Summary
31 P NMR هو أداة قوية لتوضيح الهيكلية من البوليفينول. هذا الإجراء التحليلي السريع والسهل والدقيق والكمي والعالي التكاثر ، الذي يسمح بالتحديد الكمي والتمايز لمختلف أنواع المجموعات الهيدروكسية والفينولية والكاربوكسيليك في الليجين والعفص أصبح الآن أداة تحليلية روتينية.
Abstract
ويواجه تطوير منتجات مستدامة للمستحضرات البيولوجية، من بين أمور أخرى، التحدي المتمثل في تثمين اللجنين والتانين. ولم تستغل هذه البوليمرات الحيوية العطرية الوفيرة والمتجددة على نطاق واسع بسبب تعقيدها الهيكلي المتأصل ودرجاتها العالية من التباين وتنوع الأنواع. ومما يزيد من تفاقم عدم وجود هيكل أولي محدد لهذه البوليفينولات التغيرات الكيميائية المعقدة الناجمة أثناء المعالجة، مما يضفي في نهاية المطاف مجموعة كبيرة ومتنوعة من السمات الهيكلية ذات الأهمية القصوى لأي جهود أخرى للاستفادة.
وبالتالي، فإن بروتوكول تحديد وتحديد كمية المجموعات الوظيفية المختلفة الموجودة في البوليفينول الطبيعي بسرعة وبساطة وبصورة لا لبس فيها، شرط أساسي لفهم التفاعل والفائدة النهائية.
الكمى 31P NMR يوفر الفرصة لتحديد بسرعة وموثوقية غير الubstituted، o-أحادية استبدال، وo-disubstituted الفينولات، OHs اليوفيتيك، وحمض الكاروبوكسيليك moieties في lignins والعفص مع إمكانات تطبيق واسعة النطاق.
وتتألف المنهجية من إجراء وضع العلامات الكمية في الموقع أو التانين باستخدام مسبار مناسب 31P يحتوي على مسبار، يليه الحصول على طيف كمي 31P NMR في وجود معيار داخلي. وفرة طبيعية عالية من النواة P 31يسمح لكميات صغيرة من العينة (~ 30 ملغ) وقصيرة NMR اكتساب مرات (~ 30-120 دقيقة) مع حل جيد 31إشارات P التي تعتمد اعتمادا كبيرا على البيئة الكيميائية المحيطة بها من مجموعات OH المسمى.
Introduction
وقد استشهد هذا الإجراء، الذي نشر مؤخرا في بروتوكولات الطبيعة1 أكثر من 3000 مرة في الأدب الأرشيفي وأصبح قياس روتيني لتوصيف اللجنين والتانين لأنه يوفر معلومات هيكلية أساسية وسريعة وقابلة للاستنساخ.
اللجنين والعفص
عندما قدم الكيمياء الخضراء من قبل بول T. أناستاس وجون C. فيرنر2,3, غيرت جذريا المفهوم العام للكيمياء. وعلى وجه الخصوص، تبرز أهمية استخدام المواد المستدامة بدلا من المواد الخام الأحفورية، مثل النفط والفحم، كنقطة انطلاق كجانب حاسم2و3. من بين أنواع مختلفة من الكتلة الحيوية، اللجنين هو البوليمر الحيوي العطرية الأكثر وفرة ويمكن أن ينظر إليها على أنها مصدر محتمل للسلع الصناعية والمنتجات ذات القيمة المضافة العالية4.
اللجنين هو ثاني أكثر الأخشاب وفرة (مع السليلوز يجري أولا والهيميسليلوز الثالث). يختلف محتواه في النباتات حسب نوع النبات: على سبيل المثال الأخشاب الصلبة التي تتميز بكمية أقل من اللجنين مقارنة بالأخشاب اللينة (20٪ ± 4٪ مقابل 28٪ ± 4٪). بالإضافة إلى ذلك ، فإن توزيع اللجنين داخل الأنسجة النباتية ليس متجانسا: يمكن العثور على محتوى اللجنين الأعلى في جدار الخلية5،6. اللجنين مادة متعددة الفينوليات تم الحصول عليها صناعيا كمنتج ثانوي لصناعة الورق / السليلوز7. يتم استرداده من عملية لب الخشب ، حيث تتم معالجة رقائق الخشب في المقام الأول في وجود OH- و / أو OH- + HS- ظروف أيون لفصل السليلوز عن الهيميسيلولوز واللجنين (عمليات الصودا و / أو كرافت)8،9.
أولى محاولات دراسة اللجنين قام بها بايين وشولتز على التوالي في 1838 و186510. في عام 1977 ، أدلر لخص كل ما هو متاح من المعرفة ذات الصلة في ذلك الوقت11. ومن المسلم به حاليا أن اللبنات الأساسية لللجنين هي ثلاث وحدات الفينيل بروبانويد: ف-كوماريل، كونيفيريل، والكحول سينابيل. هذه مونومرات، وذلك بفضل عملية البلمرة الراديكالية الحرة، تؤدي إلى فهيدروكسيفينيل، غواياسيل، والسنابيل الوحدات التي تشكل في نهاية المطاف على نطاق واسع اللجنين (الشكل 1)12. عدم وجود هيكل أولي في lignins يعني صعوبة متأصلة في توصيفها الهيكلي. وبناء على ذلك، كان تقييم توزيع الوزن الجزيئي دائما مثيرا للجدل إلى حد ما. اللجنين الخشب المطحون، اللجنين معزولة في ظل ظروف معتدلة أن معظمها تقريبا protolignin10،ويتكون من oligomers13 التي تتفاعل بشكل كبير عن طريق عمليات التجميع فوقالجزيئية 14،15.
الشكل 1:نموذج تمثيلي لللجنين الخشب اللين الذي يتم تسليط الضوء على أنواع مختلفة من السندات.
تصنف الليجينات عادة اعتمادا على: (أ) نوع الخشب الذي تستمد منه (مثل الخشب الصلب والخشب اللين)، (ب) العملية المستخدمة لعزله. أنواع اللجنين الصناعية الأكثر أهمية هي كرافت، ليغنوسلفونات، والأرغانوسلف.
