Summary
31P NMRはポリフェノールの構造解明のための強力なツールです。リグニンとタンニンの異なるタイプのヒドロキシ、フェノール、カルボキシ基の定量化と分化を可能にする、この高速、容易、正確、定量、および非常に再現性の分析手順は、今では日常的な分析ツールとなっています。
Abstract
持続可能なバイオリファイナリー製品の開発は、リグニンとタンニンの価引の課題に直面しています。これらの豊富な再生可能芳香族バイオポリマーは、その固有の構造の複雑さと変動性と種の多様性の高さのために広く利用されていません。これらのポリフェノールに対する定義された一次構造の欠如は、処理中に誘発される複雑な化学的変化によってさらに複合化され、最終的にはさらなる利用努力のために極めて重要な多種多様な構造的特徴を与える。
したがって、天然ポリフェノールに存在する様々な機能群の迅速かつ単純かつ明確な同定と定量化のためのプロトコルは、その反応性と最終的な有用性を理解し、それに応じて調整するための基本的な前提条件です。
定量 31P NMRは、広範な用途ポテンシャルを有するリグニンおよびタンニンの非置換、O-モノ置換、およびo-ジノールフェノール、脂肪族OHs、カルボン酸部分を迅速かつ確実に同定する機会を提供する。
方法論は、適切な31P含有プローブを用いたin situ定量リグニンまたはタンニン標識法で構成され、続いて、内部標準の存在下で定量的な31PNMRスペクトルを取得する。31P核の高い自然量は、少量のサンプル(〜30mg)および短いNMR取得時間(〜30〜120分)を、標識されたOH基の周囲の化学環境に大きく依存する31P信号を十分に解決した。
Introduction
この手順は、最近、自然プロトコル1に掲載され、アーカイブ文献で3,000回以上引用されており、不可欠で迅速で再現可能な構造情報を提供するため、リグニンとタンニンの特性評価のための日常的な測定となっています。
リグニンとタンニン
グリーンケミストリーがポール・T・アナスタスとジョン・C・ヴェルナー2、3によって導入されたとき、それは化学の一般的な概念を大きく変えました。特に、石油や石炭などの化石原料の代わりに持続可能な材料を利用することの重要性を、重要な側面2,3として強調している。バイオマスの種類が異なる中で、リグニンは最も豊富な芳香族バイオポリマーであり、工業用商品および高付加価値品4の潜在的な供給源と見なすことができる。
リグニンは2番目に豊富な木材成分です(セルロースが1位、ヘミセルロースが3番目)。植物中の含有量は植物の種類によって異なります:例えば、軟林と比較してリグニンの量が少ない広葉樹(20%±4%対28%±4%)。さらに、植物組織内のリグニン分布は均質ではない:より高いリグニン含有量は、細胞壁5、6に見つけることができます。リグニンは、紙/セルロース産業7の副産物として工業的に得られるポリフェノール系材料である。木材パルププロセスから回収され、木材チップが主にOH-および/またはOH-+HS-イオン条件下で処理され、セルロースをヘミセルロースおよびリグニン(ソーダおよび/またはクラフトプロセス)8,9から分離する。
リグニンの研究の最初の試みは、それぞれ1838年と186510年にパリーンとシュルツェによって行われました。1977年、アドラーはその時間11の関連する利用可能な知識をすべて要約しました。リグニンビルディングブロックは、p-コウマリル、針形ニル、シナピルアルコールの3つのフェニルプロパノイド単位であると現在認識されています。これらのモノマーは、フリーラジカル重合プロセスのおかげで、p-ヒドロキシフェニル、グアイアシル、およびシナピル単位を生じさせ、最終的にはリグニンを広く構成する(図1)12。リグニンの一次構造の欠如は、その構造特性の本質的な難しさを意味する。したがって、分子量の分布の評価は、常にやや議論の余地があった。粉砕された木材リグニンは、主にプロトリグニン10に近似する穏やかな条件下で単離されたリグニンを、超分子凝集プロセス14、15を介して高度に相互作用するオリゴマー13で構成される。
図1: 異なるタイプの結合が強調されている針葉樹リグニンの代表的なモデル。
リグニンは、一般的に、(a)それらが由来する木材の種類(例えば、広葉樹および針葉樹)、(b)それを分離するために使用されるプロセスに応じて分類される。最も重要な工業用リグニンタイプは、クラフト、リグノスルホン酸塩、およびオルガノソルブです。
