Summary
Ett standardprotokoll beskrivs för att studera antitumöraktiviteten och associerad toxicitet av IL-1α i en syngen musmodell av HNSCC.
Abstract
Cytokinbehandling är en lovande immunterapeutisk strategi som kan producera robusta antitumörimmunsvar hos cancerpatienter. Det proinflammatoriska cytokinet interleukin-1 alfa (IL-1α) har utvärderats som ett anticancermedel i flera prekliniska och kliniska studier. Dosbegränsande toxiciteter, inklusive influensaliknande symtom och hypotoni, har dock dämpat entusiasmen för denna terapeutiska strategi. Polyanhydridnanopartikel (NP)-baserad leverans av IL-1α skulle utgöra ett effektivt tillvägagångssätt i detta sammanhang eftersom detta kan möjliggöra en långsam och kontrollerad frisättning av IL-1α systemiskt samtidigt som toxiska biverkningar minskas. Här beskrivs en analys av antitumöraktiviteten hos IL-1α-laddade polyanhydrid NPs i en syngen musmodell med skivepitelcancer (HNSCC) i huvud och hals. Murina orofaryngeala epitelceller som stabilt uttrycker HPV16 E6/E7 tillsammans med hRAS- och luciferasceller (mEERL) injicerades subkutant i den högra flanken av C57BL/6J-möss. När tumörer nådde 3-4 mm i vilken riktning som helst, administrerades en 1,5% IL-1a - laddad 20:80 1,8-bis (p-karboxifenoxi) -3,6-dioxaoktan: 1,6-bis (p-karboxifenoxi) hexan (CPTEG: CPH) nanopartikel (IL-1a-NP) formulering till möss intraperitonealt. Tumörstorlek och kroppsvikt mättes kontinuerligt tills tumörstorlek eller viktminskning nådde eutanasikriterier. Blodprover togs för att utvärdera antitumörimmunsvar genom submandibulär venipunktur och inflammatoriska cytokiner mättes genom cytokinmultiplexanalyser. Tumör- och inguinala lymfkörtlar resekterades och homogeniserades till en encellssuspension för att analysera olika immunceller genom flerfärgad flödescytometri. Dessa standardmetoder gör det möjligt för utredare att studera antitumörimmunsvaret och den potentiella mekanismen för immunstimulerande NP och andra immunterapimedel för cancerbehandling.
Introduction
Ett av de framväxande områdena inom cancerimmunterapi är användningen av inflammatoriska cytokiner för att aktivera patienternas immunförsvar mot deras tumörceller. Flera proinflammatoriska cytokiner (dvs interferon-alfa (IFNα), interleukin-2 (IL-2) och interleukin-1 (IL-1)) kan montera signifikant antitumörimmunitet, vilket har genererat intresse för att utforska antitumöregenskaperna såväl som säkerheten hos cytokinbaserade läkemedel. Interleukin-1 alfa (IL-1a) i synnerhet är ett proinflammatoriskt cytokin som kallas mastercytokin för inflammation1. Sedan upptäckten av detta cytokin i slutet av 1970-talet har det undersökts som ett anticancermedel samt ett hematopoetiskt läkemedel för att behandla de negativa effekterna av kemoterapi2. Under slutet av 1980-talet genomfördes flera prekliniska och kliniska studier för att bestämma anticancereffekterna av IL-1α 3,4,5,6. Dessa studier fann lovande antitumöraktivitet av rekombinant IL-1α (rIL-1α) mot melanom, njurcellscancer och äggstockscancer. Toxicitet, inklusive feber, illamående, kräkningar, influensaliknande symtom och allvarligast dosbegränsande hypotoni observerades emellertid. Tyvärr dämpade dessa dosrelaterade toxiciteter entusiasmen för ytterligare klinisk användning av rIL-1α.
