. Flerfarget flowcytometri vil bli brukt til å forstå endringene i immuncellepopulasjonen i tumorens mikromiljø og immuncellemigrasjon til lymfeknuten. Andre metoder kan benyttes for å identifisere immunceller, inkludert immunhistokjemi og/eller immunfluorescens av konserverte avsnitt14. Imidlertid kan disse teknikkene være tidkrevende og kjedelige å utføre på et stort antall dyr. Samlet sett vil følgende metoder tillate etterforskere å studere antitumorimmunresponsen og potensielle mekanismer for immunostimulerende midler for kreftbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo-prosedyrene som ble brukt i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care and UseCommittee (IACUC) ved University of Iowa.
1. Forberedelse og vedlikehold av HNSCC-cellelinje
MERK: I denne studien vil murine oropharyngeal epitelcellelinje stabilt transformert med HPV E6 og E7 sammen med hRas og luciferase (mEERL) bli brukt. Denne cellelinjen ble utviklet fra C57BL/6J musestamme og var en gave fra Dr. Paola D. Vermeer (Department of Surgery, University of South Dakota Sanford School of Medicine, South Dakota, USA).
- Tine et frossent hetteglass med mEERL-celler i et forvarmet (37 °C) vannbad og overfør deretter til et 15 ml konisk rør inneholdende varmt kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] supplert med 40,5% 1:1 DMEM/Hams F12, 10% Fetal Bovine Serum [FBS], 0,1% gentamicin, 0,005% hydrokortison, 0,05% transferrin, 0,05% insulin, 0,0014% tri-jodtyronin og 0,005% epidermal vekstfaktor).
- Sentrifuger det koniske røret ved 277 x g i 5 minutter ved 25 °C for å fjerne mediet. Deretter resuspenderer cellepelleten i 3-5 ml ferske medier og overfører den til en T-25 cellekulturkolbe. For optimal utvinning fra frossen lagring, plateceller ved høy tetthet.
MERK: T-25 kolber ble brukt på grunn av deres mindre størrelse, resulterer i raskere utvinningstider fra frossen lagring når cellene er i nærheten sammenlignet med T-75 kolber. - La cellene vokse i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2, utvide til større kolber (dvs. T-75 eller T-150), og passasje hver 3. dag. Når det er nok celler til ønsket implantasjon i alle mus, fjern kolbene, kast mediet og skyll forsiktig cellene med fosfatbufret saltvann (PBS). Tilsett deretter 4 ml (hvis du bruker T150-kolber) med 0,25% trypsin-EDTA, og inkuber ved 37 ° C i 2 minutter. Skala mengden trypsin opp eller ned avhengig av parabolen / kolbestørrelsen som brukes.
MERK: Typen cellelinje og graden av konfluens kan påvirke trypsiniseringstider. Lange trypsiniseringsperioder kan skade celler, noe som resulterer i lav levedyktighet. Bruk minimumstiden som trengs for trypsinisering. - Under mikroskopet beveger de frittliggende cellene på trypsinisering seg fritt. Hvis noen celler fortsatt er festet, banker du forsiktig på kolben for å mobilisere de gjenværende adherente cellene. Tilsett nye medier (skalamengde media etter ønske) for å stoppe trypsinreaksjonen og samle cellesuspensjonen i 50 ml koniske rør. Sentrifuger ved 277 x g i 5 minutter ved 25 °C for å fjerne mediet.
- Resuspender cellene i ferske medier og tell cellene. Sentrifuge en gang til (som beskrevet ovenfor), og tilsett deretter kald PBS til cellene for å lage en endelig konsentrasjon på 10 × 106 celler / ml. Hold cellesuspensjonen(e) på is før injeksjon til mus.
2. Tumorimplantasjon, medikamentell behandling og måling
MERK: De eksperimentelle dyrene ble holdt i Animal Care Facility ved University of Iowa og fulgte passende aseptiske prosedyrer for å håndtere dem.
- Bedøv C57Bl/6J mus med ketamin (80 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) blanding. Barber forsiktig flankeområdet eller ønsket injeksjonssted med en elektrisk barberhøvel.