يعتمد هيكل اللجنين بشكل كبير على أصله وكيمياء المعالجة. وبشكل أكثر تحديدا، عندما يتفاقم الهيكل المعقد وغير المنتظم لللجنين مع تنوعه الطبيعي وكيمياء المعالجة المعقدة، تظهر مادة ذات تباين شديد وتنوع وتغايرية، مما يحد من استخدامه للتطبيقات منخفضة القيمة16. في حين أن الليجنينز الخشب اللين تحتوي أساسا وحدات غواياسيل (G) مع كميات لا تذكر من مجموعات p-hydroxyphenyl (G lignin)، تتكون الليجنينز الخشب الصلب من قبل الوحدات الفرعية غواياسيل وسيرينجيل (GS lignin) بنسب متفاوتة ويتم تشكيل lignins العشب من قبل guaiacyl، سيرينجيل، وp-هيدروكسيفينيل(GSH lignin) الوحدات الفرعية. النهج الاستخراجي المستخدم للعزلة يؤثر بشكل كبير على هيكل اللجنين الناشئ17. يصور الشكل 2 ثلاثة هياكل للجنين، تختلف باختلاف نهج العزل المستخدم. ويمكن إبراز بعض الاعتبارات المتعلقة بتأثير طريقة الاستخراج. أولا، كرافت ليجنين هو اللجنين غير متلاءم، مجزأة للغاية، ومكثفة، في حين أن أورجانوسلف ليجنين لديه بنية مماثلة لللجنين الخشب المطحون (معزولة باستخدام نهج بيوركمان)18،19،20. وأخيرا، تتميز lignosulfonates بدرجة عالية من السلفونات، اعتمادا على كثافة وظروف عملية السلفونات الاستخراجية.
الشكل 2:الهياكل التمثيلية للسينيينات التقنية. في هذا الرقم، يمكن رؤية الاختلافات بين أنواع مختلفة من اللجنين. (أ)الخشب اللين كرافت اللجنين مكثف للغاية،(ب)وتتميز lignosulfonates من قبل مجموعات كبرتونيك على الكربونات المشبعة، و (C) اللجنين organosolv لديه بنية مماثلة لتلك التي من الخشب المطحون اللجنين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
على غرار الليغنينز ، العفص هي مركبات متعددة الفينولي التي توجد في النباتات. مؤخرا وتحديث استعراض على التانين 'النهج الاستخراجية والتطبيقات صدر مؤخرا من قبل داس وآخرون21. ويمكن تسليط الضوء على أهمية العفص في الحياة اليومية النظر في مثالين: أنها تضفي الطعم واللون على النبيذ22; وعلاوة على ذلك هيكلها متعدد الفينولية يقدم خصائص مضادة للأكسدة ويجعلها مثالية للتطبيق في صناعة الدباغة23. وتنقسم العفص إلى فئتين: قابلة للتحلل المائي وغير قابلة للتحلل المائي. يمكن اعتبار العفص القابل للتحلل بوليمر من استرات حمض الغالي ، دي غاليك ، و ellagic(الشكل 3). هذه استرات نتيجة استرداد الأحماض الفينولية مع جزيئات السكر (على سبيل المثال، الجلوكوز، الرهامنوس، وأرابينوز).
الشكل 3: العفص القابلة للتحلل المائي النموذجي: حمض التانيك ، vescalgin. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
العفص غير القابلة للتحلل المائي ، والمعروف أيضا باسم العفص المكثف ، هي البوليمرات وأوليجومرات مشتقة من فلافان -3-ols. بين فلافان-3-ols، catechins وجالوكاشين هي الأكثر شيوعا. فهي مركبات بلورية عديمة اللون(الشكل 4). البلمرة يخلق البوليمر تتميز هيكل helicoidal. يتم توجيه مجموعات الهيدروكسي العطرية على السطح الخارجي للحلزون ، في حين أن الأكسجين البيران في الداخل.
الشكل 4: هياكل بروانتوسيانيدين: R = H، OH، OCH3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
توصيف الليجينات والعفص باستخدام NMR
وهناك نوعان من المعلومات حاسمان في توصيف اللجنين أو التانين: (أ) التركيب الكيميائي (مثل محتوى مجموعة الهيدروكسي، والطبيعة، وتواتر الروابط بين الوحدات) و (ب) الوزن الجزيئي والتعددية. منذ الدراسات المبكرة على اللجنين، تم استخدام تقنيات مختلفة لتحقيق هذه الأهداف، وظهرت فئتين من الأساليب: الأساليب الكيميائية والفيزيائية.
في كيمياء اللجنين ، تم استخدام الطرق الكيميائية ، مثل أكسدة النيتروبينزين القلوية ، اشتقاق تليها شق اختزالي ، أكسدة البيرمانجانات ، وثيواسيدليسيس ، تاريخيا على نطاق واسع24،25،26،27،28،29. ومع ذلك ، حتى لو تم تنفيذ البروتوكولات التحليلية وتحسينها ، فهي تتطلب وقتا طويلا وشاقة وتتطلب مهارات تجريبية واسعةالنطاق 30. بدلا من ذلك ، من بداية التحليل الآلي ، تم استخدام أساليب مادية لأداء توصيفات اللجنين والتانين31. هذه التقنيات تسمح للتغلب على مشاكل الأساليب الكلاسيكية مما يجعل من السهل توصيف هيكل اللجنين.
الرنين المغناطيسي النووي (NMR) يسمح بالحصول على معلومات حول بنية اللجنين والتركيب الكيميائي بين التقنيات الآلية. على وجه الخصوص، يمكن للبيانات من الأطياف الكميةأحادية الأبعاد 1 H NMR والكمية 13C NMR الأطياف توفير معلومات حول أنواع مختلفة من الترابطات بين الوحدات اللجنين32،33،34،35. وللأسف، تعاني الأطياف أحادية الأبعاد من تداخل الإشارات، الذي يمكن أن يقوض بشكل خطير جهود تكامل الإشارات. وقد استخدمت الإصدارات الكمية من HSQC (التماسك الكمومي واحد Heteronuclear) ، Q -HSQC (الكمية -- Heteronuclear واحد التماسك الكم) ، لفهم هيكل اللجنين بشكل أفضل ، وتوفير معلومات مفيدة حول الروابط الداخلية. ومع ذلك، فإنها لا يمكن أن تستخدم بالكامل لتحديد مختلف المباني وحدات13،36،37 كميا.