För att försöka ta itu med den kritiska frågan om IL-1a-medierad toxicitet kommer polyanhydridnanopartikelformuleringar (NP) som möjliggör kontrollerad frisättning av IL-1α genom yterosionskinetik att undersökas. Dessa NP-formuleringar är avsedda att skörda fördelarna med antitumöregenskaperna hos IL-1α samtidigt som dosbegränsande biverkningar minskas7. Polyanhydrider är FDA-godkända polymerer som bryts ned genom yterosion vilket resulterar i nästan nollorderfrisättning av inkapslade medel 8,9,10,11,12. Amfifila polyanhydridsampolymerer innehållande 1,8-bis-(p-karboxifenoxi)-3,6-dioxaoktan (CPTEG) och 1,6-bis-(p-karboxifenoxi) hexan (CPH), har rapporterats vara utmärkta leveranssystem för olika nyttolaster inom onkologi och immunologibaserad forskning 8,12. I följande protokoll 20:80 CPTEG: CPH NPs laddade med 1.5 vikt% rIL-1α (IL-1a-NPs) kommer att användas för att studera antitumöraktiviteten och toxiciteten hos detta cytokin i en musmodell av HNSCC.
Det övergripande målet med följande procedurer är att bedöma antitumöraktiviteten hos IL-1a-NP på HNSCC. De beskrivna förfarandena, inklusive bedömning av tumörtillväxt och överlevnad, kan tillämpas på alla immunmodulerande medel av intresse. Dessa procedurer bör utföras i en syngen musmodell med ett intakt immunsystem13 för att maximera klinisk relevans. IL-1α-NP-toxicitet kommer också att bedömas genom att mäta förändringar i cirkulerande nivåer av proinflammatoriska cytokiner och djurvikt. Det finns många metoder för att bestämma in vivo läkemedelstoxicitet; De mest använda metoderna innefattar emellertid mätning av serumenzymer för organtoxicitet och histologiska förändringar i dessa organ. Men för att utföra histologiska analyser måste djuret offras, vilket kommer att påverka experimentets överlevnadskurvor. Därför kommer detta protokoll att innehålla ett protokoll för insamling av blod från levande möss för mätning av cytokiner i serumprover. Det insamlade serumet kan användas för mätning av önskade serumanalyter med avseende på organtoxicitet. Multicolor flow cytometri kommer att användas för att förstå förändringarna i immuncellspopulationen i tumörmikromiljön och immuncellsmigration till lymfkörteln. Andra metoder kan användas för att identifiera immunceller, inklusive immunhistokemi och/eller immunofluorescens av bevarade avsnitt14. Dessa tekniker kan dock vara tidskrävande och tråkiga att utföra på ett stort antal djur. Sammantaget kommer följande metoder att göra det möjligt för utredare att studera antitumörimmunsvaret och potentiella mekanismer för immunstimulerande medel för cancerbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla in vivo-procedurer som användes i denna studie godkändes av Institutional Animal Care and UseCommittee (IACUC) vid University of Iowa.
1. Förberedelse och underhåll av HNSCC-cellinjen
OBS: I denna studie kommer den murina orofaryngeala epiteliala cellinjen stabilt transformerad med HPV E6 och E7 tillsammans med hRas och luciferas (mEERL) att användas. Denna cellinje utvecklades från C57BL / 6J musstam och var en gåva från Dr. Paola D. Vermeer (Institutionen för kirurgi, University of South Dakota Sanford School of Medicine, South Dakota, USA).
- Tina en frusen injektionsflaska med mEERL-celler i ett förvärmt (37 °C) vattenbad och överför sedan till ett 15 ml koniskt rör innehållande varma odlingsmedier (Dulbeccos modifierade örnmedium [DMEM] kompletterat med 40,5% 1:1 DMEM/Hams F12, 10% Fetal Bovine Serum [FBS], 0,1% gentamicin, 0,005% hydrokortison, 0,05% transferrin, 0,05% insulin, 0,0014% trijodtyronin och 0,005% epidermal tillväxtfaktor).
- Centrifugera det koniska röret vid 277 x g i 5 min vid 25 °C för att avlägsna mediet. Suspendera sedan cellpelleten igen i 3-5 ml färskt medium och överför den till en T-25-cellodlingskolv. För optimal återhämtning från fryst förvaring, plåtceller med hög densitet.
OBS: T-25-kolvar användes på grund av deras mindre storlek, vilket resulterar i snabbare återhämtningstider från fryst lagring när celler är i närheten jämfört med T-75-kolvar. - Låt cellerna växa i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5%CO2, expandera till större kolvar (dvs T-75 eller T-150) och passera var 3:e dag. När det finns tillräckligt med celler för önskad implantation i alla möss, ta bort kolvarna, kassera mediet och skölj försiktigt cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt sedan 4 ml (om T150-kolvar används) 0,25 % trypsin-EDTA och inkubera vid 37 °C i 2 minuter. Skala mängden trypsin upp eller ner beroende på vilken skål / kolvstorlek som används.
