Summary
31 P NMR is een krachtig hulpmiddel voor de structurele opheldering van polyfenolen. Deze snelle, eenvoudige, nauwkeurige, kwantitatieve en zeer reproduceerbare analyseprocedure, die de kwantificering en differentiatie van de verschillende soorten hydroxy-, fenol- en carbonlgroepen in lignines en tannines mogelijk maakt, is nu een routinematig analytisch hulpmiddel geworden.
Abstract
De ontwikkeling van duurzame bioraffinageproducten wordt onder meer geconfronteerd met de uitdaging van lignine en tanninevalorisatie. Deze overvloedige, hernieuwbare aromatische biopolymeren zijn niet op grote schaal geëxploiteerd vanwege hun inherente structurele complexiteit en hoge mate van variabiliteit en soortendiversiteit. Het ontbreken van een gedefinieerde primaire structuur voor deze polyfenolen wordt verder verergerd door complexe chemische veranderingen die tijdens de verwerking worden geïnduceerd, waardoor uiteindelijk een grote verscheidenheid aan structurele kenmerken van extreme betekenis wordt gegeven voor verdere gebruiksinspanningen.
Bijgevolg is een protocol voor de snelle, eenvoudige en ondubbelzinnige identificatie en kwantificering van de verschillende functionele groepen die aanwezig zijn in natuurlijke polyfenolen, een fundamentele voorwaarde voor het begrijpen en dienovereenkomstig afstemmen van hun reactiviteit en uiteindelijk nut.
Kwantitatieve 31P NMR biedt de mogelijkheid om snel en betrouwbaar ongesubstitueerde, o-mono gesubstitueerde en o-disubstitueerde fenolen, alifatische OHs en carbonzuurmoieties in lignines en tannines met een breed toepassingspotentieel te identificeren.
De methodologie bestaat uit een in situ kwantitatieve lignine- of tannine-etiketteringsprocedure met behulp van een geschikte 31P-bevattende sonde, gevolgd door de verwerving van een kwantitatief 31P NMR-spectrum in aanwezigheid van een interne standaard. De hoge natuurlijke abundantie van de 31P-kern zorgt voor kleine hoeveelheden van het monster (~ 30 mg) en korte NMR-acquisitietijden (~ 30-120 min) met goed opgeloste 31 P-signalendie sterk afhankelijk zijn van de omringende chemische omgeving van de gelabelde OH-groepen.
Introduction
Deze procedure, die onlangs werd gepubliceerd in Nature Protocols1, is meer dan 3.000 keer geciteerd in de archiefliteratuur en is een routinemeting geworden voor lignine- en tanninekarakterisering omdat het essentiële, snelle en reproduceerbare structurele informatie biedt.
Lignine en tannines
Toen Green Chemistry werd geïntroduceerd door Paul T. Anastas en John C. Werner2,3, veranderde het de algemene opvatting van chemie drastisch. Met name het belang van het gebruik van duurzame materialen in plaats van fossiele grondstoffen, zoals olie en steenkool, als uitgangspunt wordt benadrukt als een cruciaal aspect2,3. Van de verschillende soorten biomassa is lignine het meest voorkomende aromatische biopolymeer en kan worden gezien als een potentiële bron voor industriële grondstoffen en producten met een hoge toegevoegde waarde4.
Lignine is het op één na meest voorkomende houtbestanddeel (waarbij cellulose de eerste is en hemicellulose derde). Het gehalte in planten varieert afhankelijk van het planttype: bijvoorbeeld hardhout dat wordt gekenmerkt door een lagere hoeveelheid lignine in vergelijking met naaldhout (20% ± 4% versus 28% ± 4%). Bovendien is de lignineverdeling in plantaardig weefsel niet homogeen: het hogere ligninegehalte is te vinden in de celwand5,6. Lignine is een polyfenolisch materiaal dat industrieel wordt verkregen als bijproduct van de papier-/cellulose-industrie7. Het wordt teruggewonnen uit het houtpulpproces, waarbij houtsnippers voornamelijk worden verwerkt in aanwezigheid van OH- en / of OH- + HS- ioncondities om cellulose te scheiden van hemicellulose en lignine (Soda- en / of Kraft-processen)8,9.
De eerste pogingen om lignine te bestuderen werden gedaan door Payen en Schultze, respectievelijk in 1838 en 186510. In 1977 vatte Adler alle relevante beschikbare kennis van die tijd samen11. Momenteel wordt erkend dat de ligninebouwstenen drie fenyl-propanoïde eenheden zijn: p-coumaryl, coniferyl en sinapylalcoholen. Deze monomeren geven, dankzij een polymerisatieproces van vrije radicalen, aanleiding tot p-hydroxyfenyl-, guaiacyl- en sinapyleenheden die uiteindelijk in grote lijnen lignine vormen (Figuur 1)12. Het ontbreken van een primaire structuur in lignine impliceert een inherente moeilijkheid voor de structurele karakterisering ervan. Dienovereenkomstig is de evaluatie van de verdeling van het molecuulgewicht altijd enigszins controversieel geweest. Gemalen houtlignine, de lignine geïsoleerd onder milde omstandigheden die meestal protoligninebenaderen 10, is samengesteld uit oligomeren13 die sterk interageren via supramoleculaire aggregatieprocessen14,15.
Figuur 1: Een representatief model van lignine van zachthout waarin de verschillende soorten bindingen worden uitgelicht. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Lignine wordt gewoonlijk ingedeeld afhankelijk van: (a) het type hout waarvan ze zijn afgeleid (bijvoorbeeld hardhout en naaldhout), (b) het proces dat wordt gebruikt om het te isoleren. De meest cruciale industriële ligninesoorten zijn Kraft, Lignosulfonaten en Organosolv.
