Summary
Drosophila에서,oocyte 핵은 oogenesis 도중 microtubule 의존적인 이주를 겪습니다. 여기서, 우리는 계란 챔버 전 vivo에라이브 이미징을 수행하여 마이그레이션을 따라 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 우리의 절차는 회전 디스크 공초점 현미경 검사를 사용하여 다중 위치 3D 타임 랩스 영화를 취득하기 위해 12 시간 동안 살아있는 계란 챔버를 유지합니다.
Abstract
살아있는 세포 화상 진찰은 세포 내의 세포 운동, 세포 골격 재배열, 또는 극성 패터닝을 통제하는 세포 및 분자 기계장치를 이해하기 위하여 특히 필요합니다. 난소 핵 포지셔닝을 연구할 때, 라이브 이미징 기술은 이 과정의 역동적인 사건을 포착하는 데 필수적입니다. Drosophila 계란 챔버는 다세포 구조와 수많은 유전 도구의 큰 크기와 가용성 때문에이 현상을 연구 하는 우수한 모델 시스템. Drosophila 중간 oogenesis 도중, 핵은 microtubule 생성한 힘에 의해 중재된 비대칭 위치를 채택하기 위하여 oocyte 내의 중앙 위치에서 이동합니다. 핵의 이 이동 및 위치는 태아의 극성 축과 후속 성인 비행을 결정하기 위하여 필요합니다. 이 마이그레이션의 한 가지 특징은 3차원(3D)으로 발생하여 라이브 이미징이 필요하다는 것입니다. 따라서, 핵 이동을 규제하는 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 해부 된 계란 챔버를 배양하고 회전 디스크 공초점 현미경 을 사용하여 시간 경과 취득에 의해 12 시간 동안 라이브 이미징을 수행하는 프로토콜을 개발했습니다. 전반적으로, 우리의 조건은 우리가 오랜 시간 동안 Drosophila 계란 챔버를 보존 할 수 있습니다, 따라서 3D의 샘플의 많은 수에서 시각화 할 핵 마이그레이션의 완료를 가능하게.
Introduction
몇 년 동안 드로소필라 오키테는 핵 이주를 연구하는 모델 시스템으로 부상했습니다. Drosophila oocyte는 계란 챔버에게 불린 다세포 구조물에서 발전합니다. 계란 챔버는 여포 체 세포의 상피 층으로 둘러싸인 16 개의 생식 세포 (15 명의 간호사 세포 및 난미세포)를 포함합니다. 계란 챔버 개발은 14 단계로 세분화되었습니다(그림 1A),그 동안 oocyte 성장하고 배아의 초기 개발에 필요한 매장량을 축적할 것이다. 개발 중, 현미경 재구성 및 모계 결정요인의 비대칭 수송시, 난소세포는 안테로-등대 및 등류 복부를 따라 편광한다. 이 축은 배아의 후속 극성 축과 이 난미1의수정에서 발생하는 성인을 결정한다. oogenesis 동안, 핵은 oocyte에 비대칭 위치를 채택합니다. 6단계에서, 핵은 세포에 중심을 두고 있다. 난십체에 의해 수신되는 후방 여포 세포에 의해 방출되는 신호를 아직 확인되지 않은 후, 핵은 7단계(도 1B)2,3단계에서전방 및 측면 혈장 막 사이의 교차를 향해 이동한다. 이러한 비대칭 위치는 등대-복부 축의 판정을 유도하기 위해 요구된다.