OBS: Typ av cellinje och grad av sammanflöde kan påverka trypsiniseringstiderna. Långa trypsiniseringsperioder kan skada celler vilket resulterar i låg livskraft. Använd den minsta tid som behövs för trypsinisering. - Under mikroskopet rör sig de fristående cellerna på trypsinisering fritt. Om vissa celler fortfarande är fästa, knacka mycket försiktigt på kolven för att mobilisera de återstående vidhäftande cellerna. Tillsätt nytt medium (skala mängden media efter önskemål) för att stoppa trypsinreaktionen och samla cellsuspensionen i 50 ml koniska rör. Centrifugera vid 277 x g i 5 min vid 25 °C för att avlägsna mediet.
- Resuspendera cellerna i färska medier och räkna cellerna. Centrifugera en gång till (enligt beskrivningen ovan) och tillsätt sedan kall PBS till cellerna för att göra en slutlig koncentration på 10 × 106 celler / ml. Förvara cellsuspensionen/-suspensionerna på is före injektion till möss.
2. Tumörimplantation, läkemedelsbehandling och mätning
OBS: Försöksdjuren hölls i djurvårdsanläggningen vid University of Iowa och följde lämpliga aseptiska procedurer för att hantera dem.
- Bedövar C57Bl/6J-möss med ketamin (80 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) blandning. Raka försiktigt flankområdet eller önskat injektionsställe med en elektrisk rakhyvel.
OBS: Kom ihåg att dokumentera användningen av kontrollerade ämnen enligt vad som krävs enligt institutionella (eller andra) regler och förordningar. - Desinficera flankområdet med en etanoldyna och injicera långsamt 100 μL (innehållande 1 x 106 celler) av cellsuspensionen subkutant med en 25-28 G spruta. Bedöva mössen före injektion för att förhindra plötsliga rörelser och cellförlust. Före varje injektion, blanda försiktigt cellsuspensionen för att förhindra att cellerna sätter sig i botten av injektionsflaskan eller det koniska röret.
- Efter att ha tagit upp cellsuspensionen i sprutan, ta bort alla bubblor och dött utrymme från toppen. Injicera cellsuspensionen långsamt och stadigt. Använd inte samma nål på flera möss. Gör alltid extra cellsuspensioner för att ta hänsyn till oavsiktlig förlust.
- Placera djuret i sina respektive burar och övervaka dem tills de återhämtar sig från anestesi. Under anestesi riskerar djur hypotermi; Ge därför extra värme eller placera mössen nära varandra för att hålla värmen (om de hålls i samma bur).
- När tumörer når 3 mm i någon riktning, randomisera mössen (efter tumörstorlek och / eller vikt) i behandlingsgrupperna och starta sedan läkemedelsbehandlingen. Injicera mössen intraperitonealt (i.p.) med NPs15 innehållande 3,75 μg rIL-1α/mus dag 4 och 9. Mät och registrera tumörvolymen ((längd x bredd 2) /2) och musvikten dagligen eller varannan dag tills tumörstorleken eller mössen når eutanasikriterier.
OBS: Även med en erfaren forskare är det svårt att implantera tumören av samma storlek i alla möss. Randomisera djur i experimentella grupper baserat på tumörstorlek och musvikt.
3. Bloduppsamling och serumseparation
OBS: Blodinsamling från en submandibulär ven är en enkel och effektiv teknik som möjliggör blodinsamling från medvetna djur eller djur under anestesi. För denna studie samlades blod från djuren när de var under anestesi.
- Bedöva mössen med en injektion av ketamin / xylazinblandning som nämnts ovan.
- Ta tag i den lösa huden över axeln med den icke-dominanta handen och punktera den submandibulära venen med en 18 G nål eller lansett, något bakom underkäken (en vit fläck vid det området).
- Punktera venen för att säkerställa blodflödet omedelbart. Samla 200-300 μL blod (beroende på musvikt) i ett 1,5 ml polypropenmikrocentrifugrör eller serumseparatorrör. Efter blodinsamling, applicera försiktigt tryck på punkteringsstället tills blödningen har slutat. Återför mössen till sina respektive burar och observera tills de återhämtar sig från anestesi.
OBS: Samla inte mer än 1% av musens kroppsvikt i en samling eller under en 24-timmarsperiod. - Låt det uppsamlade blodet koagulera vid rumstemperatur i 20-30 min. Lägg rören på is tills de är redo att centrifugeras.