リグニンの構造は、その起源と化学処理に大きく依存しています。より具体的には、リグニンのかなり複雑で不規則な構造がその自然な多様性と複雑な処理化学と複合化されると、極度のばらつき、多様性、および異質性の材料が出現し、その使用を低価値用途16に限定する。針葉樹リグニンは、主にグアイアシル単位(G)を含み、p-ヒドロキシフェニル基(Gリグニン)の量がごくわずかであるが、硬質葉樹リグニンはグアイアシルとシリンギルサブユニット(GSリグニン)によって構成され、草リグニンはグアイアシルによって構成され、 シリンギル、およびp-ヒドロキシフェニル(GSHリグニン)サブユニット。分離に使用される抽出アプローチは、新興リグニン17の構造に劇的に影響を与える。図2は、採用されている絶縁アプローチによって異なる3つのリグニン構造を示しています。抽出方法の効果に関するいくつかの考慮事項を強調することができます。第一に、クラフトリグニンは、ディールキル化され、高度に断片化され、凝縮されたリグニンであり、一方でオルガノソルブリグニンは、粉砕された木材リグニン(ビョルクマンアプローチを使用して単離)18、19、20に類似した構造を有する。最後に、リグノスルホネートは、抽出スルホン化プロセスの強度および条件に応じて、高度なスルホン化を特徴とする。
図2: 技術的リグニンの代表的な構造 この図では、異なるタイプのリグニンの違いが分かる。(A)軟材クラフトリグニンは高度に凝縮されており、(B)リグノスルホン酸は飽和炭素上のスルホン基を特徴とし、(C)有機ソLVリグニンは粉砕された木材リグニンと同様の構造を有する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
リグニンと同様に、タンニンは植物に見られるポリフェノール化合物です。タンニンの抽出アプローチとアプリケーションに関する最近のレビューと更新されたレビューは、最近Dasららによってリリースされました21.日常生活におけるタンニンの重要性は、2つの例を考えると強調することができます:彼らはワイン22に味と色を与えます。さらに、そのポリフェノール構造は抗酸化特性を提供し、日焼け業界23での適用に最適です。タンニンは、加水分解性と非加水分解性の2つのクラスに分けられます。加水分解性タンニンは、ガリック、ジギャリック、およびエラグ酸エステルのポリマーと考えることができる(図3)。これらのエステルは、糖分子(例えば、グルコース、ラムノース、アラビノース)を用いたフェノール酸のエステル化から生じる。
図3:典型的な加水分解性タンニン:タンニン酸、ベスカルギン。この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
非加水分解性タンニンは、凝縮タンニンとも呼ばれ、フラバン-3-olsに由来するポリマーおよびオリゴマーです。フラバン-3-olsの中で、カテキンおよびガカテキンが最も頻繁である。彼らは無色の結晶性化合物である(図4)。重合は、ヘリコイド構造を特徴とするポリマーを作成する。芳香族ヒドロキシ基は螺旋の外側に向けられ、ピラン酸素は内部にある。
図4: プロアントシアニジン構造: R =H, OH, OCH3.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
NMRを用いたリグニンとタンニンの特性
リグニンまたはタンニンの特性評価において重要な情報の2つのタイプ:(a)化学構造(例えば、ヒドロキシ基の含有量、性質、単位間結合の頻度)および(b)分子量および多分散性。リグニンに関する初期の研究以来、これらの目標を達成するために異なる技術が採用されており、化学的および物理的な方法の2つのクラスの方法が出現しました。
リグニン化学では、アルカリ性ニトロベンゼン酸化などの化学的方法、後に還元的切断、過マンガン酸酸化、およびチオ酸分解を伴う誘導体化が、24、25、26、27、28、29に広く用いられてきた。しかし、分析プロトコルが実装され、最適化されている場合でも、それらは時間を要し、面倒であり、広範な実験スキルを必要とします30.あるいは、器械分析の最初から、リグニンおよびタンニン特性31を実行するために物理的方法が使用されてきた。これらの技術は、リグニン構造を容易に特徴付けることができるように古典的な方法の問題を克服することができます。