De structuur van lignine is sterk afhankelijk van de oorsprong en verwerkingschemie. Meer specifiek, wanneer de vrij complexe en onregelmatige structuur van lignine wordt verergerd met zijn natuurlijke diversiteit en de complexe verwerkingschemie, ontstaat een materiaal van extreme variabiliteit, diversiteit en heterogeniteit, waardoor het gebruik ervan wordt beperkt tot laagwaardige toepassingen16. Terwijl lignine van zachthout voornamelijk guaiacyleenheden (G) bevat met verwaarloosbare hoeveelheden p-hydroxyfenylgroepen (G-lignine), worden hardhoutligninen samengesteld uit guaiacyl- en syringylsubeenheden (GS-lignine) in verschillende verhoudingen en graslignines worden gevormd door subeenheden guaiacyl, syringyl en p-hydroxyfenyl(GSH lignine). De extractieve benadering die wordt gebruikt voor isolatie heeft een dramatische invloed op de structuur van de opkomende lignine17. Figuur 2 toont drie ligninestructuren, verschillend door de gebruikte isolatiebenadering. Enkele overwegingen met betrekking tot het effect van de extractiemethode kunnen worden benadrukt. Ten eerste is Kraft lignine een dealkylated, sterk gefragmenteerde en gecondenseerde lignine, terwijl Organosolv lignine een structuur heeft die vergelijkbaar is met gemalen houtlignine (geïsoleerd met behulp van de Bjorkman-benadering)18,19,20. Ten slotte worden lignosulfonaten gekenmerkt door een hoge mate van sulfonatie, afhankelijk van de intensiteit en de omstandigheden van het extractieve sulfonatieproces.
Figuur 2: Representatieve structuren voor technische lignine. In deze figuur zijn de verschillen tussen de verschillende soorten lignine te zien. (A) Softwood Kraft lignine is sterk gecondenseerd, (B) lignosulfonaten worden gekenmerkt door sulfonische groepen op verzadigde koolstoften, en (C) organosolv lignine heeft een structuur vergelijkbaar met die van gemalen hout lignine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Net als lignines zijn tannines polyfenolische verbindingen die in planten worden aangetroffen. Een recente en bijgewerkte beoordeling van de extractieve benaderingen en toepassingen van tannines werd onlangs vrijgegeven door Das et al.21. Het belang van tannines in het dagelijks leven kan worden benadrukt aan de hand van twee voorbeelden: ze geven smaak en kleur aan wijnen22; bovendien biedt hun polyfenolische structuur antioxiderende eigenschappen en maakt ze ideaal voor toepassing in de bruiningsindustrie23. Tannines zijn onderverdeeld in twee klassen: hydrolyseerbaar en niet-hydrolyseerbaar. Hydrolyseerbare tannines kunnen worden beschouwd als een polymeer van gallische, di-gallische en ellaginezuuresters(figuur 3). Deze esters zijn het gevolg van de verestering van de fenolzuren met suikermoleculen (bijv. Glucose, rhamnose en arabinose).
Figuur 3: Typische hydrolyseerbare tannines: looizuur, vescalgin. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Niet-hydrolyseerbare tannines, ook bekend als gecondenseerde tannines, zijn polymeren en oligomeren die afkomstig zijn van flavan-3-ols. Onder flavan-3-ols komen catechines en gallocatechinen het meest voor. Het zijn kleurloze kristallijne verbindingen(figuur 4). Door de polymerisatie ontstaat een polymeer dat wordt gekenmerkt door een helicoïdale structuur. De aromatische hydroxygroepen zijn gericht op de buitenkant van de helix, terwijl de pyran-oxygenen zich in het binnenste bevinden.
Figuur 4: Proantocyanidinestructuren: R =H, OH, OCH3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Karakterisering van lignines en tannines met NMR
Twee soorten informatie zijn cruciaal bij de karakterisering van lignine of tannine: (a) chemische structuur (bijv. Hydroxy-groepsinhoud, aard en frequentie van interunit-verbindingen) en (b) molecuulgewicht en polydispersiteit. Sinds de vroege studies over lignine zijn verschillende technieken gebruikt om deze doelen te bereiken, en er zijn twee klassen van methoden ontstaan: chemische en fysische methoden.
In de ligninechemie zijn chemische methoden, zoals alkalische nitrobenzeenoxidatie, derivatisatie gevolgd door reductieve splitsing, permanganaatoxidatie en thioacidolyse, historisch veel gebruikt24,25,26,27,28,29. Maar zelfs als de analytische protocollen zijn geïmplementeerd en geoptimaliseerd, zijn ze tijdrovend, bewerkelijk en vereisen ze uitgebreide experimentele vaardigheden30. Als alternatief zijn vanaf het begin van de instrumentele analyse fysische methoden gebruikt om lignine- en tanninekarakteriseringen uit te voeren31. Deze technieken maken het mogelijk om de problemen van klassieke methoden te overwinnen, waardoor het gemakkelijk is om de ligninestructuur te karakteriseren.
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) maakt het verkrijgen van informatie over ligninestructuur en chemische samenstelling tussen de instrumentele technieken mogelijk. In het bijzonder kunnen gegevens van kwantitatieve monodimensionale 1H NMR-spectra en kwantitatieve 13C NMR-spectra informatie verschaffen over verschillende soorten lignine-interunitbindingen32,33,34,35. Helaas lijden monodimensionale spectra aan signaaloverlapping, wat de inspanningen voor signaalintegratie ernstig kan ondermijnen. Kwantitatieve versies van HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), Q-HSQC (Quantitative - Heteronuclear Single Quantum Coherence), zijn gebruikt om de ligninestructuur beter te begrijpen en nuttige informatie te geven over interne koppelingen. Ze kunnen echter niet volledig worden gebruikt om de verschillende gebouweneenheden13,36,37 kwantitatief te bepalen.
