Summary
HNSCCの同系マウスモデルにおけるIL-1αの抗腫瘍活性および関連する毒性を研究するための標準プロトコルが記載されている。
Abstract
サイトカイン療法は、がん患者に強力な抗腫瘍免疫応答を生み出すことができる有望な免疫療法戦略です。炎症誘発性サイトカインインターロイキン-1アルファ(IL-1α)は、いくつかの前臨床および臨床試験で抗がん剤として評価されています。しかし、インフルエンザのような症状や低血圧などの用量制限毒性は、この治療戦略への熱意を弱めています。IL-1αのポリ無水物ナノ粒子(NP)ベースの送達は、毒性副作用を低減しながら全身的にIL-1αのゆっくりと制御された放出を可能にする可能性があるため、この文脈では効果的なアプローチを表します。ここでは、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)同系マウスモデルにおけるIL-1α担持ポリ無水物NPsの抗腫瘍活性の解析について説明する。HPV16 E6/E7をhRASおよびルシフェラーゼ(mEERL)細胞とともに安定発現するマウス中咽頭上皮細胞をC57BL/6Jマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が任意の方向に3〜4 mmに達したら、1.5%IL-1aを装填した20:80の1,8-ビス(p-カルボキシフェノキシ)-3,6-ジオキサオクタン:1,6-ビス(p-カルボキシフェノキシ)ヘキサン(CPTEG:CPH)ナノ粒子(IL-1α-NP)製剤をマウス腹腔内投与しました。腫瘍の大きさおよび体重は、腫瘍の大きさまたは体重減少が安楽死基準に達するまで連続的に測定された。血液サンプルを採取して顎下静脈穿刺による抗腫瘍免疫応答を評価し、炎症性サイトカインをサイトカインマルチプレックスアッセイで測定しました。腫瘍と鼠径リンパ節を切除し、単一細胞懸濁液にホモジナイズして、マルチカラーフローサイトメトリーでさまざまな免疫細胞を分析しました。これらの標準的な方法により、研究者は抗腫瘍免疫応答と免疫刺激NPの潜在的なメカニズムを研究することができます 癌治療のための他の免疫療法剤。
Introduction
がん免疫療法の新たな分野の1つは、炎症性サイトカインを使用して、腫瘍細胞に対する患者の免疫系を活性化することです。いくつかの炎症誘発性サイトカイン(すなわち、インターフェロンアルファ(IFNα)、インターロイキン-2(IL-2)、およびインターロイキン-1(IL-1))は、重要な抗腫瘍免疫をマウントすることができ、サイトカインベースの薬物の抗腫瘍特性と安全性の探求に関心が寄せられています。特にインターロイキン-1α(IL-1α)は、炎症のマスターサイトカイン1として知られる炎症誘発性サイトカインである。1970年代後半にこのサイトカインが発見されて以来、化学療法の副作用を治療するための造血薬としてだけでなく、抗癌剤としても研究されてきました2。1980年代後半に、IL-1α 3,4,5,6の抗癌効果を決定するために、いくつかの前臨床および臨床試験が実施されました。これらの研究では、メラノーマ、腎細胞がん、および卵巣がんに対する組換えIL-1α(rIL-1α)の有望な抗腫瘍活性が見つかりました。ただし、発熱、吐き気、 ?? 吐、インフルエンザ様症状、および最も深刻な用量制限低血圧などの毒性が一般的に観察されました。.残念ながら、これらの用量関連毒性は、rIL-1αのさらなる臨床使用への熱意を弱めました。
IL-1α媒介毒性の重要な問題に対処するために、 表面侵食速度論によるIL-1αの制御放出を可能にするポリ無水物ナノ粒子(NP)製剤が調査されます。これらのNP製剤は、用量制限副作用を低減しながらIL−1αの抗腫瘍特性の利益を享受することを意図している7。ポリ無水物はFDA承認のポリマーであり、表面侵食によって分解し、カプセル化された薬剤のほぼゼロ次放出をもたらします8、9、10、11、12。1,8-ビス-(p-カルボキシフェノキシ)-3,6-ジオキサオクタン(CPTEG)および1,6-ビス-(p-カルボキシフェノキシ)ヘキサン(CPH)を含む両親媒性ポリ無水物コポリマーは、腫瘍学および免疫学に基づく研究において、さまざまなペイロードの優れた送達システムであると報告されています8,12。次のプロトコル20:80では、1.5重量%のrIL-1α(IL-1α-NP)を搭載したCPTEG:CPH NPを使用して、このサイトカインの抗腫瘍活性と毒性を研究します HNSCCのマウスモデル。