그림 1: 드로소필라 멜라노가스터 달걀 챔버. (A)핵 봉투와 플라즈마 멤브레인에 라벨을 붙이는 유비-PH-RFP를 표시하는 Fs(2)Ket-GFP를 발현하는 형질전환 파리로부터의 고정 된 오방. ovariole는 다른 단계에서 계란 챔버를 개발로 구성되어 있습니다. 성숙은 배아 줄기 세포가 상주하는 전방 팁(왼쪽)에서 발아마리움을 가진 전방 후방 축을 따라 증가하고 후방 끝(오른쪽)에서 구층이 증가합니다. (B)핵이 난낭을 중심으로 하는 oogenesis(왼쪽)의 6단계에서 디스크 공초점 현미경을 회전시킴으로써 살아있는 계란 챔버의 Z-프로젝션. 핵은 전방 플라즈마 멤브레인 (난소와 간호사 세포 사이)와 측면 혈장 막 (난낭과 여포 세포 사이)와 접촉하여 단계 7 (오른쪽)에서 비대칭 위치를 채택하기 위해 마이그레이션됩니다. 이러한 위치는 등쪽 측의 결단을 유도하고, 따라서 계란 챔버의 등복부 축을 유도할 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
수십 년 동안, 이 핵 이주는 면역 염색에 의하여 고정된 조직에 공부되었습니다. 이 접근 방식은 특히이 과정이 마이크로 튜블러4,5의조밀 한 네트워크에 따라 달라지는 것을 입증 할 수 있게했습니다. 최근에는 몇 시간 동안 난낭의 라이브 이미징과 호환되는 조건을 제공하는 프로토콜을 개발하여 이 과정을 동적으로6으로연구할 수 있게 되었습니다.
따라서, 처음으로, 우리는 핵이 이동 하는 동안 우대 및 특성 궤적을 설명할 수 있었다, 전방 플라즈마 멤브레인을 따라 하나 (APM) 및 oocyte의 측면 플라즈마 멤브레인을 따라 다른(그림 2). 이러한 최신 결과는 핵 마이그레이션과 같은 동적 프로세스를 연구할 때 실시간 이미징 프로토콜의 중요성을 강조합니다.
그림 2: 핵의 다른 이동 경로의 회로도 표현. oogenesis의 단계 6에서, oocyte는 중앙 핵을 가진 큰 세포입니다. 이 단계에서, 전방 후방 극성 축은 여포 세포와 접촉하여 난낭의 후방/측면 플라즈마 멤브레인으로 설정되고 전방 플라즈마 멤브레인(노란색)은 간호사 세포2와접촉한다. 우리는 이전에 핵이 전방 플라즈마 막 (APM)을 따라, 측면 혈장 막 (LPM)을 따라 또는 세포질 (STAD, 곧장 안테로-등쪽 피질)을 통해 이동할 수 있다고 보고했다6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
난구 핵 이동은 약 3 h6의현상이며, 지금까지 실제 마이그레이션의 시작을 촉발시키는 이벤트는 알 수 없습니다. 이주의 시작은 또한 이 기계장치를 공부하는 데 이용된 단백질 돌연변이에 의해 연기될 수 있습니다. 이러한 알려지지 않은 변수는 오랜 기간(10-12h)에 걸쳐 이미지를 획득하도록 동기를 부여했습니다. 따라서 난모세포가 살아 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 계란 챔버가 발전함에 따라 구형에서 타원형 모양으로 안테로 후방 축을 따라 길게 변합니다. 이러한 신장은 1단계에서 8단계로, 안후축7에수직으로 발생하는 여포 세포의 회전에 의해 구동된다. 또한, 맥동 특성이있는 근육의 관 칼집은 계란 챔버를 둘러싸고 있습니다. 그것의 생리적 기능은 지속적으로 oviduct를 향해 개발 여포를 밀어하는 것입니다 8. 해부 후 계란 챔버의 진동을 유발하는 움직임을 제한하기 위해 높이 150 μm을 측정하는 관측 마이크로 챔버(도 3A)를설계했습니다. 이 높이는 10단계와 11단계에서 여포의 크기보다 약간 높습니다. 계란 챔버의 회전을 유지하면서 시료의 수직 이동을 상당히 제한하여 여포 발달에 제한된 결함을 초래합니다. 그런 다음 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 다중 위치 시간 경과 획득에 의해 해부 된 계란 챔버에 12 시간 동안 라이브 이미징을 수행합니다. 여기서 우리는 6단계와 7단계 사이의 난소핵 이주를 연구하기 위한 우리의 의정서를 설명합니다.