للتغلب على القضايا المرتبطة NMR أحادية و ثنائية الأبعاد، تم النظر في اشتقاق الركيزة. ومن مزايا هذا النهج أنه يمكن إدخال تسميات محددة داخل الجزيئات الكبيرة المعقدة ولا ينتج أي تداخل طيفي عن المذيب الذي يتم فيه إذابة الركائز المسماة1. وكان فيركاد الرائد في هذا المجال، حيث أجرى 31تحليلا ل NMR للمشتقات الفوسفورية ومشتقات الفحم والمركبات ذات الصلة38. وفي منشورها، تم إجراء فحص لواشف مختلفة تحتوي على الفوسفور (فوسفولان)، وسجل التحول الكيميائي للمركبات الأخرى المسماة. قدم فريق Argyropoulos لأول مرة اشتقاق للتحليل الكمي والنوعي لمجموعات الهيدروكسي في اللجنين في عام 1991. بعد دراسة اشتقاق مركبات نموذج اللجنين باستخدام الكواشف المحتوية على الفوسفور ، مهدت مجموعته الطريق لواحدة من أكثر التقنيات استخداما يوميا في كيمياء اللجنين ، 31تحليل P NMR39،40،41،42،43. من بين الفوسفولات المختلفة التي تم فحصها ، وصل أرجيروبولوس إلى استخدام 2-chloro-4،4،5،5-tetramethyl-1،3-2-dioxaphospholane (TMDP) باعتباره الأنسب لإجراء تحليل اللجنين44. يتفاعل TMDP بشكل انتقائي مع مجموعات الهيدروكسي مما يسبب التكوين الكمي للمشتقات المحتوية على الفوسفور التي تتميز بتحولات كيميائية محددة 31P NMR (الشكل 5).
الشكل 5: اللجنين والتانين الكيمياء الفوسفيتيلية. يتم وضع العلامات على مجموعات اللجنين والتانين labile H من خلال رد الفعل في الموقع. وتتميز البوليفينول المسمى من قبل محددة 31P NMR العصابات المقابلة لنوع مختلف من المجموعات الهيدروكسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم تنفيذ اشتقاق العينة في خليط البيريدين / الكلوروفورم (1.6:1) ؛ ينتج هذا الاختيار عن تقييم دقيق. البيريدين له ميزتين. أولا، اختيار المذيبات التي تتميز معلمة هيلدبراند من حوالي 22.1 MPa1/2 يبسط ويضخم اللجنين solubilization45. وبالتالي، فإن إضافة البيريدين كمذيب، الذي تساوي معلمة هيلدبراند 21.7، هو الأمثل. ثانيا، يصاحب تفاعل TMDP مع مجموعات الهيدروكسي تشكيل حمض الهيدروكلوريك (HCl) كمنتج ثانوي مع ما يصاحب ذلك من آثار سلبية تجاه التكوين السهل لمشتقات اللجنين فوسفولان. لهذا السبب، HCl الناتجة يحتاج إلى تحييد. عندما تكون موجودة في فائض كبير، والأساسية من البيريدين، بالنسبة لMDP، يسمح لتحييد HCl (عن طريق تشكيل هيدروكلوريد البيريدين).
ويستند استخدام النظام الموصى به البيريدين / الكلوروفورم المذيبات الثنائية deuterated على ثلاثة أسباب. أولا، يفضل حل العينة. ثانيا، بما أن هيدروكلوريد البيريدين قابل للذوبان في الكلوروفورم، فإنه يمكن أن يمنع هطول الأمطار وتدهور الطيف النهائي. ثالثا، يتم اختيار الكلوروفورم المشوه للإشارة المفردة الفريدة، مما يسمح بتأمين مطياف NMR أثناء عملية الاستحواذ. يتم تنفيذ اشتقاق العينة في وجود معيار داخلي. وبهذه الطريقة، عندما يتم اشتقاق العينة والمعيار، فإن مقارنة تكاملات قمم العينة والمعيار تسمح بتقدير كمي للكمية لكل نوع من مجموعات الهيدروكسي الموجودة. وقد اعتبرت مركبات مختلفة كمقاييس داخلية. وتتميز هذه المركبات من قبل مجموعة هيدروكسي واحد لكل جزيء، وتقدم إشارة حادة واحدة في الطيف 31P NMR بعد الاشتقاق. يجب أن يتم اختيار المعيار بعناية. وينبغي ألا تتداخل إشاراته مع إشارات العينة المشتقة. كان الكوليسترول يستخدم على نطاق واسع خلال الأيام الأولى. ومع ذلك، فإن التداخل الجزئي مع الإشارات الناشئة عن مجموعة الهيدروكسي اليفالي يحد من استخدامه. للتحليل الروتيني، يفضل الحلول القياسية الداخلية ل N-هيدروكسي-5-نوربورن-2,3-ديكاربوكسيميد (NHND). ومع ذلك، بسبب عدم الاستقرار NHND، يمكن تخزين حلولها القياسية فقط لبضعة أيام46.
Protocol
مخطط التدفق التالي (الشكل 6) يحدد البروتوكول التجريبي بأكمله لإجراء تحليل 31P NMR للجنيه والعفص.
الشكل 6: إجراء تحليل 31P NMR من lignins والعفص. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. عينة المعالجة المسبقة
- الجافة على aliquot (حوالي 100 ملغ) من التحليل (عينة اللجنين أو التانين) بين عشية وضحاها في فرن فراغ تعيين في 40 درجة مئوية.
ملاحظة: هناك حاجة إلى اهتمام خاص على اختيار درجة الحرارة لأن درجات الحرارة أعلى من 40 درجة مئوية قد تغير كيميائيا بنية حساسة من البوليفينول فحصها. - بعد التجفيف، نقل العينة بسرعة إلى مزيل كبريتات الكالسيوم اللامائية حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة إلزامية لتجنب العينة امتصاص الرطوبة من البيئة.
2. إعداد محلول المذيبات
- إعداد خليط مذيبات الكلوروفورم البيريدين/deuterated في قارورة عينة 20 مل عن طريق خلط البيريدين اللامائية والكلوروفورم deuterated في 1.6/1 (v/v) نسبة.
تنبيه: انتبه أثناء التلاعب بالبيريدين والكلوروفورم المشوه. هذه المركبات قابلة للاشتعال، ضارة، وسامة. إعداد واستخدام الحل في غطاء الدخان جيد التهوية باستخدام قفازات مناسبة. - إضافة 5-8 غرام من المنخلات الجزيئية 5A المنشط جيدا والمجففة في الكريات 3.2 ملم لإزالة آثار المياه. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام غطاء الحاجز لمنع ملامسة الهواء وتلوث الرطوبة في نظام المذيبات. تخزين الحل المعد في الظلام.
3. إعداد الحل المعياري الداخلي (IS)
- في قارورة Erlenmeyer 2 مل، قم بإعداد محلول 0.1 M من الكروم (III) أسيتيليستونات (حوالي 10 ملغ) ومعيار داخلي (حوالي 35.8 ملغ من NHND أو 77.3 ملغ من الكوليسترول) في محلول المذيبات الذي تم إعداده مسبقا.