以下の手順の全体的な目標は、HNSCCに対するIL-1α-NPの抗腫瘍活性を評価することです。記載された手順は、腫瘍の成長および生存を評価することを含む、関心のある任意の免疫調節剤に適用することができる。これらの手順は、臨床的関連性を最大化するために、無傷の免疫系13 を有する同系マウスモデルにおいて実施されるべきである。IL-1α-NP毒性は、炎症誘発性サイトカインの循環レベルと動物の体重の変化を測定することによっても評価されます。 in vivo 薬物毒性を決定する方法はたくさんあります。しかしながら、最も広く使用されている方法は、それらの器官における器官毒性および組織学的変化についての血清酵素の測定を含む。しかしながら、組織学的分析を行うには、動物を犠牲にする必要があり、それは実験の生存曲線に影響を与えるであろう。したがって、このプロトコルは、血清サンプル中のサイトカインの測定のための生きたマウスからの血液の収集のためのプロトコルを含むであろう。収集された血清は、臓器毒性に関する任意の所望の血清分析物の測定に使用することができる。マルチカラーフローサイトメトリーは、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の変化とリンパ節への免疫細胞の移動を理解するために使用されます。免疫組織化学および/または保存された切片の免疫蛍光を含む他の方法を利用して免疫細胞を同定することができる14。ただし、これらの手法は、多数の動物で実行するには時間がかかり、面倒な場合があります。全体として、以下の方法により、研究者は抗腫瘍免疫応答と潜在的なメカニズムを研究することができます 癌治療のための免疫刺激剤。
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Protocol
この研究で使用されたすべての in vivo 手順は、アイオワ大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. HNSCC細胞株の調製と維持
注:この研究では、マウス中咽頭上皮細胞株がHPV E6およびE7で安定して形質転換されました hRasおよびルシフェラーゼ(mEERL)が使用されます。この細胞株は、C57BL/6Jマウス系統から開発されたもので、Paola D. Vermeer博士(米国サウスダコタ州サウスダコタ大学サンフォード医学部外科)からの贈り物でした。
- mEERL細胞の凍結バイアルを予熱した(37°C)ウォーターバスで解凍し、温かい培養培地(40.5%1:1 DMEM/Hams F12、10%ウシ胎児血清[FBS]、0.1%ゲンタマイシン、0.005%ヒドロコルチゾン、0.05%トランスフェリン、0.05%インスリン、0.0014%トリヨードチロニン、および0.005%上皮成長因子を添加したダルベッコ改変イーグル培地[DMEM])に移します。
- コニカルチューブを277 x g で25°Cで5分間遠心分離し、培地を除去します。次に、細胞ペレットを3〜5 mLの新鮮な培地に再懸濁し、T-25細胞培養フラスコに移します。凍結保存からの最適な回収のために、高密度で細胞をプレートします。
注:T-25フラスコはサイズが小さいため使用され、T-75フラスコと比較して細胞が近接している場合の凍結保存からの回復時間が短縮されます。 - 細胞を37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内で増殖させ、より大きなフラスコ(すなわち、T-75またはT-150)に増殖させ、3日ごとに継代させる。すべてのマウスに所望の移植に十分な細胞があるら、フラスコを取り出し、培地を廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかにすすぎます。次に、4 mL(T150フラスコを使用する場合)の0.25%トリプシン-EDTAを加え、37°Cで2分間インキュベートします。使用する皿/フラスコのサイズに応じて、トリプシンの量を増減します。
注:細胞株の種類とコンフルエンシーの程度は、トリプシン処理時間に影響を与える可能性があります。トリプシン処理期間が長いと、細胞に損傷を与え、生存率が低下する可能性があります。トリプシン処理に必要な最小限の時間を使用してください。 - 顕微鏡下では、トリプシン処理で剥離した細胞は自由に動く。一部の細胞がまだ付着している場合は、フラスコを非常に軽くたたいて、残りの付着細胞を動員します。新しい培地(必要に応じて培地の量を増やす)を加えてトリプシン反応を停止し、細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに回収します。277 x g で25°Cで5分間遠心分離し、培地を除去します。
- 細胞を新鮮な培地に再懸濁し、細胞をカウントします。(上記のように)もう一度遠心分離し、次に細胞に冷PBSを加えて、最終濃度を10×106 細胞/ mLにします。マウスに注射する前に、細胞懸濁液を氷上に保ちます。.
