Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Количественный 31P ЯМР анализ лигнинов и танинов

Published: August 2, 2021 doi: 10.3791/62696
Automatic Translation
2, 1, 1
1Department of Molecular Sciences and Nanosystems, Ca’ Foscari University of Venezia, 2Departments of Chemistry and Forest Biomaterials, North Carolina State University

Summary

31 31 ЯМР является мощным инструментом для структурного выяснения полифенолов. Эта быстрая, простая, точная, количественная и высоко воспроизводимая аналитическая процедура, которая позволяет количественно оценивать и дифференцировать различные типы гидрокси,фенольных и карбоксильных групп в лигнинах и танинах, теперь стала обычным аналитическим инструментом.

Abstract

Разработка устойчивых продуктов биоперерабатывающей продукции сталкивается, в частности, с проблемой валоризации лигнина и танина. Эти обильные, возобновляемые ароматические биополимеры не получили широкого применения из-за присущей им структурной сложности и высокой степени изменчивости и видового разнообразия. Отсутствие определенной первичной структуры для этих полифенолов дополнительно усугубляется сложными химическими изменениями, вызванными во время обработки, в конечном итоге придав большое разнообразие структурных особенностей, имеющих чрезвычайное значение для любых дальнейших усилий по использованию.

Следовательно, протокол для быстрой, простой и однозначной идентификации и количественной оценки различных функциональных групп, присутствующих в природных полифенолах, является фундаментальной предпосылкой для понимания и, соответственно, адаптации их реакционной способности и возможной полезности.

Количественный ЯМР 31дает возможность быстро и надежно идентифицировать незамещенные, о-монозамещенные и o-дисзамещенные фенолы, алифатические ОТн и часть карбоновой кислоты в лигнинах и танинах с широким потенциалом применения.

Методология состоит из процедуры количественной маркировки лигнина или танина in situ с использованием подходящего зонда, содержащего 31P, с последующим получением количественного спектра ЯМР 31P в присутствии внутреннего стандарта. Высокая естественная плотность ядра 31P позволяет использовать небольшое количество образца (~ 30 мг) и короткое время получения ЯМР (~ 30-120 мин) с хорошо разрешенными сигналами 31P, которые сильно зависят от окружающей химической среды меченых групп OH.

Introduction

Эта процедура, которая была недавно опубликована в Nature Protocols1, была процитирована более 3000 раз в архивной литературе и стала обычным измерением характеристики лигнина и танина, поскольку она обеспечивает важную, быструю и воспроизводимую структурную информацию.

Лигнин и дубильные вещества
Когда Зеленая химия была введена Полом Т. Анастасом и Джоном К. Вернером2,3,она резко изменила общую концепцию химии. В частности, важность использования устойчивых материалов вместо ископаемого сырья, такого как нефть и уголь, в качестве отправной точки подчеркивается в качестве важнейшего аспекта2,3. Среди различных типов биомассы лигнин является наиболее распространенным ароматическим биополимером и может рассматриваться как потенциальный источник промышленных товаров и продуктов с высокой добавленной стоимостью4.

Лигнин является вторым наиболее распространенным древесным компонентом (причем целлюлоза является первой, а гемицеллюлоза третьей). Его содержание в растениях варьируется в зависимости от типа растения: например, лиственные породы характеризуются меньшим количеством лигнина по сравнению с хвойными породами (20% ± 4% против 28% ± 4%). Кроме того, распределение лигнина в растительной ткани не однородно: более высокое содержание лигнина можно найти в клеточнойстенке5,6. Лигнин представляет собой полифенолический материал, полученный промышленным способом в качестве побочного продукта бумажной/целлюлозной промышленности7. Его извлекают из процесса древесной массы, в котором древесная щепа в основном перерабатывается в присутствии ионных условий OH- и/или OH- + HS- для отделения целлюлозы от гемицеллюлозы и лигнина (процессы соды и / или крафта)8,9.

Первые попытки изучения лигнина были предприняты Пайеном и Шульце, соответственно, в 1838 и 1865годах 10. В 1977 году Адлер обобщил все соответствующие имеющиеся знания тоговремени 11. В настоящее время признано, что строительными блоками лигнина являются три фенилпропаноидные единицы: п-кумариловый, хвойный и синапиловый спирты. Эти мономеры, благодаря процессу свободнорадикальной полимеризации, дают начало р-гидроксифенильным, гваяциловым и синапиловым единицам, которые в конечном итоге широко составляют лигнин(рисунок 1)12. Отсутствие первичной структуры в лигнинах подразумевает присущую ему трудность для его структурной характеристики. Соответственно, оценка распределения молекулярной массы всегда была несколько спорной. Измельченный древесный лигнин, лигнин, выделенный в мягких условиях, которые в основном приближаются к протолигнину10,состоит из олигомеров13, которые сильно взаимодействуют через процессы супрамолекулярной агрегации14,15.

Figure 1
Рисунок 1:Репрезентативная модель лигнина хвойных пород, в которой выделены различные типы связей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Лигнины обычно классифицируются в зависимости от: а) типа древесины, из которой они получены (например, лиственная и хвойная древесина), b) процесса, используемого для ее выделения. Наиболее важными промышленными типами лигнина являются крафт, лигносульфонаты и органосольв.