- Centrifugera koagulerat blod vid 1540 x g i 15 minuter vid 4 °C.
- Samla det övre lagret (serum) utan att störa de röda blodkropparna. Förvaras vid -80 °C fram till användning.
4. Multiplexering av uppsamlat serum
- Tina serum- eller plasmaproverna medan du håller dem på is.
- Centrifugera proverna vid 1540 x g i 5 minuter vid 4 °C för att sedimentera eventuellt cellskräp och samla försiktigt upp serumskiktet uppifrån.
- Ta fram multiplexsatsen vid rumstemperatur.
OBS: Det finns flera kommersiellt tillgängliga multiplexsatser som är utformade för specifika cytokiner, kemokiner eller tillväxtfaktorer. Det är också möjligt att anpassa satsen baserat på proteinet av intresse. - Utför analysen enligt tillverkarens protokoll för att detektera cytokiner.
OBS: De flesta multiplexsatser använder magnetiska pärlor för att binda den fångade antikroppen. Så det är viktigt att använda en automatiserad eller handhållen magnetisk bricka under tvätt. Annars kommer de magnetiska pärlorna att tvättas bort från plattan, och man kommer inte att ha tillräckligt med händelser för att ta läsningen.
5. Samling av tumör och inguinal lymfkörtel och beredning av encellssuspension
- Bedöva mössen med ketamin/xylazinblandning. För att säkerställa fullständig sedering, använd pedalreflex (fast tåklämma). Om mössen inte svarar, avliva mössen genom cervikal dislokation.
- Lägg varje mus på ryggen och spraya 70% etanol på bukområdet. Använd pincett och sax för att skära tumören ut från vänster sida av mössen och lymfkörteln från höger sida. Om tumören är stor, skär i små bitar och ta 500-600 mg av vävnaden. För lymfkörteln, samla hela orgeln.
OBS: Det finns två lymfkörtlar på båda sidor av inguinalområdet. Beroende på experimentella mål kan lymfkörteln och tumören isoleras från samma sida. Men om tumören blir mycket stor blir det inte lätt att samla lymfkörteln från samma sida. - Placera vävnaderna på respektive dissociatorrör som innehåller 3-5 ml RPMI-media. Homogenisera vävnaden med hjälp av en automatiserad dissociator.
OBS: Andra automatiserade eller handhållna homogenisatorer kan användas. - Efter homogenisering, överför cellsuspensionen genom ett 70 μm filter till ett 50 ml koniskt rör. Centrifugera vid 277 x g i 5 min vid 25 °C för att avlägsna mediet. Tvätta och resuspendera cellerna i 1-2 ml kall PBS.
6. FACS-färgning av encellssuspension
- Använd 0,4% trypanblå färgning för att räkna de livskraftiga cellerna i en hemocytometer. Beräkna volymen som krävs för att få 2-3 miljoner celler och överför dem till respektive FACS-rör.
- Använd livskraftsfärg för att grinda på levande celler; Annars kan ospecifik bindning av antikroppen med döda celler uppstå som kan ge ett falskt positivt resultat.
OBS: Zombiefärgämne användes för färgning av levande och döda celler i detta experiment. Flera fixerbara och icke-fixerbara färgämnen (t.ex. propidiumjodid) är kommersiellt tillgängliga. - Centrifugera (277 x g i 5 min vid 25 °C) de räknade cellerna. Häll av supernatanten och suspendera cellerna igen till 300 μL PBS. Tillsätt 0,5-1 μL zombiefärgämne/rör. Inkubera vid rumstemperatur i 20 min i mörker.
- Centrifugera (277 x g i 5 min vid 25 °C) och tvätta cellerna med 1–2 ml FACS-buffert och suspendera dem igen till 200 μL FACS-buffert.
- Tillsätt Fc-receptorblockerare (2 μL per 200 μL eller enligt tillverkarens protokoll) och inkubera cellerna i 10 minuter.
- Centrifugera (277 x g i 5 min vid 25 °C) och tvätta cellerna med 1-2 ml FACS-buffert. Tillsätt antikroppscocktailen och inkubera i 30 minuter vid 4 °C i mörker.
