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Chemistry

लिग्निन और टैनिन का मात्रात्मक 31पी एनएमआर विश्लेषण

Published: August 2, 2021 doi: 10.3791/62696
Automatic Translation
2, 1, 1
1Department of Molecular Sciences and Nanosystems, Ca’ Foscari University of Venezia, 2Departments of Chemistry and Forest Biomaterials, North Carolina State University

Summary

31 पी एनएमआर पॉलीफेनॉल के संरचनात्मक स्पष्टता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह तेज, आसान, सटीक, मात्रात्मक और अत्यधिक प्रजनन योग्य विश्लेषणात्मक प्रक्रिया, जो लिग्निन और टैनिन में विभिन्न प्रकार के हाइड्रोक्सी, फेनोलिक और कार्बोक्सिल समूहों के मात्राकरण और भेदभाव के लिए अनुमति देती है, अब एक नियमित विश्लेषणात्मक उपकरण बन गया है।

Abstract

लिग्निन और टैनिन वैलोराइजेशन की चुनौती के साथ, अन्य लोगों के अलावा टिकाऊ बायोरिफाइनरी उत्पादों के विकास का सामना करना पड़ा है। इन प्रचुर मात्रा में, नवीकरणीय सुगंधित बायोपॉलिमर को उनकी अंतर्निहित संरचनात्मक जटिलता और परिवर्तनशीलता और प्रजातियों की विविधता की उच्च डिग्री के कारण व्यापक रूप से शोषण नहीं किया गया है। इन पॉलीफेनॉल के लिए एक परिभाषित प्राथमिक संरचना की कमी प्रसंस्करण के दौरान प्रेरित जटिल रासायनिक परिवर्तनों के साथ और अधिक जटिल है, अंततः किसी भी आगे उपयोग के प्रयासों के लिए चरम महत्व की संरचनात्मक सुविधाओं की एक बड़ी विविधता प्रदान करती है।

नतीजतन, प्राकृतिक पॉलीफेनॉल में मौजूद विभिन्न कार्यात्मक समूहों की तेजी से, सरल और स्पष्ट पहचान और मात्राकरण के लिए एक प्रोटोकॉल, समझने के लिए एक मौलिक शर्त है और तदनुसार उनकी प्रतिक्रियाशीलता और अंतिम उपयोगिता दर्जी है।

मात्रात्मक 31पी एनएमआर व्यापक अनुप्रयोग क्षमता के साथ लिग्निन और टैनिन में तेजी से और मज़बूती से अप्रमाणित, ओ-मोनो प्रतिस्थापित, और ओ-डिस्टुपुटेड फिनोल, एलिफेटिक ओएचएस, और कार्बोक्सिलिक एसिड मोइटीज़ की पहचान करने का अवसर प्रदान करता है।

कार्यप्रणाली में उपयुक्त 31पी युक्त जांच का उपयोग करके सीटू मात्रात्मक लिग्निन या टैनिन लेबलिंग प्रक्रिया होती है, जिसके बाद आंतरिक मानक की उपस्थिति में मात्रात्मक 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रम का अधिग्रहण होता है। 31पी नाभिक की उच्च प्राकृतिक बहुतायत नमूना (~ 30 मिलीग्राम) और छोटे एनएमआर अधिग्रहण समय (~ 30-120 मिनट) की छोटी मात्रा के लिए अच्छी तरह से हल 31पी संकेतों के साथ अनुमति देता है जो लेबल वाले ओह समूहों के आसपास के रासायनिक वातावरण पर अत्यधिक निर्भर हैं।

Introduction

यह प्रक्रिया, जिसे हाल ही में नेचर प्रोटोकॉल1 में प्रकाशित किया गया था, अभिलेखीय साहित्य में 3,000 से अधिक बार उद्धृत किया गया है और लिग्निन और टैनिन लक्षण वर्णन के लिए एक नियमित माप बन गया है क्योंकि यह आवश्यक, तेजी से और प्रजनन योग्य संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है।

लिग्निन और टैनिन
जब ग्रीन केमिस्ट्री को पॉल टी अनास्तास और जॉन सी वर्नर2,3द्वारा पेश किया गया था, तो इसने रसायन विज्ञान की सामान्य अवधारणा को काफी बदल दिया। विशेष रूप से, जीवाश्म फीडस्टॉक्स के बजाय टिकाऊ सामग्रियों को नियोजित करने के महत्व, जैसे तेल और कोयला, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में एक महत्वपूर्ण पहलू2,3के रूप में रेखांकित किया गया है। विभिन्न प्रकार के बायोमास में, लिग्निन सबसे प्रचुर मात्रा में सुगंधित बायोपॉलिमर है और इसे औद्योगिक वस्तुओं और उच्च वर्धित मूल्य उत्पादों4के लिए एक संभावित स्रोत के रूप में देखा जा सकता है।

लिग्निन दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में लकड़ी-घटक है (सेल्यूलोज के साथ पहले और हेमीसेल्यूलोज तीसरे) हैं। पौधों में इसकी सामग्री पौधे के प्रकार के आधार पर भिन्न होती है: उदाहरण के लिए सॉफ़्टवुड्स की तुलना में लिग्निन की कम मात्रा (20% ± 4% बनाम 4% बनाम 28% ± 4%)। इसके अलावा, सब्जी ऊतक के भीतर लिग्निन वितरण सजातीय नहीं है: उच्च लिग्निन सामग्री सेल दीवार5,6में पाया जा सकता है। लिग्निन एक पॉलीफेनोलिक सामग्री है जो औद्योगिक रूप से पेपर/सेल्यूलोज उद्योग7के उप-उत्पाद के रूप में प्राप्त की जाती है । यह लकड़ी के लुगदी प्रक्रिया से बरामद किया जाता है, जिसमें लकड़ी के चिप्स मुख्य रूप सेओह-और/या ओह-+ एचएस-आयन शर्तों की उपस्थिति में संसाधित किए जाते हैं ताकि हेमीसेल्यूलोज और लिग्निन (सोडा और/या क्राफ्ट प्रक्रियाओं) से सेल्यूलोज को अलग किया जा सके ।

लिग्निन का अध्ययन करने का पहला प्रयास क्रमशः 1838 और 186510में पेएन और शुल्ट्ज़ द्वारा किया गया था। 1977 में, एडलर ने उस समय11के सभी प्रासंगिक उपलब्ध ज्ञान का सारांश दिया। वर्तमान में यह माना जाता है कि लिग्निन बिल्डिंग ब्लॉक तीन फिनाइल-प्रोपेनोइड इकाइयां हैं: पी-कौआरिल, कोनिफेरिल और सिनापिल अल्कोहल। ये मोनोमर, एक मुक्त कट्टरपंथी बहुलीकरण प्रक्रिया के लिए धन्यवाद, पी-हाइड्रोक्सीफेनिल, गुआसिल और सिनापिल इकाइयों को जन्म देते हैं जो अंततः मोटे तौर पर लिग्निन(चित्र 1) 12 का गठन करते हैं। लिग्निन में प्राथमिक संरचना की कमी इसके संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक अंतर्निहित कठिनाई का तात्पर्य है। तदनुसार, आणविक वजन के वितरण का मूल्यांकन हमेशा कुछ विवादास्पद रहा है। मिल्ड वुड लिग्निन, हल्के परिस्थितियों में अलग-थलग लिग्निन जो लगभग ज्यादातर प्रोटोलिग्निन10,ओलिगोमर13 से बना है जो14, 15सुप्रामोलेकुलर एकत्रीकरण प्रक्रियाओं के माध्यम से अत्यधिक बातचीत करता है।

Figure 1
चित्रा 1:सॉफ्टवुड लिग्निन का एक प्रतिनिधि मॉडल जिसमें विभिन्न प्रकार के बांडों पर प्रकाश डाला गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लिग्निन को आमतौर पर इस आधार पर वर्गीकृत किया जाता है: (क) लकड़ी का प्रकार जिससे वे प्राप्त होते हैं (जैसे, दृढ़ लकड़ी और सॉफ़्टवुड), (ख) प्रक्रिया इसे अलग करने के लिए उपयोग की जाती है। सबसे महत्वपूर्ण औद्योगिक लिग्निन प्रकार क्राफ्ट, लिग्नोसल्फोट्स और ऑर्गेनोसोलव हैं।

लिग्निन की संरचना इसकी उत्पत्ति और प्रसंस्करण रसायन विज्ञान पर अत्यधिक निर्भर है। अधिक विशेष रूप से, जब लिग्निन की जटिल और अनियमित संरचना इसकी प्राकृतिक विविधता और जटिल प्रसंस्करण रसायनों के साथ जटिल होती है, तो अत्यधिक परिवर्तनशीलता, विविधता और विषमता की सामग्री निकलती है, जो इसके उपयोग को कम मूल्य वाले अनुप्रयोगों तक सीमित करती है16। जबकि सॉफ़्टवुड लिग्निन में मुख्य रूप से गुआसिल इकाइयां (जी) पी-हाइड्रोक्सीफेनिल समूहों (जी लिग्निन) की नगण्य मात्रा के साथ होती हैं, हार्डवुड लिग्निन अलग-अलग अनुपात में गुआइसिल और सिरिंगिल सबिग्निट (जीएस लिग्निन) द्वारा बनाई जाती हैं और घास लिग्निन गुआइसिल, सिरिंगिल और पी-हाइड्रोक्सीफेनिल (जीएच लिग्निन) उपकुनिट द्वारा गठित किए जाते हैं। अलगाव के लिए प्रयोग किया जाने वाला निष्कर्चकम दृष्टिकोण उभरते लिग्निन17की संरचना को नाटकीय रूप से प्रभावित करता है . चित्रा 2 में तीन लिग्निन संरचनाओं को दर्शाया गया है, जो नियोजित अलगाव दृष्टिकोण से भिन्न है। निष्कर्षण विधि के प्रभाव के बारे में कुछ विचारों पर प्रकाश डाला जा सकता है। सबसे पहले, क्राफ्ट लिग्निन एक dealkylated, अत्यधिक खंडित, और गाढ़ा लिग्निन है, जबकि ऑर्गेनोसोल्व लिग्निन में मिल्ड लकड़ी लिग्निन (ब्योर्कमैन दृष्टिकोण का उपयोगकरके अलग-थलग)18, 19,20के समान संरचना है। अंत में, लिग्नोसल्फोट्स को उच्च स्तर की सल्फोनेशन की विशेषता होती है, जो तीव्रता और एक्सट्रक्टिव सल्फोनेशन प्रक्रिया की स्थितियों के आधार पर होती है।

Figure 2
चित्रा 2:तकनीकी लिग्निन के लिए प्रतिनिधि संरचनाएं। इस आंकड़े में विभिन्न प्रकार के लिग्निन के बीच मतभेद देखे जा सकते हैं। (क)सॉफ्टवुड क्राफ्ट लिग्निन अत्यधिक गाढ़ा है,(बी)लिग्नोसल्फोलेट संतृप्त कार्बन पर सल्फोनिक समूहों की विशेषता है, और(सी)ऑर्गेनोसोल्व लिग्निन में मिल्ड लकड़ी लिग्निन के एक के समान संरचना होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लिग्निन के समान, टैनिन पॉलीफेनोलिक यौगिक होते हैं जो पौधों में पाए जाते हैं। टैनिन के निष्कर्द दृष्टिकोणों और अनुप्रयोगों पर हाल ही में और अद्यतन समीक्षा हाल ही में दास एट अल21द्वारा जारी की गई थी । रोजमर्रा की जिंदगी में टैनिन के महत्व को दो उदाहरणों पर विचार करते हुए रेखांकित किया जा सकता है: वे मदिरा22को स्वाद और रंग प्रदान करते हैं; इसके अलावा उनकी पॉली-फेनोलिक संरचना एंटीऑक्सीडेंट विशेषताएं प्रदान करता है और उन्हें कमाना उद्योग23में आवेदन के लिए आदर्श बनाता है . टैनिन को दो वर्गों में विभाजित किया गया है: हाइड्रोलिजेबल और गैर-हाइड्रोलिजेबल। हाइड्रोलिजेबल टैनिन को गैलिक, डि-गैलिक और एलेजिक एसिड एस्टर(चित्रा 3)का बहुलक माना जा सकता है। ये एस्टर चीनी अणुओं (जैसे, ग्लूकोज, रेमनोज़ और अरबिनोज़) के साथ फेनोलिक एसिड के एस्टेरिफिकेशन से परिणाम देते हैं।

Figure 3
चित्र 3:ठेठ हाइड्रोलिजेबल टैनिन: टैनिक एसिड, वेस्केलिन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

गैर-हाइड्रोलिजेबल टैनिन, जिसे गाढ़ा टैनिन भी कहा जाता है, फ्लैवन-3-ओल्स से प्राप्त होने वाले पॉलिमर और ओलिगोमर हैं। फ्लैवन-3-ओल्स, कैटेकिन और गैलोकेटिन में सबसे अधिक बार होते हैं। वे बेरंग क्रिस्टलीय यौगिक(चित्रा 4)हैं। बहुलकीकरण एक पॉलीमर बनाता है जो एक हेलीकॉइड संरचना की विशेषता है। सुगंधित हाइड्रोक्सी समूहों को हेलिक्स के बाहरी हिस्से पर निर्देशित किया जाता है, जबकि पायरन ऑक्सीजन इंटीरियर में होते हैं।

Figure 4
चित्रा 4:प्रोएंटोसायनिड संरचनाएं: आर = एच, ओह, ओच3। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एनएमआर का उपयोग करके लिग्निन और टैनिन का लक्षण वर्णन
लिग्निन या टैनिन लक्षण वर्णन में दो प्रकार की जानकारी महत्वपूर्ण है: (क) रासायनिक संरचना (उदाहरण के लिए, हाइड्रोक्सी समूह की सामग्री, प्रकृति, और इंटरयूनिट लिंकेज की आवृत्ति) और (ख) आणविक वजन और पॉलीडिसपरिटी। लिग्निन पर शुरुआती अध्ययनों के बाद से, इन लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए विभिन्न तकनीकों को नियोजित किया गया है, और तरीकों के दो वर्ग उभरे हैं: रासायनिक और भौतिक तरीके।

लिग्निन रसायन विज्ञान में, रासायनिक तरीकों, जैसे क्षारीय नाइट्रोबेनजेन ऑक्सीकरण, व्युत्पन्नीकरण जिसके बाद अपचयी दरार, परमगनेट ऑक्सीकरण, और थिओएसिडोलिसिस, ऐतिहासिक रूप से24, 25,26,27,28, 29का उपयोग किया गया है। हालांकि, भले ही विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल लागू किए गए हैं और अनुकूलित हैं, वे समय की मांग कर रहे हैं, श्रमसाध्य हैं, और व्यापक प्रयोगात्मक कौशल30की आवश्यकता है। वैकल्पिक रूप से, वाद्य विश्लेषण की शुरुआत से, लिग्निन और टैनिन लक्षण31प्रदर्शन करने के लिए भौतिक तरीकों का उपयोग किया गया है। ये तकनीक शास्त्रीय तरीकों की समस्याओं पर काबू पाने की अनुमति देती हैं जिससे लिग्निन संरचना की विशेषता आसान हो जाते हैं।

परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) वाद्य तकनीकों के बीच लिग्निन संरचना और रासायनिक संरचना के बारे में जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता है। विशेष रूप से, मात्रात्मक मोनोआयामी 1एच एनएमआर स्पेक्ट्रा और मात्रात्मक 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रा के आंकड़े विभिन्न प्रकार के लिग्निन इंटरयूनिट बॉन्डिंग32, 33,34,35के बारे में जानकारी दे सकते हैं। दुर्भाग्य से, मोनोआयामी स्पेक्ट्रा सिग्नल ओवरलैप से पीड़ित है, जो सिग्नल एकीकरण प्रयासों को गंभीर रूप से कमजोर कर सकता है। एचएसक्यूसी (हेट्रोन्यूक्लियर सिंगल क्वांटम जुटना), क्यू-एचएसक्यूसी (क्वांटिटेटिव - हेट्रोन्यूक्लियर सिंगल क्वांटम जुटना) के मात्रात्मक संस्करणों का उपयोग लिग्निन संरचना को बेहतर ढंग से समझने के लिए किया गया है, जो आंतरिक संपर्कों के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, उन्हें मात्रात्मक रूप से विभिन्न इमारतों इकाइयों13,36, 37निर्धारित करनेकेलिए पूरीतरह से उपयोग नहीं किया जा सकता है।

मोनो और दो आयामी एनएमआर से जुड़े मुद्दों को दूर करने के लिए, सब्सट्रेट व्युत्पन्नीकरण पर विचार किया गया है। इस दृष्टिकोण के फायदों में यह है कि जटिल मैक्रोमॉल्यूल के भीतर विशिष्ट लेबल पेश किए जा सकते हैं और विलायक से कोई स्पेक्ट्रल हस्तक्षेप परिणाम नहीं होता है जिसमें लेबल किए गए सब्सट्रेट्स को भंग कर दिया जाता है1। Verkade इस क्षेत्र में अग्रणी था, फॉस्फोरस डेरिवेटिव, कोयला डेरिवेटिव, और संबंधित यौगिकों ३८के31पी एनएमआर विश्लेषण प्रदर्शन । इसके प्रकाशन में, विभिन्न फास्फोरस युक्त अभिकर्ण (फास्फोरलेन) की स्क्रीनिंग की गई थी, और अन्य लेबल वाले यौगिकों का रासायनिक बदलाव दर्ज किया गया था। आर्गिरोपोलोस की टीम ने सबसे पहले 1991 में लिग्निन में हाइड्रोक्सी समूहों के मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए व्युत्पन्नीकरण की शुरुआतकी। फास्फोरस युक्त अभिकर्मकों का उपयोग करके लिग्निन मॉडल यौगिकों के व्युत्पन्न का अध्ययन करने के बाद, उनके समूह ने लिग्निन रसायन विज्ञान, 31 पी एनएमआर विश्लेषण39,40, 41,42,43में सबसे दैनिक उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक का मार्ग प्रशस्त किया। विभिन्न फॉस्फोलेन की जांच के बीच, Argyropoulos 2-क्लोरो-4, 4, 5, 5-टेट्रामेथिल-1, 3-2-डायोक्साफोस्फोलेन (TMDP) के उपयोग पर पहुंचे के रूप में सबसे उपयुक्त एक लिग्निन विश्लेषण४४प्रदर्शन करने के लिए जा रहा है । टीएमडीपी चुनिंदा हाइड्रोक्सी समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है जिससे फास्फोरस युक्त डेरिवेटिव के मात्रात्मक गठन की विशेषता विशिष्ट 31पी एनएमआर रासायनिक बदलाव(चित्रा 5) द्वारा विशेषता है।

Figure 5
चित्रा 5:लिग्निन और टैनिन फॉस्फिलेशन केमिस्ट्री। लेबलिंग लिग्निन और टैनिन लैबिल एच समूहों को सीटू प्रतिक्रिया में पूरा किया जाता है। लेबल वाले पॉलीफेनॉल को विभिन्न प्रकार के हाइड्रोक्सी समूहों के अनुरूप विशिष्ट 31पी एनएमआर बैंड द्वारा चिह्नित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नमूना व्युत्पन्न एक पाइरिडीन/क्लोरोफॉर्म (1.6:1) मिश्रण में किया जाता है; एक सटीक मूल्यांकन से यह विकल्प परिणाम। पाइरिडीन के दो फायदे हैं। सबसे पहले, लगभग 22.1 एमपीए1/2 के हिल्डेब्रांड पैरामीटर की विशेषता वाले सॉल्वेंट का चयन करना लिग्निन घुलूबिलाइजेशन45को सरल और बढ़ाता है। नतीजतन, एक विलायक के रूप में पाइरिडीन का जोड़, जिसका हिल्डेब्रांड पैरामीटर 21.7 के बराबर है, इस प्रकार इष्टतम है। दूसरे, हाइड्रोक्सी समूहों के साथ टीएमडीपी की प्रतिक्रिया हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के गठन के साथ लिग्निन-फॉस्फोलेन डेरिवेटिव के फेसियल गठन की ओर सहवर्ती नकारात्मक प्रभावों के साथ एक उप-उत्पाद के रूप में है । इस कारण से, परिणामी एचसीएल को निष्प्रभावी करने की आवश्यकता है। जब महत्वपूर्ण अतिरिक्त में मौजूद होता है, तो टीएमडीपी के सापेक्ष पाइरिडीन की बुनियादीता, एचसीएल के बेअसर होने की अनुमति देती है (पाइरिडीन हाइड्रोक्लोराइड के गठन के माध्यम से)।

अनुशंसित पाइरिडीन/ड्यूटेरेटेड क्लोरोफॉर्म बाइनरी सॉल्वेंट सिस्टम का उपयोग तीन कारणों पर आधारित है। सबसे पहले, यह नमूना विघटन के पक्ष में है । दूसरे, चूंकि पाइरिडीन हाइड्रोक्लोराइड क्लोरोफॉर्म में घुलनशील होता है, इसलिए यह अंतिम स्पेक्ट्रम की वर्षा और गिरावट को रोक सकता है । तीसरा, ड्यूटेरेटेड क्लोरोफॉर्म को अपने अनूठे सिंगलेट सिग्नल के लिए चुना जाता है, जिससे अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर को लॉक करने की अनुमति मिलती है। नमूना व्युत्पन्न आंतरिक मानक की उपस्थिति में किया जाता है। इस तरह, जब नमूना और मानक प्राप्त होते हैं, तो नमूने की चोटियों के अभिन्न अंगों की तुलना और मानक प्रत्येक प्रकार के हाइड्रोक्सी समूह के लिए राशि की मात्रा की मात्रा की अनुमति देता है। विभिन्न यौगिकों को आंतरिक मानक माना गया है। इन यौगिकों को प्रति अणु एक हाइड्रोक्सी समूह द्वारा चिह्नित किया जाता है, जो व्युत्पन्न होने के बाद 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रम में एक तेज संकेत प्रदान करता है। मानक का चयन सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। इसका संकेत प्राप्त नमूने के साथ ओवरलैप नहीं होना चाहिए। शुरुआती दिनों में कोलेस्ट्रॉल का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता था। हालांकि, एलिफेटिक हाइड्रोक्सी समूह से उत्पन्न संकेतों के साथ एक आंशिक ओवरलैप इसके उपयोग को सीमित करता है। नियमित विश्लेषण के लिए, एन-हाइड्रोक्सी-5-नॉर्बोर्न-2, 3-डिकार्बोक्सिड (एनएचएनडी) के आंतरिक मानक समाधानों को पसंद किया जाता है। हालांकि, एनएचएनडी अस्थिरता के कारण, इसके मानक समाधान केवल कुछ दिनों के लिए संग्रहीत किए जा सकते हैं46।

Protocol

निम्नलिखित प्रवाह चार्ट(चित्रा 6)लिग्निन और टैनिन के 31पी एनएमआर विश्लेषण करने के लिए पूरे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है।

Figure 6
चित्र 6:लिग्निन और टैनिन के 31पी एनएमआर विश्लेषण की प्रक्रिया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

1. नमूना प्रीट्रीटमेंट

  1. 40 डिग्री सेल्सियस पर सेट वैक्यूम ओवन में रात भर एनालिट (लिग्निन या टैनिन सैंपल) के एक एलिकोट (लगभग 100 मिलीग्राम) को सुखाएं।
    नोट: तापमान चयन पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है क्योंकि 40 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान रासायनिक रूप से जांच किए गए पॉलीफेनॉल की संवेदनशील संरचना को बदल सकता है।
  2. सूखने के बाद, नमूना को तेजी से एक निर्जल कैल्शियम सल्फेट डेसीकेट डेसीकेट में स्थानांतरित करें जब तक कि यह कमरे के तापमान तक न पहुंच जाए। यह कदम पर्यावरण से नमूना अवशोषित आर्द्रता से बचने के लिए अनिवार्य है।

2. सॉल्वेंट समाधान तैयारी

  1. 1.6/1 (v/v) अनुपात में निर्जल पाइरिडीन और ड्यूटेरेटेड क्लोरोफॉर्म को मिलाकर 20 एमएल सैंपल शीशी में एक पाइरिडीन/ड्यूटेरेटेड क्लोरोफॉर्म सॉल्वेंट मिश्रण तैयार करें ।
    सावधानी: पाइरिडीन और ड्यूटेरेटेड क्लोरोफॉर्म में हेरफेर करते समय ध्यान दें। ये यौगिक ज्वलनशील, हानिकारक और जहरीले होते हैं। उपयुक्त दस्ताने का उपयोग करके एक अच्छी तरह से हवादार धुएं-हुड में समाधान तैयार करें और उपयोग करें।
  2. पानी के निशान को हटाने के लिए 3.2 मिमी छर्रों में अच्छी तरह से धोए गए और सूखे सक्रिय 5A आणविक छलनी के 5-8 ग्राम जोड़ें। इसके अलावा, सॉल्वेंट सिस्टम के वायु संपर्क और नमी संदूषण को रोकने के लिए पट टोपी के उपयोग की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। तैयार समाधान को अंधेरे में स्टोर करें।

3. आंतरिक मानक समाधान (आईएस) तैयारी

  1. 2 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में, पहले तैयार सॉल्वेंट समाधान में क्रोमियम (III) एसिटालेसेटोनेट (लगभग 10 मिलीग्राम) और आंतरिक मानक (लगभग 35.8 मिलीग्राम एनएचएनडी या 77.3 मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल) का 0.1 एम समाधान तैयार करें।
    सावधानी: क्रोमियम (III) एसिटालेसिटोनेट हानिकारक है; इसके हेरफेर के दौरान, उपयुक्त दस्ताने पहनें।
  2. आईएस के समाधान में जोड़ा गया आईएस का सही वजन रिकॉर्ड करें।
  3. सक्रिय आणविक छलनी (बिंदु 2.2 देखें) युक्त सीलबंद टोपी से लैस एक शीशी में आईएस समाधान स्थानांतरित करें और इसे 40 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।

4. एनएमआर नमूना समाधान तैयारी

  1. एक सरगर्मी बार से लैस 2 एमएल शीशी में ~ 30 मिलीग्राम नमूना सही वजन। शीशी को पट टोपी से सील कर दें।
  2. सैंपल शीशी में सॉल्वेंट सिस्टम सॉल्यूशन का 0.5 एमएल जोड़ें।
  3. एक माइक्रोपिपेट के माध्यम से नमूना शीशी में आईएस समाधान के 100 μL स्थानांतरण। चुंबकीय रूप से परिणामी फैलाव (500 आरपीएम) को तब तक हिलाएं जब तक कि सभी लिग्निन या टैनिन भंग न हो जाए, जिसके परिणामस्वरूप एक स्पष्ट समाधान होता है।
    नोट: चूंकि पूर्ण नमूना घुलनशीलता जरूरी है, इसलिए यह कदम 12 घंटे तक लग सकता है।
  4. नमूना समाधान के लिए टीएमडीपी के 0.1 एमएल स्थानांतरित करें। जोरदार चुंबकीय सरगर्मी के तहत नमूना रखें। सैंपल का घोल सील रखें। उपयुक्त दस्ताने पहनते समय एक अच्छी तरह से हवादार धुएं-हुड में टीएमडीपी का उपयोग करें।
    सावधानी: टीएमडीपी और इसके वाष्प संक्षारक, हानिकारक और पानी के साथ तेजी से बातचीत करते हैं।
    नोट: पीले रंग की वर्षा का गठन नमूने में पानी के निशान या पाइरिडीन/क्लोरोफॉर्म समाधान के कारण होता है। ऐसे मामले में, सभी संभव नमी संदूषण से बचा जा सके, यह सुनिश्चित करके प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए।
  5. नमूना समाधान को पाश्चुर पिपेट का उपयोग करके एनएमआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।

5. एनएमआर विश्लेषण

  1. नली को एनएमआर इंस्ट्रूमेंट में लोड करें। इस विश्लेषण को करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले स्पेक्ट्रोमीटर को ब्रॉडबैंड जांच की जरूरत है ।
  2. तालिका 1 1में दिखाई गई सेटिंग के अनुसार प्रायोगिक मापदंडों को ठीक करें।
पल्स कार्यक्रम विलोम गेटेड डिविपलिंग पल्स (zgig)
नाभिक 31P
स्पेक्ट्रल चौड़ाई 100 बजे.m
अधिग्रहण का समय - 0.8 एस
शिथिलता में देरी ≥ 10 एस
स्कैन नंबर 64 या अधिक
स्पेक्ट्रम केंद्र 140 बजे.m।

तालिका 1: प्रायोगिक पैरामीटर 31पीएनएमआर स्पेक्ट्रा को व्युत्पन्न लिग्निन या टैनिन के रिकॉर्ड करने के लिए।

  1. ड्यूटेरेटेड क्लोरोफॉर्म की गूंज आवृत्ति का उपयोग करके स्पेक्ट्रोमीटर आवृत्ति सेट करें, नमूना शिम करें और स्पेक्ट्रोमीटर को ट्यून करें। इसके बाद अधिग्रहण शुरू करें।

6. स्पेक्ट्रम प्रसंस्करण और विश्लेषण

  1. प्रक्रिया 31पी एनएमआर कच्चे डेटा निम्नलिखित चरणों के अनुसार एक उपयुक्त मानक सॉफ्टवेयर द्वारा।
    1. फोरियर ट्रांसफॉर्मेशन करें।
    2. मैनुअल चरण सुधार द्वारा चरण को समायोजितकरें (प्रोसेसिंग | चरण सुधार | मैनुअल सुधार)।
    3. मैन्युअल रूप से बेसलाइन को सही करें, ध्यान से शून्य अंक सेट करें(प्रोसेसिंग | बेसलाइन | मल्टीपॉइंट बेसलाइन करेक्शन)।
  2. सिग्नल अंशांकन।
    1. 132.2 पीपीएम के रासायनिक बदलाव मूल्य पर फॉस्फिटीलेटेड पानी के लिए संकेत सेट करें(विश्लेषण | संदर्भ | संदर्भ)।
      नोट: 175 पीपीएम पर एक तेज 31पी सिग्नल की उपस्थिति टीएमडीपी की अधिकता के कारण है। इसकी उपस्थिति नमूने का पूर्ण व्युत्पन्न सुनिश्चित करती है। यदि यह चोटी अनुपस्थित है, तो किसी को पूरी तरह से नमूना और विलायक सुखाने और अधिक टीएमडीपी जोड़कर पूरी प्रक्रिया पर फिर से विचार करने की आवश्यकता है। एक बार यह गारंटी है, स्पेक्ट्रम स्पेक्ट्रल रेंज १३२ में लगभग १५० पीपीएम(चित्रा 7)में तेजी से बढ़ी है ।

Figure 7
चित्र 7:टीएमडीपी की अधिकता की उपस्थिति की जांच करें: यदि इसे देखा जा सकता है, तो नमूने का व्युत्पन्नकरण पूरा हो गया है। इसके बाद स्पेक्ट्रा का विश्लेषण किया जा सकता है। 155 और 132 पीपीएम के बीच स्पेक्ट्रल रेंज में है कि ज़ूम करने के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. एकीकरण
    1. आंतरिक मानक को 1.0 तक सेट करके एकीकरण को सामान्य करें (पीक | पर क्लिक करें इंटीग्रल | को संपादित करें सामान्यीकृत: 1.00) निम्नलिखित तालिकाओं में सूचित रासायनिक बदलावों के अनुसार स्पेक्ट्रम एकीकरण करें। टैनिन के लिए लिग्निन और टेबल 3 के लिए टेबल 2 का उपयोग करें।
कार्यात्मक समूह रासायनिक बदलाव (पीपीएम)
एलिफेटिक ओह 149.0-146.0
फेनोलिक ओह 144.0-137.4
C5 प्रतिस्थापित फेनोलिक ओह 143.0-140.2
5-5 'फेनोलिक ओह 141.7-140.2
सिरिंजल ओह 143.2-142.7
4-ओ-5 ' ओह 142.8-141.7
गुआसिल ओह 140.2-138.8
पी-हाइड्रोक्सीफेनिल ओह 138.8-137.4
सीओओएच 136.0-133.6
ट्राइसिन 137.0-136.0

तालिका 2: लिग्निन फॉस्फेटेटेड ओह-समूहों के लिए 31पी एनएमआर रासायनिक बदलाव।

कार्यात्मक समूह रासायनिक बदलाव (पीपीएम)
रिंग ए
ओ-अनसब्सिट्यूटेड फिनोलिक 137.9–137.4
ओ-प्रतिस्थापित फेनोलिक 138.8–137.9
रिंग बी
कैटेकोल ओह 140.2–138.8
पायरोगलोल ओह 144.0–140.2
रिंग सी
अलीफतीसी ओह 146.0–145.0

तालिका 3: टैनिन फॉस्फेटेटेड ओह-समूहों के लिए 31पी एनएमआर रासायनिक बदलाव।

नोट: मानक स्पेक्ट्रल-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, रासायनिक बदलाव के पूर्व-परिभाषित क्षेत्रों को एकीकृत करना संभव है। यह अवसर लाभप्रद है जब कई स्पेक्ट्रा को संसाधित किया जाना है।

7. कार्यात्मक समूह मात्राकरण

  1. आईएस के समाधान की एकाग्रता की गणना करें।
    Equation 1
  2. विशिष्ट संकेत के बराबर राशि की गणना करें:
    Equation 2
    Equation 3

Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल लिग्निन और टैनिन के विश्लेषण के लिए दोनों लागू किया जा सकता है। लिग्निन रसायन विज्ञान में, यह विधि मौलिक है क्योंकि यह विभिन्न प्रकार के हाइड्रोक्सी समूहों का पता लगाने और मात्राकरण की अनुमति देती है। चित्रा 8A-D विभिन्न आवृत्तियों पर काम कर रहे स्पेक्ट्रोमीटर के साथ अधिग्रहीत लिग्निन और टैनिन के 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रा के उदाहरण दिखाते हैं। चित्रा 8A में दिखाया गया स्पेक्ट्रम 300 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके दर्ज किया गया था, जबकि चित्रा 8D 700 मेगाहर्ट्ज एनएमआर उपकरण के साथ दर्ज किया गया था।

Figure 8
चित्रा 8:मात्रात्मक 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रम (ए) सॉफ्टवुड क्राफ्ट लिग्निन (स्पेक्ट्रम 30.8 मिलीग्राम लिग्निन पर 300 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर के साथ दर्ज किया गया), (बी) सॉफ़्टवुड लिग्नोसुल्फोनिक एसिड (स्पेक्ट्रम 30.1 पर 300 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर के साथ दर्ज किया गया लिग्नोसल्फोनेट के संरक्षण के बाद लिग्नोसल्फोनेट के संरक्षण के बाद मिलीग्राम लिग्नोसुल्फोनिक एसिड), (सी) बबूल टैनिन (स्पेक्ट्रम 30.3 मिलीग्राम नमूने पर 300 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर के साथ दर्ज किया गया) और (डी) सॉफ़्टवुड क्राफ्ट लिग्निन (स्पेक्ट्रम पर 700 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर के साथ दर्ज किया गया 7.2 मिलीग्राम लिग्निन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इन स्पेक्ट्रा को सावधानीपूर्वक दर्ज किया गया था और मैन्युअल रूप से संसाधित किया गया था। एलिफेटिक (150-145 पीपीएम), सुगंधित (145-137 पीपीएम), और कार्बोक्सिलिक (136-134 पीपीएम) हाइड्रोक्सी समूहों के लिए विशिष्ट संकेत बहुत अच्छी तरह से हल किए जाते हैं और इस तरह आसानी से एकीकृत होते हैं। यदि स्पेक्ट्रल विंडो खोली जाती है (95 से 190 पीपीएम, चित्रा 8),तीन तेज, मजबूत चोटियां (175, 144 और 132 पीपीएम) स्पष्ट हैं। वे क्रमशः टीएमडीपी, आंतरिक मानक (कोलेस्ट्रॉल या एनएचएनडी) और हाइड्रोक्सीलेटेड-टीएमडीपी (पानी के निशान के कारण) की अधिकता के कारण होते हैं।

क्राफ्ट और ऑर्गेनोसोलोव लिग्निन के विपरीत, लिग्नोसल्फोलेट पाइरिडीन/क्लोरोफॉर्म मिश्रण में अघुलनशील होते हैं । एक विश्वसनीय 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए, घुलनशीलता अनिवार्य है। इस समस्या को दूर करने के लिए, लिग्नोसल्फोनेट को व्युत्पन्न होने से पहले संबंधित लिग्नोसल्फोनिक एसिड में परिवर्तित किया जा सकता है। मजबूत एसिड (यानी, सल्फ्यूरिक एसिड), या एसिड एक्सचेंज रेजिन (जैसे, डोटेक्स 1H, एक मजबूत एसिड सपेर एक्सचेंजर) के साथ लिग्नोसल्फोनेट समाधानों का इलाज करने से सभी सल्फोनेट समूहों का अम्लीय रूपों में रूपांतरण होता है। परिणामस्वरूप उत्पादों को चयनात्मक सोज़ोर्पेटिव रेजिन (XAD-7, एक ध्रुवीय एसोरबेंट का उपयोग करके अम्लीय समाधान से हटाया जा सकता है, जिसका उपयोग इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके विश्लेषण किया गया 60,000 यू.m.ए) तक आणविक वजन की विशेषता वाले यौगिकों को अलग करने के लिए किया जाता है। चित्रा 8B एक टीएमडीपी व्युत्पन्न लिग्नोसुलोनिक एसिड के मात्रात्मक 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रम से पता चलता है । इस मामले में भी हाइड्रोक्सी समूहों के अलग-अलग संकेत स्पष्ट हैं। चित्रा 8C टीएमडीपी का उपयोग करके प्राप्त टैनिन नमूने का एक विशिष्ट मात्रात्मक 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रम दिखाता है। रिंग बी में विभिन्न एलिफेटिक ओह (रिंग सी), पायरोफिलोल और कैटेकोल इकाइयों और रिंग ए में इकाइयों से एक विशिष्ट संकेत अच्छी तरह से दिखाई देता है।

Discussion

वर्णित विधि आर्गिरोपोलोस 37 , 38,39, 40 ,41,42द्वारा विकसित लिग्निन के गुणात्मक और मात्रात्मक लक्षण वर्णन के उद्देश्य से विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन और अनुकूलन का प्रतिनिधित्व करता है । लिग्निन संरचनात्मक स्पष्टता के लिए उपलब्ध कई अन्य तकनीकों की तुलना में, विधि को व्यापक रूप से सबसे सतही, तेजी से और प्रजनन योग्य के रूप में स्वीकार किया गया है। गीले रासायनिक तरीकों (जैसे, नाइट्रोबेनजेन, परमंगनेट ऑक्सीडेशन, आदि) की वैधता ऑपरेटर के अच्छे प्रयोगात्मक कौशल पर निर्भर करती है, जो प्रभावी रूप से सीमित ऑपरेटरों तक विधि को सीमित करती है। इसके अलावा, कई कमियों के लिए खाते में गीले रासायनिक तरीकों के लिए साहित्य में सुधार कारकों का सामना करना असामान्य नहीं है। वर्णित 31पी एनएमआर प्रोटोकॉल में उन्नत प्रायोगिक कौशल की आवश्यकता नहीं है जो इसे आसानी से लागू, उपयोगकर्ता के अनुकूल और व्यापक रूप से उपलब्ध कराते हैं। अन्य वाद्य विश्लेषणात्मक तरीकों की तुलना में, 31पी एनएमआर एकमात्र तकनीक है जो लिग्निन में विभिन्न हाइड्रोक्सी समूहों का सटीक पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने में सक्षम है। उदाहरण के लिए, एफटीआर का उपयोग 1एच एनएमआर जैसे विभिन्न हाइड्रोक्सी समूहों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, दोनों तकनीकें पीड़ित हैं क्योंकि वे व्यापक संकेत ओवरलैप मुद्दों के कारण विश्वसनीय मात्रात्मक डेटा प्रदान नहीं कर सकते हैं। एक और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी है, जिसे सबसे पहले गोल्डश्मिड द्वारा रिपोर्ट किया गया था। हालांकि, यह दृष्टिकोण हाइड्रोक्सी समूहों के सामान्य समग्र निर्धारण तक सीमित है क्योंकि यह एलिफेटिक, सुगंधित और कार्बोक्सिलिक ओएचएस47के बीच प्रभावी रूप से अंतर नहीं कर सकता है।

आर्थिक दृष्टिकोण से, 31पी एनएमआर तकनीक की एकमात्र सीमा टीएमडीपी की कीमत है, जो अपेक्षाकृत महंगी रिएजेंट है। इसकी कीमत प्रति ग्राम लगभग 190 अमरीकी डॉलर है; नतीजतन, यदि विश्लेषण की लागत केवल टीएमडीपी की कीमत के लिए अनुमानित होगी, तो पाइरिडीन/क्लोरोफॉर्म मिश्रण और ऑपरेटर समय से प्राप्त लोगों को छोड़कर, यह विश्लेषण प्रति 24 अमरीकी डॉलर की राशि होगी । इस मुद्दे को हल करने के लिए, कई प्रयोगशालाएं टीएमडीपी को संश्लेषित करने का सहारा लेते हैं, इस प्रकार, अभिकर्मक लागत को कम करते हैं। ऐसा करने के लिए, ट्राइथिलमाइन44की उपस्थिति में पिनाकोल और फॉस्फोरस ट्राइक्लोराइड पर प्रतिक्रिया व्यक्त की जाती है। तकनीकी रूप से, यह प्रतिक्रिया अपेक्षाकृत आसान है; हालांकि, फॉस्फोरस ट्राइक्लोराइड के उपयोग में देखभाल और अच्छी तरह से नियंत्रित वैक्यूम आसवन सहित इसके वर्क-अप की आवश्यकता है। टीएमडीपी के संश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी अनुरोध पर आपूर्ति की जा सकती है।

हालांकि यह प्रोटोकॉल आसानी, प्रजनन क्षमता और परिशुद्धता के मामले में सबसे अच्छा है, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं को उजागर करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, नमूने को चिन्हित पाइरिडीन/क्लोरोफॉर्म मिश्रण में पूरी तरह से घुलनशील होने की जरूरत है । यह विचार मौलिक है क्योंकि हाइड्रोक्सिल समूहों की मात्रात्मक फॉस्फायलेशन प्रतिक्रिया को पूरी तरह से सजातीय परिस्थितियों में होने की आवश्यकता है । यदि नमूने का केवल एक हिस्सा घुलनशील है, तो परिणामी विश्लेषण गलत होगा। दूसरे, जांच किए जाने वाले नमूने को नमी और विलायक-मुक्त करने की आवश्यकता है क्योंकि ये चर विश्लेषण की सटीकता और समग्र सफलता को हानिकारक रूप से प्रभावित करेंगे। आर्द्रता के निशान टीएमडीपी के साथ प्रतिक्रिया देंगे 2-हाइड्रोक्सी-4,4'-5, 5'-टेट्रामेथिल-1, 3, 2-डायोक्साफोस्फोलेन। यह यौगिक एक पीला-पीला फ्लोक्यूलेटिंग नमक है, जो पाइरिडीन/क्लोरोफॉर्म सॉल्वेंट मिश्रण में अघुलनशील है, जिससे अपर्याप्त एनएमआर सिग्नल अधिग्रहण होता है । चूंकि नमूने के केवल एक छोटे वजन (~ 30 मिलीग्राम) की आवश्यकता होती है, इसलिए विश्लेषण से पहले सही तरीके से ज्ञात होने के लिए इसके सटीक वजन के लिए इसे अस्थिर से मुक्त करने की आवश्यकता होती है।

कभी-कभी, नमूना समाधान के मुद्दों को बढ़ावा दिया जा सकता है (विशेष रूप से अत्यधिक ऑक्सीकृत नमूनों के लिए) एक सह-विलायक (यानी, डाइमेथाइलफॉर्मेमाइड) की छोटी मात्रा जोड़कर, नमूना विघटन में सहायता करते हुए। सैद्धांतिक रूप से, टीएमडीपी के साथ बातचीत नहीं करने वाले हर विलायक का उपयोग नमूना विघटन में मदद करने के लिए किया जा सकता है। सह-विलायक के चुनाव में लैबिल हाइड्रोक्सी या अमीनो समूहों वाले सह-सॉल्वैंट्स शामिल नहीं हो सकते क्योंकि वे रिएजेंट के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, जिससे अंतिम स्पेक्ट्रा भ्रामक होता है । विशेष रूप से, डिमेथाइल्सुफॉक्साइड भी टीएमडीपी के साथ प्रतिक्रिया करता है जो सह-विलायक के रूप में इसके उपयोग को रोकता है। जब घुलनशीलता के मुद्दे उठते हैं, तो पाइरिडीन-आधारित आयनिक तरल पदार्थ, जैसे 1-एलिल-3-ब्यूटिलपाइरिडिनियम क्लोराइड का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, आयनिक लिक्विड एक बार फिर ड्राई48होना चाहिए . लिग्नोसल्फोट्स (एक लिग्निन प्रकार एक उच्च सल्फोनेशन डिग्री की विशेषता) को भंग करने के लिए, बेअसर समूहों को उनके अम्लीय रूप में परिवर्तित करने से जुड़े एक पूर्व-उपचार को सहायक होने का प्रदर्शन किया गया था। लिग्नोसल्फोनेट को जलीय मीडिया में अम्लीय विनिमय रेजिन का उपयोग करके आसानी से उनकी अम्लीय स्थितियों में परिवर्तित किया जा सकता है। परिणामस्वरूप लिग्नोल्फोनिक एसिड विशिष्ट अवशोषण (जैसे, XAD-7) और इथेनॉल में अवशोषण पर उनके सोखने से समाधान से अलग हो जाते हैं। 40 डिग्री सेल्सियस पर कम दबाव पर इथेनॉलिक समाधानों का वाष्पीकरण लिग्नोसुलाफोनिक एसिड के अलगाव की अनुमति देता है। इन लिग्निन को तब 31पी एनएमआर द्वारा चित्रित किया जा सकता है क्योंकि वे प्रोटोकॉल द्वारा प्रस्तावित पाइरिडीन/क्लोरोफॉर्म मिश्रण में घुलनशील हैं ।

हल्के तापमान पर लंबे समय तक वैक्यूम सुखाने से प्रत्येक नमूने में नमी और अन्य volatiles की मात्रा को प्रभावी ढंग से कम कर देता है। विशेष रूप से, पानी की छोटी मात्रा अंतिम स्पेक्ट्रम को प्रभावित नहीं करती है क्योंकि टीएमडीपी को अधिक मात्रा में जोड़ा जाता है। इसके अलावा, कुछ मामलों में, 2-हाइड्रोक्सी-4,4'-5,5'-टेट्रामेथिल-1, 3,2-डायोसाफोस्फोलेन की थोड़ी मात्रा एनएमआर ट्यूब या नमूना शीशी में मौजूद आर्द्रता से हो सकती है। इन मामलों में, सरगर्मी पूरी तरह से गठित वर्षा की मात्रा को भंग करने के लिए पर्याप्त है। यदि 2-हाइड्रोक्सी-4,4'-5,5'-टेट्रामेथिल-1,3,3,2-डायॉक्साफोस्फोलेन की उच्च मात्रा बनती है, तो नमूना तैयार करने को दोहराने, सुखाने के उपचार में सुधार करने का सुझाव दिया जाता है। उदाहरण के लिए, उपयोग से पहले, सभी ग्लासवेयर को गर्मी बंदूक के साथ संक्षेप में गर्म किया जा सकता है।

स्पेक्ट्रम को रिकॉर्ड करने के लिए उपयोग की जाने वाली स्पेक्ट्रल रेंज विभिन्न हाइड्रोक्सिल समूहों के बारे में संकेत के लिए ब्याज के क्षेत्र की तुलना में व्यापक है। हालांकि, यह समझना अनिवार्य है कि नमूना व्युत्पन्न सफलतापूर्वक हुआ या नहीं। पूर्ण नमूना व्युत्पन्न की पुष्टि 174 पीपीएम के आसपास एक मजबूत संकेत की उपस्थिति से दी गई है। यह तेज चोटी टीएमडीपी के कारण है, और इसका अस्तित्व यह सुनिश्चित करता है कि अभिकर्मक अतिरिक्त रूप से मौजूद था, और इसलिए, सभी हाइड्रोक्सिल समूहों को प्राप्त किया गया है। यदि यह चोटी अनुपस्थित है, तो दो सबसे संभावित कारण हैं: (1) उपयोग की जाने वाली टीएमडीपी की मात्रा नमूने के पूर्ण व्युत्पन्न करने के लिए अपर्याप्त है, या (2) नमूने में उच्च मात्रा में पानी मौजूद है। पहले मामले में, टीएमडीपी की उच्च मात्रा का उपयोग करने से नमूना का पूर्ण व्युत्पन्न होने की संभावना सुनिश्चित होगी, और 174 पीपीएम पर सिग्नल दिखाई देगा। दूसरे मामले में, नमूना अधिक बड़े पैमाने पर सूख जाना चाहिए। एक बार टीएमडीपी की अधिकता सुनिश्चित होने के बाद, पीक एकीकरण किया जा सकता है। इस ऑपरेशन से पहले, एक संकरा खिड़की (150 से 132 पीपीएम) पर ज़ूम करें जो ब्याज के संकेतों को सीमित करता है।

उपरोक्त प्रायोगिक प्रोटोकॉल में रिपोर्ट किए गए नमूने (~ 30 मिलीग्राम) की मात्रा का विश्लेषण किया गया है, जिसे 300 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर या उससे अधिक के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले स्पेक्ट्रा एकत्र करने के लिए चुना गया है। फिर भी, हमने देखा है कि यदि 500 मेगाहर्ट्ज या उच्च क्षेत्र चुंबक का उपयोग किया जाता है तो नमूना राशि को कम करना संभव है। उदाहरण के लिए, चित्रा 8 डीमें, एनएमआर स्पेक्ट्रम (700 मेगाहर्ट्ज उपकरण के परिणामस्वरूप) 7.2 मिलीग्राम लिग्निन के साथ तैयार नमूने का दिखाया गया है। इस स्पेक्ट्रम का सिग्नल एकीकरण लिग्निन की उच्च मात्रा का उपयोग करते समय प्राप्त किए गए परिणाम प्रदान करता है। यह तथ्य उन सभी शोध के लिए इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता को बढ़ाता है जिसमें उत्पादों की कम मात्रा उपलब्ध है।

कुल मिलाकर, इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को कई अनुसंधान और विकास अनुप्रयोगों पर लागू किया जा सकता है जब लिग्निन और टैनिन में मौजूद विभिन्न हाइड्रोक्सी समूहों की उत्पत्ति और भाग्य को समझना आवश्यक है। विशेष रूप से, जब जीपीसी और एचएसक्यूसी डेटा के साथ मिलकर, जिसके परिणामस्वरूप डेटा लिग्निन या टैनिन की संरचना पर आगे विस्तृत और अटकलें लगाने का अवसर प्रदान करता है। कई उदाहरणों में जहां रासायनिक संशोधनों लिग्निन या एक टैनिन के हाइड्रोक्सी समूहों के लिए लागू कर रहे हैं, मात्रात्मक 31पी एनएमआर विश्लेषण अत्यंत का पता लगाने के लिए कि क्या इन संशोधनों हुआ और किस डिग्री के लिए मूल्यवान हो सकता है । उदाहरण के लिए, चित्रा 9 अपने ऑक्सीकरण से पहले और बाद में एक ही लिग्निन के दो एनएमआर स्पेक्ट्रा दिखाता है। एक सरल गुणात्मक मूल्यांकन ऑक्सीकरण पर एलिफेटिक और सुगंधित हाइड्रोक्सी समूहों दोनों की कमी को दर्शाता है, इस प्रकार मूल्यवान जानकारी और मार्गदर्शन प्रदान करता है।

Figure 9
चित्र 9:मात्रात्मक 31पीएनएमआर स्पेक्ट्रा एक ही ऑर्गेनोसोल्व लिग्निन का टीएमडीपी (ए) पूर्व और(बी)अपने ऑक्सीकरण के बाद का उपयोग करके प्राप्त किया गया । स्पेक्ट्रा एक 300 एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर दर्ज किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अंत में, इस तकनीक में पॉलीफेनोलिक, ओह असर लिग्निन, और टैनिन (और यहां तककि सिंथेटिक पॉलिमर)49,50,51 से निपटने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में, रसायन विज्ञान से लेकर इंजीनियरिंग, जीव विज्ञान से बहुलक, और फार्मास्यूटिकल अनुप्रयोगों से संबंधित पूछताछ करते समय सबसे आवश्यक और शक्तिशाली उपकरणों में से होने के सभी गुण हैं।

Disclosures

क्लाउडिया क्रेस्टिनी और डिमिट्रिस एस आर्जिरोपोलोस यह सुनिश्चित करते हैं कि सभी लेखकों (सी.C, एन.पी.और डीएसए) के हितों का कोई टकराव न हो।

Acknowledgments

पिछले कुछ वर्षों में इस काम को विभिन्न वित्तीय पुरस्कारों द्वारा समर्थित किया गया है जिसमें कनाडा के पल्प एंड पेपर रिसर्च इंस्टीट्यूट, मैकगिल विश्वविद्यालय मॉन्ट्रियल, कनाडा की प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन यूएसए, संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग और सोल्वे कंपनी जैसे संगठन शामिल थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 - 1000 µl Eppendorf micropipette VWR 613-0866
20 - 200 µl Eppendorf micropipette VWR 613-0865
2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% Sigma-Aldrich 447536
Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) Precisa LX220 A
Binder Vacuum Oven Binder VD53
Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 Sigma-Aldrich 29651-U
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151823
Cholesterol, Sigma-grade Sigma-Aldrich C8667
Molecular sieves, 4A Sigma-Aldrich 208604
N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% Sigma-Aldrich 226378
NMR spectrometer, 300 MHz Bruker
Norell natural quartz 3 mm NMR tubes Sigma-Aldrich NORS33007
Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) VWR 613-0342
Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) VWR 613-0239
Pyridine, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich 270970
Stirring bars,micro, 3 mm lenght VWR 442-0360
Stirring bars,micro, 6 mm lenght VWR 442-0362
Triphenylphospine oxide, 97% Sigma-Aldrich T84603
Vials for environmental analysis, WHEATON,  20.00 mL DWK Life Sciences WHEAW224609
Weighing paper, grade 531 VWR 516-0318P

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रसायन विज्ञान अंक 174
लिग्निन और टैनिन का मात्रात्मक <sup>31</sup>पी एनएमआर विश्लेषण
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Argyropoulos, D. S., Pajer, N.,… More

Argyropoulos, D. S., Pajer, N., Crestini, C. Quantitative 31P NMR Analysis of Lignins and Tannins. J. Vis. Exp. (174), e62696, doi:10.3791/62696 (2021).

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