تنبيه: الكروم (III) أسيتيليستونات ضار; أثناء التلاعب به ، وارتداء قفازات مناسبة. - سجل الوزن الدقيق ل IS المضافة في حل IS.
- نقل حل IS في قارورة مجهزة بغطاء مختوم يحتوي على منخل الجزيئية المنشطة (انظر النقطة 2.2) وتخزينها في الظلام في 40 درجة مئوية.
4. NMR إعداد حل عينة
- تزن بدقة ~ 30 ملغ من عينة في قارورة 2 مل مجهزة شريط اثارة. ختم القارورة مع غطاء الحاجز.
- إضافة 0.5 مل من محلول نظام المذيبات إلى قارورة العينة.
- نقل 100 ميكرولتر من حل IS في قارورة العينة عبر micropipette. تحريك مغناطيسيا التشتت الناتج (500 دورة في الدقيقة) حتى يذوب كل اللجنين أو التانين، مما يؤدي إلى حل واضح.
ملاحظة: نظرا لأن اكتمال عملية التشحيم للعينة أمر حتمي، فقد تستغرق هذه الخطوة ما يصل إلى 12 ساعة. - نقل 0.1 مل من TMDP إلى الحل عينة. ضع العينة تحت التحريك المغناطيسي القوي. إبقاء الحل عينة مختومة. استخدام TMDP في غطاء الدخان جيدة التهوية في حين يرتدي قفازات مناسبة.
تنبيه: TMDP وأبخرتها هي تآكل، ضارة، وتتفاعل بسرعة مع الماء.
ملاحظة: يرجع تكوين الترسب الأصفر إلى آثار المياه في العينة أو محلول البيريدين /الكلوروفورم. في مثل هذه الحالة، يجب تكرار الإجراء عن طريق ضمان تجنب جميع التلوث المحتمل للرطوبة. - نقل الحل عينة في أنبوب NMR باستخدام ماصة باستور.
5. تحليل NMR
- تحميل الأنبوب في أداة NMR. ويحتاج المطياف المستخدم لإجراء هذا التحليل إلى مسبار عريض النطاق.
- إصلاح المعلمات التجريبية وفقا للإعداد الموضح في الجدول 11.
| برنامج نبض | نبض فصل معكوس مسور (zgig) |
| نواة | 31P |
| عرض طيفي | 100 مساء.m |
| وقت الاستحواذ | - 0.8 ق |
| تأخير الاسترخاء | ≥ 10 s |
| رقم المسح الضوئي | 64 أو أكثر |
| مركز الطيف | 140 مساء.m |
الجدول 1: بارامترات تجريبية لتسجيل 31 أطيافP NMR من الليجنيات المشتقة أو العفص.
- تعيين تردد مطياف باستخدام تردد الرنين من الكلوروفورم deuterated، شيم العينة وضبط مطياف. ثم ابدأ عملية الاستحواذ.
6. معالجة الطيف وتحليله
- معالجة 31P NMR البيانات الخام من قبل برنامج قياسي مناسب وفقا للخطوات التالية.
- تنفيذ تحويل فورييه.
- ضبط المرحلة حسب تصحيح المرحلة اليدوية (معالجة | | تصحيح المرحلة تصحيح يدوي).
- تصحيح الأساس يدويا، بعناية وضع نقطة الصفر (معالجة | | الأساس تصحيح خط الأساس متعدد النقاط).
- معايرة الإشارة.
- تعيين إشارة للمياه phosphitylated في قيمة التحول الكيميائي من 132.2 جزء في المليون (تحليل | | المرجعية المرجع).
ملاحظة: وجود إشارة 31P حادة في 175 جزء في المليون بسبب الزائدة TMDP. ويضمن وجودها اشتقاق العينة بالكامل. إذا كانت هذه الذروة غائبة، يحتاج المرء إلى إعادة النظر في الإجراء بأكمله من خلال توفير عينة شاملة وتجفيف المذيبات وإضافة المزيد من TMDP. وبمجرد ضمان ذلك، يتم تكبير الطيف في النطاق الطيفي 132 إلى حوالي 150 دورة في الدقيقة(الشكل 7).
- تعيين إشارة للمياه phosphitylated في قيمة التحول الكيميائي من 132.2 جزء في المليون (تحليل | | المرجعية المرجع).
الشكل 7: تحقق من وجود فائض من TMDP: إذا كان يمكن رؤيته، اشتقاق العينة كاملة. ويمكن بعد ذلك تحليل الأطياف. للقيام بذلك التكبير في النطاق الطيفي بين 155 و 132 في الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تكامل
- تطبيع التكامل عن طريق وضع المعيار الداخلي إلى 1.0 (انقر على الذروة | تحرير | المتكاملة تطبيع: 1.00). إجراء تكامل الطيف وفقا للتحولات الكيميائية المبلغ عنها في الجداول التالية. استخدم الجدول 2 للجنيهات والجدول 3 للتانين.
| مجموعة وظيفية | التحول الكيميائي (ppm) |
| اليفاتيك OH | 149.0-146.0 |
| فينول OH | 144.0-137.4 |
| C5 استبدال الفينولية OH | 143.0-140.2 |
| 5-5 'الفينولية OH | 141.7-140.2 |
| سيرينغيل أوه | 143.2-142.7 |
| 4-O-5 'OH | 142.8-141.7 |
| غوايسيل أوه | 140.2-138.8 |
| ف هيدروكسيفينيل OH | 138.8-137.4 |
| كووه | 136.0-133.6 |
| تريسين | 137.0-136.0 |
الجدول 2: 31P NMR التحولات الكيميائية لمجموعات اللجنين phosphitylated OH.
| مجموعة وظيفية | التحول الكيميائي (ppm) |
| خاتم A | |
| o الفينولية غير المدعومة | 137.9–137.4 |
| o بديل فينوليك | 138.8–137.9 |
| الخاتم ب | |
| كاتيكول أوه | 140.2–138.8 |
| بيروغالول أوه | 144.0–140.2 |
| الخاتم C | |
| ألفاتيك OH | 146.0–145.0 |
الجدول 3: 31P NMR التحول الكيميائي لمجموعات التانين phosphitylated OH.
ملاحظة: باستخدام برمجيات المعالجة الطيفية القياسية، يمكن تحديد مناطق محددة مسبقا للتحول الكيميائي لكي يتم دمجها. هذه الفرصة مفيدة عندما يكون هناك العديد من الأطياف التي يتعين معالجتها.