- Efter inkubationen centrifugeras (277 x g i 5 min vid 25 °C) och cellerna tvättas med 1–2 ml FACS-buffert. Tillsätt 300-400 μL 2% paraformaldehydlösning och resuspendera för fixering. Förvara cellerna i detta steg i ett par dagar vid 4 °C eller analysera omedelbart med flerfärgad flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie undersöktes antitumöraktiviteten hos polyanhydrid IL-1α i en syngen musmodell av HNSCC. Rekombinant IL-1α (rIL-1α) bromsade signifikant mEERL-tumörtillväxten (figur 1A), även om viktminskning observerades hos de behandlade mössen, som återställdes efter avslutad behandling (figur 1B). IL-1α-NPs inducerade inte en signifikant antitumöreffekt jämfört med saltlösning eller blank-NP (figur 1A) och åtföljdes av viss viktminskning, men inte lika framträdande som rIL-1α (figur 1B). Möss behandlade med rIL-1α överlevde signifikant längre än de andra behandlingsgrupperna (figur 1C). Dessutom var cirkulerande nivåer av IL-1α, IL-1β och IFN-γ högre hos rIL-1α-behandlade möss jämfört med de andra behandlingsgrupperna (figur 2A-C). Dessa resultat tyder på att förbättringar av IL-1α-NP med avseende på antitumöreffekt är motiverade.
Figur 1: Effekt av rIL-1α på tumörtillväxt, överlevnad och kroppsvikt. Manliga C57BL / 6J-möss (n = 10-11 möss / behandlingsgrupp) med mEERL HNSCC-tumörer behandlades i.p. dag 1 och dag 5 med rIL-1α (3,75 μg rIL-1α), IL-1α-NP (0,25 mg NP innehållande 3,75 μg rIL-1α), Blank-NP (0,25 mg NP) och 100 μL saltlösning (CON). Visade är förändringar i genomsnittlig tumörvolym (A), normaliserad kroppsvikt (B) och överlevnadskurvor (C). Felstaplar representerar medelvärdets standardfel. *p < 0,05 jämfört med andra behandlingsgrupper. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Effekt av rIL-1α på cirkulerande cytokiner. Blodprover samlades in från en delmängd av möss (n = 4 möss / behandlingsgrupp) efter den andra läkemedelsadministrationen och analyserades för cirkulerande cytokinnivåer genom multiplexanalys. Visas är cirkulerande nivåer av IL-1α (A), IL-1β (B) och IFN-γ (C). Felstaplar representerar medelvärdets standardfel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll gör det möjligt för alla prövare att studera antitumöraktiviteten och några av de underliggande mekanismerna för immunmodulerande läkemedel i ett in vivo tumörmusmodellsystem. Här användes en syngen subkutan tumörmodell, som har flera fördelar jämfört med ortotopiska modeller, inklusive dess tekniskt enkla protokoll, enkel övervakning av tumörtillväxt, mindre djursjuklighet och högre producerbarhet. Subkutana tumörmodeller kan också modifieras till en bilateral tumörmodell genom att injicera tumörceller på både vänster och höger flank. I denna bilaterala tumörmodell kan strålbehandling eller läkemedel administreras till en tumör intratumoralt och abscopala svar kan övervakas. Ortotopiska HNSCC-musmodeller, även om de är mer kliniskt relevanta, är tekniskt utmanande att generera, svåra att övervaka tumörtillväxt och tumörbördan i munhålan resulterar ofta i för tidig eutanasi på grund av mössens oförmåga att äta och dricka.
Beredningen av celler är ett viktigt steg för bildandet av symmetriska och liknande tumörer i alla möss. Dålig beredning av celler resulterar i minskad cellviabilitet och påverkar kraftigt tumörgenerering hos möss. Tumörcellerna rekommenderas att vara vid ett tidigt passagenummer och inom 80% -90% sammanflöde. Högre passagenummer och sammanflöde påverkar cellviabiliteten och därmed tumörgenereringen. Cellerna bör också injiceras så snart efter beredning som möjligt eftersom viabiliteten är reducerad om den förvaras i PBS längre än 20-30 minuter. Om ett stort antal möss behöver implanteras med tumörer, rekommenderas att göra en stamlösning av celler som hålls i media och förbereda injicerbara cellsuspensioner i PBS för en mindre grupp djur.
Det finns flera kritiska steg i protokollet som måste underhållas noggrant efter beredning av tumörceller för injektion. Att injicera tumörceller till det subdermala utrymmet kan producera olika tumörtillväxtmönster och storlekar jämfört med det subkutana utrymmet. Därför bör noggrann uppmärksamhet läggas på nålplacering för konsekvent tumörbildning. Nålval är också viktigt. Om nålen är mindre än cancercellen kan mindre nålar stressa cellerna vilket resulterar i mindre livskraft. Om nålen är mycket stor kan det skada djuret och resultera i cellläckage från det injicerade stället. Även för erfarna forskare med rätt nålstorlek kan det finnas cellläckage på det injicerade stället vilket resulterar i en liten eller ingen tumör. Det är viktigt att forskare använder rätt teknik för tumörinjektion och optimal nålstorlek för att minska tumörcellförlust och öka noggrannheten och precisionen under tumörcellimplantation. Tumörmätningar bör göras noggrant med Vernier-bromsok (manuella eller elektroniska). Den bästa praxisen är att vara konsekvent med riktningen för tumörlängd och breddmätning för att minska variabiliteten. Tumörmätning av samma forskare under hela studien kan minska variationen.
Som förväntat gick möss som fick rIL-1α ner i vikt under behandlingen, vilket stöder tidigare fynd15,16. Även om viktminskning är ett enkelt och okomplicerat sätt att bedöma toxicitet, finns det andra toxikologiska slutpunkter som kan användas. Bedömning av antalet blodkroppar (vita blodkroppar, röda blodkroppar och trombocyter) och leverenzymnivåer (aspartattransaminas, alaninaminotransferas och alkaliskt fosfatas) ger värdefull information om läkemedelstoxicitet. Dessutom kan en delmängd av möss offras och histopatologisk analys av organ (lever, njurar, bukspottkörtel, lunga etc.) kan utföras. Systemisk inflammation används ofta som en indikator på toxicitet. Här analyserades ett antal cirkulerande proinflammatoriska cytokiner hos mössen efter läkemedelsbehandling med submandibulär venipunktur med hjälp av en 18 G nål. Submandibulär venipunktur på möss kräver en färdighet som kommer från många upprepningar av proceduren. Om punkteringen är för djup kan det orsaka blödning från örat och inre vävnadsskada. Om nålen inte penetreras tillräckligt långt kan en otillräcklig mängd blod samlas in. Alternativ till nålar är användningen av engångsblödande lansetter. Det finns olika typer av blödande lansetter som är kommersiellt tillgängliga som skiljer sig åt i längd. Forskare bör använda en lämplig lansettstorlek för att säkerställa optimal blodinsamling och human behandling av djur. För denna procedur visas resultat för tre cytokiner (figur 2A-C). Det är troligt att en ökning av cirkulerande proinflammatoriska cytokiner inklusive IL-1α, IL-1β och IFN-γ observerats hos rIL-1α-behandlade möss kan associeras med akut viktminskning (figur 1B) observerad i denna behandlingsgrupp.
Slutligen beskrivs ett protokoll för isolering och beredning av encellssuspensioner av mösstumörer och lymfkörtlar. Denna metod är användbar för dem som försöker upptäcka förändringar i immuncellsaktivering och rekrytering på grund av läkemedelsbehandling. Under dissektion av tumörer bör fettvävnad, hud, hår och annat skräp elimineras så mycket som möjligt. Vanligtvis bör tumörvolymen vara större än 30 mm3 för att ha tillräckligt med celler för flödescytometri. Men om tumören är mycket stor kan det vara svårt att förbereda encellssuspensioner. Stora tumörer ska skäras i små bitar innan de placeras i dissogatorröret. Processen bör göras snabbt för att få optimala livskraftiga celler. Dessutom gör stora tumörer det svårt att hitta den inguinala lymfkörteln på tumörsidan. I detta fall kan den inguinala lymfkörteln samlas in från motsatt plats. När encellssuspensioner erhålls kan de färgas med olika antikroppar och analyseras med multicolor flödescytometri.
Sammantaget ger dessa protokoll ett effektivt sätt att studera antitumöraktiviteten hos immunmodulerande läkemedel och de associerade förändringarna i cirkulerande cytokiner och immuncellspopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av Merit Review Award #I01BX004829 från USA (USA) Department of Veterans Affairs, Biomedical Laboratory Research and Development Service och stöds av Mezhir Award Program genom Holden Comprehensive Cancer Center vid University of Iowa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
References
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W.
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J.
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J.
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