도 3: 관측실의 회로도 표현. (A)(상단 보기) 슬라이드 의 중간에 드릴웰의 높이 (A)와 둘레 (A')와 알루미늄 슬라이드의 정확한 치수. (B)(하단 뷰) 우물을 차단하는 커버슬립은 실리콘 그리스로 슬라이드에 밀봉된다. (C)(최고 보기) 해부 된 ovarioles는 가스 투과성 멤브레인에 의해 덮여 있는 화상 진찰 매체에서 개발한다. 할로카본 오일은 멤브레인을 안정화하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
핵 이주를 따르고 난마세포의 궤적을 정밀하게 평가하기 위해서는 핵 봉투와 플라즈마 멤브레인 모두에 대한 마커가 필요합니다. 이 목표를 가지고, 높은 신호 / 소음 비율을 가지고 라이브 이미징의 과정을 통해 퇴색하지 않는 두 개의 전간이 선택되었습니다. 플라즈마 멤브레인에 라벨을 붙이기 위해 RFP에 융합된 인간 인지질제 C ∂1(PLC∂1)의 Pleckstrin Homology(PH) 도메인을 인코딩하는 P[ubi-PH-RFP]를 사용하는 것이 좋습니다. 본 PH 도메인은난소9의혈장 막을 따라 분포된 인포이노시타이드 PI(4,5)P2에 결합한다. 핵 봉투의 경우, GFP가 Drosophila ß-importin을 인코딩하는 유전자 내에 GFP가 삽입되는 P[PPT-un1]Fs(2)는 동질적이고 강렬한신호(10)를표시한다. 어린 파리(1~2일)는 난소 해부 24-48h 전에 건조한 효모가 들어있는 신선한 유리병에 놓입니다.
이 라이브 이미징 분석의 경우, 시료에 대해 반응성이 없는 1mm 두께의 알루미늄 조각이 현미경 슬라이드의 치수로 절단되었습니다. 슬라이드 중앙에 16mm 직경의 구멍이 있어 0.85mm로 반소되어 있습니다. 이 카운터보어는 깊이가 150 μm(도3A)인추가 6mm 직경 구멍을 가지고 있습니다. 커버슬립은 알루미늄챔버(도 3B)의바닥에 실리콘 그리스(시료에 대한 불활성)로 접착된다. 샘플을 중간 채워진 우물에 배치한 후,O2/CO2교환에 투과가능한 멤브레인을 매체 위에 배치하고 할로카본 오일(도3C)에둘러싸여 있다.
해부에 대 한, 0.05 x 0.02 mm의 팁 치수를 가진 스테인레스 스틸 집게를 사용 하 여 하는 것이 좋습니다., 그리고 0.20 m m 직경 바늘 의 분리에 대 한(도 4B,C). 마이그레이션하는 핵은 카메라가 장착된 회전 디스크 공초점 반전 현미경 CSU-X1에 이미지됩니다. 다중 위치 이미지는 24°C에서 15분마다 타임랩트에 의해 획득되었다. 15분 간격을 통해 샘플에 대한 형광 단백질 및 광독성의 제한된 광표백으로 다중 위치 획득을 수행할 수 있습니다. 또한, 짧은 간격은 핵 궤적을 따르는 훨씬 더 유익한 데이터를 제공하지 않을 것입니다. 영화는 피지 소프트웨어(11)를 통해 처리및 분석됩니다.
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Protocol
1. 이미징 중간 준비
- 사용 당일 신선한 미디어를 준비하십시오. 슈나이더 배지의 파이펫 200 μL (L-글루타민과 0.40 g/L의 NaHCO3은 10% 열 불활성 태아 송아지 혈청, 페니실린 의 100 U/mL, 그리고 100 mg/mL의 연쇄상 구균)로 보완되었습니다.
- 인슐린 의 30 μL 와 보충 10 mg/mL.
- 열 불활성 태아 종아리 세럼 4 μL을 추가합니다.
2. 관측실 준비
- 파이펫 팁으로 천공슬라이드(도 4D)의아래쪽 구멍 주위에 소량의 실리콘 그리스를 발라주세요.
