Summary
Vi ændrede Marmarou vægtdråbemodellen for voksne zebrafisk for at undersøge en bredde af patologier efter stump-force traumatisk hjerneskade (TBI) og de mekanismer, der ligger til grund for efterfølgende neuronal regenerering. Denne stump-kraft TBI model er skalerbar, inducerer en mild, moderat, eller svær TBI, og opsummerer skade heterogenitet observeret i human TBI.
Abstract
Blunt-force traumatiske hjerneskader (TBI) er den mest almindelige form for hovedtraume, som spænder over en række sværhedsgrader og resulterer i komplekse og heterogene sekundære virkninger. Mens der ikke er nogen mekanisme til at erstatte eller regenerere de tabte neuroner efter en TBI hos mennesker, zebrafisk besidder evnen til at regenerere neuroner i hele deres krop, herunder hjernen. For at undersøge bredden af patologier, der udvises i zebrafisk efter en stump kraft TBI og for at studere de mekanismer, der ligger til grund for det efterfølgende neuronalt regenerativt respons, ændrede vi det almindeligt anvendte gnaver Marmarou vægtfald til brug i voksne zebrafisk. Vores enkle stump-kraft TBI model er skalerbar, fremkalde en mild, moderat, eller svær TBI, og recapitulates mange af de fænotyper observeret efter menneskelige TBI, såsom kontakt- og posttraumatiske anfald, ødem, subdural og intracerebral hæmatomer, og kognitive funktionsnedsættelser, hver vises i en skade sværhedsgrad-afhængige måde. TBI sequelae, som begynder at dukke op inden for få minutter efter skaden, stilne af og vende tilbage til næsten ubeskadigede kontrolniveauer inden for 7 dage efter skaden. Den regenerative proces begynder så tidligt som 48 timer efter skade (hpi), med peak celle spredning observeret af 60 hki. Således producerer vores zebrafisk stump kraft TBI-model karakteristiske primære og sekundære skade TBI patologier svarende til human TBI, som giver mulighed for at undersøge sygdomsdebut og progression sammen med mekanismerne for neuronal regenerering, der er unik for zebrafisk.
Introduction
Traumatiske hjerneskader (TBI) er en global sundhedskrise og en førende årsag til død og handicap. I USA oplever ca. 2,9 millioner mennesker en TBI hvert år, og mellem 2006-2014 steg dødeligheden på grund af TBI eller TBI-følgevirkninger med over 50%1. Men, TBIs varierer i deres ætiologi, patologi, og klinisk præsentation skyldes i høj grad delvis til dels til skadesmekanismen (MOI), som også påvirker behandlingsstrategier og forudsagt prognose2. Selvom TBIs kan skyldes forskellige MOI, de er overvejende resultatet af enten en gennemtrængende eller stump-kraft traumer. Gennemtrængende traumer repræsenterer en lille procentdel af TBIs og generere en alvorlig og fokal skade, der er lokaliseret til den umiddelbare og omkringliggende spiddet hjerne regioner3. I modsætning hertil, stump-kraft TBIs er mere almindelige i den almindelige befolkning, spænder over en række sværhedsgrader (mild, moderat, og svær), og producere en diffus, heterogen, og global skade påvirker flere hjerne regioner1,4,5.
Zebrafisk (Danio rerio) er blevet brugt til at undersøge en bred vifte af neurologiske fornærmelser spænder over centralnervesystemet (CNS) 6,7,8,9. Zebrafisk har også, i modsætning til pattedyr, en medfødt og robust regenerativ reaktion på at reparere CNS damage10. Nuværende zebrafisk traumer modeller bruger forskellige skade metoder, herunder penetration, excision, kemisk fornærmelse, eller trykbølger11,12,13,14,15,16. Men hver af disse metoder udnytter en MOI, der sjældent opleves af den menneskelige befolkning, er ikke skalerbar på tværs af en række skade sværhedsgrader, og ikke løse heterogenitet eller sværhedsgrad-afhængige TBI følgevirkninger rapporteret efter stump kraft TBI. Disse faktorer begrænser brugen af zebrafiskmodellen til at forstå de underliggende mekanismer i patologierne forbundet med den mest almindelige form for TBI i den menneskelige befolkning (milde stumpe kraftskader).