MERK: Husk å dokumentere bruken av kontrollerte stoffer i henhold til institusjonelle (eller andre) regler og forskrifter. - Desinfiser flankeområdet med en etanolpute og injiser langsomt 100 μL (som inneholder 1 x 106 celler) av cellesuspensjonen subkutant ved hjelp av en 25-28 G sprøyte. Bedøv musene før injeksjon for å forhindre plutselige bevegelser og celletap. Før hver injeksjon blandes cellesuspensjonen forsiktig for å hindre at cellene setter seg til bunnen av hetteglasset eller koniske røret.
- Etter å ha tatt opp cellesuspensjonen i sprøyten, fjern alle boblene og dødrommet fra toppen. Injiser cellesuspensjonen på en langsom og jevn måte. Ikke bruk samme kanyle på flere mus. Gjør alltid ekstra cellesuspensjoner for å ta hensyn til utilsiktet tap.
- Plasser dyret i deres respektive bur og overvåk dem til de kommer seg etter anestesi. Under anestesi er dyr i fare for hypotermi; Gi derfor ekstra varme eller plasser musene nær hverandre for å holde varmen (hvis de er plassert i samme bur).
- Når svulster når 3 mm i hvilken som helst retning, randomiser musene (etter tumorstørrelse og / eller vekt) i behandlingsgruppene og start deretter medikamentell behandling. Injiser musene intraperitonealt (i.p.) med NP15 som inneholder 3,75 μg rIL-1α/mus på dag 4 og 9. Mål og registrer tumorvolumet ((lengde x bredde 2) /2) og musevekten daglig eller annenhver dag til tumorstørrelsen eller musene når eutanasikriterier.
MERK: Selv med en erfaren forsker er det vanskelig å implantere samme størrelse svulst i alle mus. Randomiser dyr i eksperimentelle grupper basert på tumorstørrelse og musevekt.
3. Blodoppsamling og serumseparasjon
MERK: Blodinnsamling fra en submandibulær vene er en enkel og effektiv teknikk som tillater blodinnsamling fra bevisste dyr eller dyr under anestesi. For denne studien ble blod samlet fra dyrene når de var under anestesi.
- Bedøv musene med en injeksjon av ketamin / xylazinblanding som nevnt ovenfor.
- Ta tak i den løse huden over skulderen med den ikke-dominerende hånden og punkter venen submandibular med en 18 G nål eller lansett, litt bak kjeven (en hvit flekk på det området).
- Punkter venen for å sikre blodstrømmen umiddelbart. Samle 200-300 μL blod (avhengig av musevekt) i et 1,5 ml polypropylen mikrosentrifugerør eller serumseparatorrør. Etter blodoppsamling, bruk forsiktig trykk på stikkstedet til blødningen har stoppet. Returner musene til sine respektive bur og observer til de kommer seg fra anestesi.
MERK: Ikke samle mer enn 1% av musens kroppsvekt i en samling eller over en 24 timers periode. - La det oppsamlede blodet koagulere ved romtemperatur i 20-30 min. Legg rørene på is til de er klare til å sentrifugeres.
- Sentrifuger blodets koagulerte blod ved 1540 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Samle det øvre laget (serum) uten å forstyrre de røde blodcellene. Oppbevares ved -80 °C inntil bruk.
4. Multipleksing av oppsamlet serum
- Tine serum- eller plasmaprøvene mens du holder dem på is.
- Sentrifuger prøvene ved 1540 x g i 5 minutter ved 4 °C for å sedimentere eventuelle cellerester og samle serumlaget forsiktig fra toppen.
- Ta frem multiplekssettet ved romtemperatur.
MERK: Det finnes flere kommersielt tilgjengelige multiplekssett som er designet for spesifikke cytokiner, kjemokiner eller vekstfaktorer. Det er også mulig å tilpasse settet basert på proteinet av interesse. - Utfør analysen i henhold til produsentens protokoll for å oppdage cytokiner.