Om de problemen in verband met mono- en tweedimensionale NMR op te lossen, is substraatderivatisatie overwogen. Een van de voordelen van deze aanpak is dat specifieke labels kunnen worden geïntroduceerd in het complexe macromolecuul en er geen spectrale interferentie het gevolg is van het oplosmiddel waarin de gelabelde substraten zijn opgelost1. Verkade was de pionier op dit gebied en voerde 31P NMR-analyse uit van fosforderivaten, steenkoolderivaten en aanverwante verbindingen38. In de publicatie werd een screening van verschillende fosforbevattende reagentia (fosfalen) uitgevoerd en werd de chemische verschuiving van andere gelabelde verbindingen geregistreerd. Het team van Argyropoulos introduceerde voor het eerst derivatisatie voor de kwantitatieve en kwalitatieve analyse van hydroxygroepen in lignine in 1991. Na het bestuderen van de derivatisatie van ligninemodelverbindingen met behulp van fosforhoudende reagentia, maakte zijn groep de weg vrij voor een van de meest dagelijks gebruikte technieken in de ligninechemie, 31P NMR-analyse39,40,41,42,43. Van de verschillende onderzochte fosfalanen kwam Argyropoulos tot het gebruik van 2-chloor-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxafosfaolaan (TMDP) als de meest geschikte om lignineanalyse uit te voeren44. TMDP reageert selectief met hydroxygroepen die de kwantitatieve vorming van fosforbevattende derivaten veroorzaken die worden gekenmerkt door specifieke chemische verschuivingen van 31P NMR(figuur 5).
Figuur 5: Lignine en tanninefosfititeringschemie. Het labelen van lignine en tannine labiele H-groepen wordt bereikt door in situ reactie. De gelabelde polyfenolen worden gekenmerkt door specifieke 31P NMR-banden die overeenkomen met de verschillende type hydroxygroepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Monster derivatisatie wordt uitgevoerd in een pyridine / chloroform (1.6: 1) mengsel; deze keuze is het resultaat van een nauwkeurige evaluatie. Pyridine heeft twee voordelen. Ten eerste vereenvoudigt en versterkt het selecteren van een oplosmiddel dat wordt gekenmerkt door een Hildebrand-parameter van ongeveer22,1 MPa 1/2 de oplosbaarheid van lignine45. Bijgevolg is de toevoeging van pyridine als oplosmiddel, waarvan de Hildebrand-parameter gelijk is aan 21,7, dus optimaal. Ten tweede gaat de reactie van TMDP met hydroxygroepen gepaard met de vorming van zoutzuur (HCl) als bijproduct met bijkomende negatieve implicaties voor de gemakkelijke vorming van lignine-fosfaolanederivaten. Om deze reden moet de resulterende HCl worden geneutraliseerd. Wanneer aanwezig in significante overmaat, maakt de basiciteit van de pyridine, ten opzichte van TMDP, de neutralisatie van de HCl mogelijk (via de vorming van pyridinehydrochloride).
Het gebruik van het aanbevolen pyridine/gedeutereerde chloroform binaire oplosmiddelsysteem is gebaseerd op drie redenen. Ten eerste bevordert het het oplossen van monsters. Ten tweede, omdat pyridinehydrochloride oplosbaar is in chloroform, kan het neerslag en verslechtering van het uiteindelijke spectrum voorkomen. Ten derde wordt gekozen voor gedeutereerd chloroform vanwege het unieke singletsignaal, waardoor de NMR-spectrometer tijdens het acquisitieproces kan worden vergrendeld. Monsterderivatisatie wordt uitgevoerd in aanwezigheid van een interne standaard. Op deze manier, wanneer het monster en de standaard worden gederivatiseerd, maakt de vergelijking van de integralen van de pieken van het monster en de standaard de kwantificering van de hoeveelheid voor elk type aanwezige hydroxygroep mogelijk. Verschillende verbindingen zijn beschouwd als interne normen. Deze verbindingen worden gekenmerkt door een enkele hydroxygroep per molecuul, die na derivatisatie een enkel scherp signaal in het 31P NMR-spectrum biedt. De selectie van de norm moet zorgvuldig worden gemaakt. Het signaal mag niet overlappen met dat van het gederivatiseerde monster. Cholesterol werd veel gebruikt tijdens de vroege dagen. Een gedeeltelijke overlap met signalen afkomstig van alifatische hydroxygroep beperkt echter het gebruik ervan. Voor routineanalyse hebben interne standaardoplossingen van N-hydroxy-5-norborneen-2,3-dicarboximide (NHND) de voorkeur. Vanwege nhnd-instabiliteit kunnen de standaardoplossingen echter slechts enkele dagen worden bewaard46.
Protocol
Het volgende stroomschema (figuur 6) schetst het hele experimentele protocol om een 31P NMR-analyse van lignines en tannines uit te voeren.
Figuur 6: Procedure voor de 31P NMR-analyse van lignines en tannines. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
1. Monstervoorbehandeling
- Droog een aliquot (ongeveer 100 mg) van de analyt (lignine of tanninemonster) een nacht in een vacuümoven op 40 °C.
OPMERKING: Bijzondere aandacht is nodig voor de temperatuurkeuze, aangezien temperaturen hoger dan 40 °C de gevoelige structuur van de onderzochte polyfenolen chemisch kunnen veranderen. - Breng het monster na het drogen snel over naar een watervrije calciumsulfaat-siccator totdat het kamertemperatuur bereikt. Deze stap is verplicht om te voorkomen dat het monster vocht uit de omgeving absorbeert.
2. Bereiding van oplosmiddeloplossing
- Bereid een mengsel van pyridine/gedeutereerd chloroform-oplosmiddel in een injectieflacon met monster van 20 ml door watervrij pyridine en gedeutereerd chloroform te mengen in een verhouding van 1,6/1 (v/v).
LET OP: Let op tijdens het manipuleren van pyridine en gedeutereerd chloroform. Deze verbindingen zijn ontvlambaar, schadelijk en giftig. Bereid en gebruik de oplossing in een goed geventileerde zuurkast met de juiste handschoenen. - Voeg 5-8 g goed gewassen en gedroogde geactiveerde 5A moleculaire zeven toe in pellets van 3,2 mm om watersporen te verwijderen. Bovendien wordt het gebruik van een septumdop ten zeerste aanbevolen om luchtcontact en vochtverontreiniging van het oplosmiddelsysteem te voorkomen. Bewaar de bereide oplossing in het donker.
3. Bereiding van interne standaardoplossing (IS)
- Bereid in een Erlenmeyer van 2 ml een 0,1 M-oplossing van chroom (III) acetylacetonaat (ongeveer 10 mg) en interne standaard (ongeveer 35,8 mg NHND of 77,3 mg cholesterol) in de eerder bereide oplosmiddeloplossing.