- 두께 0.13-0.16mm의 24 x 50mm 커버슬립을 배치합니다.
- 파이펫 팁의 넓은 끝으로 커버슬립을 밀봉하고슬라이드(도 4F,G)에실리콘 링 내부를 만들기 위해 실리콘을 평평하게 하기 위해 커버슬립에 압력을 가한다.
3. 난소 해부
- CO2 패드에서 원하는 표현형의 암컷 비행을 마취시화한다.
- 해부 우물에서 이미징 배지의 150 μL에서 여성을이송한다(도 4H).
- 포셉으로 흉부를 잡고 두 번째 포셉으로 등복부 큐티클을 꼬집어 한 여성을 엽니다.
- 큐티클 개구부 시 쉽게 볼 수 있는 난소 쌍을 분리하고 분리합니다.
- 자궁, 배기 및 근육 칼집(그림 4I)을조심스럽게 제거합니다.
- 이미징 배지의 10-15 μL 을 떨어 뜨리고 이미징 챔버에 난소 1개를 전달한다(도4J,K).
4. 달걀 챔버 격리
- 난소를 분리하려면 난소의 후방 끝을 바늘로 (이전 단계로) 잡습니다. 다른 바늘로 세균을 조심스럽게 잡아당겨 바오리올을 따로 떼어 놓습니다.
- 계란 챔버에 나머지 근육 칼집을 제거; 칼집을 들고 다른 하나는 큰 챔버를 통해 ovariole에 당기고 (단계 9 이상).
- 흔들리지 않는 오바리오레가 가라앉고 커버슬립에 연락하도록 허용합니다.
- 집게의 도움으로 미세 챔버에서 늦은 단계와 난소의 나머지 부분을 제거합니다. 조심스럽게 획득을 용이하게하기 위해 바늘로 다른 사람으로부터 혈관을 거리(도 4L).
5. 관측실 폐쇄
- 투과성 멤브레인의 작은 사각형(10 x 10mm)을 자른다(도4M,N).
- 어떤 기포(도 4O)를추방하기 위해 이미징 매체의 상단에 멤브레인을 신중하게 적용합니다.
- 밀폐막의 윤곽에 우물 주위에 할로카본 오일의 얇은 층으로 챔버를 밀봉(도 4P,Q).
6. 이미징
- 40배 목표(HCX PL 아포, 1.25NA, 오일 침수)를 사용하여 반전된 현미경의 슬라이드 홀더에 이미징 설정을 배치합니다.
- 핵이 마이그레이션할 준비가 된 다른 단계 6 난모세포의 위치를 찾아 저장합니다.
- 488 및 561 nm 레이저를 설정합니다. 150mW의 측정 된 출력 레이저 전력으로 레이저 전력의 30 %와 300 ms 및 500 ms 노출을 각각 사용합니다.
- 실험을 설정합니다. 핵을 중심으로 1 μm의 간격으로 15 분-41 섹션의 간격으로 12 h의 시간 경과를 취하십시오.
참고: 위에서 설명한 노출 시간에 따라 이 설정을 사용하면 약 45초에서 한 위치를 획득할 수 있습니다. 위치 변경으로 인해 지연이 있으므로 이러한 조건에서 최대 12개의 포지션을 설정하는 것이 좋습니다.
7. 이미지 분석
- 플러그인 직교 보기를 사용하여 소프트웨어 피지에서 영화를 처리하고 수동으로 핵을 추적합니다.