MERK: De fleste multiplekssettene bruker magnetiske perler for å binde det fangede antistoffet. Så det er viktig å bruke en automatisert eller håndholdt magnetisk vaskemaskin under vask. Ellers vil magnetkulene vaske av fra platen, og man vil ikke ha nok hendelser til å ta lesingen.
5. Innsamling av tumor og inguinal lymfeknute og forberedelse av enkeltcellesuspensjon
- Bedøv musene med ketamin / xylazinblanding. For å sikre fullstendig sedasjon, bruk pedalrefleks (fast tåklemme). Hvis musene ikke reagerer, avlive musene ved cervikal dislokasjon.
- Legg hver mus på ryggen og spray 70% etanol på mageområdets hud. Bruk tang og saks for å kutte svulsten ut fra venstre side av musene og lymfeknuten fra høyre side. Hvis svulsten er stor, kutt i små biter og ta 500-600 mg av vevet. For lymfeknudepunktet, samle hele orgelet.
MERK: Det er to lymfeknuter på begge sider av lyskeregionen. Avhengig av eksperimentelle mål kan lymfeknuten og svulsten isoleres fra samme side. Men hvis svulsten blir veldig stor, vil det ikke være lett å samle lymfeknuten fra samme side. - Plasser vevet på de respektive dissosiatorrørene som inneholder 3-5 ml RPMI-medier. Homogeniser vevet ved hjelp av en automatisert dissosiator.
MERK: Andre automatiserte eller håndholdte homogenisatorer kan brukes. - Etter homogenisering, overfør cellesuspensjonen gjennom et 70 μm filter til et 50 ml konisk rør. Sentrifuger ved 277 x g i 5 minutter ved 25 °C for å fjerne mediet. Vask og resuspender cellene i 1-2 ml kald PBS.
6. FACS-farging av encellesuspensjon
- Bruk 0,4% trypanblå farging for å telle levedyktige celler i et hemocytometer. Beregn volumet som kreves for å få 2-3 millioner celler og overfør dem til det respektive FACS-røret.
- Bruk levedyktig fargestoff til gate på levende celler; Ellers kan det oppstå uspesifikk binding av antistoffet med døde celler som kan gi et falskt positivt resultat.
MERK: Zombiefargestoff ble brukt til levende og døde cellefarging i dette eksperimentet. Flere fikserbare og ikke-fikserbare fargestoffer (f.eks. Propidiumjodid) er kommersielt tilgjengelige. - Sentrifuge (277 x g i 5 minutter ved 25 °C) de telte cellene. Dekanter supernatanten og resuspender cellene i 300 μl PBS. Tilsett 0,5-1 μL zombiefargestoff/rør. Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter i mørket.
- Sentrifuge (277 x g i 5 minutter ved 25 °C) og vask cellene med 1-2 ml FACS-buffer og resuspender dem i 200 μL FACS-buffer.
- Legg til Fc-reseptorblokker (2 μL per 200 μL eller i henhold til produsentens protokoll) og inkuber cellene i 10 minutter.
- Sentrifuge (277 x g i 5 minutter ved 25 °C) og vask cellene med 1-2 ml FACS-buffer. Tilsett antistoffcocktailen og rug i 30 minutter ved 4 °C i mørket.
- Etter inkubasjonen, sentrifuger (277 x g i 5 minutter ved 25 °C) og vask cellene med 1-2 ml FACS-buffer. Tilsett 300-400 μL 2% paraformaldehydoppløsning og resuspender for fiksering. Oppbevar cellene på dette trinnet i et par dager ved 4 ° C eller analyser umiddelbart med flerfarget flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble antitumoraktiviteten til polyanhydrid IL-1α i en syngen musemodell av HNSCC undersøkt. Rekombinant IL-1α (rIL-1α) reduserte signifikant mEERL-tumorveksten (figur 1A), selv om vekttap ble observert hos de behandlede musene, som ble gjenopprettet etter seponering av behandlingen (figur 1B). IL-1a-NP induserte ingen signifikant antitumoreffekt sammenlignet med saltvann eller blank-NP (figur 1A) og ble ledsaget av noe vekttap, men ikke så fremtredende som rIL-1α (figur 1B). Mus behandlet med rIL-1α overlevde signifikant lenger enn de andre behandlingsgruppene (figur 1C). I tillegg var sirkulerende nivåer av IL-1α, IL-1β og IFN-γ høyere i rIL-1α-behandlede mus sammenlignet med de andre behandlingsgruppene (figur 2A-C). Disse resultatene tyder på at forbedringer i IL-1a-NP med hensyn til antitumoreffekt er berettiget.