Структура лигнина сильно зависит от его происхождения и химии обработки. Более конкретно, когда довольно сложная и нерегулярная структура лигнина усугубляется его природным разнообразием и сложными химическими данными обработки, появляется материал чрезвычайной изменчивости, разнообразия и неоднородности, ограничивающий его использование низкоценными приложениями16. В то время как лигнины древесины хвойных пород содержат главным образом гуаяциловые единицы (G) с незначительными количествами p-гидроксифенильных групп (G-лигнин), лиственные лигнины состоят из гуаяциловых и синингильных субъединиц (GS лигнин) в различных соотношениях, а травяные лигнины состоят из субъединиц гуаяцила, сирингила и p-гидроксифенила (GSH лигнин). Экстрактивный подход, используемый для выделения, резко влияет на структуру возникающего лигнина17. На рисунке 2 показаны три структуры лигнина, отличающиеся используемым подходом к изоляции. Можно было бы выделить некоторые соображения, касающиеся воздействия метода экстракции. Во-первых, крафт-лигнин представляет собой салкилированный, сильно фрагментированный и конденсированный лигнин, в то время как лигнин Organosolv имеет структуру, похожую на измельченный древесный лигнин (выделенный с использованием подхода Бьоркмана)18,19,20. Наконец, лигносульфонаты характеризуются высокой степенью сульфирования в зависимости от интенсивности и условий процесса экстрактивного сульфирования.

Figure 2
Рисунок 2:Репрезентативные структуры для технических лигнинов. На этом рисунке можно увидеть различия между различными типами лигнина. (A)Крафт-лигнин хвойной древесины сильно конденсирован,(B)лигносульфонаты характеризуются сульфонными группами на насыщенных углеродах, а(C)органосольв-лигнин имеет структуру, аналогичную структуре измельченного древесного лигнина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Подобно лигнинам, танины представляют собой полифенольные соединения, которые содержатся в растениях. Недавний и обновленный обзор экстрактивных подходов и применений танинов был недавно выпущен Das et al.21. Значение дубильных веществ в повседневной жизни можно выделить на двух примерах: они придают вкус и цвет винам22; кроме того, их полифенольная структура обеспечивает антиоксидантные характеристики и делает их идеальными для применения в кожевенной промышленности23. Танины делятся на два класса: гидролизуемые и негидролизуемые. Гидролизуемые танины можно считать полимером сложных эфиров галльской, дигаллической и эллаговой кислот(рис. 3). Эти сложные эфиры являются результатом этерификации фенольных кислот молекулами сахара (например, глюкозы, ромнозы и арабинозы).

Figure 3
Рисунок 3:Типичные гидролизуемые танины: дубильной кислоты, вескальгина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Негидролизуемые танины, также известные как конденсированные танины, представляют собой полимеры и олигомеры, полученные из флаван-3-ол. Среди флаван-3-олов наиболее частыми являются катехины и галлокатехин. Они представляют собой бесцветные кристаллические соединения(рисунок 4). Полимеризация создает полимер, характеризующийся геликоидальной структурой. Ароматические гидроксигруппы направлены на внешнюю сторону спирали, в то время как пирановые кислороды находятся внутри.

Figure 4
Рисунок 4:Структуры проантоцианидина: R = H, OH, OCH3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Характеристика лигнинов и дубильных веществ с помощью ЯМР
При характеристике лигнина или танина решающее значение имеют два типа информации: (а) химическая структура (например, содержание гидроксигруппы, характер и частота взаимосвязей между собой) и (б) молекулярная масса и полидисперсность. Начиная с ранних исследований лигнина, для достижения этих целей использовались различные методы, и появились два класса методов: химические и физические методы.

В химии лигнина химические методы, такие как щелочное окисление нитробензола, дериватизация с последующим восстановительным расщеплением, окисление перманганата и тиоацидолиз, исторически широко использовались24,25,26,27,28,29. Однако, даже если аналитические протоколы были внедрены и оптимизированы, они требуют много времени, трудоемки и требуют обширных экспериментальных навыков30. Альтернативно, с самого начала инструментального анализа физические методы использовались для выполнения характеристик лигнина и танина31. Эти методики позволяют преодолеть проблемы классических методов, облегчая характеристику структуры лигнина.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) позволяет получить информацию о структуре и химическом составе лигнина среди инструментальных методов. В частности, данные количественных моноразмерных спектров ЯМР 1Ч и количественных ЯМР-спектров 13С могут дать информацию о различных типах лигниновых межъединых связей32,33,34,35. К сожалению, моноразмерные спектры страдают от перекрытия сигналов, что может серьезно подорвать усилия по интеграции сигналов. Количественные версии HSQC (гетероядерная одиночная квантовая когерентность), Q-HSQC (количественная - гетероядерная одиночная квантовая когерентность) были использованы для лучшего понимания структуры лигнина, предоставляя полезную информацию о внутренних связях. Тем не менее, они не могут быть полностью использованы для количественного определения различных зданийблоков 13,36,37.

Для преодоления проблем, связанных с моно- и двумерным ЯМР, рассмотрена дериватизация субстрата. Одним из преимуществ этого подхода является то, что специфические метки могут быть введены в сложную макромолекулу и не возникает спектральной интерференции от растворителя, в котором растворяются меченыеподложки1. Verkade был пионером в этой области, выполнив 31P ЯМР-анализ производных фосфора, производных угля и родственных соединений38. В его публикации был проведен скрининг различных фосфорсодержащих реагентов (фосфоланов), и зафиксирован химический сдвиг других меченых соединений. Команда Аргиропулоса впервые представила дериватизацию для количественного и качественного анализа гидроксигрупп в лигнине в 1991году. После изучения дериватизации модельных соединений лигнина с использованием фосфорсодержащих реагентов, его группа проложила путь для одного из наиболее ежедневно используемых методов в химии лигнина, 31P ЯМР-анализа39,40,41,42,43. Среди различных исследованных фосфоланов Аргиропулос пришел к использованию 2-хлор-4,4,5,5-тетраметил-1,3-2-диоксафосфолана (TMDP) как наиболее подходящего для проведения анализа лигнина44. TMDP избирательно реагирует с гидроксигруппами, вызывая количественное образование фосфорсодержащих производных, характеризующихся специфическими химическими сдвигами ЯМР 31(рис. 5).