LET OP: Chroom (III) acetylacetonaat is schadelijk; draag tijdens de manipulatie geschikte handschoenen. - Noteer het exacte gewicht van de IS die in de IS-oplossing is toegevoegd.
- Breng de IS-oplossing over in een injectieflacon met een verzegelde dop met geactiveerde moleculaire zeven (zie punt 2.2) en bewaar deze in het donker bij 40 °C.
4. Bereiding van nmr-monsteroplossing
- Weeg nauwkeurig ~30 mg monster af in een injectieflacon van 2 ml uitgerust met een roerstaaf. Sluit de injectieflacon af met een septumdop.
- Voeg 0,5 ml van de oplosmiddelsysteemoplossing toe aan de injectieflacon met monster.
- Breng 100 μL van de IS-oplossing over in de injectieflacon met monster via een micropipette. Roer magnetisch de resulterende dispersie (500 rpm) totdat alle lignine of tannine is opgelost, wat resulteert in een heldere oplossing.
OPMERKING: Aangezien volledige oplosbaarheid van het monster noodzakelijk is, kan deze stap tot 12 uur duren. - Breng 0,1 ml TMDP over in de monsteroplossing. Plaats het monster onder krachtig magnetisch roeren. Houd de monsteroplossing verzegeld. Gebruik TMDP in een goed geventileerde zuurkap terwijl u de juiste handschoenen draagt.
LET OP: TMDP en zijn dampen zijn corrosief, schadelijk en werken snel samen met water.
OPMERKING: De vorming van een geel neerslag is te wijten aan watersporen in het monster of de pyridine / chloroform-oplossing. In een dergelijk geval moet de procedure worden herhaald door ervoor te zorgen dat alle mogelijke vochtverontreiniging wordt vermeden. - Breng de monsteroplossing over in een NMR-buis met behulp van een Pasteur-pipet.
5. NMR-analyse
- Laad de buis in het NMR-instrument. De spectrometer die wordt gebruikt om deze analyse uit te voeren, heeft een breedbandsonde nodig.
- De experimentele parameters vaststellen volgens de instelling in tabel 11.
| PULSE PROGRAMMA | Inverse gated ontkoppelingspuls (zgig) |
| NUCLEOUS | 31p |
| SPECTRALE BREEDTE | 100 p.p.m. |
| ACQUISITIETIJD | - 0,8 s |
| ONTSPANNING VERTRAGING | ≥ 10 s |
| SCANT NUMMER | 64 of meer |
| SPECTRUM CENTRUM | 140 p.p.m. |
Tabel 1: Experimentele parameters om 31P NMR-spectra van gederivatiseerde lignines of tannines te registreren.
- Stel de spectrometerfrequentie in met behulp van de resonantiefrequentie van gedeutereerde chloroform, shim het monster en stem de spectrometer af. Start vervolgens de acquisitie.
6. Spectrumverwerking en -analyse
- Verwerk 31P NMR ruwe gegevens door een geschikte standaardsoftware volgens de volgende stappen.
- Voer Fouriertransformatie uit.
- Fase aanpassen door handmatige fasecorrectie(Verwerking | | voor fasecorrectie Handmatige correctie).
- Corrigeer de basislijn handmatig en stel zorgvuldig nulpuntenin (Verwerking | Baseline | Multipoint Baseline Correctie).
- Signaalkalibratie.
- Stel het signaal voor het gefosforyleerde water in op de chemische verschuivingswaarde van 132,2 ppm(Analyse | Referentie | Referentie).
OPMERKING: De aanwezigheid van een scherp 31P-signaal bij 175 ppm is te wijten aan het overschot aan TMDP. De aanwezigheid ervan zorgt voor de volledige derivatisatie van het monster. Als deze piek afwezig is, moet men de hele procedure opnieuw bekijken door een grondig monster en oplosmiddeldroging te bieden en meer TMDP toe te voegen. Zodra dit is gegarandeerd, wordt het spectrum ingezoomd in het spectrale bereik 132 tot ongeveer 150 ppm(figuur 7).
- Stel het signaal voor het gefosforyleerde water in op de chemische verschuivingswaarde van 132,2 ppm(Analyse | Referentie | Referentie).
Figuur 7: Controleer de aanwezigheid van een teveel aan TMDP: als het kan worden gezien, is de derivatisatie van het monster voltooid. De spectra kunnen dan worden geanalyseerd. Om dat te doen zoomen in het spectrale bereik tussen 155 en 132 ppm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Integratie
- Normaliseer de integratie door de interne standaard in te stellen op 1.0 (klik op de Peak | Integraal | bewerken Genormaliseerd: 1.00). Voer spectrumintegratie uit volgens de chemische verschuivingen die in de volgende tabellen worden gerapporteerd. Gebruik tabel 2 voor lignines en tabel 3 voor tannines.
| FUNCTIONELE GROEP | CHEMISCHE VERSCHUIVING (ppm) |
| Alifatische OH | 149.0-146.0 |
| Fenolische OH | 144.0-137.4 |
| C5 gesubstitueerde fenolische OH | 143.0-140.2 |
| 5-5 'fenolische OH | 141.7-140.2 |
| Syringyl OH | 143.2-142.7 |
| 4-O-5 'OH | 142.8-141.7 |
| Guaiacyl OH | 140.2-138.8 |
| p-hydroxyfenyl OH | 138.8-137.4 |
| Cooh | 136.0-133.6 |
| Tricine | 137.0-136.0 |
Tabel 2: 31P NMR chemische verschuivingen voor ligninefosfaaliteits-OH-groepen.
| FUNCTIONELE GROEP | CHEMISCHE VERSCHUIVING (ppm) |
| Ring A | |
| o-ongesubstitueerde fenolische | 137.9–137.4 |
| o-gesubstitueerde FENOL | 138.8–137.9 |
| Ring B | |
| Catechol OH | 140.2–138.8 |
| Pyrogallol OH | 144.0–140.2 |
| Ring C | |
| AliphatiC OH | 146.0–145.0 |
Tabel 3: 31P NMR chemische verschuiving voor tanninefosfiteitslated OH-groepen.
OPMERKING: Met behulp van standaard spectrale verwerkingssoftware is het mogelijk om vooraf gedefinieerde gebieden van de chemische verschuiving in te stellen die moeten worden geïntegreerd. Deze mogelijkheid is voordelig wanneer meerdere spectra moeten worden verwerkt.