7. التحديد الكمي للمجموعة الوظيفية
- حساب تركيز حل IS.
- حساب المبلغ المكافئ للإشارة المحددة:
Representative Results
ويمكن تطبيق البروتوكول الموصوف على حد سواء لتحليل lignins والعفص. في كيمياء اللجنين ، هذه الطريقة أساسية لأنها تسمح باكتشاف وتحديد كمية الأنواع المختلفة من مجموعات الهيدروكسي. ويبين الشكل 8A-D أمثلة على 31أطياف P NMR من الليغنيتين والعفص المكتسبة باستخدام مطيافات تعمل بترددات مختلفة. وسجل الطيف المبين في الشكل 8 ألف باستخدام مطياف NMR MHz 300، بينما سجل الشكل 8D باستخدام جهاز NMR 700 ميغاهرتز.
الشكل 8:الطيف الكمي 31P NMR من (A) الخشب اللين كرافت ليجنين (الطيف المسجل مع مطياف MHz 300 على 30.8 ملغ من اللجنين)، (B) حمض الليجنوسلفونيك الخشب اللين (الطيف المسجل مع مطياف 300 ميغاهرتز على 30.1 ملغ من اللجنين بعد الحفاظ على lignosulfonate لحمض الليغنوسلفونيك)، (C) أكاسيا تانين (الطيف المسجل مع مطياف 300 ميغاهرتز على عينة 30.3 ملغ) و (D) الخشب اللين كرافت ليجنين (الطيف المسجل مع مطياف 700 ميغاهرتز على 7.2 ملغ من اللجنين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد سجلت هذه الأطياف بعناية وعالجت يدويا. الإشارات النموذجية لaliphatic (150-145 صفحة في الدقيقة) ، العطرية (145-137 صفحة في الدقيقة) ، و carboxylic (136-134 صفحة في الدقيقة) مجموعات هيدروكسي يتم حلها بشكل جيد للغاية وعلى هذا النحو متكاملة بسهولة. إذا تم فتح النافذة الطيفية (من 95 إلى 190 ppm، الشكل 8)،تظهر ثلاث قمم حادة وقوية (175 و144 و132 ppm). ويرجع ذلك إلى فائض TMDP ، المعيار الداخلي (الكوليسترول أو NHND) ، وHedorxylated - TMDP (الناجمة عن آثار المياه) ، على التوالي.
وعلى النقيض من الكرافت واللجنين الأورغنوسوم، فإن الليغنوسلفونات غير قابلة للذوبان في خليط البيريدين/الكلوروفورم. للحصول على 31P NMR الطيف موثوق بها، الذوبان إلزامي. للتغلب على هذه المشكلة، يمكن تحويل الليغنوسلفونات إلى الأحماض lignosulfonic المقابلة قبل الاشتقاق. علاج حلول lignosulfonate مع الأحماض القوية (أي حمض الكبريتيك)، أو حمض تبادل الراتنجات (على سبيل المثال، Dowex 1H، مبادل حمض cation قوية) يدفع تحويل جميع مجموعات السلفونات في أشكالها الحمضية. يمكن إزالة المنتجات الناتجة من المحلول الحمضي باستخدام راتنجات امتزازية انتقائية (XAD-7 ، وهو مادة ماصة قطبية تستخدم لعزل المركبات التي تتميز بالأوزان الجزيئية تصل إلى 60،000 u.m.a) التي تم تحليلها باستخدام هذا البروتوكول. ويبين الشكل 8B الطيف الكمي 31P NMR من حمض الليغنوسلفونيك المشتق من TMDP. حتى في هذه الحالة ، فإن الإشارات المختلفة لمجموعات الهيدروكسي واضحة. ويبين الشكل 8C طيفا كميا نموذجيا قدره 31P NMR لعينة تانين مشتقة باستخدام TMDP. إشارة مميزة من مختلف ALIPHATIC OH (الحلقة C)، بيروغالول، ووحدات كاتيكول في الحلقة B ووحدات في حلقة A مرئية بشكل جيد.
Discussion
تمثل الطريقة الموصوفة تنفيذ وتحسين البروتوكول التحليلي الذي يهدف إلى التوصيف النوعي والكمي لللينين كما طوره أرجروبولوس37و38و39و40و41و42. بالمقارنة مع العديد من التقنيات الأخرى المتاحة لتوضيح البنية اللجنين، وقد تم قبول هذه الطريقة على نطاق واسع باعتبارها من بين الأكثر سهولة، وسريعة، وقابلة للاستنساخ. تعتمد صلاحية الطرق الكيميائية الرطبة (مثل النيتروبينزين وأكسدة البيرمانجانات وما إلى ذلك) على المهارات التجريبية الجيدة للمشغل ، مما يقصر الطريقة بشكل فعال على المشغلين المحدودين. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس من غير المألوف أن تواجه عوامل تصحيح في الأدب لأساليب الكيميائية الرطبة لحساب العديد من العيوب. لا يتطلب بروتوكول 31P NMR الموصوف مهارات تجريبية متقدمة تجعل هذا قابلا للتطبيق بسهولة وسهل الاستخدام ومتاحا على نطاق واسع. بالمقارنة مع غيرها من الأساليب التحليلية مفيدة، 31P NMR هي التقنية الوحيدة القادرة على الكشف بدقة وقياس مجموعات الهيدروكسي المختلفة في lignins. فعلى سبيل المثال، يمكن استخدام النقل البري الدولي لتحديد مختلف المجموعات الهيدروكسية مثل 1H NMR. ومع ذلك، تعاني كلتا التقنيتين لأنهما لا تستطيعان تقديم بيانات كمية موثوقة بسبب قضايا تداخل الإشارات الواسعة النطاق. تقنية أخرى تستخدم على نطاق واسع هو التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس ، التي أبلغ عنها لأول مرة Goldschmid. النهج، ومع ذلك، يقتصر على تحديد عام عموما لمجموعات هيدروكسي لأنه لا يمكن التفريق بشكل فعال بين اليافاتية والعطرية، و carboxylic OHs47.