Figure 5
Рисунок 5:Химия лигнина и танина фосфитилирования. Маркировка лигнина и танина лабильных групп H осуществляется путем реакции in situ. Меченые полифенолы характеризуются специфическими 31ЯМР-полосами, соответствующими различным типам гидроксигрупп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дериватизацию проб проводят в смеси пиридин/хлороформ (1,6:1); этот выбор является результатом точной оценки. Пиридин имеет два преимущества. Во-первых, выбор растворителя, характеризующегося параметром Хильдебранда около 22,1МПа 1/2, упрощает и усиливает солюбилизацию лигнина45. Следовательно, добавление пиридина в качестве растворителя, параметр Хильдебранда которого равен 21,7, таким образом, является оптимальным. Во-вторых, реакция TMDP с гидроксигруппами сопровождается образованием соляной кислоты (HCl) в качестве побольного продукта с сопутствующими негативными последствиями для легкого образования лигнин-фосфолановых производных. По этой причине полученный HCl необходимо нейтрализовать. При наличии значительного избытка основность пиридина по отношению к TMDP позволяет нейтрализовать HCl (путем образования гидрохлорида пиридина).

Использование рекомендуемой системы бинарных растворителей пиридин/дейтерированный хлороформ основано на трех причинах. Во-первых, это способствует растворению образца. Во-вторых, поскольку пиридина гидрохлорид растворим в хлороформе, он может предотвратить осаждение и ухудшение конечного спектра. В-третьих, дейтерированный хлороформ выбирается за его уникальный синглетный сигнал, позволяющий блокировать ЯМР-спектрометр в процессе сбора. Дериватизация образца проводится при наличии внутреннего стандарта. Таким образом, когда образец и стандарт дериватизированы, сравнение интегралов пиков образца и стандарта позволяет количественно оценить количество для каждого типа присутствующей гидроксигруппы. Различные соединения рассматривались в качестве внутренних стандартов. Эти соединения характеризуются одной гидроксигруппой на молекулу, предлагая один резкий сигнал в спектре ЯМР 31после дериватизации. Выбор стандарта должен быть сделан тщательно. Его сигнал не должен перекрываться с сигналами дериватизированного образца. Холестерин широко использовался в первые дни. Однако частичное перекрытие сигналами, возникающими из алифатической гидроксигруппы, ограничивает его использование. Для рутинного анализа предпочтительны внутренние стандартные растворы N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида (NHND). Однако из-за нестабильности NHND его стандартные решения могут храниться только в течение несколькихдней 46.

Protocol

Следующая блок-схема(рисунок 6)описывает весь экспериментальный протокол для выполнения 31ЯМР анализа лигнинов и танинов.

Figure 6
Рисунок 6:Процедура анализа 31P ЯМР лигнинов и танинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Предварительная обработка образцов

  1. Высушите аликвоту (около 100 мг) анализируемого вещества (образец лигнина или танина) на ночь в вакуумной печи, установленной при 40 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание необходимо уделять выбору температуры, поскольку температуры выше 40 °C могут химически изменять чувствительную структуру исследуемых полифенолов.
  2. После высыхания быстро перенесите образец в безводный осушитель сульфата кальция до тех пор, пока он не достигнет комнатной температуры. Этот шаг является обязательным, чтобы избежать поглощения образцом влаги из окружающей среды.

2. Приготовление раствора раствора раствора

  1. Готовят смесь растворителей пиридина/дейтерированного хлороформа во флаконе с образцом 20 мл путем смешивания безводного пиридина и дейтерированного хлороформа в соотношении 1,6/1 (v/v).
    ВНИМАНИЕ: Обратите внимание при манипулировании пиридином и дейтерированным хлороформом. Эти соединения легковоспламеняющиеся, вредные и токсичные. Приготовьте и используйте раствор в хорошо проветриваемом вытяжном капюшоне в соответствующих перчатках.
  2. Добавить 5-8 г хорошо промытых и высушенных активированных молекулярных сит 5А в гранулах 3,2 мм для удаления следов воды. Кроме того, использование крышки перегородки настоятельно рекомендуется для предотвращения контакта воздуха и загрязнения влагой системы растворителей. Хранить приготовленный раствор в темноте.

3. Внутреннее приготовление стандартного раствора (ИС)

  1. В колбе Эрленмейера объемом 2 мл готовят 0,1 М раствор ацетилацетоната хрома (III) (около 10 мг) и внутренний стандарт (около 35,8 мг NHND или 77,3 мг холестерина) в предварительно приготовленном растворе растворителя.
    ВНИМАНИЕ: Ацетилацетонат хрома (III) вреден; во время его манипуляции надевайте соответствующие перчатки.
  2. Запишите точный вес ИС, добавленного в решение ИС.
  3. Переложите раствор ИС во флакон, оснащенный герметичным колпачком, содержащим активированные молекулярные сита (см. пункт 2.2), и храните его в темноте при 40 °C.