7. Functionele groepskwantificering
- Bereken de concentratie van de IS-oplossing.
- Bereken de equivalente hoeveelheid van het specifieke signaal:
Representative Results
Het beschreven protocol kan zowel voor de analyse van lignines als tannines worden toegepast. In de ligninechemie is deze methode fundamenteel omdat het de detectie en kwantificering van de verschillende soorten hydroxygroepen mogelijk maakt. Figuur 8A-D toont voorbeelden van 31P NMR-spectra van lignines en tannines verkregen met spectrometers die op verschillende frequenties werken. Het spectrum in figuur 8A werd geregistreerd met behulp van een 300 MHz NMR-spectrometer, terwijl figuur 8D werd opgenomen met een 700 MHz NMR-instrument.
Figuur 8: Kwantitatief 31P NMR-spectrum van (A) kraftlignine van zachthout (spectrum geregistreerd met een 300 MHz-spectrometer op 30,8 mg lignine), (B) zachthoutlignosulfonzuur (spectrum geregistreerd met een 300 MHz-spectrometer op 30,1 mg lignine na conservering van lignosulfonaat tot lignosulfonzuur), (C) Acacia tannine (spectrum geregistreerd met een 300 MHz spectrometer op een monster van 30,3 mg) en (D) zachthout kraftlignine (spectrum geregistreerd met een spectrometer van 700 MHz op 7,2 mg lignine). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Deze spectra werden zorgvuldig geregistreerd en handmatig verwerkt. De typische signalen voor alifatische (150-145 ppm), aromatische (145-137 ppm) en carbon (136-134 ppm) hydroxygroepen zijn zeer goed opgelost en als zodanig gemakkelijk geïntegreerd. Als het spectrale venster wordt geopend (van 95 tot 190 ppm, figuur 8),zijn drie scherpe, sterke pieken (175, 144 en 132 ppm) zichtbaar. Die zijn te wijten aan de overmaat aan TMDP, respectievelijk de interne standaard (cholesterol of NHND) en de gehydroxyleerde TMDP (veroorzaakt door watersporen).
In tegenstelling tot kraft en organosolv lignine zijn lignosulfonaten onoplosbaar in het pyridine/chloroform mengsel. Om een betrouwbaar 31P NMR-spectrum te verkrijgen, is oplosbaarheid verplicht. Om dit probleem op te lossen, kunnen lignosulfonaten vóór derivatisatie worden omgezet in de overeenkomstige lignosulfonzuren. Het behandelen van lignosulfonaatoplossingen met sterke zuren (d.w.z. zwavelzuur) of zuuruitwisselingsharsen (bijv. Dowex 1H, een sterke zure kationenwisselaar) stimuleert de conversie van alle sulfonaatgroepen in hun zure vormen. De resulterende producten kunnen uit de zure oplossing worden verwijderd met behulp van selectieve adsorptieharsen (XAD-7, een polair adsorbens dat wordt gebruikt om verbindingen te isoleren die worden gekenmerkt door molecuulgewichten tot 60.000 u.m.a) geanalyseerd met behulp van dit protocol. Figuur 8B toont het kwantitatieve 31P NMR-spectrum van een TMDP gederivatiseerd lignosulfonzuur. Zelfs in dit geval zijn de verschillende signalen van de hydroxygroepen duidelijk. Figuur 8C toont een typisch kwantitatief 31P NMR-spectrum van een tanninemonster gederivatiseerd met TMDP. Een karakteristiek signaal van de verschillende alifatische OH (Ring C), pyrogallol en catechol eenheden in ring B en eenheden in ring A zijn goed zichtbaar.
Discussion
De beschreven methode vertegenwoordigt de implementatie en optimalisatie van het analytische protocol gericht op de kwalitatieve en kwantitatieve karakterisering van lignine zoals ontwikkeld door Argyropoulos37,38,39,40,41,42. In vergelijking met veel andere technieken die beschikbaar zijn voor lignine structurele opheldering, is de methode algemeen aanvaard als een van de meest gemakkelijke, snelle en reproduceerbare. De geldigheid van de natte chemische methoden (bijv. Nitrobenzeen, permanganaatoxidaties, enz.) is afhankelijk van de goede experimentele vaardigheden van de operator, waardoor de methode effectief wordt beperkt tot beperkte operators. Bovendien is het niet ongebruikelijk om correctiefactoren in de literatuur tegen te komen voor natte chemische methoden om verschillende nadelen te verklaren. Het beschreven 31P NMR-protocol vereist geen geavanceerde experimentele vaardigheden waardoor dit gemakkelijk toepasbaar, gebruiksvriendelijk en op grote schaal beschikbaar is. In vergelijking met andere instrumentele analysemethoden is 31P NMR de enige techniek die in staat is om de verschillende hydroxygroepen in lignine nauwkeurig te detecteren en te kwantificeren. FTIR kan bijvoorbeeld worden gebruikt om verschillende hydroxygroepen te identificeren, zoals 1H NMR. Beide technieken lijden echter omdat ze geen betrouwbare kwantitatieve gegevens kunnen bieden vanwege uitgebreide problemen met signaaloverlapping. Een andere veel gebruikte techniek is UV-Vis-spectroscopie, voor het eerst gerapporteerd door Goldschmid. De aanpak is echter beperkt tot een algemene algemene bepaling van hydroxygroepen, aangezien deze niet effectief onderscheid kan maken tussen alifatische, aromatische en carbonzuur-OHs47.
Vanuit economisch oogpunt is de enige beperking van de 31P NMR-techniek de prijs van TMDP, een relatief duur reagens. Het kost ongeveer 190 USD per gram; indien de analysekosten derhalve slechts zouden worden benaderd tot de prijs van TMDP, met uitzondering van de kosten die afkomstig zijn van het pyridine/chloroformmengsel en die van de exploitant, zou deze ongeveer 24 USD per analyse bedragen. Om dit probleem op te lossen, nemen veel laboratoria hun toevlucht tot het synthetiseren van TMDP, waardoor de reagenskosten worden verlaagd. Om dit te doen, worden pinacol en fosfortrichloride gereageerd in aanwezigheid van triethylamine44. Technisch gezien is deze reactie relatief eenvoudig; er is echter zorg nodig bij het gebruik van fosfortrichloride en de work-up ervan, inclusief goed gecontroleerde vacuümdestillatie. Meer details over de synthese van de TMDP kunnen op verzoek worden verstrekt.