그림 4: 단계 마이크로 챔버 장착 사진. (A, B, C) 필요한 도구의 준비 : 잘 플레이트, 집게, 바늘, 이미징 매체, 실리콘 그리스, 투과 성 멤브레인 및 알루미늄 슬라이드를 해부. (D)파이펫 팁이 있는 알루미늄 슬라이드 뒷면의 실리콘 그리스를 적용합니다. (E)유리 커버슬립이 실리콘 그리스에 붙어 챔버의 바닥을 만듭니다. (F,G) 피펫 팁의 넓은 극단으로 커버슬립의 압력 적용으로 챔버 내부의 조인트를 만듭니다. (H,I) 이미징 미디어에서 플라이 난소의 해부. (J)마이크로 챔버에서 이미징 매체의 한 방울의 파이프팅. (K,L) 바늘을 사용하여 마이크로 챔버에서 혈관의 분리. (M,N,O) 투과성 멤브레인은 10 x 10mm 정사각형으로 절단하고 마이크로 챔버에서 배지의 방울 위에 배치합니다. (P,Q) 할로탄소 오일마이크로 챔버밀봉. 샘플을 이미지화할 준비가 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
마이그레이션하기 전에 핵은 동적이며 사전 마이그레이션으로 정의된 기간 동안 중앙 위치 주위의 진동이 발생합니다. 이 작은 움직임은 난모세포의 중간에 평형을 유지하는 밀고 당기는 힘의 균형을 반영한다. 핵의 궤적을 정량화함으로써, 우리는 APM과 LPM 궤적이 비슷한 비율을 가지고 있음을 보여 주었다. 우리는 핵과 혈장 멤브레인6사이의 첫 번째 접촉에 의해 궤적의 본질을 정의한다. 따라서, 핵은 이를 따라 미끄러지기 전에 APM 또는 LPM에 도달하여 두 혈장 멤브레인의 교차점에 도달한다(도5,영화 1-2). 또한, 우리는 뚜렷한 단서가 각 궤적을 선호한다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어, 난낭의 핵과 후방 막 사이에 클러스터된 중척추생물은 APM 궤적을 가능하게 한다. 반대로, 핵 봉투에 비대칭적으로 위치한 미세투필-관련 단백질(MAP) 버섯 체결함(Mud)은 LPM6을따라 궤적을 지원합니다. 더욱이, 중구 또는 진흙의 고갈은 야생형 컨텍스트6에비해 핵의 이동 속도에 영향을 미친다.
도 5: 살아있는 이미징 현미경 검사법에 의한 난낭 핵의 이동의 대표적인 이미지. (A)핵 봉투 마커(Fs(2)KetGFP) 및 플라즈마 멤브레인 마커(ubi-PH-RFP)를 발현하는야생형 계란 챔버의 난소세포 핵의 핵 이주를 보여주는 타임랩스 무비 1으로부터 추출한 선택된 프레임. (B)난마귀에 초점을 맞춘 영화 2 (영화 1의자른 버전)에서 선택한 프레임. 시간 경과의 시작 부분에 대한 시간(h:min)은 선택한 각 프레임의 맨 위에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
난소와 계란 챔버 의 성장은 시간 경과 기록(그림 5)에서쉽게 볼 수있는 올바른 개발의 징후입니다. 반대로, 막기 기형이 모낭 세포를 분해하고, 세포를 기절시키고, 수축된 핵은 죽어가는 계란 챔버의 첫 징후이다(그림6, 영화 3-4). 이러한 퇴행성 계란 챔버의 관찰에 따라, 핵 운동은 더 이상 분석을 위해 악용할 수 없습니다. 일반적으로, 우리는 이미징(도 6A)의8 h 전에 어떤 퇴화 oocyte를 관찰하지 않으며 조기 변성의 드문 경우는 해부 또는 장착 단계(도 6B)동안의문제로 인한 것입니다. 우리는 난모세포의 50%가 화상 진찰의 10 시간 후에 아직도 살아 있다는 것을 고려합니다.