4. Подготовка пробоотборного раствора ЯМР

  1. Точно взвесьте ~ 30 мг образца во флаконе 2 мл, оснащенном перемешивающим батончиком. Запечатайте флакон крышкой перегородки.
  2. Добавьте 0,5 мл раствора растворителя во флакон образца.
  3. Перенесите 100 мкл раствора ИС во флакон с образцом через микропипетку. Магнитно перемешайте полученную дисперсию (500 об/мин) до тех пор, пока весь лигнин или танин не растворится, в результате чего образовался прозрачный раствор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку полная солюбилизация образца является обязательной, этот этап может занять до 12 ч.
  4. Переложить 0,1 мл TMDP в образец раствора. Поместите образец под энергичное магнитное перемешивание. Держите образец раствора в герметичном удерживе. Используйте TMDP в хорошо проветриваемом вытяжном капюшоне, надев соответствующие перчатки.
    ВНИМАНИЕ: TMDP и его пары коррозионны, вредны и быстро взаимодействуют с водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образование желтого осадка происходит из-за следов воды в образце или растворе пиридина/хлороформа. В таком случае процедуру необходимо повторить, убедив все возможные загрязнения влагой.
  5. Перенесите раствор образца в ЯМР-трубку с помощью пипетки Пастера.

5. ЯМР-анализ

  1. Загрузите трубку в прибор ЯМР. Спектрометр, используемый для выполнения этого анализа, нуждается в широкополосном зонде.
  2. Зафиксируйте экспериментальные параметры в соответствии с настройкой, показанной в таблице 11.
ПУЛЬСОВАЯ ПРОГРАММА Обратный закрытый импульс разъединивания (zgig)
ЯДРА 31П
СПЕКТРАЛЬНАЯ ШИРИНА 100 с.m.
ВРЕМЯ ПРИОБРЕТЕНИЯ - 0,8 с
ЗАДЕРЖКА РЕЛАКСАЦИИ ≥ 10 с
КОЛИЧЕСТВО СКАНОВ 64 или более
СПЕКТРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР 140 с.m.

Таблица 1: Экспериментальные параметры для регистрации 31П ЯМР спектров производных лигнинов или дубильных веществ.

  1. Установите частоту спектрометра, используя резонансную частоту дейтерированного хлороформа, продувите образец и настройте спектрометр. Затем приступайте к приобретению.

6. Обработка и анализ спектра

  1. Обрабатывайте необработанные данные ЯМР 31с помощью соответствующего стандартного программного обеспечения в соответствии со следующими шагами.
    1. Выполните преобразование Фурье.
    2. Регулировка фазы вручную (Обработка | | коррекции фазы Ручная коррекция).
    3. Корректировать базовый уровень вручную, тщательно устанавливая нулевые точки (Обработка | Базовый | Многоточечная базовая коррекция).
  2. Калибровка сигнала.
    1. Установите сигнал для фосфитилированной воды на значение химического сдвига 132,2 ppm (Анализ | Справочные | Справка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие резкого сигнала 31P при 175 ppm обусловлено избытком TMDP. Его наличие обеспечивает полную дериватизацию образца. Если этот пик отсутствует, необходимо пересмотреть всю процедуру, предоставив тщательную сушку образца и растворителя и добавив больше TMDP. Как только это гарантировано, спектр увеличивается в спектральном диапазоне от 132 до примерно 150 ppm(рисунок 7).

Figure 7
Рисунок 7:Проверьте наличие избытка TMDP: если его можно увидеть, дериватизация образца завершена. Затем спектры могут быть проанализированы. Для этого масштабируйте спектральный диапазон от 155 до 132 ppm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Интеграция
    1. Нормализуйте интеграцию, установив внутренний стандарт на 1.0 (нажмите на пиковую | Редактирование интегральной | Нормализовано: 1.00). Выполните интеграцию спектра в соответствии с химическими сдвигами, о которых сообщается в следующих таблицах. Используйте таблицу 2 для лигнинов и таблицу 3 для дубильных веществ.
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГРУППА ХИМИЧЕСКИЙ СДВИГ (ppm)
Алифатический ОН 149.0-146.0
Фенольные ОН 144.0-137.4
C5 замещен фенолического ОН 143.0-140.2
5-5' фенольные OH 141.7-140.2
Сирингил OH 143.2-142.7
4-O-5' OH 142.8-141.7
Гуаяцилл OH 140.2-138.8
п-гидроксифенил OH 138.8-137.4
COOH 136.0-133.6
Трицин 137.0-136.0

Таблица 2: 31П ЯМР химические сдвиги для лигнин-фосфитилированных ОН-групп.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГРУППА ХИМИЧЕСКИЙ СДВИГ (ppm)
Кольцо А
o-незамещенный фенолик 137.9–137.4
o-замещен фенолич 138.8–137.9
Кольцо B
Катехол OH 140.2–138.8
Пирогаллол OH 144.0–140.2
Кольцо C
Алифатик О.Х. 146.0–145.0

Таблица 3: 31П Химический сдвиг ЯМР для таниновых фосфитилированных ОН-групп.

ПРИМЕЧАНИЕ: Используя стандартное программное обеспечение для спектральной обработки, можно установить предварительно определенные области химического сдвига для интеграции. Эта возможность выгодна, когда приходится обрабатывать несколько спектров.

7. Количественная оценка функциональных групп

  1. Рассчитайте концентрацию раствора ИС.
    Equation 1
  2. Рассчитайте эквивалентное количество конкретного сигнала:
    Equation 2
    Equation 3

Representative Results

Описанный протокол может применяться как для анализа лигнинов, так и дубильных веществ. В химии лигнина этот метод является фундаментальным, поскольку он позволяет обнаруживать и количественно определять различные типы гидроксигрупп. На рисунке 8А-D показаны примеры 31ЯМР спектров лигнинов и танинов, полученных с помощью спектрометров, работающих на разных частотах. Спектр, показанный на рисунке 8А, был записан с помощью ЯМР-спектрометра 300 МГц, в то время как на рисунке 8D был записан с помощью прибора ЯМР 700 МГц.