2. 腫瘍移植、薬物治療、測定
注:実験動物はアイオワ大学の動物飼育施設に保管され、適切な無菌手順に従って取り扱われました。
- C57Bl/6Jマウスをケタミン(80 mg/kg)とキシラジン(10 mg/kg)を混合して麻酔します。電気かみそりで側面領域または目的の注射部位を慎重に剃ります。
注意: 制度(またはその他の)規則や規制で要求されている規制物質の使用を文書化することを忘れないでください。 - エタノールパッドで脇腹領域を消毒し、25〜28Gのシリンジを使用して100μL(1 x 106 細胞を含む)の細胞懸濁液を皮下にゆっくりと注入する。突然の動きや細胞の損失を防ぐために、注射前にマウスを麻酔します。各注射の前に、細胞懸濁液を穏やかに混合して、細胞がバイアルまたはコニカルチューブの底に沈降するのを防ぎます。
- 細胞懸濁液をシリンジに取り込んだ後、上部からすべての気泡とデッドスペースを取り除きます。細胞懸濁液をゆっくりと着実に注入します。複数のマウスで同じ針を使用しないでください。偶発的な損失を考慮して、常に追加のセル懸濁液を作成してください。
- 動物をそれぞれのケージに入れ、麻酔から回復するまで監視します。麻酔中、動物は低体温のリスクがあります。したがって、補助的な熱を提供するか、マウスを互いに近づけて保温します(同じケージに収容されている場合)。
- 腫瘍が任意の方向に3 mmに達したら、治療群のマウスを(腫瘍のサイズおよび/または体重によって)ランダム化し、薬物治療を開始します。4日目と9日目に、3.75 μgのrIL-1α /マウスを含むNP15 をマウスの腹腔内(i.p.)に注射します。腫瘍の大きさまたはマウスが安楽死基準に達するまで、腫瘍体積((長さx幅2)/ 2)およびマウス体重を毎日または隔日で測定および記録する。
注:経験豊富な研究者でも、すべてのマウスに同じサイズの腫瘍を移植することは困難です。腫瘍のサイズとマウスの体重に基づいて動物を実験グループにランダム化します。
3.採血と血清分離
注:顎下静脈からの採血は、意識のある動物や麻酔下の動物からの採血を可能にする簡単で効果的な技術です。この研究では、動物が麻酔下にあるときに動物から血液を採取しました。
- 上記のようにケタミン/キシラジン混合物の注射でマウスを麻酔します。
- 利き手ではない手を使用して肩の上の緩んだ皮膚をつかみ、下顎骨の少し後ろにある18 Gの針またはランセットで顎下静脈に穴を開けます(その領域の白い斑点)。
- すぐに血流を確保するために静脈を穿刺します。200〜300 μLの血液(マウスの体重によって異なります)を1.5 mLのポリプロピレン製マイクロ遠心チューブまたは血清分離チューブに収集します。採血後、出血が止まるまで穿刺部位に穏やかな圧力をかけます。マウスをそれぞれのケージに戻し、麻酔から回復するまで観察します。
注意: 1回の収集または24時間にわたってマウスの体重の24%を超えて収集しないでください。 - 集めた血栓を室温で20〜30分間放置します。遠心分離の準備ができるまでチューブを氷の上に置きます。
- 凝固した血液を1540 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
- 赤血球を乱すことなく上層(血清)を収集します。使用するまで-80°Cで保存してください。
4. 採取した血清の多重化
- 血清または血漿サンプルを氷上に保ちながら解凍します。
- サンプルを1540 x g で4°Cで5分間遠心分離して細胞破片を沈降させ、上から血清層を注意深く収集します。
- マルチプレックスキットを室温で取り出します。
注:特定のサイトカイン、ケモカイン、または成長因子用に設計された市販のマルチプレックスキットがいくつかあります。また、目的のタンパク質に基づいてキットをカスタマイズすることができる。 - サイトカインを検出するために、製造元のプロトコルに従ってアッセイを実行します。