核磁気共鳴(NMR)は、インストゥルメンタル技術の中でリグニン構造と化学組成に関する情報を得ることができます。特に、定量単次元1HNMRスペクトルおよび定量13CNMRスペクトルからのデータは、異なるタイプのリグニンインターユニットボンディング32、33、34、35に関する情報を提供することができる。残念ながら、単次元スペクトルはシグナルの重複に苦しみ、信号統合の取り組みを深刻に損なう可能性があります。HSQC(異核単一量子コヒーレンス)、Q-HSQC(定量- ヘテロ核単一量子コヒーレンス)の定量版は、リグニン構造をよりよく理解するために使用され、内部リンケージに関する有用な情報を提供している。しかし、それらは、様々な建物ユニット13、36、37を定量的に決定するために十分に利用することはできません。
単一および2次元NMRに関連する問題を克服するために、基質誘導体化が検討されている。このアプローチの利点の中でも、標識基板が溶解した溶媒から、複雑な高分子内に特異的なラベルを導入し、スペクトル干渉が生じることがない点である。ヴェルケードはこの分野のパイオニアであり、リン誘導体、石炭誘導体、および関連化合物38の31PNMR分析を行った。その公表では、異なるリン含有試薬(ホスホラネア)のスクリーニングを行い、他の標識化合物の化学シフトを記録した。Argyropoulosのチームは、1991年にリグニンのヒドロキシ基の定量的および定性的分析のための誘導体化を初めて導入しました。リン含有試薬を用いたリグニンモデル化合物の誘導体化を研究した後、彼のグループはリグニン化学で最も日替わりの技術の1つ、31P NMR分析39、40、41、42、43への道を開いた。調べた異なるホスホラネの中で、アルギロプロスは、リグニン分析を行う最も適したものとして2-クロロ-4、4、5-テトラメチル-1、3-2-ジオクサフォスフォラン(TMDP)の使用に到着した。TMDPは、特定の31PNMR化学シフトを特徴とするリン含有誘導体の定量的形成を引き起こすヒドロキシ基と選択的に反応する(図5)。
図5:リグニンとタンニンのホスフィレーション化学 リグニンおよびタンニン不安定H基の標識は、その際の反応によって達成される。標識されたポリフェノールは、異なるタイプのヒドロキシ基に対応する特定の 31P NMRバンドによって特徴付けられる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
サンプル誘導体化は、ピリジン/クロロホルム(1.6:1)混合物で行われます。この選択は、正確な評価から生じる。ピリジンには2つの利点があります。まず、約22.1 MPa1/2 のヒルデブラントパラメータを特徴とする溶媒を選択すると、リグニン可溶化45を単純化し、増幅する。その結果、溶媒としてのピリジンの添加は、ヒルデブラントのパラメータが21.7に等しい、したがって最適である。第二に、TMDPとヒドロキシ基の反応は、リグニン・ホスホラン誘導体のファシリティ形成に対する付随的な負の意味を有する副生成物としての塩酸(HCl)の形成を伴う。このため、結果の HCl を中和する必要があります。有意な過剰に存在する場合、ピリジンの塩基性は、TMDPに対して、HClの中和(ピリジン塩酸塩の形成を介して)を可能にする。
推奨ピリジン/重水素化クロロホルムバイナリ溶媒システムの使用は、3つの理由に基づいています。まず、サンプル溶解を好む。第二に、ピリジン塩酸塩がクロロホルムに可溶であるように、最終スペクトルの沈殿および劣化を防止できる。第三に、重水素化クロロホルムは、取得プロセス中にNMR分光計のロックを可能にする、そのユニークなシングル信号のために選択されます。サンプル誘導体化は、内部標準の存在下で行われます。このようにして、サンプルと標準が誘導体化されるとき、サンプルと標準のピークの積分の比較により、ヒドロキシ基の種類ごとに量を定量化することができます。様々な化合物が内部標準として考えられてきました。これらの化合物は、分子当たりの単一のヒドロキシ基によって特徴付け、誘導体化後の 31P NMRスペクトルにおいて単一の鋭いシグナルを提供する。標準の選択は慎重に行う必要があります。その信号は、導出されたサンプルのものと重複してはなりません。コレステロールは、初期の時代に広く使用されました。しかし、脂肪族ヒドロキシ基から生じるシグナルとの部分的な重複は、その使用を制限する。ルーチン分析のために、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシミド(NHND)の内部標準溶液が好ましい。しかし、NHNDの不安定性のために、その標準的なソリューションは、数日46のためにのみ保存することができます。
Protocol
次のフローチャート(図6)は、リグニンとタンニンの 31P NMR分析を行う実験プロトコル全体を概説しています。
1. サンプル前処理
- 40°Cにセットした真空オーブンで、検体(リグニンまたはタンニンサンプル)のアリコート(約100mg)を一晩乾燥させます。
注:40°Cより高い温度は、検査されたポリフェノールの敏感な構造を化学的に変化させる可能性があるため、温度選択に特に注意が必要です。 - 乾燥後、室温になるまで、試料を無水硫酸デシケーターに迅速に移す。このステップは、環境から湿度を吸収するサンプルを避けるために必須です。
2. 溶剤溶液調製
- 無水ピリジンと重水素化クロロホルムを1.6/1(v/v)比で混合して、20 mLサンプルバイアルでピリジン/重水素化クロロホルム溶媒混合物を調製します。
注意:ピリジンと重水素化クロロホルムを操作しながら注意してください。これらの化合物は、可燃性、有害、および毒性があります。適切な手袋を使用して、換気の良いフュームフードで溶液を準備し、使用してください。 - 5〜8gのよく洗浄し、乾燥した活性化5A分子篩を3.2mmペレットに加え、水の痕跡を取り除きます。また、中隔キャップの使用は、溶媒システムの空気接触および水分汚染を防ぐために強く推奨されます。準備した溶液を暗闇の中に保管してください。
3. 内部標準ソリューション(IS)の準備
- 2 mL のエルレンマイヤーフラスコで、あらかじめ調製した溶媒にクロム(III)アセチルアセトネート(約10 mg)および内部標準(約 35.8 mg の NHND または 77.3 mg のコレステロール)の 0.1 M 溶液を調製します。
注意: クロム(III)アセチルアセトネートは有害です。その操作中に、適切な手袋を着用してください。 - IS ソリューションに追加された IS の正確な重みを記録します。
- 活性分子篩(ポイント2.2参照)を含む密閉キャップを装備したバイアルでIS溶液を移し、40°Cの暗闇の中に保管します。
4. NMR サンプル溶液調製
- 2 mL バイアルに30mgのサンプルを正確に秤量し、攪拌棒を装着します。中隔キャップでバイアルを密封します。
- サンプルバイアルに0.5mLの溶剤系溶液を加えます。
- マイクロピペットを介してサンプルバイアル内のIS溶液の100 μLを移動します。得られた分散液(500rpm)を全てのリグニンまたはタンニンが溶解するまで磁気的に攪拌し、透明な溶液を得る。
注: 完全なサンプルの可溶化が不可欠であるため、この手順は最大 12 時間かかる可能性があります。 - TMDPの0.1 mLをサンプル溶液に移します。サンプルを激しい磁気攪拌下に置きます。サンプル溶液を密閉してください。適切な手袋を着用しながら、換気の良い発煙フードにTMDPを使用してください。
注意: TMDPとその蒸気は腐食性、有害、水との迅速な相互作用です。
注:黄色の沈殿物の形成は、サンプルまたはピリジン/クロロホルム溶液中の水痕に起因します。このような場合、可能なすべての水分汚染を回避することによって手順を繰り返さなければならない。 - パスツールピペットを使用して、サンプル溶液をNMRチューブに移します。
5. NMR分析
- チューブをNMR機器にロードします。この分析を行うために使用される分光計は、広帯域プローブを必要とします。
- 表11に示した設定に従って実験パラメータを修正する。
| パルスプログラム | 逆ゲートデカップリングパルス(zgig) |
| 核 | 31P |
| スペクトル幅 | 午後100.m。 |
| 取得時間 | - 0.8 s |
| リラクゼーション遅延 | ≥ 10 s |
| スキャン番号 | 64以上 |
| スペクトラムセンター | 午後140時.m。 |
表1:誘導体化リグニンまたはタンニンの31 P NMRスペクトルを記録する実験パラメータ。
- 重水素化クロロホルムの共振周波数を用いて分光計周波数を設定し、試料をシムし、分光計を調整する。次に、取得を開始します。
6. スペクトル処理と解析
- 以下の手順に従って、適切な標準ソフトウェアにより 31PNMR生データを処理する。
- フーリエ変換を実行します。
- 手動位相補正によるフェーズの調整 (処理|位相補正|手動修正)。
- ベースラインを手動で修正し、慎重にゼロポイントを設定(処理|ベースライン|マルチポイントベースライン補正)。
- 信号キャリブレーション。
- 132.2 ppmの化学シフト値でホスファイレート水の信号を設定します(分析|リファレンス|リファレンス)。
注: 175 ppm でシャープな31P 信号が存在するのは、TMDP の超過によるものです。その存在はサンプルの完全な誘導を保障する。このピークがない場合は、徹底的なサンプルと溶媒乾燥を提供し、より多くのTMDPを追加することによって、手順全体を再検討する必要があります。これが保証されると、スペクトルはスペクトル範囲132から約150ppmでズームされます(図7)。
- 132.2 ppmの化学シフト値でホスファイレート水の信号を設定します(分析|リファレンス|リファレンス)。
図7:過剰なTMDPの存在を確認する:それが見えるならば、サンプルの誘導体化は完了した。 スペクトルは分析することができます。155と132 ppmの間のスペクトル範囲でそのズームを行うには。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 統合
- 内部標準を 1.0 に設定して統合を標準化する ( ピーク |整数|の編集正規化: 1.00)。以下の表に示す化学シフトに従ってスペクトルの統合を行う。リグニンの 場合は表 2、 タンニンの 場合は表 3 を使用します。
| 官能基 | ケミカルシフト(ppm) |
| 脂肪族OH | 149.0-146.0 |
| フェノールOH | 144.0-137.4 |
| C5置換フェノールOH | 143.0-140.2 |
| 5-5' フェノール OH | 141.7-140.2 |
| 注射器 OH | 143.2-142.7 |
| 4-O-5' OH | 142.8-141.7 |
| グアイアシルOH | 140.2-138.8 |
| p-ヒドロキシフェニル OH | 138.8-137.4 |
| クー | 136.0-133.6 |
| トリシン | 137.0-136.0 |
表 2:31PNMR化学シフトはリグニンホスファニル化OH基に対する。
| 官能基 | ケミカルシフト(ppm) |
| リングA | |
| o-置換されていないフェノール | 137.9–137.4 |
| o 置換フェノール | 138.8–137.9 |
| リングB | |
| カテコール OH | 140.2–138.8 |
| ピロガロール OH | 144.0–140.2 |
| リングC | |
| アリファティク OH | 146.0–145.0 |
表3:タンニンホスファチレートOH基に対する31P NMR化学シフト。
注:標準のスペクトル処理ソフトウェアを使用して、化学シフトの定義済み領域を統合するように設定することができます。この機会は、いくつかのスペクトルを処理する必要がある場合に有利です。
7. 機能グループの定量化
- IS溶液の濃度を計算します。
- 特定の信号の等価量を計算します。
Representative Results
記載されたプロトコルは、リグニンとタンニンの分析の両方に適用することができる。リグニン化学では、この方法は、異なる種類のヒドロキシ基の検出と定量を可能にするため、基本的な方法です。図8A-Dは、異なる周波数で働く分光計で獲得したリグニンとタンニンの31P NMRスペクトルの例を示す。図8Aに示すスペクトルは300MHzのNMR分光計を用いて記録され、図8Dは700MHzのNMR計測器で記録された。
図8:(A)針葉樹クラフトリグニンの定量31P NMRスペクトル(30.8mgのリグニンで300MHz分光計で記録されたスペクトル)、(B)針葉樹リグノスルホン酸(300MHz分光計で記録されたスペクトルは30.1mgの リグノスルホン酸をリグノスルホン酸に保存した後のリグニン、(C)アカシアタンニン(30.3 mgサンプル上の300MHz分光計で記録されたスペクトル)と(D)針葉樹クラフトリグニン(700MHz分光計で記録されたスペクトル)7.2 mgのリグニン)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
これらのスペクトルは慎重に記録され、手動で処理されました。脂肪族(150-145 ppm)、芳香族(145-137 ppm)、およびカルボキシカル(136-134 ppm)ヒドロキシ基の典型的な信号は非常によく解決され、容易に統合される。スペクトルウィンドウが開いている場合(95~190ppm、 図8)、3つの鋭い強いピーク(175、144、および132ppm)が明らかになっています。これらは、TMDPの過剰、内部標準(コレステロールまたはNHND)、およびヒドロキシル化TMDP(水痕跡によって引き起こされる)に起因する。
クラフトおよびオルガノゾルリグニンとは対照的に、リグノスルホン酸はピリジン/クロロホルム混合物に不溶性である。信頼できる 31PNMRスペクトルを得るためには、溶解性が必須である。この問題を克服するために、リグノスルホン酸は、誘導体化前に対応するリグノスルホン酸に変換することができる。リグノスルホン酸溶液を強酸(すなわち硫酸)で処理する、または酸交換樹脂(例えば、ダウエックス1H、強酸カチオン交換器)は、それらの酸性形態におけるすべてのスルホン酸基の変換を駆動する。得られた製品は、このプロトコルを使用して分析した選択性吸着性樹脂(XAD-7、分子量を特徴とする化合物を分離するために使用される極性吸着剤.m.mです。 図8B は、TMDP誘導体化リグノスルホン酸の定量 31PNMRスペクトルを示す。この場合でも、ヒドロキシ基の異なるシグナルが明らかである。 図8C は、TMDPを用いて誘導体化されたタンニン試料の代表的な定量 31PNMRスペクトルを示す。異なる脂肪族OH(リングC)、ピロガロール、および環Bのカテコール単位とリングAの単位からの特徴的な信号は、よく見える。
Discussion
記載された方法は、Argyropoulos37,38,39,40,41,42によって開発されたリグニンの定性的および定量的特徴付けを目的とした分析プロトコルの実施および最適化を表す。リグニン構造解明に利用できる他の多くの技術と比較して、この方法は、最もファシリティ、迅速、再現性の一つとして広く受け入れられています。湿式化学法(例えば、ニトロベンゼン、過マンガン酸酸化等)の妥当性は、作業者の良好な実験スキルに依存し、限定的なオペレータに効果的にこの方法を閉じ込める。さらに、いくつかの欠点を考慮して、湿式化学法の文献の補正因子に遭遇することは珍しくありません。記載された31P NMRプロトコルは、この容易に適用可能で、ユーザーフレンドリーで、広く利用可能な高度な実験スキルを必要としません。他の器械分析法と比較して、31P NMRはリグニンの異なるヒドロキシ基を正確に検出し、定量することができる唯一の技術である。例えば、FTIRは、1HNMRなどの様々なヒドロキシ基を同定するために使用することができる。しかし、これらの手法は、広範囲にわたる信号重複の問題により、信頼性の高い定量データを提供できないため、問題を起点とする。もう一つの広く使用されている技術は、まずGoldschmidによって報告されるUV-Vis分光法である。しかし、このアプローチは、脂肪族、芳香族、およびカルボキシ性OHs47の間で効果的に区別できないため、ヒドロキシ基の一般的な全体的な決定に限定される。
経済的な観点から 、31PNMR技術の唯一の制限は、TMDPの価格であり、比較的高価な試薬である。それはグラムあたり約190 USDの費用がかかります。したがって、分析コストが、ピリジン/クロロホルム混合物とオペレータ時間の混合物から派生するものを除いて、TMDPの価格にのみ近似される場合、それは分析ごとに約24米ドルに相当するであろう。この問題を解決するために、多くの研究所はTMDPを合成し、試薬コストを削減することに頼っています。これを行うために、ピナコールと三塩化リンは、トリエチルアミン44の存在下で反応する。技術的には、この反応は比較的簡単です。しかし、三塩化リンの使用と、十分に制御された真空蒸留を含むその作業に注意が必要です。TMDPの合成に関する詳細は、ご要望に応じて提供することができます。
このプロトコルは、容易さ、再現性、精度の点で最高のプロトコルの一つですが、いくつかの重要な点を強調する必要があります。まず、同定されたピリジン/クロロホルム混合物に完全に溶解する必要があります。この検討は、水酸基の定量的なホスフィチル化反応が完全に均一な条件下で行われる必要があるため、基本的なものです。サンプルの一部だけが可溶化されている場合、結果の分析は不正確になります。第二に、これらの変数は分析の精度と全体的な成功に悪影響を及ぼすので、検査するサンプルは水分と溶媒を含まない必要があります。湿度の痕跡は、2-ヒドロキシ-4、4'-5、5'-テトラメチル-1,3,2-ディオサフォスフォランを与えるTMDPと反応します。この化合物は淡黄色凝集塩であり、ピリジン/クロロホルム溶媒混合物に不溶性であり、不十分なNMRシグナル取得を引き起こす。サンプルの重量(30mg)が少ないため、分析前に正確に知られる正確な重量のために揮発性物質を含まない必要があります。
場合によっては、サンプル溶媒和の問題は、少量の共溶媒(すなわちジメチルホルムアミド)を添加することによって(特に高酸化性のサンプルの場合)、サンプル溶解を助ける(特に高酸化サンプルの場合)促進することができる。原則として、TMDPと相互作用しないすべての溶媒を使用して、サンプル溶解を助けることができます。共溶媒の選択は、試薬と反応するため、ラビイルヒドロキシまたはアミノ基を含む共溶媒を含むことはできません, 誤解を招く最終的なスペクトルを引き起こします.特に、ジメチルスルホキシドはまた、共溶媒としての使用を排除するTMDPと反応する。ピリジンベースのイオン液体は、例えば、1-アリル-3-ブチルピリジニウムの塩化物は、溶解性の問題が発生したときに使用することができます。しかし、イオン液体は再び乾燥する必要があります48.リグノスルホン酸(高スルホネーション度を特徴とするリグニン型)を溶解するために、中和された基をそれらの酸性形態に変換することを含む前処理が有用であることが実証された。リグノスルホン酸は、水性媒体中の酸性交換樹脂を用いて、それらの酸性条件に簡便に変換することができる。得られたリグノスルホン酸は、特定の樹脂(例えば、XAD-7)に対する吸着とエタノール中の脱着によって溶液から分離される。40°Cでの減圧によるエタノール溶液の蒸発により、リグノスルホン酸の単離が可能です。これらのリグニンは、プロトコルによって提案されたピリジン/クロロホルム混合物に可溶性であるため 、31P NMRによって特徴づけることができる。
穏やかな温度での長期の真空乾燥は、効果的に各サンプルの水分やその他の揮発性の量を減少させます。特に、少量の水は、TMDPが過剰に添加されるため、最終的なスペクトルに影響を与えません。また、場合によっては、NMRチューブまたはサンプルバイアルに存在する湿度から、少量の2-ヒドロキシ-4,5,5'-テトラメチル-1,3,2-ジオクサホスホレインが生じることがあります。これらの場合、攪拌は、形成された沈殿物の量を完全に溶解するのに十分である。2-ヒドロキシ-4,4'-5,5'-テトラメチル-1,3,2-ジオクサフォスホレインが多量に形成された場合、サンプル調製を繰り返し、乾燥処理を改善することが示唆される。例えば、使用前に、すべてのガラス製品は、ヒートガンで短時間加熱することができます。
スペクトルを記録するために使用されるスペクトル範囲は、異なるヒドロキシル基に関する信号の対象領域と比較して広い。ただし、これは、サンプル誘導体化が正常に発生したかどうかを理解することが義務付けられています。完全なサンプル誘導体化の確認は、174 ppm前後の強い信号の存在によって与えられる。この急激なピークは未反応のTMDPによるものであり、その存在は試薬が過剰に存在することを保証し、したがって、すべてのヒドロキシル基が誘導体化された。このピークが存在しない場合、(1)使用されるTMDPの量がサンプルの完全な誘導体化を行うには不十分である、または(2)サンプル中に高い量の水が存在する2つの最も可能性のある原因である。最初のケースでは、TMDPの量を多く使用すると、サンプルの完全な誘導体化が保証され、174 ppmの信号が表示される可能性があります。第2の場合、試料はより広範囲に乾燥すべきである。過剰なTMDPが確保されれば、ピーク統合が行われる。この操作を行う前に、対象の信号を閉じ込める狭いウィンドウ (150 ~ 132 ppm) にズームします。
分析するサンプルの量(〜30mg)は、上記の実験プロトコルで報告され、300MHzNMR分光計以上に対して良好な品質スペクトルを収集するように選択されている。しかし、500MHz以上の磁場磁石を使用すれば、サンプル量を減らすことが可能と見なされています。例えば、 図8Dでは、7.2mgのリグニンを用いて調製したサンプルのNMRスペクトル(700MHzの計測器から生じる)が示されている。このスペクトルのシグナル集積は、リグニンの量を多く使用する場合に得られるものと同じ結果を提供する。この事実は、少量の製品が利用可能なすべての研究に対して、このプロトコルの適用性を増幅します。
全体的に見て、リグニンやタンニンに存在する様々なヒドロキシ基の起源と運命を理解する場合、この実験プロトコルは多くの研究開発アプリケーションに適用することができます。特に、GPCおよびHSQCデータと結合すると、結果のデータはリグニンまたはタンニンの構造についてさらに詳しく調べ、推測する機会を提供する。リグニンまたはタンニンのヒドロキシ基に化学修飾が適用される多くの場合、定量 的な31P NMR分析は、これらの修飾が発生したかどうか、どの程度に起こったかを検出するために非常に貴重です。例えば、 図9 は、その酸化の前後に同じリグニンの2つのNMRスペクトルを示しています。単純な定性的評価は、酸化時の脂肪族基と芳香族ヒドロキシ基の両方の減少を示し、貴重な情報と指導を提供します。
図9:定量31PNMRスペクトルは、TMDP(A)前および(B)を用いて誘導体化した同一のオルガノソルブリグニンのスペクトルを、その酸化をポストする。スペクトルは、300 NMR分光計を用いて記録した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
結論として、この技術は、ポリフェノール、OHベアリングリグニン、タンニン(さらには合成ポリマー)49、50、51を扱う問い合わせが生物学からポリマー、医薬品アプリケーションに至るまで、様々な分野で行われる必要がある場合、最も重要で強力なツールの中にあるというすべての属性を有する。
Disclosures
クラウディア・クレストリーニとディミトリス・S・アルギロプーロスは、すべての著者(C.C.、N.P.、D.S.A.)に利益相反がないことを保証します。
Acknowledgments
この活動は、カナダのパルプ・アンド・ペーパー研究所、マギル大学モントリオール、カナダ自然科学工学研究評議会、国立科学財団米国、米国農業省、ソルベイ社などの組織を含む様々な金融賞によって支えられてきました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 - 1000 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0866 | |
| 20 - 200 µl Eppendorf micropipette | VWR | 613-0865 | |
| 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% | Sigma-Aldrich | 447536 | |
| Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) | Precisa | LX220 A | |
| Binder Vacuum Oven | Binder | VD53 | |
| Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 | Sigma-Aldrich | 29651-U | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| Cholesterol, Sigma-grade | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Molecular sieves, 4A | Sigma-Aldrich | 208604 | |
| N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% | Sigma-Aldrich | 226378 | |
| NMR spectrometer, 300 MHz | Bruker | ||
| Norell natural quartz 3 mm NMR tubes | Sigma-Aldrich | NORS33007 | |
| Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) | VWR | 613-0342 | |
| Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) | VWR | 613-0239 | |
| Pyridine, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| Stirring bars,micro, 3 mm lenght | VWR | 442-0360 | |
| Stirring bars,micro, 6 mm lenght | VWR | 442-0362 | |
| Triphenylphospine oxide, 97% | Sigma-Aldrich | T84603 | |
| Vials for environmental analysis, WHEATON, 20.00 mL | DWK Life Sciences | WHEAW224609 | |
| Weighing paper, grade 531 | VWR | 516-0318P |
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