من وجهة نظر اقتصادية ، فإن القيد الوحيد لتقنية 31P NMR هو سعر TMDP ، وهو كاشف مكلف نسبيا. يكلف حوالي 190 دولار أمريكي للجرام الواحد. وبالتالي، إذا كانت تكلفة التحليل ستكون تقريبية فقط لسعر TMDP، باستثناء تلك المستمدة من خليط البيريدين/ الكلوروفورم وتلك الخاصة بوقت المشغل، فإنها ستبلغ حوالي 24 دولارا أمريكيا لكل تحليل. لحل هذه المشكلة، تلجأ العديد من المختبرات إلى توليف TMDP، وبالتالي، تقليل تكاليف الكاشف. للقيام بذلك، يتم رد فعل بيناكول وثلاثي كلوريد الفوسفور في وجود تريثيلامين44. من الناحية الفنية ، رد الفعل هذا سهل نسبيا ؛ ومع ذلك ، فإن الرعاية في استخدام ثلاثي كلوريد الفوسفور ومتابعة العمل ، بما في ذلك التقطير الفراغي الذي يتم التحكم فيه بشكل جيد ، مطلوب. ويمكن تقديم مزيد من التفاصيل عن توليف TMDP عند الطلب.
على الرغم من أن هذا البروتوكول هو من بين الأفضل من حيث السهولة والقابلية للاستنساخ والدقة، إلا أنه يجب تسليط الضوء على بعض النقاط الحرجة. أولا، يجب أن تكون العينة قابلة للذوبان بشكل كامل في خليط البيريدين/الكلوروفورم المحدد. هذا الاعتبار أساسي لأن رد فعل الفوسفيثيل الكمي لمجموعات الهيدروكسيل يجب أن يحدث في ظل ظروف متجانسة تماما. إذا تم تليين جزء من العينة فقط، فإن التحليل الناتج سيكون غير دقيق. ثانيا، يجب أن تكون العينة التي سيتم فحصها خالية من الرطوبة والمذيبات لأن هذه المتغيرات ستؤثر بشكل ضار على دقة التحليل ونجاحه بشكل عام. آثار الرطوبة سوف تتفاعل مع TMDP إعطاء 2-هيدروكسي-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane. هذا المركب هو ملح تعويم شاحب أصفر ، غير قابل للذوبان في خليط المذيبات البيريدين / الكلوروفورم ، مما تسبب في اكتساب إشارة NMR غير كافية. نظرا لأن وزن العينة الصغير فقط (~ 30 ملغ) مطلوب ، فيجب أن يكون خاليا من المواد المتطايرة لوزنه الدقيق ليكون معروفا بدقة قبل التحليل.
في بعض الأحيان ، يمكن تعزيز قضايا حل العينات (خاصة بالنسبة للعينات المؤتأكسدة للغاية) عن طريق إضافة كميات صغيرة من المذيبات المشتركة (أي ثنائي ميثيلفورماميد) ، مما يساعد على حل العينة. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام كل مذيب لا يتفاعل مع TMDP للمساعدة في حل العينة. لا يمكن أن يتضمن انتخاب المذيبات المشتركة المذيبات المشتركة التي تحتوي على مجموعات هيدروكسي أو أمينية لأنها تتفاعل مع الكاشف ، مما يسبب أطيافا نهائية مضللة. وتجدر الإشارة إلى أن ثنائي ميثيل سلفوكسيد يتفاعل أيضا مع TMDP يمنع استخدامه كمذيب مشارك. يمكن استخدام السوائل الأيونية القائمة على البيريدين، مثل كلوريد الأليل-3-بوتيلبيريدينيوم، عندما تنشأ مشكلات في الذوبان. ومع ذلك ، يجب أن يكون السائل الأيوني جافا مرة أخرى48. لإذابة الليغنوسلفونات (نوع اللجنين الذي يتميز بدرجة كبريتون عالية)، ثبت أن العلاج المسبق الذي ينطوي على تحويل المجموعات المحايدة إلى شكلها الحمضي مفيد. يمكن تحويل الليغنوسلفونات بشكل ملائم إلى ظروفها الحمضية باستخدام راتنجات التبادل الحمضية في الوسائط المائية. يتم عزل الأحماض lignosulfonic الناتجة عن الحل عن طريق الامتزاز على راتنجات محددة (على سبيل المثال، XAD-7) و desorption في الإيثانول. تبخر حلول الإيثانول على الضغط المنخفض عند 40 درجة مئوية يسمح بعزل أحماض الليغنوسلفونيك. ويمكن بعد ذلك أن تتميز هذه الليغنينز من قبل 31P NMR لأنها قابلة للذوبان في خليط البيريدين / الكلوروفورم المقترحة من قبل البروتوكول.
التجفيف الفراغي لفترات طويلة في درجات حرارة معتدلة يقلل بشكل فعال من كمية الرطوبة وغيرها من المواد المتطايرة في كل عينة. وتجدر الإشارة إلى أن كميات صغيرة من المياه لا تؤثر على الطيف النهائي لأن TMDP يضاف بشكل زائد. وبالإضافة إلى ذلك، في بعض الحالات، قد تنتج كمية صغيرة من 2-هيدروكسي-4،4'-5،5'-tetramethyl-1،3،2-dioxaphospholane من الرطوبة الموجودة في أنبوب NMR أو قارورة العينة. في هذه الحالات، والتحريك كافية لإذابة كمية من التعجيل شكلت تماما. إذا تم تشكيل كمية عالية من 2-هيدروكسي-4،4'-5،5'-tetramethyl-1،3،2-dioxaphospholane، يقترح تكرار إعداد العينة، وتحسين علاج التجفيف. على سبيل المثال، قبل الاستخدام، يمكن تسخين جميع الأواني الزجاجية لفترة وجيزة مع بندقية الحرارة.
النطاق الطيفي المستخدم لتسجيل الطيف واسع مقارنة بمنطقة الاهتمام للإشارة المتعلقة بمجموعات الهيدروكسيل المختلفة. ومع ذلك، هذا إلزامي لفهم ما إذا كان اشتقاق العينة حدث بنجاح. يتم تأكيد اشتقاق العينة الكاملة من خلال وجود إشارة قوية حول 174 جزء في المليون. هذه الذروة الحادة يرجع إلى TMDP غير المنقحة ، ووجودها يضمن أن الكاشف كان موجودا بشكل زائد ، وبالتالي ، تم اشتقاق جميع مجموعات الهيدروكسيل. إذا كانت هذه الذروة غائبة، فإن السببين الأكثر احتمالا هما: (1) كمية TMDP المستخدمة غير كافية لإجراء اشتقاق كامل للعينة، أو (2) وجود كمية عالية من الماء في العينة. في الحالة الأولى، من المرجح أن يضمن استخدام كمية أكبر من TMDP اشتقاق العينة بالكامل، وستظهر الإشارة عند 174 جزء في المليون. في الحالة الثانية، يجب أن تجفف العينة على نطاق أوسع. بمجرد ضمان وجود فائض في TMDP ، يمكن تنفيذ ذروة التكامل. قبل هذه العملية، قم بالتكبير إلى نافذة أضيق (150 إلى 132 جزء في المليون) التي تحصر إشارات الاهتمام.