Figure 8
Рисунок 8:Количественный 31ЯМР спектра (А) хвойных крафт-лигнина (спектр, регистрируемый спектрометром 300 МГц на 30,8 мг лигнина), (В) лигносульфоновой кислоты хвойных пород (спектр, зарегистрированный спектром 300 МГц на 30,1 мг лигнина после сохранения лигносульфоната до лигносульфоновой кислоты), (C) танин акации (спектр, зарегистрированный спектром 300 МГц на образце 30,3 мг) и (D) лигнин крафта хвойных пород (спектр, зарегистрированный спектр спектрометром 700 МГц на 7,2 мг лигнина). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эти спектры тщательно записывались и обрабатывались вручную. Типичные сигналы для алифатических (150-145 ppm), ароматических (145-137 ppm) и карбоксильных (136-134 ppm) гидроксигрупп очень хорошо разрешены и как таковые легко интегрируются. Если открыть спектральное окно (от 95 до 190 ppm, рисунок 8),то будут только только три резких, сильных пика (175, 144 и 132 ppm). Это связано с избытком TMDP, внутреннего стандарта (холестерин или NHND), и гидроксилированного TMDP (вызванного следами воды), соответственно.

В отличие от крафта и лигнина органосульфоната, лигносульфонаты нерастворимы в смеси пиридин/хлороформ. Для получения надежного спектра ЯМР 31растворимость обязательна. Чтобы преодолеть эту проблему, лигносульфонаты могут быть преобразованы в соответствующие лигносульфокислоты перед дериватизацией. Лечение растворов лигносульфоната сильными кислотами (т.е. серной кислотой) или кислотообменными смолами (например, Dowex 1H, сильным кислотным катионитным обменником) приводит к превращению всех сульфонатных групп в их кислые формы. Полученные продукты могут быть удалены из кислотного раствора с помощью селективных адсорбционных смол (XAD-7, полярный адсорбент, используемый для выделения соединений, характеризующихся молекулярными массами до 60 000 ед.m.а), проанализированных с использованием этого протокола. На рисунке 8B показан количественный спектр ЯМР 31производной лигносульфоновой кислоты TMDP. Даже в этом случае различные сигналы гидроксигрупп очевидны. На рисунке 8C показан типичный количественный 31ЯМР-спектр образца танина, дериватированного с использованием TMDP. Хорошо виден характерный сигнал от различных алифатических единиц OH (ring C), пирогаллола и катехола в кольце B и единиц в кольце A.

Discussion

Описанный способ представляет собой реализацию и оптимизацию аналитического протокола, направленного на качественную и количественную характеристику лигнинов, разработанного Argyropoulos37,38,39,40,41,42. По сравнению со многими другими методами, доступными для структурного выяснения лигнина, этот метод был широко принят как один из самых быстрых, быстрых и воспроизводимых. Обоснованность влажных химических методов (например, нитробензола, окисления перманганата и т. д.) зависит от хороших экспериментальных навыков оператора, эффективно ограничивая метод ограниченными операторами. Кроме того, нередко в литературе по мокрым химическим методам встречаются поправочный коэффициент, чтобы учесть несколько недостатков. Описанный протокол ЯМР 31не требует продвинутых экспериментальных навыков, что делает его легко применимым, удобным для пользователя и широко доступным. По сравнению с другими инструментальными аналитическими методами, ЯМР 31является единственным методом, способным точно обнаруживать и количественно оценивать различные гидроксигруппы в лигнинах. Например, FTIR может быть использован для идентификации различных гидроксигрупп, таких как ЯМР 1H. Оба метода, однако, страдают, поскольку они не могут предложить надежные количественные данные из-за обширных проблем перекрытия сигналов. Другим широко используемым методом является спектроскопия UV-Vis, впервые сообщенная Гольдшмидом. Подход, однако, ограничен общим определением гидроксигрупп, поскольку он не может эффективно дифференцироваться между алифатическими, ароматическими и карбокилическими OHs47.

С экономической точки зрения единственным ограничением метода ЯМР 31является цена TMDP, который является относительно дорогим реагентом. Стоит около 190 usd за грамм; следовательно, если стоимость анализа будет приближена только к цене TMDP, исключая затраты, полученные из смеси пиридина/хлороформа, и стоимость времени оператора, то она составит около 24 долл. Для решения этого вопроса многие лаборатории прибегают к синтезу TMDP, тем самым снижая затраты на реагенты. Для этого пинаколь и трихлорид фосфора реагируют в присутствии триэтиламина44. Технически эта реакция относительно проста; однако требуется осторожность при использовании трихлорида фосфора и его доработке, включая хорошо контролируемую вакуумную дистилляцию. Более подробная информация о синтезе TMDP может быть предоставлена по запросу.

Несмотря на то, что этот протокол является одним из лучших с точки зрения простоты, воспроизводимости и точности, необходимо выделить некоторые критические моменты. Во-первых, образец должен быть полностью растворим в идентифицированной смеси пиридин/хлороформ. Это соображение является фундаментальным, поскольку количественная реакция фосфитилирования гидроксильных групп должна происходить в полностью однородных условиях. Если солюбилизируется только часть образца, полученный анализ будет неточным. Во-вторых, исследуемый образец должен быть без влаги и растворителей, поскольку эти переменные будут пагубно влиять на точность и общий успех анализа. Следы влажности будут реагировать с TMDP, давая 2-гидрокси-4,4'-5,5'-тетраметил-1,3,2-диоксафосфолан. Это соединение представляет собой бледно-желтую флокуляющую соль, нерастворимую в смеси растворителей пиридина и хлороформа, вызывая недостаточное получение сигнала ЯМР. Поскольку требуется только небольшой вес (~ 30 мг) образца, он должен быть свободен от летучих веществ, чтобы его точный вес был точно известен до анализа.