Figur 1: Effekt av rIL-1α på tumorvekst, overlevelse og kroppsvekt. Mannlige C57BL/6J-mus (n = 10-11 mus/behandlingsgruppe) med mEERL HNSCC-svulster ble behandlet i.p. på dag 1 og dag 5 med rIL-1α (3,75 μg rIL-1α), IL-1α-NP (0,25 mg NP inneholdende 3,75 μg rIL-1α), Blank-NP (0,25 mg NP) og 100 μL saltoppløsning (CON). Vist er endringer i gjennomsnittlig tumorvolum (A), normalisert kroppsvekt (B) og overlevelseskurver (C). Feilfelt representerer standardfeilen til gjennomsnittet. *p < 0,05 versus andre behandlingsgrupper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekt av rIL-1α på sirkulerende cytokiner. Blodprøver ble samlet inn fra en undergruppe av mus (n = 4 mus / behandlingsgruppe) etter den andre legemiddeladministrasjonen og analysert for sirkulerende cytokinnivåer ved multipleksanalyse. Vist er sirkulerende nivåer av IL-1α (A), IL-1β (B) og IFN-γ (C). Feilfelt representerer standardfeilen til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen vil tillate enhver etterforsker å studere antitumoraktiviteten og noen av de underliggende mekanismene til immunmodulerende legemidler i et in vivo tumormusemodellsystem. Her ble det brukt en syngen subkutan tumormodell, som har flere fordeler i forhold til ortotopiske modeller, inkludert den teknisk enkle protokollen, enkel overvåking av tumorvekst, mindre dyresykelighet og høyere produserbarhet. Subkutane tumormodeller kan også modifiseres til en bilateral tumormodell ved å injisere tumorceller på både venstre og høyre flanke. I denne bilaterale tumormodellen kan strålebehandling eller legemidler administreres til en svulst intratumoralt, og abskopiale responser kan overvåkes. Ortotopiske HNSCC-musemodeller, mens de er mer klinisk relevante, er teknisk utfordrende å generere, vanskelig å overvåke tumorvekst, og tumorbelastningen i munnhulen resulterer ofte i for tidlig eutanasi på grunn av musens manglende evne til å spise og drikke.
Fremstillingen av celler er et viktig skritt for dannelsen av symmetriske og lignende store svulster i alle mus. Dårlig forberedelse av celler resulterer i redusert celle levedyktighet og påvirker i stor grad tumorgenerering hos mus. Tumorcellene anbefales å være i et tidlig passasjenummer og innenfor 80% -90% konfluens. Høyere passasjenummer og konfluens påvirker cellens levedyktighet og dermed tumorgenerering. Celler bør også injiseres så snart etter tilberedning som mulig, siden levedyktigheten reduseres hvis den oppbevares i PBS utover 20-30 min. Hvis et stort antall mus må implanteres med svulster, anbefales det å lage en stamløsning av celler som holdes i media og forberede injiserbare cellesuspensjoner i PBS for en mindre gruppe dyr.
