Summary
I Drosophilagjennomgår oocyttkjernen mikrotubulavhengig migrasjon under oogenese. Her beskriver vi en protokoll som ble utviklet for å følge migrasjonen ved å utføre levende avbildning på eggkamre ex-vivo. Vår prosedyre opprettholder eggkamre i live i 12 timer for å skaffe seg 3D-tidsforløpfilmer med flere posisjoner ved hjelp av konfektmikroskopi med spinnende disk.
Abstract
Levende celleavbildning er spesielt nødvendig for å forstå de cellulære og molekylære mekanismene som regulerer organelle bevegelser, cytoskjelett omorganiseringer eller polaritetsmønster i cellene. Når du studerer oocyttkjerneposisjonering, er live-imaging teknikker avgjørende for å fange opp de dynamiske hendelsene i denne prosessen. Drosophila eggkammer er en multicellulær struktur og et utmerket modellsystem for å studere dette fenomenet på grunn av sin store størrelse og tilgjengelighet av mange genetiske verktøy. Under Drosophila midt-oogenese migrerer kjernen fra en sentral posisjon i oocytten for å vedta en asymmetrisk posisjon formidlet av mikrotubulegenererte krefter. Denne migrasjonen og plasseringen av kjernen er nødvendig for å bestemme polaritetsøksene til embryoet og den etterfølgende voksne fly. Et kjennetegn ved denne overføringen er at den forekommer i tre dimensjoner (3D), noe som skaper en nødvendighet for levende avbildning. For å studere mekanismene som regulerer kjernefysisk migrasjon, har vi derfor utviklet en protokoll for å dyrke de dissekerte eggkamrene og utføre levende avbildning i 12 timer ved tidsforløpoppkjøp ved hjelp av spinnende disk konfokal mikroskopi. Samlet sett tillater våre forhold oss å bevare Drosophila eggkamre i live i lang tid, og dermed muliggjøre fullføring av kjernefysisk migrasjon som skal visualiseres i et stort antall prøver i 3D.
Introduction
I flere år har Drosophila-oocytten dukket opp som et modellsystem for å studere kjernefysisk migrasjon. Drosophila oocytten utvikler seg i en multicellulær struktur kalt eggkammeret. Eggkamre omfatter 16 bakterieceller (15 sykepleierceller og oocytten) omgitt av et epitellag av follikulære somatiske celler. Eggkammerutvikling har blitt delt inn i 14 stadier (Figur 1A), hvor oocytten vil vokse og akkumulere reserver som er nødvendige for den tidlige utviklingen av embryoet. Under utviklingen, ved mikrotubul omorganisering og asymmetrisk transport av mors determinanter, polariserer oocytten langs antero-dorsale og dorso-ventrale akser. Disse aksene bestemmer de påfølgende polaritetsøksene til embryoet og den voksne som oppstår ved befruktning av denne oocytten1. Under oogenese vedtar kjernen en asymmetrisk posisjon i oocytten. I trinn 6 er kjernen sentrert i cellen. Ved et ennå ikke identifisert signal som slippes ut av de bakre follikulære cellene som mottas av oocytten, migrerer kjernen mot skjæringspunktet mellom de fremre og laterale plasmamembranene i trinn 7 (Figur 1B)2,3. Denne asymmetriske posisjonen er nødvendig for å indusere bestemmelsen av dorso-ventralaksen.
Figur 1: Drosophila melanogaster eggkamre. (A) Fast ovariol fra transgene fluer som uttrykker Fs(2)Ket-GFP som merker atomkonvoluttene og ubi-PH-RFP som merker plasmamembranene. Ovariolen består av å utvikle eggkamre på forskjellige stadier. Modningen øker langs antero-posterioraksen med germariumet på den fremre spissen (venstre) der bakteriestammecellen ligger og det eldre stadiet på bakre spiss (høyre). (B) Z-projeksjon av levende eggkammer ved å spinne disk konfektmikroskopi på trinn 6 av oogenese (venstre), der kjernen er sentrert i oocytten. Kjernen vil migrere for å vedta en asymmetrisk posisjon på trinn 7 (høyre) i kontakt med den fremre plasmamembranen (mellom oocytten og sykepleiercellen) og den laterale plasmamembranen (mellom oocytten og follikulære celler). Denne posisjonen vil indusere bestemmelsen av dorsalsiden og dermed eggkammerets dorso-ventrale akse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I mange tiår har denne kjernefysiske migrasjonen blitt studert på fast vev ved immunstaining. Denne tilnærmingen har spesielt gjort det mulig å demonstrere at denne prosessen avhenger av et tett nettverk av mikrotubuler4,5. Mer nylig utviklet vi en protokoll som tilbyr forhold som er kompatible med live bildebehandling av oocytten i løpet av flere timer, noe som gjør det mulig å studere denne prosessen dynamisk6.
Derfor har vi for første gang kunnet beskrive at kjernen har fortrinnsrett og karakteristiske baner under sin migrasjon, en langs den fremre plasmamembranen (APM) og en annen langs den laterale plasmamembranen (LPM) i oocytten (figur 2). Disse siste resultatene understreker viktigheten av live-imaging protokoller når du studerer dynamiske prosesser som kjernefysisk migrasjon.
Figur 2: Skjematisk representasjon av de ulike overføringsbanene til kjernen. På trinn 6 av oogenesen er oocytten en stor celle med en sentral kjerne. På dette stadiet er antero-posterior polaritetsaksen satt med en bakre / lateral plasmamembran av oocytten i kontakt med follikulære celler og den fremre plasmamembranen (i gult) er i kontakt med sykepleiercellene2. Vi har tidligere rapportert at kjernen kan migrere enten langs den fremre plasmamembranen (APM), langs lateral plasmamembranen (LPM), eller gjennom cytoplasma (STAD, rett til antero-dorsal cortex)6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Oocyttkjernemigrasjonen er et fenomen på ca 3 h6, og så langt er hendelsen som utløser starten på selve migrasjonen ukjent. Starten på migrasjonen kan også forsinkes av proteinmutanter som brukes til å studere denne mekanismen. Disse ukjente variablene motiverte oss til å skaffe bilder over lange tidsperioder (10-12 timer). Det er derfor viktig å sørge for at oocyttene forblir i live. Etter hvert som eggkammeret utvikler seg, forlenger det langs antero-posterioraksen fra en sfærisk til en elliptisk form. Denne forlengelsen drives av rotasjonen av follikulære celler, som oppstår fra trinn 1 til trinn 8, vinkelrett på antero-posterioraksen7. I tillegg omgir en rørformet skjede av muskel med pulsatile eiendom eggkamrene. Den fysiologiske funksjonen er å skyve de utviklende folliklene mot ovidukten kontinuerlig8. For å begrense bevegelsene som induserer svingninger i eggkamrene etter avhandlingen, designet vi et observasjonsmikrokammer som måler 150 μm i høyden (Figur 3A). Denne høyden er marginalt høyere enn størrelsen på en follikkel i trinn 10 og 11. Det begrenser betraktelig de vertikale bevegelsene til prøven samtidig som rotasjonen av eggkammeret bevares, og dermed resulterer det i begrensede feil i follikkelutviklingen. Vi utfører deretter levende avbildning i 12 timer på dissekerte eggkamre ved flerposisjonelle tidsforløpanskaffelser ved hjelp av et konfokalt mikroskop med spinnende disk. Her beskriver vi vår protokoll for å studere oocytt kjernefysisk migrasjon mellom trinn 6 og 7.
Figur 3: Skjematisk representasjon av observasjonskammeret. (A) (Sett ovenfra) Nøyaktige dimensjoner på aluminiumsskuffen med høydene (A) og omkretsene (A'' av brønnen boret midt i skredet. (B) (Nederste visning) En deksler som blokkerer brønnen er forseglet til lysbildet med silisiumfett. (C) (Sett ovenfra) Dissekerte eggstokker utvikler seg i et bildemedium som er dekket av en gassgjennomtrengelig membran. Halokarbonolje brukes til å stabilisere membranen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å følge atommigrasjonen og nøyaktig vurdere baner i oocytten, er det nødvendig med markører for både atomkonvolutten og plasmamembranen. Med dette målet er to transgenes som har et høyt signal / støyforhold og ikke falmer i løpet av live bildebehandling valgt. For å merke plasmamembranen anbefales det å bruke en P[ubi-PH-RFP] som koder Pleckstrin Homology (PH)-domenet til Human Phospholipase C ∂1 (PLC∂1) som er smeltet til RFP. Dette PH-domenet binder seg til fosfoinositid PI(4,5)P2 fordelt langs plasmamembranen til oocytten9. For atomkonvolutten viser P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP proteinfellestamme der GFP settes inn i genet som koder Drosophila ß-importin, et homogent og intenst signal10. Unge fluer (1-2 dager gamle) plasseres i friske hetteglass som inneholder tørr gjær 24-48 timer før eggstokk disseksjon.
For denne levende bildeanalysen er et 1 mm tykt stykke aluminium, som ikke er reaktivt for prøven, kuttet inn i dimensjonene til en mikroskopisklie. Den har et hull med en diameter på 16 mm i midten av lysbildet som er motboret til 0,85 mm. Denne motbanen har et ekstra hull med en diameter på 6 mm med en dybde på 150 μm (figur 3A). En deksler limes med silikonfett (inert for prøven) nederst i aluminiumskammeret (Figur 3B). Etter å ha plassert prøvene i den middels fylte brønnen, plasseres en membran som kan gjennomsyres av O2/CO2-utveksling over mediet og er omgitt av halokarbonolje (figur 3C).
For disseksjonen anbefales det å bruke rustfrie stål tang med en spissdimensjon på 0,05 x 0,02 mm og 0,20 mm diameter nåler for separasjon av eggstokkene (Figur 4B,C). De migrerende kjernene er avbildet på et konfokalt invertert mikroskop CSU-X1 med spinnende disk utstyrt med et kamera. Bilder med flere posisjoner ble anskaffet ved tidsforløp hvert 15. Et intervall på 15 minutter gjør det mulig å utføre oppkjøp med flere posisjoner med begrenset fotobleaching av fluorescerende proteiner og fototoksisitet for prøvene. Videre vil et kortere intervall ikke gi mye mer informative data for å følge kjernefysiske baner. Filmene behandles og analyseres via Fiji-programvare11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bildebehandling medium forberedelse
- Forbered ferske medier på bruksdagen. Pipette 200 μL Schneider medium (inneholder L-Glutamine og 0,40 g/l NaHCO3 supplert med 10% varmeinaktivert fosterkalvserum, 100 U/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin).
- Supplement med 30 μL insulin 10 mg/ml.
- Tilsett 4 μL varmeinaktivert fosterkalvserum.
2. Forberedelse av observasjonskammer
- Med pipettespiss kan du påføre en liten mengde silikonfett rundt hullet på undersiden av den punkterte sklien (Figur 4D).
- Plasser en 24 x 50 mm deksler på 0,13-0,16 mm tykkelse.
- Med den brede enden av en pipettespiss, trykk på dekslene for å flate ut silikonet for å forsegle dekslene og lage en silikonring innvendig til lysbildet (Figur 4F,G).
3. Eggstokk disseksjon
- Bedøv en kvinnelig flue av ønsket fenotype på en CO 2-pute.
- Overfør kvinnen i 150 μL av bildemediet i en dissekeringsbrønn (Figur 4H).
- Åpne en kvinne ved å ta tak i thoraxen med tang og klemme dorsal abdomen kutikal med et annet par tang.
- Isoler og løsne eggstokkene, som skal være lett synlige ved kutikal åpning.
- Fjern forsiktig livmor, ovidukt og muskelhylse (Figur 4I).
- Plasser en dråpe på 10-15 μL av bildemediet og overfør en eggstokk i bildekammeret (Figur 4J,K).
4. Eggkammerisolasjon
- For å skille eggstokkene, hold den bakre enden av eggstokken (mot de eldre stadiene) med nålen. Ert fra hverandre eggstokkene ved å forsiktig trekke på germariumet med en annen nål.
- Fjern den gjenværende muskelhylsen på eggkamrene; den ene nålen som holder hylsen og den andre trekker på ovariolen gjennom de større kamrene (trinn 9 eller eldre).
- La den uskadde ovariolen synke og komme i kontakt med dekslene.
- Fjern sene stadier og resten av eggstokkene fra mikrokammeret ved hjelp av tang. Avstand forsiktig eggstokkene fra de andre med nåler for å lette oppkjøpet (Figur 4L).
5. Observasjonskammerlukking
- Klipp en liten firkant (10 x 10 mm) gjennomtrengelig membran (Figur 4M,N).
- Påfør membranen forsiktig på toppen av bildemediet for å utvise luftbobler (Figur 4O).
- Hermetisk forsegle kammeret med et tynt lag halokarbonolje rundt brønnen på membranekonturen (Figur 4P,Q).
6. Bildebehandling
- Plasser bildeoppsettet på skyveholderen på det inverterte mikroskopet ved hjelp av et 40x objektiv (HCX PL Apo, 1,25NA, oljeinnlevelse).
- Finn og lagre posisjoner i forskjellige trinn 6 oocytter der kjernen er klar til å migrere.
- Sett opp 488 og 561 nm lasere. Med en målt utgangslasereffekt på 150 mW, bruk henholdsvis 30% av lasereffekten og 300 ms og 500 ms eksponering.
- Sett opp eksperimentet. Ta en tidsforløp på 12 timer med intervallet på 15 min-41 seksjoner med et intervall på 1 μm sentrert på kjernen.
MERK: I henhold til eksponeringstiden som er beskrevet ovenfor, tillater denne innstillingen anskaffelse av en posisjon på rundt 45 s. Siden det er en forsinkelse på grunn av posisjonsendring, anbefales det å sette maksimalt 12 stillinger under disse forholdene.
7. Bildeanalyse
- Behandle filmene på programvaren Fiji, ved hjelp av plug-in Orthogonal-visningen og spor kjernene manuelt.
Figur 4: Trinnvise mikrokammermonteringsbilder. (A,B,C) Forberedelse av de nødvendige verktøyene: dissekering av brønnplate, tang, nåler, bildemedier, silisiumfett, gjennomtrengelig membran og aluminiumssklie. (D) Påføring av silisiumfettet på baksiden av aluminiumsskuffen med pipettespiss. (E) En glassdekslelip limes på silisiumfettet for å skape bunnen av kammeret. (F,G) Trykkpåføring på dekslene med den bredere ekstremiteten til en pipettespiss for å skape en skjøt inne i kammeret. (H,I) Disseksjon av flueovaries i bildemediene. (J) Pipettering av en dråpe bildemedier i mikrokammeret. (K,L) Separasjon av eggstokkene i mikrokammeret ved hjelp av nåler. (M,N,O) Gjennomtrengelig membran kuttet i en 10 x 10 mm firkant og plassert over mediets fall i mikrokammeret. (P,Q) Tetting av mikrokammeret med halokarbonolje. Prøvene er klare til å avbildes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før migrasjon er kjernen dynamisk og svinger rundt en sentral posisjon i en periode definert som forflytting. Disse små bevegelsene gjenspeiler en balanse mellom å presse og trekke krefter som opprettholder likevekt midt i oocytten. Ved å kvantifisere banene til kjernene har vi vist at APM- og LPM-banene hadde lignende proporsjoner. Vi definerer banens natur ved første kontakt mellom kjernen og plasmamembranen6. Dermed når kjernen enten APM eller LPM før den glir langs den, for å nå sin endelige posisjon i skjæringspunktet mellom de to plasmamembranene (Figur 5,Filmer1-2). Videre har vi vist at tydelige signaler favoriserer hver av banene. For eksempel muliggjør sentrosomene som er gruppert mellom kjernen og den bakre membranen i oocytten APM-banen. Omvendt støtter mikrotubule-assosiert protein (MAP) Mushroom Body Defect (Mud), som ligger asymmetrisk til atomkonvolutten, en bane langs LPM6. Videre påvirker uttømmingen av enten sentrosomer eller gjørme migrasjonshastigheten til kjernen sammenlignet med den ville typen kontekst6.
Figur 5: Representative bilder av migreringen av oocyttkjernen ved levende bildemikroskopi. (A) Utvalgte rammer hentet fra tidsforløp Film 1 som viser atommigrering av oocyttkjernen til et eggkammer av vill type som uttrykker atomkonvoluttmarkøren (Fs(2)KetGFP) og plasmamembranmarkøren (ubi-PH-RFP). (B) Valgte delbilder fra Film 2 (den beskårne versjonen av Film 1) med fokus på oocytten. Tid (i t:min) i forhold til begynnelsen av tidsforløpet er angitt øverst i hver markerte ramme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Oocytten og eggkammerveksten er tegn på riktig utvikling, som er lett synlige i tidsforløpopptak (figur 5). Tvert imot er membrandeformiteter deorganiserte follikulære celler, stuntede celler og krympede kjerner de første tegnene på døende eggkamre (Figur 6, Film 3-4). Ved observasjon av disse degenerative eggkamrene er nukleibevegelsene ikke lenger utnyttbare for analyse. Vanligvis observerer vi ikke noen degenerert oocytt før 8 timers avbildning (figur 6A) og de sjeldne tilfellene av tidlig degenerasjon skyldes problemer under disseksjons- eller monteringstrinnene (Figur 6B). Vi anser at 50% av oocytter fortsatt er i live etter 10 timers avbildning.
Figur 6: Representative bilder av degenerasjonen av et eggkammer under levende bildebehandling. (A) Utvalgte rammer ekstrahert fra tidsforløp Film 3 viser degenerasjonen av et eggkammer av vill type etter 8 timer, og uttrykker atomkonvoluttmarkøren (Fs(2)KetGFP) og plasmamembranmarkøren (ubi-PH-RFP). (B) Utvalgte rammer hentet fra Film 4 som viser rask degenerasjon av et eggkammer av vill type. Slik tidlig degenerasjon er karakteristisk for et problem under avhandlingen eller monteringstrinnene. Tid (i t:min) i forhold til begynnelsen av tidsforløpet er angitt øverst i hver markerte ramme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Overdreven bevegelser kan være et ekstra problem som resulterer i ubrukelige data og videre analyse, da eggkamrene ikke vil forbli i den avbildede rammen. For å omgå dette problemet bruker vi et 40x mål som gir en tilstrekkelig observasjonsramme og tillater bevegelser av eggkamrene langs x-y-flyet samtidig som vi gir nok oppløsning til en kvalitativ vurdering av trekkstien tatt av oocyttkjernen. I tillegg, for å begrense effekten av overdreven bevegelser i z-aksen og for å holde oocytten innenfor z-stack-området, utfører vi z-seksjoner over 40 μm stack (41 seksjoner 1 μm fra hverandre), mens stage-6 oocyte har en størrelse på 20 μm.
Film 1: Representativ film av et eggkammer av vill type som uttrykker både atomkonvoluttmarkøren (Fs(2)Ket-GFP) og plasmamembranmarkøren (ubi-PH-RFP). I dette eksemplet kontakter oocyttkjernen først den fremre membranen og glir langs den for å nå antero-dorsalhjørnet. Den forløpte tiden for tidsforløpet er angitt i h:min øverst til venstre i videoen. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 2: Beskåret versjon av Film 1, med fokus på oocytten. Den forløpte tiden for tidsforløpet er angitt i h:min øverst til venstre i videoen. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 3: Representativ film av et eggkammer av vill type som uttrykker både atomkonvoluttmarkøren (Fs(2)Ket-GFP) og plasmamembranmarkøren (ubi-PH-RFP). I dette eksemplet begynner eggkammeret å degenerere ved 8:45 timer før ferdigstillelse av kjernemigrasjon. Den forløpte tiden for tidsforløpet er angitt i h:min øverst til venstre i videoen. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 4: Representativ film av tidlig degenerasjon av et eggkammer av vill type som uttrykker både atomkonvoluttmarkøren (Fs(2)Ket-GFP) og plasmamembranmarkøren (ubi-PH-RFP). Den forløpte tiden for tidsforløpet er angitt i h:min øverst til venstre i videoen. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Andre protokoller beskriver hvordan du forbereder og kultur Drosophila eggkamre ex vivo for live-imaging analyse12,13. Nyheten i denne protokollen er bruken av et bildekammer konstruert ved hjelp av en uthulet aluminiumssklie, en dekslelip og en O2/ CO2 gjennomtrengelig membran. Den største fordelen med dette oppsettet er å begrense bevegelsen i Z uten å utøve press på prøven. Dermed kan oocytten fortsatt bevege seg fritt, og dette er grunnen til at først brukes 40x-målet, og for det andre er z-stabler anskaffet langs 40 μm, mens oocytten er rundt 20 μm høyde på trinn 6.
Selv om denne protokollen er relativt enkel, er hvert trinn avgjørende for analysen. Forberedelsen av mikrokammeret, den gjennomtrengelige membranen og kammerets forsegling er avgjørende for å tillate gassutveksling og forhindre tørking av bildemediet og derfor prøvene. Å skade eggkammeret kompromitterer overlevelsen, så delikate og presise disseksjonsteknikker er avgjørende. I tillegg må muskelhylsen fjernes helt, da gjenværende biter av denne strukturen vil resultere i uønsket eggkammerbevegelse.
Aluminium, i tillegg til sikkerheten for prøven, er valgt for sin styrke, holdbarhet og enkel rengjøring. Andre materialer er ennå ikke undersøkt under disse forholdene. Bruken av plast med utviklingen av 3D-skriver er fristende; Imidlertid må man være veldig presis med å lage et hull med en høyde på 150 μm.
Nylig har Huynh og kolleger utviklet en bildeteknikk tilpasset Drosophila germarium basert på hydrogel14. Hvorvidt dette kan tilpasses trinn 6 i oogenese gjenstår å teste. Spesielt er det ikke kjent om bevegelser som rotasjon av follikkelen kan forekomme i hydrogelsystemet. Disse rotasjonsbevegelsene er avgjørende for forlengelsen av eggkammeret og dermed normal utvikling.
Andre protokoller har brukt halokarbonolje for å følge oocyttkjernemigrasjon15,16. De optiske egenskapene til olje og bildemediet som brukes i vår protokoll er svært forskjellige. Spesielt har Schneider-mediet maksimalt lysabsorpsjon for bølgelengder rundt 450 nm. Derfor observerer vi et høyere signal/støyforhold med olje. Halokarbonoljen reduserer imidlertid oocyttoverlevelsen til 1-2 timer, noe som begrenser evnen til å følge hele migrasjonen av kjernen, spesielt i genetiske sammenhenger der denne migrasjonen forstyrres. Med denne nåværende protokollen tillater bildemediet en lang overlevelse av eggkammer, slik at vi kan utføre tidsforløpopptak opp til 12 timer. Dermed maksimerer vi vår sjanse til å fange hele migreringsprosessen.
Ved hjelp av våre nåværende parametere kan vi bare utføre maksimalt 12 posisjoner for tidsforløpet. I gjennomsnitt er en tredjedel av de avbildede kjernene levedyktige og kan analyseres. For å forbedre effektiviteten kan et spinnende diskmikroskop utstyrt med et dobbelt kamerasystem, som vil tillate oppkjøp av begge bølgelengdene samtidig, brukes til å øke oppkjøpstiden og dermed øke antall posisjoner.
Videre, da dette mikrokammeret gjør det mulig å dyrke de dissekerte eggkamrene i en relativt lang periode, kan bruken utvides til studiet av andre dynamiske mekanismer for drosophila oogenese som må vurderes ex vivo (f.eks. cytoplasmisk streaming i oocytten, follikkelrotasjonen, follikkelceller morphogenesis, etc.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi er svært takknemlige for Jean-Antoine Lepesant og Nicolas Tissot som opprinnelig utviklet protokollen og delte noen grafiske elementer i figur 3 med oss. Vi takker Fanny Roland-Gosselin som tok bildene av figur 4. Vi takker også andre laboratoriemedlemmer for nyttige diskusjoner som bidro til ameliorasjonen av denne teknikken og Nathaniel Henneman for hans kommentarer som bidro til å forbedre dette manuskriptet. Vi anerkjenner ImagoSeine kjerneanlegget til instituttet Jacques Monod, medlem av France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh støttes av et stipendiat fra det franske forskningsdepartementet (MESRI). Antoine Guichet og Fred Bernard ble støttet av ARC (Grant PJA20181208148), Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) og av et Emergence-stipend fra IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetize CO2 pad | Dutscher | 789060 | Anesthetize flies |
| Coverslip (24x50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Observation-chamber preparation |
| Forceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissection |
| Stainless steel needles | Entosphinx | 20 | Dissection |
| Heat-inactivated fetal calf serum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Imaging medium |
| Insulin solution bovine pancreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Imaging medium |
| Penicilin/Streptomycin solution | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Imaging medium |
| Permeable membrane | Leica | 11521746 | Observation-chamber preparation |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Imaging medium |
| Silicon grease | BECKMAN COULTER | 335148 | Observation-chamber preparation |
| Spinning disk confocal | Zeiss | CSU-X1 | Nuclear migration observation |
| Voltalef oil 10S | VWR | 24627 - 188 | Observation-chamber preparation |
References
- Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
- Roth, S., Lynch, J. A. Symmetry breaking during drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).
- Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. Nucleus positioning within Drosophila egg chamber. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).
- Januschke, J., et al. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
- Cetera, M., Horne-Badovinac, S. Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).
- Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte. Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).
- Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa. Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).
- Chanet, S., Huynh, J. R. Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells. Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).
- Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis. Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).
- Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).