Иногда проблемы сольватации образцов могут быть повышены (особенно для сильно окисленные образцы) путем добавления небольших количеств совыщетеля (т.е. диметилформамида), способствующего растворению образца. В принципе, каждый растворитель, который не взаимодействует с TMDP, может быть использован для растворения образца. Выбор сорастворителя не может включать сорастворители, содержащие лабильную гидрокси или аминогруппы, поскольку они вступают в реакцию с реагентом, вызывая вводящие в заблуждение конечные спектры. Примечательно, что диметилсульфоксид также реагирует с TMDP, что исключает его использование в качестве совреждателя. Ионные жидкости на основе пиридина, такие как 1-аллил-3-бутилпиридиний хлорид, могут использоваться при возникновении проблем с растворимостью; однако ионная жидкость должна быть снова сухой48. Для растворения лигносульфонатов (тип лигнина, характеризующийся высокой степенью сульфирования) было показано, что предварительная обработка, включающая превращение нейтрализованных групп в их кислую форму, является полезной. Лигносульфонаты могут быть удобно преобразованы в их кислые условия с использованием кислотно-обменных смол в водных средах. Полученные лигносульфоновые кислоты выделяют из раствора путем их адсорбции на специфических смолах (например, XAD-7) и десорбции в этаноле. Выпаривание этанольных растворов при пониженном давлении при 40 °C позволяет изолирует лигносульфонные кислоты. Эти лигнины могут быть охарактеризованы 31ЯМР, поскольку они растворимы в смеси пиридин/хлороформ, предложенной протоколом.

Длительная вакуумная сушка при умеренных температурах эффективно снижает количество влаги и других летучих веществ в каждом образце. Примечательно, что небольшие количества воды не влияют на конечный спектр, потому что TMDP добавляется в избытке. Кроме того, в некоторых случаях небольшое количество 2-гидрокси-4,4'-5,5'-тетраметил-1,3,2-диоксафосфолана может быть результатом влажности, присутствующей в пробирке ЯМР или флаконе образца. В этих случаях достаточно перемешивания, чтобы полностью растворить количество образовавого осадка. Если образуется большое количество 2-гидрокси-4,4'-5,5'-тетраметил-1,3,2-диоксафосфолана, предлагается повторить пробоподготовку, улучшая обработку сушки. Например, перед использованием вся стеклянная посуда может быть ненадолго нагрета с помощью тепловой пушки.

Спектральный диапазон, используемый для записи спектра, широк по сравнению с областью, интересуемой для сигнала в отношении различных гидроксильных групп. Однако это необходимо для понимания того, успешно ли произошла дериватизация образца. Подтверждение полной дериватизации образца дает наличие сильного сигнала около 174 ppm. Этот резкий пик обусловлен нереактированным TMDP, и его существование гарантирует, что реагент присутствовал в избытке, и, следовательно, все гидроксильные группы были дериватизированы. Если этот пик отсутствует, двумя наиболее вероятными причинами являются: (1) количество используемого TMDP недостаточно для выполнения полной дериватизации образца или (2) в образце присутствует большое количество воды. В первом случае использование более высокого количества TMDP, скорее всего, обеспечит полную дериватизацию образца, и появится сигнал при 174 ppm. Во втором случае образец следует высушить более широко. Как только избыток TMDP обеспечен, можно выполнить пиковую интеграцию. Перед этой операцией увеличьте масштаб до более узкого окна (от 150 до 132 ppm), которое ограничивает интересующих сигналы.

Количество образца (~ 30 мг), которое должно быть проанализировано, сообщается в приведенном выше экспериментальном протоколе, было выбрано для сбора спектров хорошего качества для ЯМР-спектрометра 300 МГц или более. Тем не менее, мы заметили, что можно уменьшить количество образца, если использовать полевой магнит 500 МГц или выше. Например, на рисунке 8Dпоказан спектр ЯМР (полученный из прибора 700 МГц) образца, приготовленного с 7,2 мг лигнина. Интеграция сигналов этого спектра дает те же результаты, что и при использовании более высоких количеств лигнина. Этот факт усиливает применимость этого протокола для всех исследований, в которых доступны небольшие количества продуктов.

В целом, этот экспериментальный протокол может быть применен ко многим исследованиям и разработкам, когда требуется понимание происхождения и судьбы различных гидроксигрупп, присутствующих в лигнинах и танинах. В частности, в сочетании с данными GPC и HSQC полученные данные предоставляют возможность для дальнейшего развития и спекуляции над структурой лигнина или танина. Во многих случаях, когда химические модификации применяются к гидроксигруппам лигнина или танина, количественные анализы ЯМР 31могут быть чрезвычайно ценными для определения того, произошли ли эти модификации и в какой степени. Например, на рисунке 9 показаны два ЯМР-спектра одного и того же лигнина до и после его окисления. Простая качественная оценка показывает восстановление как алифатических, так и ароматических гидроксигрупп при окислении, что обеспечивает ценную информацию и рекомендации.