도 6: 라이브 이미징 중 계란 챔버의 변성의 대표적인 이미지. (A)8시간 후 야생형 계란 챔버의 변성을 보여주는 타임랩스 무비 3로부터 추출된 선택된 프레임, 핵 봉투 마커(Fs(2)KetGFP) 및 플라즈마 멤브레인 마커(ubi-PH-RFP)를 표현한다. (B)야생형 계란챔버의 급속한 변성을 보여주는 Movie 4로부터 추출된 선택된 프레임. 이러한 초기 변성은 해부 또는 장착 단계 중 문제의 특징이다. 시간 경과의 시작 부분에 대한 시간(h:min)은 선택한 각 프레임의 맨 위에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
과도한 움직임은 계란 챔버가 이미지 된 프레임에 남아 있지 않기 때문에 사용할 수없는 데이터와 추가 분석을 초래하는 추가 문제가 될 수 있습니다. 이 문제를 우회하기 위해, 우리는 관찰의 적절한 프레임을 제공하고 oocyte 핵에 의해 취해진 철새 경로의 질적 평가를위한 충분한 해상도를 제공하면서 x-y 평면을 따라 계란 챔버의 움직임을 허용하는 40 배 목표를 사용합니다. 또한 z축에서 과도한 움직임의 효과를 제한하고 z 스택 범위 내에서 난토를 유지하기 위해 40 μm 스택(41μm 1 μm 간격)을 초과하는 z 단면을 수행하며, 스테이지-6 난낭은 20 μm의 크기를 갖는다.
영화 1: 핵봉투마커(Fs(2)와플라즈마 멤브레인마커(ubi-PH-RFP)를모두 표현하는 야생형 계란 챔버의 대표적인 영상. 이 예에서, oocyte 핵은 전방 막에 먼저 접촉하고 안테로-등쪽 모서리에 도달하기 위하여 그(것)들을 따라 밀어. 시간 경과의 경과 시간은 비디오의 왼쪽 위 모서리에 h:min으로 표시됩니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2 : 난마귀에 초점을 맞춘 영화 1의 자른 버전. 시간 경과의 경과 시간은 비디오의 왼쪽 위 모서리에 h:min으로 표시됩니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 3: 핵봉투마커(Fs(2)와플라즈마 멤브레인마커(ubi-PH-RFP)를모두 표현하는 야생형 계란 챔버의 대표적인 영상. 이 예에서, 계란 챔버는 핵 이동이 완료되기 전에 8:45 h에서 퇴화하기 시작합니다. 시간 경과의 경과 시간은 비디오의 왼쪽 위 모서리에 h:min으로 표시됩니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 4: 핵봉투마커(Fs(2)와플라즈마 멤브레인마커(ubi-PH-RFP)를모두 표현하는 야생형 계란 챔버의 조기 변성의 대표적인 영상. 시간 경과의 경과 시간은 비디오의 왼쪽 위 모서리에 h:min으로 표시됩니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다른 프로토콜은 실시간 이미징 분석12,13에대한 Drosophila 계란 챔버 전 vivo를 준비하고 문화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 참신은 중공 알루미늄 슬라이드, 커버슬립 및 O2/CO2 투과성 멤브레인을 사용하여 생성된 이미징 챔버의 사용입니다. 이 셋업의 주요 장점은 샘플에 압력을 가하지 않고 Z의 움직임을 제한하는 것입니다. 따라서, 난모세포는 여전히 자유롭게 움직일 수 있으며, 이것이 첫 번째, 40x 목표가 사용되고 둘째, z-스택이 40 μm을 따라 획득되는 반면, 난소는 6단계에서 약 20 μm 높이이다.
이 프로토콜은 비교적 간단하지만 각 단계는 분석에 중요합니다. 마이크로 챔버의 준비, 투과성 멤브레인 및 챔버의 밀봉은 가스 교환을 허용하고 이미징 매체의 건조를 방지하고, 따라서, 샘플. 계란 챔버를 손상하면 생존이 손상되므로 섬세하고 정밀한 해부 기술이 가장 중요합니다. 추가적으로, 근육 칼집은 완전히 제거 되어야 하는이 구조의 나머지 조각 원치 않는 계란 챔버 운동 귀 착될 것 이다.
알루미늄은 시료의 안전성 외에도 강도, 내구성 및 세척편의성으로 선정되었습니다. 다른 자료는 이러한 조건하에서 아직 조사되지 않았습니다. 3D 프린터의 개발과 플라스틱의 사용은 유혹이다; 그러나 높이가 150μm인 구멍을 만드는 것은 매우 정확해야 합니다.