注:ほとんどのマルチプレックスキットは、磁気ビーズを使用して捕捉された抗体に結合します。したがって、洗浄中は自動またはハンドヘルド磁気洗浄機を使用することが不可欠です。そうしないと、磁気ビーズがプレートから洗い流され、読み取りを行うのに十分なイベントがなくなります。
5.腫瘍および鼠径リンパ節の採取と単一細胞懸濁液の調製
- ケタミン/キシラジン混合物でマウスを麻酔します。完全な鎮静を確実にするために、ペダル反射(しっかりしたつま先のつまみ)を使用してください。マウスが反応しない場合は、頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。
- 各マウスを仰向けに置き、腹部の皮膚に70%エタノールをスプレーします。鉗子とハサミを使用して、マウスの左側から腫瘍を切り取り、右側からリンパ節を切り取ります。腫瘍が大きい場合は、細かく切って500〜600 mgの組織を取ります。リンパ節の場合は、臓器全体を集めます。
注:鼠径部の両側に2つのリンパ節があります。実験目標に応じて、リンパ節と腫瘍を同じ側から分離することができます。しかし、腫瘍が非常に大きくなると、同じ側からリンパ節を採取することは容易ではなくなります。 - 3〜5mLのRPMI培地を含むそれぞれの解離管に組織を置きます。自動解離器を使用して組織を均質化します。
注意: 他の自動またはハンドヘルドホモジナイザーを使用できます。 - ホモジナイズ後、細胞懸濁液を70 μmのフィルターを通して50 mLのコニカルチューブに移します。277 x g で25°Cで5分間遠心分離し、培地を除去します。細胞を洗浄し、1〜2 mLの冷たいPBSに再懸濁します。
6. 単一細胞懸濁液のFACS染色
- 0.4%トリパンブルー染色を使用して、血球計算盤で生細胞をカウントします。2〜300万個のセルを取得するために必要な体積を計算し、それらをそれぞれのFACSチューブに移します。
- 生細胞をゲートするために生存率色素を使用します。そうしないと、抗体と死細胞との非特異的結合が起こり、偽陽性の結果をもたらす可能性があります。
注:この実験では、生細胞と死細胞の染色にゾンビ色素を使用しました。いくつかの固定可能および非固定可能な色素(例えば、ヨウ化プロピジウム)が市販されている。 - 遠心分離機(277 x g で25°Cで5分間)で細胞を計数した。上清をデカントし、細胞を300 μLのPBSに再懸濁します。0.5〜1μLのゾンビ染料/チューブを追加します。暗所で20分間室温でインキュベートします。
- 遠心分離機(277 x g 、25°Cで5分間)し、細胞を1〜2 mLのFACSバッファーで洗浄し、200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
- Fc受容体遮断薬(200 μLあたり2 μL、またはメーカーのプロトコルに従って)を追加し、細胞を10分間インキュベートします。
- 遠心分離機(277 x g で25°Cで5分間)し、1〜2 mLのFACSバッファーで細胞を洗浄します。抗体カクテルを加え、暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
- インキュベーション後、遠心分離(277 x g で25°Cで5分間)し、1〜2 mLのFACSバッファーで細胞を洗浄します。300〜400μLの2%パラホルムアルデヒド溶液を加え、固定のために再懸濁します。このステップで細胞を4°Cで数日間保存するか、マルチカラーフローサイトメーターですぐに分析します。
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Representative Results