Figure 9
Рисунок 9:Количественные 31ЯМР спектры того же Лигнина Organosolv, дериватизированного с использованием TMDP (A)до и(B)после его окисления. Спектры регистрировались с помощью 300 ЯМР-спектрометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В заключение, этот метод имеет все атрибуты быть одним из самых важных и мощных инструментов, когда запросы, касающиеся полифенольных, ОН-несущих лигнинов и дубильных веществ (и даже синтетических полимеров)49,50,51, должны быть сделаны в различных областях, начиная от химии до инженерии, от биологии до полимеров и фармацевтических применений.

Disclosures

Клаудия Крестини и Димитрис С. Аргиропулос гарантируют, что все авторы (C.C., N.P. и D.S.A.) не имеют конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа на протяжении многих лет поддерживалась различными финансовыми наградами, в которые входили такие организации, как Научно-исследовательский институт целлюлозы и бумаги Канады, Университет Макгилла в Монреале, Совет по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады, Национальный научный фонд США, Министерство сельского хозяйства Соединенных Штатов и компания Solvay.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 - 1000 µl Eppendorf micropipette VWR 613-0866
20 - 200 µl Eppendorf micropipette VWR 613-0865
2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% Sigma-Aldrich 447536
Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) Precisa LX220 A
Binder Vacuum Oven Binder VD53
Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 Sigma-Aldrich 29651-U
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151823
Cholesterol, Sigma-grade Sigma-Aldrich C8667
Molecular sieves, 4A Sigma-Aldrich 208604
N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% Sigma-Aldrich 226378
NMR spectrometer, 300 MHz Bruker
Norell natural quartz 3 mm NMR tubes Sigma-Aldrich NORS33007
Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) VWR 613-0342
Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) VWR 613-0239
Pyridine, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich 270970
Stirring bars,micro, 3 mm lenght VWR 442-0360
Stirring bars,micro, 6 mm lenght VWR 442-0362
Triphenylphospine oxide, 97% Sigma-Aldrich T84603
Vials for environmental analysis, WHEATON,  20.00 mL DWK Life Sciences WHEAW224609
Weighing paper, grade 531 VWR 516-0318P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, X., et al. Determination of hydroxyl groups in biorefinery resources via quantitative 31 P NMR spectroscopy. Nature Protocols. 14 (9), 2627-2647 (2019).
  2. Anastas, P. T., Williamson, T. C. Green chemistry: An overview. Green Chemistry. 626, 1-17 (1996).
  3. Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: Principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
  4. Collins, M. N., et al. Valorization of lignin in polymer and composite systems for advanced engineering applications - A review. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 828-849 (2019).
  5. De Gruyter. Biorefinery: From Biomass to Chemicals and Fuels. , (2012).
  6. Sannigrahi, P., Pu, Y., Ragauskas, A. Cellulosic biorefineries-unleashing lignin opportunities. Current Opinion in Environmental Sustainability. 2 (5), 383-393 (2010).
  7. Lange, H., Decina, S., Crestini, C. Oxidative upgrade of lignin - Recent routes reviewed. European Polymer Journal. 49 (6), 1151-1173 (2013).
  8. Glasser, W. G. Classification of lignin according to chemical and molecular structure. Lignin: Historical, Biological, and Materials Perspectives. 742, 216-238 (1999).
  9. Wiley. Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology, 2 Volume Set, 5th Edition. , Wiley. (2004).
  10. Lewis, N. G., Sarkanen, S. Preface. Lignin and Lignan Biosynthesis. 697, 9-11 (1998).
  11. Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11 (3), 169-218 (1977).
  12. Ragauskas, A. J., et al. Lignin valorization: Improving lignin processing in the biorefinery. Science. 344 (6185), (2014).
  13. Crestini, C., Melone, F., Sette, M., Saladino, R. Milled wood lignin: A linear oligomer. Biomacromolecules. 12 (11), 3928-3935 (2011).
  14. Guerra, A., et al. On the propensity of lignin to associate: A size exclusion chromatography study with lignin derivatives isolated from different plant species. Phytochemistry. 68 (20), 2570-2583 (2007).
  15. Contreras, S., Gaspar, A. R., Guerra, A., Lucia, L. A., Argyropoulos, D. S. Propensity of lignin to associate: Light scattering photometry study with native lignins. Biomacromolecules. 9 (12), 3362-3369 (2008).
  16. Gigli, M., Crestini, C. Fractionation of industrial lignins: opportunities and challenges. Green Chemistry. 22 (15), 4722-4746 (2020).
  17. Adler, E. Structural elements of lignin. Industrial & Engineering Chemistry. 49 (9), 1377-1383 (1957).
  18. Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 1. Extraction of lignin with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 477-485 (1956).
  19. Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 2. Extraction of lignin-carbohydrate compelexes with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 243-251 (1957).
  20. Bjorkman, A. Studied on finely divided wood. Part 5. The effect of milling. Svensk Pappersit. , 329-335 (1957).
  21. Das, A. K., Islam, N., Ashaduzzaman, F. O., Dungani, R. Review on tannins: Extraction processes, applications and possibilities. South African Journal of Botany. 135, 58-70 (2020).
  22. Laitila, J. E. Composition and evolution of oligomeric proanthocyanidin-malvidin glycoside adducts in commercial red wines. Food Chemistry. 340, 127905 (2021).
  23. Covington, A. D., Wise, W. R. Tanning Chemistry. , RSC Publishing. (2019).