Hoewel dit protocol tot de beste behoort in termen van gemak, reproduceerbaarheid en precisie, moeten enkele kritieke punten worden benadrukt. Ten eerste moet het monster volledig oplosbaar zijn in het geïdentificeerde pyridine/chloroformmengsel. Deze overweging is van fundamenteel belang omdat de kwantitatieve fosfaatreactie van de hydroxylgroepen onder volledig homogene omstandigheden moet plaatsvinden. Als slechts een deel van het monster is oplosbaarheid, zou de resulterende analyse onnauwkeurig zijn. Ten tweede moet het te onderzoeken monster vocht- en oplosmiddelvrij zijn, omdat deze variabelen de precisie en het algehele succes van de analyse nadelig zullen beïnvloeden. Sporen van vochtigheid zullen reageren met TMDP die 2-hydroxy-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane geeft. Deze verbinding is een lichtgeel flocculerend zout, onoplosbaar in het pyridine / chloroform oplosmiddelmengsel, waardoor onvoldoende NMR-signaalacquisitie ontstaat. Aangezien slechts een klein gewicht (~ 30 mg) van een monster vereist is, moet het vrij zijn van vluchtige stoffen om het precieze gewicht nauwkeurig bekend te maken vóór de analyse.
Soms kunnen problemen met de oplossing van monsters worden bevorderd (vooral voor sterk geoxideerde monsters) door kleine hoeveelheden van een co-oplosmiddel (d.w.z. dimethylformamide) toe te voegen, waardoor het monster kan worden opgelost. In principe kan elk oplosmiddel dat geen interactie heeft met TMDP worden gebruikt om het monster op te helpen oplossen. De verkiezing van een co-oplosmiddel kan geen co-oplosmiddelen omvatten die labiele hydroxy- of aminogroepen bevatten, omdat ze reageren met het reagens, waardoor misleidende eindspectra ontstaan. Met name dimethylsulfoxide reageert ook met TMDP, waardoor het gebruik ervan als co-oplosmiddel wordt uitgesloten. Op pyridine gebaseerde ionische vloeistoffen, zoals 1-allyl-3-butylpyridiniumchloride, kunnen worden gebruikt wanneer zich oplosbaarheidsproblemen voordoen; de ionische vloeistof moet echter opnieuw droog zijn48. Om lignosulfonaten (een ligninetype gekenmerkt door een hoge sulfonatiegraad) op te lossen, bleek een voorbehandeling waarbij geneutraliseerde groepen in hun zure vorm werden omgezet, nuttig te zijn. Lignosulfonaten kunnen gemakkelijk worden omgezet in hun zure omstandigheden met behulp van zure uitwisselingsharsen in waterige media. De resulterende lignosulfonzuren worden geïsoleerd uit de oplossing door hun adsorptie op specifieke harsen (bijv. XAD-7) en desorptie in ethanol. Verdamping van de ethanolische oplossingen onder verminderde druk bij 40 °C maakt de isolatie van lignosulfonzuren mogelijk. Deze ligninen kunnen dan worden gekenmerkt door 31P NMR omdat ze oplosbaar zijn in het pyridine / chloroform-mengsel dat door het protocol wordt voorgesteld.
Langdurig vacuümdrogen bij milde temperaturen vermindert effectief de hoeveelheid vocht en andere vluchtige stoffen in elk monster. Met name kleine hoeveelheden water hebben geen invloed op het uiteindelijke spectrum omdat TMDP in overmaat wordt toegevoegd. Bovendien kan in sommige gevallen een kleine hoeveelheid 2-hydroxy-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxafosfaolaan het gevolg zijn van de vochtigheid in de NMR-buis of de injectieflacon van het monster. In deze gevallen is roeren voldoende om de hoeveelheid van het gevormde neerslag volledig op te lossen. Als een grote hoeveelheid 2-hydroxy-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxafosfaolane wordt gevormd, wordt voorgesteld de monstervoorbereiding te herhalen, waardoor de droogbehandeling wordt verbeterd. Zo kan voor gebruik al het glaswerk kort verwarmd worden met een warmtepistool.
Het spectrale bereik dat wordt gebruikt om het spectrum vast te leggen is breed in vergelijking met het gebied dat van belang is voor het signaal met betrekking tot de verschillende hydroxylgroepen. Dit is echter verplicht om te begrijpen of de monsterderivatisatie met succes heeft plaatsgevonden. De bevestiging van volledige monsterderivatisatie wordt gegeven door de aanwezigheid van een sterk signaal rond 174 ppm. Deze scherpe piek is te wijten aan de niet-gereageerde TMDP en het bestaan ervan zorgt ervoor dat het reagens in overmaat aanwezig was en daarom zijn alle hydroxylgroepen gederivatiseerd. Als deze piek afwezig is, zijn de twee meest waarschijnlijke oorzaken: (1) de gebruikte hoeveelheid TMDP is onvoldoende om de volledige derivatisatie van het monster uit te voeren, of (2) er is een grote hoeveelheid water in het monster aanwezig. In het eerste geval zou het gebruik van een hogere hoeveelheid TMDP waarschijnlijk de volledige derivatisatie van het monster garanderen en het signaal bij 174 ppm verschijnen. In het tweede geval moet het monster uitgebreider worden gedroogd. Zodra een overmaat aan TMDP is verzekerd, kan piekintegratie worden uitgevoerd. Zoom vóór deze bewerking in op een smaller venster (150 tot 132 ppm) dat de interessesignalen beperkt.