本研究では、HNSCCの同系マウスモデルにおけるポリ無水物IL-1αの抗腫瘍活性を調べた。組換えIL−1α(rIL−1α)は、mEERL腫瘍増殖を有意に減速させたが(図1A)、処置マウスでは体重減少が観察されたが、これは処置離脱後に回復した(図1B)。IL-1α-NPは、生理食塩水またはブランクNPと比較して有意な抗腫瘍効果を誘導せず(図1A)、rIL-1αほど顕著ではありませんが、いくらかの体重減少を伴いました(図1B)。rIL-1αで処置されたマウスは、他の処置群よりも有意に長く生存した(図1C)。さらに、IL-1α、IL-1β、およびIFN-γの循環レベルは、他の治療群と比較してrIL-1α治療マウスで高かった(図2A-C)。これらの結果は、抗腫瘍効果に関するIL-1α-NPの改善が必要であることを示唆しています。
図1:腫瘍の成長、生存、および体重に対するrIL-1αの影響。 mEERL HNSCC腫瘍を有する雄C57BL/6Jマウス(n = 10-11匹/治療群)を、1日目および5日目にrIL-1α(3.75μgのrIL-1α)、IL-1α-NP(3.75μgのrIL-1αを含む0.25mgのNP)、ブランクNP(0.25mgのNP)、および100μLの生理食塩水(CON)でi.p.治療した。平均腫瘍体積(A)、正規化体重(B)、および生存曲線(C)の変化が示されています。エラーバーは平均の標準誤差を表します。*p < 0.05 対他の治療群。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:循環サイトカインに対するrIL-1αの影響。 2回目の薬物投与後にマウスのサブセット(n = 4匹/治療群)から血液サンプルを採取し、マルチプレックスアッセイによって循環サイトカインレベルを分析しました。IL-1α(A)、IL-1β(B)、およびIFN-γ(C)の循環レベルを示す。エラーバーは平均の標準誤差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルにより、研究者は抗腫瘍活性と免疫調節薬の根底にあるメカニズムのいくつかを研究することができます in vivo 腫瘍マウスモデルシステム。ここでは、同系皮下腫瘍モデルが使用されましたが、これは、技術的に簡単なプロトコル、腫瘍増殖の容易なモニタリング、動物の罹患率の低下、およびより高い産生性を含む、同所性モデルに比べていくつかの利点を有する。皮下腫瘍モデルは、左右両側に腫瘍細胞を注入することにより、両側性腫瘍モデルに改変することもできる。この両側性腫瘍モデルでは、放射線療法または薬物を腫瘍内の1つの腫瘍に投与することができ、アブスコパル応答をモニターすることができる。同所性HNSCCマウスモデルは、より臨床的に関連性があるが、技術的に生成が難しく、腫瘍の成長を監視することが困難であり、口腔内の腫瘍量は、マウスが飲食することができないために早期安楽死をもたらすことが多い。
細胞の調製は、すべてのマウスにおいて対称的で類似したサイズの腫瘍を形成するための重要なステップである。細胞の調製が不十分な場合、細胞の生存率が低下し、マウスの腫瘍発生に大きく影響します。腫瘍細胞は、早期の継代数で80%〜90%のコンフルエント以内にあることが推奨されます。継代数とコンフルエンシーが高いほど、細胞の生存率に影響を与え、したがって腫瘍の生成に影響を与えます。細胞はまた、20〜30分を超えてPBSに保持すると生存率が低下するため、調製後できるだけ早く注入する必要があります。多数のマウスに腫瘍を移植する必要がある場合は、培地に保持された細胞のストック溶液を作製し、より小さな動物群のためにPBS中で注射可能な細胞懸濁液を調製することが推奨される。
プロトコルには、注射用の腫瘍細胞を準備した後に注意深く維持する必要があるいくつかの重要なステップがあります。皮下腔に腫瘍細胞を注入すると、皮下腔と比較して異なる腫瘍増殖パターンおよびサイズが生じる可能性がある。したがって、一貫した腫瘍形成のために針の配置に細心の注意を払う必要があります。針の選択も重要です。針が癌細胞よりも小さい場合、針が小さいと細胞にストレスがかかり、生存率が低下する可能性があります。針が非常に大きい場合、動物を傷つけ、注射部位から細胞が漏れる可能性があります。正しい針のサイズを持つ経験豊富な研究者であっても、注入部位に細胞漏れがあり、腫瘍が小さいかまったくない可能性があります。腫瘍細胞の損失を減らし、腫瘍細胞の移植中の精度と精度を高めるために、研究者が腫瘍注入と最適な針サイズに正しい技術を使用することが重要です。腫瘍の測定は、ノギス(手動または電子)を使用して慎重に行う必要があります。ベストプラクティスは、変動性を減らすために、腫瘍の長さと幅の測定の方向と一貫性を保つことです。研究全体を通して同じ研究者による腫瘍測定は、変動性を減らすことができます。
予想通り、rIL-1αを投与されたマウスは治療中に体重が減少し、これは以前の知見を支持している15,16。減量は毒性を評価するためのシンプルで簡単な方法ですが、利用できる他の毒物学的エンドポイントがあります。血球数(白血球、赤血球、血小板数)と肝酵素レベル(アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)の評価は、薬物毒性に関する貴重な情報を提供します。さらに、マウスのサブセットを屠殺することができ、臓器(肝臓、腎臓、膵臓、肺など)の組織病理学的分析を行うことができます。全身性炎症はしばしば毒性の指標として使用されます。ここでは、18G針を用いた顎下静脈穿刺による薬物治療後のマウスにおいて、多数の循環炎症誘発性サイトカインを分析した。マウスの顎下静脈穿刺には、手順の多くの繰り返しから来るスキルが必要です。穿刺が深すぎると、耳からの出血や内部組織の損傷を引き起こす可能性があります。一方、針が十分に貫通されていない場合、不十分な量の血液が収集される可能性があります。針に代わるものは、使い捨ての出血ランセットの使用です。市販されている出血ランセットには、長さが異なるさまざまな種類があります。研究者は、動物の最適な採血と人道的な治療を確実にするために、適切なランセットサイズを使用する必要があります。この手順について、3つのサイトカインについての結果を示す(図2A〜C)。rIL-1α治療マウスで観察されたIL-1α、IL-1β、およびIFN-γを含む循環炎症誘発性サイトカインの増加は、この治療群で観察された急性体重減少と関連している可能性があります(図1B)。
最後に、マウス腫瘍およびリンパ節の単一細胞懸濁液の単離および調製のためのプロトコルが記載されている。この方法は、薬物治療による免疫細胞の活性化と動員の変化を検出しようとする人にとって有用です。腫瘍の解剖中は、脂肪組織、皮膚、髪の毛、その他の破片をできるだけ除去する必要があります。通常、腫瘍体積は、フローサイトメトリーに十分な細胞を有するために30mm3より大きくなければならない。しかしながら、腫瘍が非常に大きい場合、単一細胞懸濁液を調製することは困難であり得る。大きな腫瘍は、解離管に入れる前に細かく切る必要があります。このプロセスは、最適な生細胞を得るために迅速に行われるべきです。さらに、大きな腫瘍は腫瘍側の鼠径リンパ節を見つけることを困難にします。この場合、鼠径リンパ節は反対側の部位から採取することができる。シングルセル懸濁液が得られたら、それらを異なる抗体で染色し、マルチカラーフローサイトメトリーで分析することができます。
全体として、これらのプロトコルは、免疫調節薬の抗腫瘍活性、および循環サイトカインと免疫細胞集団の関連する変化を研究するための効果的な方法を提供します。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、米国(米国)のメリットレビュー賞#I01BX004829によって部分的にサポートされました。退役軍人省、生物医学研究所研究開発サービス、アイオワ大学のホールデン総合がんセンターを通じたメジール賞プログラムの支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
References
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