Det er flere kritiske trinn i protokollen som må opprettholdes nøye etter klargjøring av tumorceller til injeksjon. Injisering av tumorceller til det subdermale rommet kan produsere forskjellige tumorvekstmønstre og størrelser sammenlignet med det subkutane rommet. Derfor bør det legges stor vekt på nålplassering for konsistent tumordannelse. Nålvalg er også viktig. Hvis nålen er mindre enn kreftcellen, kan mindre nåler stresse cellene som resulterer i mindre levedyktighet. Hvis nålen er veldig stor, kan den skade dyret og føre til cellelekkasje fra det injiserte stedet. Selv for erfarne forskere med riktig nålstørrelse, kan det være cellelekkasje på det injiserte stedet, noe som resulterer i en liten eller ingen svulst. Det er viktig at forskere bruker riktig teknikk for tumorinjeksjon og optimal nålstørrelse for å redusere tumorcelletap og øke nøyaktigheten og presisjonen under tumorcelleimplantasjon. Tumormålinger bør gjøres nøye ved hjelp av Vernier calipers (manuell eller elektronisk). Den beste praksis er å være konsistent med retningen av tumorlengde og breddemåling for å redusere variabiliteten. Tumormåling av samme forsker gjennom hele studien kan redusere variabiliteten.
Som forventet gikk mus som fikk rIL-1α ned i vekt under behandlingen, noe som støtter tidligere funn15,16. Selv om vekttap er en enkel og grei måte å vurdere toksisitet på, er det andre toksikologiske endepunkter som kan benyttes. Vurdering av blodlegemer (hvite blodlegemer, røde blodlegemer og blodplatetall) og leverenzymnivåer (aspartattransaminase, alaninaminotransferase og alkalisk fosfatase) gir verdifull informasjon om legemiddeltoksisitet. I tillegg kan en delmengde av mus ofres, og histopatologisk analyse av organer (lever, nyrer, bukspyttkjertel, lunge, etc.) kan utføres. Systemisk betennelse brukes ofte som en indikator på toksisitet. Her ble en rekke sirkulerende proinflammatoriske cytokiner analysert i musene etter medikamentell behandling ved submandibulær venepunktur ved bruk av en 18 G nål. Submandibulær venepunktur på mus krever en ferdighet som kommer fra mange repetisjoner av prosedyren. Hvis punkteringen er for dyp, kan det føre til blødning fra øret og indre vevskader. Mens, hvis nålen ikke penetreres langt nok, kan en utilstrekkelig mengde blod samles opp. Alternativer til nåler er bruk av engangsblødende lansetter. Det finnes forskjellige typer blødende lansett som er kommersielt tilgjengelige som varierer i lengden. Forskeren bør bruke en egnet lansettstørrelse for å sikre optimal blodinnsamling og human behandling av dyr. For denne prosedyren vises resultater for tre cytokiner (figur 2A-C). Det er sannsynlig at en økning i sirkulerende proinflammatoriske cytokiner, inkludert IL-1α, IL-1β og IFN-γ observert hos rIL-1α-behandlede mus, kan være assosiert med akutt vekttap (figur 1B) observert i denne behandlingsgruppen.
Til slutt beskrives en protokoll for isolering og fremstilling av enkeltcellede suspensjoner av mustumor og lymfeknuter. Denne metoden er nyttig for de som søker å oppdage endringer i immuncelleaktivering og rekruttering på grunn av medikamentell behandling. Under disseksjon av svulster bør fettvev, hud, hår og annet rusk elimineres så mye som mulig. Vanligvis bør tumorvolumet være større enn 30 mm3 for å ha nok celler til flowcytometri. Men hvis svulsten er veldig stor, kan det være vanskelig å forberede enkeltcellesuspensjoner. Store svulster skal kuttes i små biter før de plasseres i dissosiatorrøret. Prosessen bør gjøres raskt for å få optimale levedyktige celler. I tillegg gjør store svulster det vanskelig å finne lyskelymfeknuten på tumorsiden. I dette tilfellet kan inguinal lymfeknude hentes fra motsatt sted. Når enkeltcellesuspensjoner er oppnådd, kan de farges med forskjellige antistoffer og analyseres ved flerfarget flowcytometri.
Samlet sett gir disse protokollene en effektiv måte å studere antitumoraktiviteten til immunmodulerende legemidler, og de tilhørende endringene i sirkulerende cytokiner og immuncellepopulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av Merit Review Award #I01BX004829 fra USA Department of Veterans Affairs, Biomedical Laboratory Research and Development Service og støttet av Mezhir Award Program gjennom Holden Comprehensive Cancer Center ved University of Iowa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
References
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