وقد تم اختيار كمية العينة (~ 30 ملغ) التي سيتم تحليلها، التي تم الإبلاغ عنها في البروتوكول التجريبي أعلاه، لجمع أطياف ذات نوعية جيدة لمطياف NMR 300 ميغاهرتز أو أكثر. ومع ذلك، لاحظنا أنه من الممكن تقليل كمية العينة إذا تم استخدام مغناطيس حقل 500 ميغاهرتز أو أعلى. على سبيل المثال، في الشكل 8D، يظهر طيف NMR (الناتج عن أداة 700 ميغاهرتز) لعينة تم إعدادها مع 7.2 ملغ من اللجنين. إشارة التكامل من هذا الطيف يقدم نفس النتائج التي تم الحصول عليها عند استخدام كميات أعلى من اللجنين. هذه الحقيقة تضخيم إمكانية تطبيق هذا البروتوكول لجميع البحوث التي تتوفر كميات صغيرة من المنتجات.
وعموما، يمكن تطبيق هذا البروتوكول التجريبي على العديد من تطبيقات البحث والتطوير عند فهم أصل ومصير مختلف المجموعات الهيدروكسي الموجودة في الليغنينز والعفص مطلوب. وعلى وجه الخصوص، عندما تقترن البيانات الناتجة عن ذلك ببيانات المؤتمر العام للبراءات وHSQC، فإنها تتيح الفرصة لمزيد من التفاصيل والتكهن بشأن هيكل اللجنين أو التانين. في كثير من الحالات التي يتم فيها تطبيق التعديلات الكيميائية على مجموعات الهيدروكسي من اللجنين أو التانين ، يمكن أن تكون تحليلات 31P NMR الكمية ذات قيمة للغاية للكشف عما إذا كانت هذه التعديلات قد حدثت وإلى أي درجة. على سبيل المثال، يظهر الشكل 9 أطياف NMR من نفس اللجنين قبل وبعد أكسدتها. يظهر تقييم نوعي بسيط انخفاض مجموعات الهيدروكسي الالفيائية والعطرية عند الأكسدة ، وبالتالي توفير معلومات وإرشادات قيمة.
الشكل 9: كمي 31P NMR أطياف من نفس اللجنين Organosolv مشتق باستخدام TMDP (A) قبل و (ب) آخر أكسدتها. تم تسجيل الأطياف باستخدام مطياف NMR 300. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في الختام، هذه التقنية لديها كل سمات كونها من بين الأدوات الأكثر أهمية وقوة عند الاستفسارات التي تتعامل مع البوليفينول، OH تحمل lignins، والعفص (وحتى البوليمرات الاصطناعية)49،50،51 تحتاج إلى أن تكون مصنوعة في مجموعة متنوعة من المجالات، بدءا من الكيمياء إلى الهندسة، من علم الأحياء إلى البوليمر، والتطبيقات الصيدلانية.
Disclosures
كلوديا Crestini وديميتريس S Argyropoulos ضمان أن جميع المؤلفين (C.C., N.P., وD.S.A.) ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل على مر السنين من خلال جوائز مالية مختلفة شملت منظمات مثل معهد أبحاث اللب والورق في كندا، وجامعة ماكغيل مونتريال، ومجلس بحوث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا، والمؤسسة الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية، ووزارة الزراعة في الولايات المتحدة، وشركة سولفاي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 - 1000 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0866 | |
| 20 - 200 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0865 | |
| 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% | Sigma-Aldrich | 447536 | |
| Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) | Precisa | LX220 A | |
| Binder Vacuum Oven | Binder | VD53 | |
| Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 | Sigma-Aldrich | 29651-U | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| Cholesterol, Sigma-grade | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Molecular sieves, 4A | Sigma-Aldrich | 208604 | |
| N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% | Sigma-Aldrich | 226378 | |
| NMR spectrometer, 300 MHz | Bruker | ||
| Norell natural quartz 3 mm NMR tubes | Sigma-Aldrich | NORS33007 | |
| Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) | VWR | 613-0342 | |
| Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) | VWR | 613-0239 | |
| Pyridine, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| Stirring bars,micro, 3 mm lenght | VWR | 442-0360 | |
| Stirring bars,micro, 6 mm lenght | VWR | 442-0362 | |
| Triphenylphospine oxide, 97% | Sigma-Aldrich | T84603 | |
| Vials for environmental analysis, WHEATON, 20.00 mL | DWK Life Sciences | WHEAW224609 | |
| Weighing paper, grade 531 | VWR | 516-0318P |
References
- Meng, X., et al. Determination of hydroxyl groups in biorefinery resources via quantitative 31 P NMR spectroscopy. Nature Protocols. 14 (9), 2627-2647 (2019).
- Anastas, P. T., Williamson, T. C. Green chemistry: An overview. Green Chemistry. 626, 1-17 (1996).
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: Principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Collins, M. N., et al. Valorization of lignin in polymer and composite systems for advanced engineering applications - A review. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 828-849 (2019).
- De Gruyter. Biorefinery: From Biomass to Chemicals and Fuels. , (2012).
- Sannigrahi, P., Pu, Y., Ragauskas, A. Cellulosic biorefineries-unleashing lignin opportunities. Current Opinion in Environmental Sustainability. 2 (5), 383-393 (2010).
- Lange, H., Decina, S., Crestini, C. Oxidative upgrade of lignin - Recent routes reviewed. European Polymer Journal. 49 (6), 1151-1173 (2013).
- Glasser, W. G. Classification of lignin according to chemical and molecular structure. Lignin: Historical, Biological, and Materials Perspectives. 742, 216-238 (1999).
- Wiley. Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology, 2 Volume Set, 5th Edition. , Wiley. (2004).
- Lewis, N. G., Sarkanen, S. Preface. Lignin and Lignan Biosynthesis. 697, 9-11 (1998).
- Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11 (3), 169-218 (1977).
- Ragauskas, A. J., et al. Lignin valorization: Improving lignin processing in the biorefinery. Science. 344 (6185), (2014).
- Crestini, C., Melone, F., Sette, M., Saladino, R. Milled wood lignin: A linear oligomer. Biomacromolecules. 12 (11), 3928-3935 (2011).
- Guerra, A., et al. On the propensity of lignin to associate: A size exclusion chromatography study with lignin derivatives isolated from different plant species. Phytochemistry. 68 (20), 2570-2583 (2007).