De hoeveelheid monster (~ 30 mg) die moet worden geanalyseerd, gerapporteerd in het bovenstaande experimentele protocol, is geselecteerd om spectra van goede kwaliteit te verzamelen voor een 300 MHz NMR-spectrometer of meer. Niettemin hebben we waargenomen dat het mogelijk is om de monsterhoeveelheid te verminderen als een veldmagneet van 500 MHz of hoger wordt gebruikt. In figuur 8Dwordt bijvoorbeeld het NMR-spectrum (afkomstig van een 700 MHz-instrument) van een monster bereid met 7,2 mg lignine weergegeven. Signaalintegratie van dit spectrum biedt dezelfde resultaten als die verkregen bij het gebruik van grotere hoeveelheden lignine. Dit feit versterkt de toepasbaarheid van dit protocol voor al het onderzoek waarbij kleine hoeveelheden producten beschikbaar zijn.
Over het algemeen kan dit experimentele protocol worden toegepast op veel onderzoeks- en ontwikkelingstoepassingen wanneer het begrijpen van de oorsprong en het lot van de verschillende hydroxygroepen in lignines en tannines vereist is. In het bijzonder, in combinatie met GPC- en HSQC-gegevens, bieden de resulterende gegevens de mogelijkheid om de structuur van lignine of een tannine verder uit te werken en te speculeren. In veel gevallen waarin chemische modificaties worden toegepast op de hydroxygroepen van lignine of een tannine, kunnen kwantitatieve 31P NMR-analyses uiterst waardevol zijn om te detecteren of deze modificaties zijn opgetreden en in welke mate. Figuur 9 toont bijvoorbeeld twee NMR-spectra van dezelfde lignine voor en na de oxidatie ervan. Een eenvoudige kwalitatieve evaluatie toont de vermindering van zowel alifatische als aromatische hydroxygroepen bij oxidatie, waardoor waardevolle informatie en begeleiding wordt geboden.
Figuur 9: Kwantitatieve 31P NMR spectra van dezelfde Organosolv lignine gederivatiseerd met behulp van TMDP (A) Prior en (B) post zijn oxidatie. De spectra werden geregistreerd met behulp van een 300 NMR spectrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Kortom, deze techniek heeft alle kenmerken van een van de meest essentiële en krachtige hulpmiddelen bij vragen over polyfenolische, OH-dragende lignines en tannines (en zelfs synthetische polymeren)49,50,51 moeten worden gedaan op verschillende gebieden, variërend van chemie tot engineering, van biologie tot polymeer en farmaceutische toepassingen.
Disclosures
Claudia Crestini en Dimitris S Argyropoulos zorgen ervoor dat alle auteurs (C.C., N.P., en D.S.A.) geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit werk is in de loop der jaren ondersteund door verschillende financiële prijzen, waaronder organisaties zoals het Pulp and Paper Research Institute of Canada, McGill University Montreal, de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, National Science Foundation USA, united states department of agriculture en het solvay-bedrijf.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 - 1000 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0866 | |
| 20 - 200 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0865 | |
| 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% | Sigma-Aldrich | 447536 | |
| Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) | Precisa | LX220 A | |
| Binder Vacuum Oven | Binder | VD53 | |
| Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 | Sigma-Aldrich | 29651-U | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| Cholesterol, Sigma-grade | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Molecular sieves, 4A | Sigma-Aldrich | 208604 | |
| N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% | Sigma-Aldrich | 226378 | |
| NMR spectrometer, 300 MHz | Bruker | ||
| Norell natural quartz 3 mm NMR tubes | Sigma-Aldrich | NORS33007 | |
| Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) | VWR | 613-0342 | |
| Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) | VWR | 613-0239 | |
| Pyridine, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| Stirring bars,micro, 3 mm lenght | VWR | 442-0360 | |
| Stirring bars,micro, 6 mm lenght | VWR | 442-0362 | |
| Triphenylphospine oxide, 97% | Sigma-Aldrich | T84603 | |
| Vials for environmental analysis, WHEATON, 20.00 mL | DWK Life Sciences | WHEAW224609 | |
| Weighing paper, grade 531 | VWR | 516-0318P |
References
- Meng, X., et al. Determination of hydroxyl groups in biorefinery resources via quantitative 31 P NMR spectroscopy. Nature Protocols. 14 (9), 2627-2647 (2019).
- Anastas, P. T., Williamson, T. C. Green chemistry: An overview. Green Chemistry. 626, 1-17 (1996).
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: Principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Collins, M. N., et al. Valorization of lignin in polymer and composite systems for advanced engineering applications - A review. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 828-849 (2019).
- De Gruyter. Biorefinery: From Biomass to Chemicals and Fuels. , (2012).
- Sannigrahi, P., Pu, Y., Ragauskas, A. Cellulosic biorefineries-unleashing lignin opportunities. Current Opinion in Environmental Sustainability. 2 (5), 383-393 (2010).
- Lange, H., Decina, S., Crestini, C. Oxidative upgrade of lignin - Recent routes reviewed. European Polymer Journal. 49 (6), 1151-1173 (2013).
- Glasser, W. G. Classification of lignin according to chemical and molecular structure. Lignin: Historical, Biological, and Materials Perspectives. 742, 216-238 (1999).
- Wiley. Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology, 2 Volume Set, 5th Edition. , Wiley. (2004).
- Lewis, N. G., Sarkanen, S. Preface. Lignin and Lignan Biosynthesis. 697, 9-11 (1998).
- Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11 (3), 169-218 (1977).
- Ragauskas, A. J., et al. Lignin valorization: Improving lignin processing in the biorefinery. Science. 344 (6185), (2014).
- Crestini, C., Melone, F., Sette, M., Saladino, R. Milled wood lignin: A linear oligomer. Biomacromolecules. 12 (11), 3928-3935 (2011).
- Guerra, A., et al. On the propensity of lignin to associate: A size exclusion chromatography study with lignin derivatives isolated from different plant species. Phytochemistry. 68 (20), 2570-2583 (2007).
- Contreras, S., Gaspar, A. R., Guerra, A., Lucia, L. A., Argyropoulos, D. S. Propensity of lignin to associate: Light scattering photometry study with native lignins. Biomacromolecules. 9 (12), 3362-3369 (2008).
- Gigli, M., Crestini, C. Fractionation of industrial lignins: opportunities and challenges. Green Chemistry. 22 (15), 4722-4746 (2020).
- Adler, E. Structural elements of lignin. Industrial & Engineering Chemistry. 49 (9), 1377-1383 (1957).
- Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 1. Extraction of lignin with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 477-485 (1956).
- Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 2. Extraction of lignin-carbohydrate compelexes with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 243-251 (1957).
- Bjorkman, A. Studied on finely divided wood. Part 5. The effect of milling. Svensk Pappersit. , 329-335 (1957).
- Das, A. K., Islam, N., Ashaduzzaman, F. O., Dungani, R. Review on tannins: Extraction processes, applications and possibilities. South African Journal of Botany. 135, 58-70 (2020).
- Laitila, J. E. Composition and evolution of oligomeric proanthocyanidin-malvidin glycoside adducts in commercial red wines. Food Chemistry. 340, 127905 (2021).
- Covington, A. D., Wise, W. R. Tanning Chemistry. , RSC Publishing. (2019).
- Tarabanko, V. E., Tarabanko, N. Catalytic oxidation of lignins into the aromatic aldehydes: General process trends and development prospects. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2421 (2017).
- Guerra, A., Mendonça, R., Ferraz, A., Lu, F., Ralph, J. Structural characterization of lignin during pinus taeda wood treatment with ceriporiopsis subvermispora. Applied and Environmental Microbiology. 70 (7), 4073-4078 (2004).
- Faix, O., Andersons, B., Zakis, G. Determination of carbonyl groups of six round robin lignins by modified oximation and FTIR spectroscopy. Holzforschung. 52 (3), 268-274 (1998).
- Santos, R. B., Capanema, E. A., Balakshin, M. Y., Chang, H., Jameel, H. Lignin structural variation in hardwood species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (19), 4923-4930 (2012).
- Bose, S. K., Wilson, K. L., Hausch, D. L., Francis, R. C. Lignin analysis by permanganate oxidation. II. Lignins in Acidic Organosolv Pulps. Holzforschung. 53 (6), 603-610 (1999).
- Harman-Ware, A. E., et al. A thioacidolysis method tailored for higher-throughput quantitative analysis of lignin monomers. Biotechnology Journal. 11 (10), 1268-1273 (2016).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
- Lin, S. Y., Carlton, W. D. Methods in Lignin Chemistry. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1992).
- Lundquist, K. Proton (1H) NMR Spectroscopy. Methods in Lignin Chemistry. , 242-249 (1992).
- Robert, D. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrometry. Methods in Lignin Chemistry. , 250-273 (1992).
- Li, S., Lundquist, K. A new method for the analysis of phenolic groups in lignins by 1H NMR spectrometry. Nordic Pulp & Paper Research Journal. 9 (3), 191-195 (1994).
- Hallac, B. B., Pu, Y., Ragauskas, A. J. Chemical transformations of buddleja davidii lignin during ethanol organosolv pretreatment. Energy & Fuels. 24 (4), 2723-2732 (2010).
- Sette, M., Wechselberger, R., Crestini, C. Elucidation of lignin structure by quantitative 2D NMR. Chemistry - A European Journal. 17 (34), 9529-9535 (2011).
- Sette, M., Lange, H., Crestini, C. Quantitative HSQC analyses of lignin: A practcal comparison. Computational and Structural Biotechnology Journal. 6 (7), 201303016 (2013).
- Wroblewski, A. E., Lensink, C., Markuszewski, R., Verkade, J. G. Phosphorus-31 NMR spectroscopic analysis of coal pyrolysis condensates and extracts for heteroatom functionalities possessing labile hydrogen. Energy & Fuels. 2 (6), 765-774 (1988).
- Archipov, Y., Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part I. Model compounds. Journal of Wood Chemistry and Technology. 11 (2), 137-157 (1991).
- Argyropoulos, D. S., Heitner, C., Morin, F. G. P. NMR spectroscopy in wood chemistry - Part III. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores in mechanical pulp. Holzforschung - International Journal of the Biology, Chemistry, Physics and Technology of. 46 (3), 211-218 (2009).
- Argyropoulos, D. S., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part VI. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores and carboxylic acids present in mechanical pulps; a method for the quantitative determination of ortho-quinones. Holzforschung. 48 (1), 112-116 (1994).
- Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry part V. Qualitative analysis of lignin functional groups. Journal of Wood Chemistry and Technology. 13 (2), 187-212 (1993).
- Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part IV. Lignin models: Spin lattice relaxation times and solvent effects in 31P NMR. Holzforschung. 47 (1), 50-56 (1993).
- Granata, A., Argyropoulos, D. S. 2-Chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane, a reagent for the accurate determination of the uncondensed and condensed phenolic moieties in lignins. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 43 (6), 1538-1544 (1995).
- Duval, A., Vilaplana, F., Crestini, C., Lawoko, M. Solvent screening for the fractionation of industrial kraft lignin. Holzforschung. 70 (1), 11-20 (2016).
- Ben, H., Farrell, J. R. In-depth investigation on quantitative characterization of pyrolysis oil by 31P NMR. RSC Advances. 6 (21), 17567-17573 (2016).
- Goldschmid, O. Determination of phenolic hydroxyl content of lignin preparations by ultraviolet spectrophotometry. Analytical Chemistry. 26 (9), 1421-1423 (1954).
- Ben, H., et al. Characterization of whole biomasses in pyridine based ionic liquid at low temperature by 31P NMR: An approach to quantitatively measure hydroxyl groups in biomass as their original structures. Frontiers in Energy Research. 6, (2018).
- Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis of potentially biobased copolyesters based on adipic acid and butanediols: Kinetic study between 1,4- and 2,3-butanediol and their influence on crystallization and thermal properties. Polymer. 99, 204-213 (2016).
- Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis and characterization of biobased poly(butylene succinate-ran-butylene adipate). Analysis of the composition-dependent physicochemical properties. European Polymer Journal. 87, 84-98 (2017).
- Chan, K. P., Argyropoulos, D. S., White, D. M., Yeager, G. W., Hay, A. S. Facile quantitative analysis of hydroxyl end groups of Poly(2,6-dimethyl-1,4-phenylene oxide)s by 31P NMR spectroscopy. Macromolecules. 27 (22), 6371-6375 (1994).