최근 Huynh와 동료들은 하이드로겔14를기반으로 드로소필라 저마리움에 적응한 이미징 기술을 개발했습니다. 이것이 oogenesis에서 단계 6에 적응할 수 있는지 여부는 시험될 남아 있습니다. 구체적으로, 모낭의 회전과 같은 움직임이 하이드로겔 시스템에서 발생할 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다. 이러한 회전 움직임은 계란 챔버의 신장에 필수적이며, 따라서, 정상적인 개발.
다른 프로토콜은 단한로탄소 오일을 사용하여 오낭 핵 마이그레이션15,16을따랐다. 오일의 광학적 특성과 프로토콜에 사용되는 이미징 매체는 매우 다릅니다. 특히 슈나이더 배지는 450nm 전후의 파장에 대해 최대 광 흡수를 가합니다. 따라서 오일로 신호/잡음 비율이 더 높은 것을 관찰합니다. 그러나 할로카본 오일은 난낭 생존을 1-2h로 크게 감소시켜 핵의 전체 이동을 따르는 능력을 제한하며, 이는 특히 이 이동이 방해받는 유전적 맥락에서 제한됩니다. 이 현재 프로토콜을 사용하면 이미징 매체를 통해 계란 챔버의 긴 생존을 허용하여 최대 12시간까지 타임랩스 레코딩을 수행할 수 있습니다. 따라서 전체 마이그레이션 프로세스를 캡처할 수 있는 기회를 극대화합니다.
현재 매개 변수를 사용하여 시간 경과에 대해 최대 12개의 위치만 수행할 수 있습니다. 평균적으로, 이미지된 핵의 1/3은 실행 가능하고 분석될 수 있다. 효율성을 높이기 위해 두 파장의 획득을 동시에 허용하는 듀얼 카메라 시스템을 갖춘 회전 디스크 현미경을 사용하여 획득 시간을 단축하여 위치 수를 늘릴 수 있습니다.
더욱이, 이 마이크로 챔버는 비교적 오랜 기간 동안 해부된 계란 챔버를 배양할 수 있기 때문에, 그 사용은 전 생체내 평가가 필요한 drosophila oogenesis의 다른 동적 메커니즘의 연구로 확장 될 수있다 (예를 들어, 분모에서 세포질 스트리밍, 여포 회전, 여포 세포 형태 증 등).
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 원래 프로토콜을 개발하고 우리와 함께 그림 3의 몇 가지 그래픽 요소를 공유 장 앙투안 레페산트와 니콜라스 티소트에 매우 감사드립니다. 그림 4의 사진을 찍은 패니 롤랜드 고셀린에게 감사드립니다. 우리는 또한이 기술의 개량에 기여 도움이 토론에 기여한 다른 실험실 구성원과 이 원고를 개선하는 데 도움이 그의 의견에 대한 나다니엘 Henneman에 감사드립니다. 우리는 프랑스 바이오 이미징 (ANR-10-INBS-04)의 회원 인 자크 모노드 연구소의 이마고세인 핵심 시설을 인정합니다. Maëlys Loh는 프랑스 연구부(MESRI)의 박사 학위 펠로우십의 지원을 받고 있습니다. 앙투안 구이체와 프레드 버나드는 ARC (그랜트 PJA20181208148), 협회 데 엔트레프리즈 콘트레 르 암 (그랜트 게플루크 2020 #221366)과 IdEx Université 드 파리 (ANR-18-IDEX-0001)의 출현 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetize CO2 pad | Dutscher | 789060 | Anesthetize flies |
| Coverslip (24x50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Observation-chamber preparation |
| Forceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissection |
| Stainless steel needles | Entosphinx | 20 | Dissection |
| Heat-inactivated fetal calf serum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Imaging medium |
| Insulin solution bovine pancreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Imaging medium |
| Penicilin/Streptomycin solution | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Imaging medium |
| Permeable membrane | Leica | 11521746 | Observation-chamber preparation |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Imaging medium |
| Silicon grease | BECKMAN COULTER | 335148 | Observation-chamber preparation |
| Spinning disk confocal | Zeiss | CSU-X1 | Nuclear migration observation |
| Voltalef oil 10S | VWR | 24627 - 188 | Observation-chamber preparation |
References
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