- Contreras, S., Gaspar, A. R., Guerra, A., Lucia, L. A., Argyropoulos, D. S. Propensity of lignin to associate: Light scattering photometry study with native lignins. Biomacromolecules. 9 (12), 3362-3369 (2008).
- Gigli, M., Crestini, C. Fractionation of industrial lignins: opportunities and challenges. Green Chemistry. 22 (15), 4722-4746 (2020).
- Adler, E. Structural elements of lignin. Industrial & Engineering Chemistry. 49 (9), 1377-1383 (1957).
- Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 1. Extraction of lignin with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 477-485 (1956).
- Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 2. Extraction of lignin-carbohydrate compelexes with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 243-251 (1957).
- Bjorkman, A. Studied on finely divided wood. Part 5. The effect of milling. Svensk Pappersit. , 329-335 (1957).
- Das, A. K., Islam, N., Ashaduzzaman, F. O., Dungani, R. Review on tannins: Extraction processes, applications and possibilities. South African Journal of Botany. 135, 58-70 (2020).
- Laitila, J. E. Composition and evolution of oligomeric proanthocyanidin-malvidin glycoside adducts in commercial red wines. Food Chemistry. 340, 127905 (2021).
- Covington, A. D., Wise, W. R. Tanning Chemistry. , RSC Publishing. (2019).
- Tarabanko, V. E., Tarabanko, N. Catalytic oxidation of lignins into the aromatic aldehydes: General process trends and development prospects. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2421 (2017).
- Guerra, A., Mendonça, R., Ferraz, A., Lu, F., Ralph, J. Structural characterization of lignin during pinus taeda wood treatment with ceriporiopsis subvermispora. Applied and Environmental Microbiology. 70 (7), 4073-4078 (2004).
- Faix, O., Andersons, B., Zakis, G. Determination of carbonyl groups of six round robin lignins by modified oximation and FTIR spectroscopy. Holzforschung. 52 (3), 268-274 (1998).
- Santos, R. B., Capanema, E. A., Balakshin, M. Y., Chang, H., Jameel, H. Lignin structural variation in hardwood species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (19), 4923-4930 (2012).
- Bose, S. K., Wilson, K. L., Hausch, D. L., Francis, R. C. Lignin analysis by permanganate oxidation. II. Lignins in Acidic Organosolv Pulps. Holzforschung. 53 (6), 603-610 (1999).
- Harman-Ware, A. E., et al. A thioacidolysis method tailored for higher-throughput quantitative analysis of lignin monomers. Biotechnology Journal. 11 (10), 1268-1273 (2016).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
- Lin, S. Y., Carlton, W. D. Methods in Lignin Chemistry. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1992).
- Lundquist, K. Proton (1H) NMR Spectroscopy. Methods in Lignin Chemistry. , 242-249 (1992).
- Robert, D. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrometry. Methods in Lignin Chemistry. , 250-273 (1992).
- Li, S., Lundquist, K. A new method for the analysis of phenolic groups in lignins by 1H NMR spectrometry. Nordic Pulp & Paper Research Journal. 9 (3), 191-195 (1994).
- Hallac, B. B., Pu, Y., Ragauskas, A. J. Chemical transformations of buddleja davidii lignin during ethanol organosolv pretreatment. Energy & Fuels. 24 (4), 2723-2732 (2010).
- Sette, M., Wechselberger, R., Crestini, C. Elucidation of lignin structure by quantitative 2D NMR. Chemistry - A European Journal. 17 (34), 9529-9535 (2011).
- Sette, M., Lange, H., Crestini, C. Quantitative HSQC analyses of lignin: A practcal comparison. Computational and Structural Biotechnology Journal. 6 (7), 201303016 (2013).
- Wroblewski, A. E., Lensink, C., Markuszewski, R., Verkade, J. G. Phosphorus-31 NMR spectroscopic analysis of coal pyrolysis condensates and extracts for heteroatom functionalities possessing labile hydrogen. Energy & Fuels. 2 (6), 765-774 (1988).
- Archipov, Y., Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part I. Model compounds. Journal of Wood Chemistry and Technology. 11 (2), 137-157 (1991).
- Argyropoulos, D. S., Heitner, C., Morin, F. G. P. NMR spectroscopy in wood chemistry - Part III. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores in mechanical pulp. Holzforschung - International Journal of the Biology, Chemistry, Physics and Technology of. 46 (3), 211-218 (2009).
- Argyropoulos, D. S., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part VI. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores and carboxylic acids present in mechanical pulps; a method for the quantitative determination of ortho-quinones. Holzforschung. 48 (1), 112-116 (1994).
- Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry part V. Qualitative analysis of lignin functional groups. Journal of Wood Chemistry and Technology. 13 (2), 187-212 (1993).
- Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part IV. Lignin models: Spin lattice relaxation times and solvent effects in 31P NMR. Holzforschung. 47 (1), 50-56 (1993).
- Granata, A., Argyropoulos, D. S. 2-Chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane, a reagent for the accurate determination of the uncondensed and condensed phenolic moieties in lignins. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 43 (6), 1538-1544 (1995).
- Duval, A., Vilaplana, F., Crestini, C., Lawoko, M. Solvent screening for the fractionation of industrial kraft lignin. Holzforschung. 70 (1), 11-20 (2016).
- Ben, H., Farrell, J. R. In-depth investigation on quantitative characterization of pyrolysis oil by 31P NMR. RSC Advances. 6 (21), 17567-17573 (2016).
- Goldschmid, O. Determination of phenolic hydroxyl content of lignin preparations by ultraviolet spectrophotometry. Analytical Chemistry. 26 (9), 1421-1423 (1954).
- Ben, H., et al. Characterization of whole biomasses in pyridine based ionic liquid at low temperature by 31P NMR: An approach to quantitatively measure hydroxyl groups in biomass as their original structures. Frontiers in Energy Research. 6, (2018).
- Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis of potentially biobased copolyesters based on adipic acid and butanediols: Kinetic study between 1,4- and 2,3-butanediol and their influence on crystallization and thermal properties. Polymer. 99, 204-213 (2016).
- Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis and characterization of biobased poly(butylene succinate-ran-butylene adipate). Analysis of the composition-dependent physicochemical properties. European Polymer Journal. 87, 84-98 (2017).
- Chan, K. P., Argyropoulos, D. S., White, D. M., Yeager, G. W., Hay, A. S. Facile quantitative analysis of hydroxyl end groups of Poly(2,6-dimethyl-1,4-phenylene oxide)s by 31P NMR spectroscopy. Macromolecules. 27 (22), 6371-6375 (1994).