  24. Tarabanko, V. E., Tarabanko, N. Catalytic oxidation of lignins into the aromatic aldehydes: General process trends and development prospects. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2421 (2017).
  25. Guerra, A., Mendonça, R., Ferraz, A., Lu, F., Ralph, J. Structural characterization of lignin during pinus taeda wood treatment with ceriporiopsis subvermispora. Applied and Environmental Microbiology. 70 (7), 4073-4078 (2004).
  26. Faix, O., Andersons, B., Zakis, G. Determination of carbonyl groups of six round robin lignins by modified oximation and FTIR spectroscopy. Holzforschung. 52 (3), 268-274 (1998).
  27. Santos, R. B., Capanema, E. A., Balakshin, M. Y., Chang, H., Jameel, H. Lignin structural variation in hardwood species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (19), 4923-4930 (2012).
  28. Bose, S. K., Wilson, K. L., Hausch, D. L., Francis, R. C. Lignin analysis by permanganate oxidation. II. Lignins in Acidic Organosolv Pulps. Holzforschung. 53 (6), 603-610 (1999).
  29. Harman-Ware, A. E., et al. A thioacidolysis method tailored for higher-throughput quantitative analysis of lignin monomers. Biotechnology Journal. 11 (10), 1268-1273 (2016).
  30. Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
  31. Lin, S. Y., Carlton, W. D. Methods in Lignin Chemistry. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1992).
  32. Lundquist, K. Proton (1H) NMR Spectroscopy. Methods in Lignin Chemistry. , 242-249 (1992).
  33. Robert, D. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrometry. Methods in Lignin Chemistry. , 250-273 (1992).
  34. Li, S., Lundquist, K. A new method for the analysis of phenolic groups in lignins by 1H NMR spectrometry. Nordic Pulp & Paper Research Journal. 9 (3), 191-195 (1994).
  35. Hallac, B. B., Pu, Y., Ragauskas, A. J. Chemical transformations of buddleja davidii lignin during ethanol organosolv pretreatment. Energy & Fuels. 24 (4), 2723-2732 (2010).
  36. Sette, M., Wechselberger, R., Crestini, C. Elucidation of lignin structure by quantitative 2D NMR. Chemistry - A European Journal. 17 (34), 9529-9535 (2011).
  37. Sette, M., Lange, H., Crestini, C. Quantitative HSQC analyses of lignin: A practcal comparison. Computational and Structural Biotechnology Journal. 6 (7), 201303016 (2013).
  38. Wroblewski, A. E., Lensink, C., Markuszewski, R., Verkade, J. G. Phosphorus-31 NMR spectroscopic analysis of coal pyrolysis condensates and extracts for heteroatom functionalities possessing labile hydrogen. Energy & Fuels. 2 (6), 765-774 (1988).
  39. Archipov, Y., Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part I. Model compounds. Journal of Wood Chemistry and Technology. 11 (2), 137-157 (1991).
  40. Argyropoulos, D. S., Heitner, C., Morin, F. G. P. NMR spectroscopy in wood chemistry - Part III. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores in mechanical pulp. Holzforschung - International Journal of the Biology, Chemistry, Physics and Technology of. 46 (3), 211-218 (2009).
  41. Argyropoulos, D. S., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part VI. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores and carboxylic acids present in mechanical pulps; a method for the quantitative determination of ortho-quinones. Holzforschung. 48 (1), 112-116 (1994).
  42. Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry part V. Qualitative analysis of lignin functional groups. Journal of Wood Chemistry and Technology. 13 (2), 187-212 (1993).
  43. Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part IV. Lignin models: Spin lattice relaxation times and solvent effects in 31P NMR. Holzforschung. 47 (1), 50-56 (1993).
  44. Granata, A., Argyropoulos, D. S. 2-Chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane, a reagent for the accurate determination of the uncondensed and condensed phenolic moieties in lignins. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 43 (6), 1538-1544 (1995).
  45. Duval, A., Vilaplana, F., Crestini, C., Lawoko, M. Solvent screening for the fractionation of industrial kraft lignin. Holzforschung. 70 (1), 11-20 (2016).
  46. Ben, H., Farrell, J. R. In-depth investigation on quantitative characterization of pyrolysis oil by 31P NMR. RSC Advances. 6 (21), 17567-17573 (2016).
  47. Goldschmid, O. Determination of phenolic hydroxyl content of lignin preparations by ultraviolet spectrophotometry. Analytical Chemistry. 26 (9), 1421-1423 (1954).
  48. Ben, H., et al. Characterization of whole biomasses in pyridine based ionic liquid at low temperature by 31P NMR: An approach to quantitatively measure hydroxyl groups in biomass as their original structures. Frontiers in Energy Research. 6, (2018).
  49. Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis of potentially biobased copolyesters based on adipic acid and butanediols: Kinetic study between 1,4- and 2,3-butanediol and their influence on crystallization and thermal properties. Polymer. 99, 204-213 (2016).
  50. Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis and characterization of biobased poly(butylene succinate-ran-butylene adipate). Analysis of the composition-dependent physicochemical properties. European Polymer Journal. 87, 84-98 (2017).
  51. Chan, K. P., Argyropoulos, D. S., White, D. M., Yeager, G. W., Hay, A. S. Facile quantitative analysis of hydroxyl end groups of Poly(2,6-dimethyl-1,4-phenylene oxide)s by 31P NMR spectroscopy. Macromolecules. 27 (22), 6371-6375 (1994).

Tags

Химия выпуск 174
Количественный <sup>31</sup>P ЯМР анализ лигнинов и танинов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Argyropoulos, D. S., Pajer, N.,… More

Argyropoulos, D. S., Pajer, N., Crestini, C. Quantitative 31P NMR Analysis of Lignins and Tannins. J. Vis. Exp. (174), e62696, doi:10.3791/62696 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter