Summary
HNSCC'nin sinjenik fare modelinde IL-1α'nın antitümör aktivitesini ve ilişkili toksisitesini incelemek için standart bir protokol tanımlanmıştır.
Abstract
Sitokin tedavisi, kanser hastalarında sağlam antitümör immün yanıtları üretebilen umut verici bir immünoterapötik stratejidir. Proinflamatuar sitokin interlökin-1 alfa (IL-1α) birçok preklinik ve klinik çalışmada antikanser ajanı olarak değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, grip benzeri semptomlar ve hipotansiyon da dahil olmak üzere doz sınırlayıcı toksisiteler, bu terapötik stratejiye olan coşkuyu azaltmıştır. IL-1α'nın polianhidrit nanopartikül (NP) bazlı verilmesi, bu bağlamda etkili bir yaklaşımı temsil edecektir, çünkü bu, toksik yan etkileri azaltırken IL-1α'nın sistemik olarak yavaş ve kontrollü bir şekilde salınmasına izin verebilir. Burada, IL-1α yüklü polianhidrit NP'lerin baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC) sinjenik fare modelindeki antitümör aktivitesinin bir analizi açıklanmaktadır. HPV16 E6/E7'yi kararlı bir şekilde eksprese eden murin orofaringeal epitel hücreleri, hRAS ve lusiferaz (mEERL) hücreleri ile birlikte C57BL/6J farelerinin sağ kanadına deri altından enjekte edildi. Tümörler herhangi bir yönde 3-4 mm'ye ulaştığında, farelere intraperitoneal olarak %1,5 IL-1a - yüklü 20:80 1,8-bis (p-karboksifenoksi)-3,6-dioksaoktan:1,6-bis(p-karboksifenoksi)hekzan (CPTEG: CPH) nanopartikül (IL-1α-NP) formülasyonu uygulandı. Tümör boyutu ve vücut ağırlığı, tümör boyutu veya kilo kaybı ötenazi kriterlerine ulaşana kadar sürekli olarak ölçüldü. Submandibuler venipunktur ile antitümör immün yanıtları değerlendirmek için kan örnekleri alındı ve sitokin multipleks tahlilleri ile inflamatuar sitokinler ölçüldü. Tümör ve inguinal lenf nodları rezeke edildi ve çok renkli akış sitometrisi ile çeşitli immün hücreleri analiz etmek için tek hücreli bir süspansiyona homojenize edildi. Bu standart yöntemler, araştırmacıların antitümör immün yanıtını ve immünostimülatör NP'lerin ve kanser tedavisi için diğer immünoterapi ajanlarının potansiyel mekanizmasını incelemelerine izin verecektir.
Introduction
Kanser immünoterapisinin ortaya çıkan alanlarından biri, hastaların bağışıklık sistemini tümör hücrelerine karşı aktive etmek için enflamatuar sitokinlerin kullanılmasıdır. Birkaç proinflamatuar sitokin (yani, interferon-alfa (IFNa), interlökin-2 (IL-2) ve interlökin-1 (IL-1)), antitümör özelliklerin yanı sıra sitokin bazlı ilaçların güvenliğini keşfetmeye ilgi duyan önemli antitümör bağışıklığı oluşturabilir. Özellikle interlökin-1 alfa (IL-1α), inflamasyonun ana sitokini olarak bilinen proinflamatuar bir sitokindir1. 1970'lerin sonlarında bu sitokinin keşfinden bu yana, kemoterapinin olumsuz etkilerini tedavi etmek için bir antikanser ajanı ve hematopoetik bir ilaç olarak araştırılmıştır2. 1980'lerin sonlarında, IL-1α 3,4,5,6'nın antikanser etkilerini belirlemek için çeşitli klinik öncesi ve klinik çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalar, melanom, renal hücreli karsinom ve yumurtalık karsinomuna karşı rekombinant IL-1α'nın (rIL-1α) umut verici antitümör aktivitesini bulmuştur. Bununla birlikte, ateş, bulantı, kusma, grip benzeri semptomlar ve en ciddi doz sınırlayıcı hipotansiyon gibi toksisiteler yaygın olarak gözlenmiştir. Ne yazık ki, dozla ilişkili bu toksisiteler, rIL-1α'nın daha ileri klinik kullanımı için coşkuyu azaltmıştır.
IL-1α aracılı toksisitelerin kritik sorununu ele almaya çalışmak için, IL-1α'nın yüzey erozyon kinetiği ile kontrollü salınımına izin veren polianhidrit nanopartikül (NP) formülasyonları araştırılacaktır. Bu NP formülasyonları, IL-1α'nın antitümör özelliklerinin faydalarını elde etmeyi ve doz sınırlayıcı yan etkileri azaltmayı amaçlamaktadır7. Polianhidritler, yüzey erozyonu yoluyla parçalanan ve kapsüllenmiş ajanların 8,9,10,11,12 oranında neredeyse sıfır dereceli salınımına neden olan FDA onaylı polimerlerdir. 1,8-bis-(p-karboksifenoksi)-3,6-dioksaoktan (CPTEG) ve 1,6-bis-(p-karboksifenoksi) hekzan (CPH) içeren amfifilik polianhidrit kopolimerlerinin, onkoloji ve immünoloji temelli araştırmalarda çeşitli yükler için mükemmel dağıtım sistemleri olduğu bildirilmiştir 8,12. Aşağıdaki protokolde 20:80 CPTEG:Ağırlıkça% 1.5 rIL-1α (IL-1α-NP'ler) ile yüklü CPH NP'ler, HNSCC'nin bir fare modelinde bu sitokinin antitümör aktivitesini ve toksisitesini incelemek için kullanılacaktır.
Aşağıdaki prosedürlerin genel amacı, IL-1α-NP'lerin HNSCC'ler üzerindeki antitümör aktivitesini değerlendirmektir. Tümör büyümesinin ve sağkalımının değerlendirilmesi de dahil olmak üzere tarif edilen prosedürler, ilgilenilen herhangi bir immün modülatör ajana uygulanabilir. Bu prosedürler, klinik alaka düzeyini en üst düzeye çıkarmak için sağlam bir bağışıklık sistemi13 olan sinjenik bir fare modelinde yapılmalıdır. IL-1α-NP toksisitesi, dolaşımdaki proinflamatuar sitokin seviyelerindeki ve hayvan ağırlığındaki değişiklikleri ölçerek de değerlendirilecektir. İn vivo ilaç toksisitesini belirlemek için birçok yöntem vardır; Bununla birlikte, en yaygın kullanılan yöntemler, serum enzimlerinin organ toksisitesi ve bu organlardaki histolojik değişiklikler açısından ölçülmesini içerir. Bununla birlikte, histolojik analizler yapmak için, hayvanın kurban edilmesi gerekir, bu da deneyin hayatta kalma eğrilerini etkileyecektir. Bu nedenle, bu protokol, serum örneklerinde sitokinlerin ölçümü için canlı farelerden kan toplanması için bir protokol içerecektir. Toplanan serum, organ toksisitesi için istenen serum analitlerinin ölçümü için kullanılabilir. Çok renkli akım sitometrisi, tümör mikroortamındaki immün hücre popülasyonundaki değişiklikleri ve lenf noduna immün hücre göçünü anlamak için kullanılacaktır. İmmün hücreleri tanımlamak için, korunmuş bölüm14'ün immünohistokimyası ve / veya immünofloresansı dahil olmak üzere diğer yöntemler kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler çok sayıda hayvan üzerinde gerçekleştirmek için zaman alıcı ve sıkıcı olabilir. Genel olarak, aşağıdaki yöntemler araştırmacıların antitümör immün yanıtını ve kanser tedavisi için immünostimülatör ajanların potansiyel mekanizmalarını incelemelerine izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan tüm in vivo prosedürler, Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. HNSCC hücre hattının hazırlanması ve bakımı
NOT: Bu çalışmada, hRas ve lusiferaz (mEERL) ile birlikte HPV E6 ve E7 ile stabil olarak dönüştürülmüş murin orofaringeal epitel hücre hattı kullanılacaktır. Bu hücre hattı C57BL / 6J fare suşundan geliştirilmiştir ve Dr. Paola D. Vermeer'in (Güney Dakota Üniversitesi Sanford Tıp Fakültesi, Güney Dakota, ABD) Cerrahi Bölümü'nün bir hediyesiydi.
- Önceden ısıtılmış (37 °C) bir su banyosunda dondurulmuş bir mEERL hücresi şişesini çözün ve daha sonra ılık kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı [DMEM]% 40.5 1: 1 DMEM / Hams F12,% 10 Fetal Sığır Serumu [FBS],% 0.1 gentamisin,% 0.005 hidrokortizon,% 0.05 transferrin,% 0.05 insülin,% 0.0014 tri-iyodotironin ve% 0.005 epidermal büyüme faktörü ile desteklenmiştir).
- Ortamı çıkarmak için konik tüpü 277 x g'de 25 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Daha sonra, hücre peletini 3-5 mL taze ortamda yeniden askıya alın ve bir T-25 hücre kültürü şişesine aktarın. Dondurulmuş depolamadan optimum geri kazanım için, yüksek yoğunlukta plaka hücreleri.
NOT: T-25 şişeleri daha küçük boyutlarından dolayı kullanılmıştır, bu da hücreler T-75 şişelerine kıyasla yakın olduğunda donmuş depolamadan daha hızlı iyileşme süreleri ile sonuçlanır. - Hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C ve% 5 CO2'de büyümesine, daha büyük şişelere (yani T-75 veya T-150) genişlemesine ve her 3 günde bir geçmesine izin verin. Tüm farelere istenen implantasyon için yeterli hücre olduğunda, şişeleri çıkarın, ortamı atın ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe durulayın. Daha sonra,% 0.25 tripsin-EDTA'dan 4 mL (T150 şişeleri kullanılıyorsa) ekleyin ve 2 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kullanılan çanak / şişe boyutuna bağlı olarak tripsin miktarını yukarı veya aşağı ölçeklendirin.
NOT: Hücre çizgisinin tipi ve akıcılık derecesi tripsinizasyon sürelerini etkileyebilir. Uzun tripsinizasyon süreleri hücrelere zarar verebilir ve düşük canlılığa neden olabilir. Tripsinizasyon için gereken minimum süreyi kullanın. - Mikroskop altında, tripsinizasyondaki ayrılan hücreler serbestçe hareket eder. Bazı hücreler hala bağlıysa, kalan yapışkan hücreleri harekete geçirmek için şişeye çok nazikçe dokunun. Tripsin reaksiyonunu durdurmak için taze ortam ekleyin (istediğiniz kadar ortam miktarını ölçeklendirin) ve hücre süspansiyonunu 50 mL konik tüplerde toplayın. Ortamı çıkarmak için 25 °C'de 5 dakika boyunca 277 x g'de santrifüj yapın.
- Hücreleri taze ortamda yeniden askıya alın ve hücreleri sayın. Bir kez daha santrifüj yapın (yukarıda açıklandığı gibi) ve daha sonra 10 × 106 hücre / mL'lik bir son konsantrasyon yapmak için hücrelere soğuk PBS ekleyin. Farelere enjeksiyondan önce hücre süspansiyonlarını buz üzerinde tutun.
2. Tümör implantasyonu, ilaç tedavisi ve ölçümü
NOT: Deney hayvanları Iowa Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakım Tesisi'nde tutuldu ve bunları işlemek için uygun aseptik prosedürler izlendi.
- C57Bl / 6J farelerini ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımı ile anestezize edin. Yandaki alanı veya istenen enjeksiyon bölgesini elektrikli tıraş bıçağı ile dikkatlice tıraş edin.
NOT: Kurumsal (veya diğer) kural ve düzenlemelerin gerektirdiği şekilde kontrol edilen maddelerin kullanımını belgelemeyi unutmayın. - Yandaki alanı bir etanol pedi ile dezenfekte edin ve 25-28 G'lik bir şırınga kullanarak hücre süspansiyonunun 100 μL'sini (1 x 106 hücre içeren) deri altından yavaşça enjekte edin. Ani hareketleri ve hücre kaybını önlemek için enjeksiyondan önce fareleri anestezi altına alın. Her enjeksiyondan önce, hücrelerin şişe veya konik tüpün dibine yerleşmesini önlemek için hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın.
- Hücre süspansiyonunu şırıngaya aldıktan sonra, tüm kabarcıkları ve ölü alanı üstten çıkarın. Hücre süspansiyonunu yavaş ve sabit bir şekilde enjekte edin. Aynı iğneyi birden fazla farede kullanmayın. Kazara kaybı hesaba katmak için her zaman ekstra hücre süspansiyonları yapın.
- Hayvanı kendi kafeslerine yerleştirin ve anesteziden kurtulana kadar izleyin. Anestezi sırasında hayvanlar hipotermi riski altındadır; bu nedenle, ek ısı sağlayın veya fareleri sıcak tutmak için birbirine yakın yerleştirin (aynı kafese yerleştirilmişse).
- Tümörler herhangi bir yönde 3 mm'ye ulaştığında, tedavi gruplarındaki fareleri (tümör boyutuna ve / veya ağırlığına göre) randomize edin ve ardından ilaç tedavisine başlayın. Farelere intraperitoneal olarak (i.p.) 4. ve 9. günlerde3.75 μg rIL-1α / fare içeren NPs 15 enjekte edin. Tümör boyutunu veya fareler ötenazi kriterlerine ulaşana kadar tümörhacmini (uzunluk x genişlik 2) / 2) ve fare ağırlığını günlük veya her gün ölçün ve kaydedin.
NOT: Deneyimli bir araştırmacı ile bile, aynı büyüklükteki tümörü tüm farelere implante etmek zordur. Hayvanları tümör boyutuna ve fare ağırlığına göre deney gruplarına randomize edin.
3. Kan alımı ve serum ayrımı
NOT: Submandibuler venden kan alımı, bilinçli hayvanlardan veya anestezi altındaki hayvanlardan kan alınmasını sağlayan kolay ve etkili bir tekniktir. Bu çalışma için, anestezi altındayken hayvanlardan kan toplandı.
- Yukarıda belirtildiği gibi fareleri ketamin / ksilazin karışımı enjeksiyonu ile anestezi yapın.
- Baskın olmayan eli kullanarak omuz üzerindeki gevşek cildi kavrayın ve submandibuler damarı, mandibulanın biraz arkasında (o bölgede beyaz bir nokta) 18 G'lik bir iğne veya neşter ile delin.
- Hemen kan akışını sağlamak için damarı delin. 200-300 μL kan (fare ağırlığına bağlı olarak) 1,5 mL'lik bir polipropilen mikrosantrifüj tüpüne veya serum ayırıcı tüpüne toplayın. Kan toplandıktan sonra, kanama durana kadar delinme bölgesine hafif bir basınç uygulayın. Fareleri kendi kafeslerine geri döndürün ve anesteziden iyileşene kadar gözlemleyin.
NOT: Bir koleksiyonda veya 24 saatlik bir süre boyunca fare vücut ağırlığının %1'inden fazlasını toplama. - Toplanan kan pıhtısını oda sıcaklığında 20-30 dakika bekletin. Tüpleri santrifüj edilmeye hazır olana kadar buzun üzerine yerleştirin.
- Pıhtılaşmış kanı 4 ° C'de 15 dakika boyunca 1540 x g'de santrifüj edin.
- Kırmızı kan hücrelerini rahatsız etmeden üst tabakayı (serum) toplayın. Kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
4. Toplanan serumun çoklanması
- Serum veya plazma örneklerini buz üzerinde tutarken çözün.
- Herhangi bir hücre kalıntısını çökeltmek için numuneleri 1540 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve serum tabakasını üstten dikkatlice toplayın.
- Multipleks kiti oda sıcaklığında ortaya çıkarın.
NOT: Belirli sitokinler, kemokinler veya büyüme faktörleri için tasarlanmış, piyasada satılan birkaç multipleks kit vardır. Ayrıca, kiti ilgilenilen proteine göre özelleştirmek mümkündür. - Sitokinleri tespit etmek için tahlili üreticinin protokolüne göre yapın.
NOT: Multipleks kitlerin çoğu, yakalanan antikoru bağlamak için manyetik boncuklar kullanır. Bu nedenle, yıkama sırasında otomatik veya elde taşınan bir manyetik yıkayıcı kullanmak önemlidir. Aksi takdirde, manyetik boncuklar plakadan yıkanacak ve birinin okumayı almak için yeterli olayı olmayacaktır.
5. Tümör ve inguinal lenf nodunun toplanması ve tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
- Fareleri ketamin / ksilazin karışımı ile anestezikleştirin. Tam sedasyon sağlamak için, pedal refleksini kullanın (sıkı ayak parmağı sıkışması). Fareler yanıt vermezse, fareleri servikal çıkık ile ötenazileştirin.
- Her fareyi sırtına koyun ve karın bölgesi cildine% 70 etanol püskürtün. Tümörü farelerin sol tarafından ve lenf nodunu sağ taraftan kesmek için forseps ve makas kullanın. Tümör büyükse, küçük parçalara bölün ve 500-600 mg doku alın. Lenf nodu için tüm organı toplayın.
NOT: Kasık bölgesinin her iki tarafında iki lenf nodu vardır. Deneysel hedeflere bağlı olarak, lenf nodu ve tümör aynı taraftan izole edilebilir. Bununla birlikte, tümör çok büyürse, lenf nodunu aynı taraftan toplamak kolay olmayacaktır. - Dokuları 3-5 mL RPMI ortamı içeren ilgili ayrışıcı tüplere yerleştirin. Otomatik bir ayrıştırıcı kullanarak dokuyu homojenize edin.
NOT: Diğer otomatik veya el tipi homojenizatörler kullanılabilir. - Homojenizasyondan sonra, hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir filtreden 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Ortamı çıkarmak için 25 °C'de 5 dakika boyunca 277 x g'de santrifüj yapın. Hücreleri 1-2 mL soğuk PBS içinde yıkayın ve yeniden askıya alın.
6. Tek hücreli süspansiyonun FACS boyaması
- Bir hemositometredeki canlı hücreleri saymak için% 0.4 tripan mavisi boyama kullanın. 2-3 milyon hücre elde etmek ve bunları ilgili FACS tüpüne aktarmak için gereken hacmi hesaplayın.
- Canlı hücrelere geçiş yapmak için canlılık boyası kullanın; aksi takdirde, antikorun ölü hücrelerle spesifik olmayan bir şekilde bağlanması meydana gelebilir ve bu da yanlış pozitif sonuç verebilir.
NOT: Bu deneyde canlı ve ölü hücre boyama için zombi boyası kullanılmıştır. Birkaç sabitlenebilir ve sabitlenemeyen boya (örneğin, propidium iyodür) ticari olarak temin edilebilir. - Santrifüj (25 ° C'de 5 dakika boyunca 277 x g) sayılan hücreler. Süpernatantı boşaltın ve hücreleri 300 μL PBS'ye yeniden askıya alın. 0,5-1 μL zombi boyası/tüpü ekleyin. Karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Santrifüj (25 ° C'de 5 dakika boyunca 277 x g) ve hücreleri 1-2 mL FACS tamponu ile yıkayın ve 200 μL FACS tamponuna yeniden askıya alın.
- Fc-reseptör blokeri ekleyin (200 μL başına 2 μL veya üreticinin protokolüne göre) ve hücreleri 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Santrifüj (25 °C'de 5 dakika boyunca 277 x g) ve hücreleri 1-2 mL FACS tamponu ile yıkayın. Antikor kokteylini ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, santrifüj yapın (25 ° C'de 5 dakika boyunca 277 x g) ve hücreleri 1-2 mL FACS tamponu ile yıkayın. 300-400 μL% 2 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve fiksasyon için yeniden askıya alın. Bu adımdaki hücreleri 4 ° C'de birkaç gün saklayın veya çok renkli akış sitometresi ile hemen analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, HNSCC'nin sinjenik fare modelinde polianhidrit IL-1α'nın antitümör aktivitesi araştırılmıştır. Rekombinant IL-1α (rIL-1α), mEERL tümör büyümesini önemli ölçüde yavaşlattı (Şekil 1A), ancak tedavi edilen farelerde kilo kaybı gözlendi, bu da tedavinin kesilmesinden sonra restore edildi (Şekil 1B). IL-1α-NP'ler, salin veya boş-NP'lere kıyasla anlamlı bir antitümör etki yaratmadı (Şekil 1A) ve rIL-1α kadar belirgin olmasa da (Şekil 1B) bir miktar kilo kaybı eşlik etti. RIL-1α ile tedavi edilen fareler, diğer tedavi gruplarından anlamlı derecede daha uzun süre hayatta kalmıştır (Şekil 1C). Ek olarak, dolaşımdaki IL-1α, IL-1β ve IFN-γ seviyeleri, rIL-1α ile tedavi edilen farelerde diğer tedavi gruplarına kıyasla daha yüksekti (Şekil 2A-C). Bu sonuçlar, antitümör etkinliği açısından IL-1α-NP'deki iyileşmelerin garanti edildiğini göstermektedir.
Şekil 1: rIL-1α'nın tümör büyümesi, sağkalım ve vücut ağırlığı üzerine etkisi. mEERL HNSCC tümörleri taşıyan erkek C57BL/6J fareler (n = 10-11 fare/tedavi grubu) 1. ve 5. günlerde rIL-1α (3.75 μg rIL-1α), IL-1α-NP (3.75 μg rIL-1α içeren 0.25 mg NP), Blank-NP (0.25 mg NP) ve 100 μL salin çözeltisi (CON) ile tedavi edildi. Ortalama tümör hacmindeki (A), normalleştirilmiş vücut ağırlıklarındaki (B) ve sağkalım eğrilerindeki (C) değişiklikler gösterilmiştir. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. *p < 0.05 diğer tedavi gruplarına kıyasla. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: rIL-1α'nın dolaşımdaki sitokinler üzerine etkisi. İkinci ilaç uygulamasından sonra farelerin bir alt kümesinden (n = 4 fare / tedavi grubu) kan örnekleri toplandı ve multipleks tahlil ile dolaşımdaki sitokin seviyeleri için analiz edildi. Gösterilen IL-1α (A), IL-1β (B) ve IFN-γ (C) dolaşım seviyeleridir. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, herhangi bir araştırmacının antitümör aktivitesini ve immünomodülatör ilaçların altta yatan mekanizmalarından bazılarını in vivo tümör fare modeli sisteminde incelemesine izin verecektir. Burada, teknik olarak basit protokolü, tümör büyümesinin kolay izlenmesi, daha az hayvan morbiditesi ve daha yüksek üretilebilirlik dahil olmak üzere ortotopik modellere göre çeşitli avantajları olan sinjenik bir subkutan tümör modeli kullanılmıştır. Subkutan tümör modelleri, hem sol hem de sağ kanattaki tümör hücreleri enjekte edilerek bilateral tümör modeline de modifiye edilebilir. Bu bilateral tümör modelinde, bir tümöre intratümöral olarak radyoterapi veya ilaçlar uygulanabilir ve apskopal yanıtlar izlenebilir. Ortotopik HNSCC fare modelleri, klinik olarak daha alakalı olmakla birlikte, teknik olarak üretilmesi zor, tümör büyümesini izlemek zordur ve ağız boşluğundaki tümör yükü, farelerin yeme ve içme yetersizliği nedeniyle genellikle erken ötenazi ile sonuçlanır.
Hücrelerin hazırlanması, tüm farelerde simetrik ve benzer büyüklükteki tümörlerin oluşumu için önemli bir adımdır. Hücrelerin zayıf hazırlanması, hücre canlılığının azalmasına neden olur ve farelerde tümör oluşumunu büyük ölçüde etkiler. Tümör hücrelerinin erken geçiş sayısında ve %80-%90 oranında olması önerilir. Daha yüksek geçiş sayısı ve akıcılık hücre canlılığını ve dolayısıyla tümör oluşumunu etkiler. Hücreler ayrıca hazırlıktan sonra mümkün olan en kısa sürede enjekte edilmelidir, çünkü PBS'de 20-30 dakikadan fazla tutulursa canlılık azalır. Çok sayıda farenin tümörlerle implante edilmesi gerekiyorsa, ortamda tutulan hücrelerin bir stok çözeltisinin yapılması ve daha küçük bir hayvan grubu için PBS'de enjekte edilebilir hücre süspansiyonlarının hazırlanması önerilir.
Protokolde, tümör hücrelerini enjeksiyona hazırladıktan sonra dikkatli bir şekilde sürdürülmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Tümör hücrelerinin subdermal boşluğa enjekte edilmesi, subkutan boşluğa kıyasla farklı tümör büyüme paternleri ve boyutları üretebilir. Bu nedenle, tutarlı tümör oluşumu için iğne yerleşimine dikkat edilmelidir. İğne seçimi de önemlidir. İğne kanser hücresinden daha küçükse, daha küçük iğneler hücreleri strese sokabilir ve daha az canlılık sağlayabilir. İğne çok büyükse, hayvana zarar verebilir ve enjekte edilen bölgeden hücre sızıntısına neden olabilir. Doğru iğne boyutuna sahip deneyimli araştırmacılar için bile, enjekte edilen bölgede hücre sızıntısı olabilir, bu da küçük bir tümöre neden olabilir veya hiç tümör olmayabilir. Araştırmacıların, tümör hücresi kaybını azaltmak ve tümör hücresi implantasyonu sırasında doğruluğu ve hassasiyeti artırmak için tümör enjeksiyonu ve optimal iğne boyutu için doğru tekniği kullanmaları önemlidir. Tümör ölçümleri Vernier kaliperleri (manuel veya elektronik) kullanılarak dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. En iyi uygulama, değişkenliği azaltmak için tümör uzunluğu ve genişliği ölçümünün yönü ile tutarlı olmaktır. Çalışma boyunca aynı araştırmacı tarafından yapılan tümör ölçümü değişkenliği azaltabilir.
Beklendiği gibi, rIL-1α alan fareler tedavi sırasında kilo verdiler, bu da önceki bulguları destekliyor15,16. Kilo kaybı toksisiteyi değerlendirmenin basit ve anlaşılır bir yolu olmasına rağmen, kullanılabilecek başka toksikolojik son noktalar da vardır. Kan hücresi sayımlarının (beyaz kan hücreleri, kırmızı kan hücreleri ve trombosit sayımları) ve karaciğer enzim seviyelerinin (aspartat transaminaz, alanin aminotransferaz ve alkali fosfataz) değerlendirilmesi, ilaç toksisitesi hakkında değerli bilgiler sağlar. Ek olarak, farelerin bir alt kümesi feda edilebilir ve organların (karaciğer, böbrekler, pankreas, akciğer vb.) histopatolojik analizi yapılabilir. Sistemik inflamasyon genellikle toksisitenin bir göstergesi olarak kullanılır. Burada, 18 G'lik bir iğne kullanılarak submandibuler venipunktur ile ilaç tedavisinden sonra farelerde bir dizi dolaşımdaki proinflamatuar sitokin analiz edildi. Farelerde submandibuler venipunktur, prosedürün birçok tekrarından gelen bir beceri gerektirir. Delinme çok derinse, kulaktan kanamaya ve iç doku hasarına neden olabilir. Oysa iğneye yeterince nüfuz edilmezse, yetersiz miktarda kan toplanabilir. İğnelere alternatifler, tek kullanımlık kanama neşterlerinin kullanılmasıdır. Ticari olarak temin edilebilen ve uzunluklarına göre farklılık gösteren farklı kanama neşterleri vardır. Araştırmacılar, hayvanların optimal kan alımını ve insancıl muamelesini sağlamak için uygun bir neşter boyutu kullanmalıdır. Bu prosedür için üç sitokin için sonuçlar gösterilmiştir (Şekil 2A-C). rIL-1α ile tedavi edilen farelerde gözlenen IL-1α, IL-1β ve IFN-γ dahil olmak üzere dolaşımdaki proinflamatuar sitokinlerdeki artışın, bu tedavi grubunda gözlenen akut kilo kaybı ile ilişkili olması muhtemeldir (Şekil 1B).
Son olarak, fare tümörü ve lenf düğümlerinin tek hücreli süspansiyonlarının izolasyonu ve hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu yöntem, ilaç tedavisine bağlı olarak bağışıklık hücresi aktivasyonu ve işe alımındaki değişiklikleri tespit etmek isteyenler için yararlıdır. Tümörlerin diseksiyonu sırasında, yağ dokusu, cilt, saç ve diğer döküntüler mümkün olduğunca ortadan kaldırılmalıdır. Genellikle, akım sitometrisi için yeterli hücreye sahip olmak için tümör hacmi30 mm3'ten büyük olmalıdır. Bununla birlikte, tümör çok büyükse, tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak zor olabilir. Büyük tümörler ayrışma tüpüne yerleştirilmeden önce küçük parçalara ayrılmalıdır. Optimal canlı hücreler elde etmek için işlem hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Ek olarak, büyük tümörler tümör tarafındaki inguinal lenf nodunu bulmayı zorlaştırır. Bu durumda, inguinal lenf nodu karşı bölgeden toplanabilir. Tek hücreli süspansiyonlar elde edildikten sonra, farklı antikorlarla boyanabilir ve çok renkli akış sitometrisi ile analiz edilebilir.
Genel olarak, bu protokoller immün modülatör ilaçların antitümör aktivitesini ve dolaşımdaki sitokinlerdeki ve immün hücre popülasyonlarındaki ilişkili değişiklikleri incelemek için etkili bir yol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Amerika Birleşik Devletleri'nden (ABD) Merit Review Award #I01BX004829 tarafından desteklenmiştir. Gazi İşleri Bölümü, Biyomedikal Laboratuvar Araştırma ve Geliştirme Hizmeti ve Iowa Üniversitesi'ndeki Holden Kapsamlı Kanser Merkezi aracılığıyla Mezhir Ödül Programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
References
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