Vi havde til formål at udvikle en hurtig og skalerbar stump kraft TBI zebrafisk model, der giver muligheder for at undersøge skade patologi, progression af TBI følgevirkninger, og den medfødte regenerative respons. Vi ændrede den almindeligt anvendte gnaver Marmarou17 vægtdråbe og anvendte den på voksne zebrafisk. Denne model giver en reproducerbar vifte af sværhedsgrader lige fra mild, moderat, til svær. Denne model også generoler flere facetter af menneskelige TBI patologi, i en sværhedsgrad-afhængige måde, herunder anfald, ødem, subdural og intracerebral hæmatomer, neuronal celledød, og kognitive underskud, såsom læring og hukommelse værdiforringelse. Dage efter skade, patologier og underskud spredes, vender tilbage til niveauer, der ligner ubeskadigede kontrol. Derudover, denne zebrafisk model viser en robust spredning og neuronal regenerering svar på tværs af neuroaxis om skade sværhedsgrad.
Her giver vi detaljer mod opsætning og induktion af stump-force traumer, scoring posttraumatisk anfald, vurdering af vaskulære skader, instruktioner om forberedelse af hjerne sektioner, tilgange til kvantificering ødem, og indsigt i den proliferative reaktion efter skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafisk blev opdrættet og vedligeholdt i Notre Dame Zebrafish facilitet i Freimann Life Sciences Center. De metoder, der er beskrevet i dette manuskript blev godkendt af University of Notre Dame Animal Care and Use Committee.
1. Traumatisk hjerneskade paradigme
- Tilsæt 1 mL 2-phenoxyethanol til 1 L systemvand (60 mg Instant Ocean i 1 L deioniseret RO-vand).
- Forbered en besat opvindingstank, der indeholder 2 L systemvand ved stuetemperatur.
- Vælg den ønskede vægt af kugleleje og en ønsket længde og diameter af stål / plast slanger og bestemme energi og slagkraft.
BEMÆRK: Slangen skal have en indvendig diameter, der gør det muligt for kuglelejet at passere igennem uden at ændre sin vej eller bevægelseshastighed.- Bestem den kinetiske energi ved nedslag:
Hvor, KE = kinetisk energi, m = masse (i kg), g = gravitationskraft, h = højde (i m) fra dråbepunkt til fisk.
BEMÆRK: Dette giver kinetisk energi i J. Multiplicer værdien med 1.000 for at bestemme mJ. KE er baseret på et accelererende objekt, som opstår, når kuglelejet tabes fra en stationær position. - Generer en mild TBI (miTBI) ved hjælp af 7,62 cm lang stål / plast slanger, der ender 1,5 cm over pladen på zebrafisk kraniet (samlet afstand 9,1 cm) og en 1,5 g (6,4 mm diameter) kugleleje. Disse producerer en kinetisk energi på 1,33 mJ. Denne skade blev empirisk besluttet at svare til en miTBI baseret på centrale patofysiologiske TBI markører, såsom vaskulær skade, subdural / intracerebral hæmatom dannelse, neuronal celledød, og kognitive funktionsnedsættelser, der stort set rekapituleret, hvad der blev rapporteret i den menneskelige befolkning i en sværhedsgrad-afhængige måde.
- Beregn kinetisk energi miTBI =
- Generer en moderat TBI (moTBI) ved hjælp af 12,7 cm lang stål /plastrør, der slutter 1,5 cm over pladen på zebrafisk kraniet (samlet afstand 14,2 cm) og en 1,5 g (6,4 mm diameter) kugleleje, der producerer kinetisk energi på 2,08 mJ.
- Beregn kinetisk energi moTBI =
- Generer en alvorlig TBI (sTBI) ved hjælp af 7,62 cm lang stål /plast slanger, der ender 1,5 cm over pladen på zebrafisk kraniet (samlet afstand 9,1 cm) og en 3,3 g (8,38 mm diameter) kugleleje, der producerer en kinetisk energi på 2,94 mJ.
- Beregn kinetisk energi sTBI =
- Bestem den kinetiske energi ved nedslag:
- Fyld en petriskål med modellerings ler (figur 1, trin 1) og brug et stumpt instrument (dvs. bagsiden af et par sammentrækninger) til at skabe en hævet platform (5 cm x 1,5 cm) med ekstra modellerings ler (figur 1, trin 2).
- Brug et barberblad til at opdele den hævede platform på langs i to omtrent lige store halvdele (Figur 1, trin 3, rød stiplet linje). Form de to halvdele til en kanal, der rummer længden af en voksen fisk (Figur 1, trin 4). Brug ekstra ler til at bygge vægge, der vil sikre ~ 2 / 3 af fiskekroppen, hvilket efterlader hovedet udsat.
- Form en lille støtte i det udsatte hovedområde vinkelret på væggene for at støtte hovedet for at undgå rotation eller rekyl af hovedet ved skade (Figur 1, trin 4).
BEMÆRK: Kanalen skal være dyb nok til at støtte fisken i en rygsalstilling, men bør stadig tillade hovedet at hvile over det omgivende ler. Derudover skal hovedstøtten følge fiskens naturlige krumning og støtte den nedre underkæbe og gæller. - Sørg for, at den tabte vægt ikke hæmmes af kanalens sider (figur 1, trin 4).
- Opret en stålskive med en diameter på 3 mm ved hjælp af en minihulsstans og 22 g stålblitz. Hver disk kan bruges flere gange.
- Bedøve en fisk ved at placere den i et bægerglas med 50-100 mL af 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) 2-phenoxyethanol, indtil det ikke reagerer på hale knivspids.
- Placer fisken, rygsiden op, på lerformen i kanalen, så kroppen er fastgjort på siderne og læg en 3 mm 22 g stålskive på hovedet, centreret over det ønskede slagpunkt (Figur 1, trin 5).
- Sørg for, at fisken er justeret så vinkelret som muligt for at undgå, at hovedet vipper til den ene side, hvilket kan forårsage en ujævn påvirkning.
- Fastgør stål/plastrør ved hjælp af en standard ringstativ og armklemme, så bunden af slangen er 1,5 cm over zebrafiskens hoved (Figur 1, trin 6). Sørg for, at slangen er lige.
- Kig ned slangen og sørg for, at slangen er justeret over stålpladen.
- Kast kuglelejet (1,5 g for mild og moderat TBI og 3,3 g for svær TBI) fra en forudbestemt højde (beskrevet i trin 1.3.3-1.3.5) ned på slangen på stålpladen placeret over den ønskede neuroanatomiske interesseregion (f.eks. lillehjernen, figur 1, trin 5) for at producere den stumpe kraft TBI for den ønskede alvorlig skade. Placer de tilskadekomne fisk i en genopretningstank, der skal overvåges.
BEMÆRK: Afhængigt af alvorligheden af skaden kan der forekomme dødelighed eller tonisk-kloniske anfald. Hvis fisken ikke reagerer i en længere periode efter TBI, skal du bruge en overførselspipette eller pincet til at administrere en hale-knivspids og evaluere for et smerterespons.
2. Scoring anfald post-TBI i den voksne zebrafisk
- Bedøve og skade fisken i henhold til skadesprotokollen, der er skitseret i afsnit 1, og placere den skadede fisk i en bevandet genopretningstank på 2 L systemvand.
- Overhold fisken for tegn på posttraumatiske anfald, der begynder umiddelbart efter at være blevet placeret i genopretningstanken. Indstil en observationstid (dvs. 1 time) og registrer al beslaglæggelsesaktivitet, herunder krampeanfaldsscoren (beskrevet nedenfor), varigheden af hvert anfald og procentdelen af fisk, der oplevede anfald (figur 2A).
BEMÆRK: Anfald kan forekomme umiddelbart efter skade, samt timer eller dage efter TBI. Anfald kan vare på lang sigt, og en enkelt fisk kan have flere anfald. Fastsættelse af en observationstid på 1 time eller derover vil give en god repræsentation af den generelle tendens i beslaglæggelse satser. - Score fisk ved hjælp af Mussulini18 retningslinjer for voksne zebrafisk beslaglæggelse fænotyper.
BEMÆRK: Uden at bruge sporingssoftwaren er det svært at vurdere beslaglæggelsesscorer under 3 upartisk. Derfor bør kun beslaglæggelsesscorer på 3 eller derover registreres, når vurderingen udføres uden software.
3. Hjerne dissektion
- Aflive fisk i en 1:500 (2 mL/1 L, 0,2%) opløsning af 2-phenoxyethanol, indtil gællebevægelser ophører, og de er ikke-aktive for at fin klemme, på det ønskede endepunkt.
- Fyld en petriskål med modellering ler og skabe et lille hulrum til at støtte kroppen under dissektion.
- Placer fisken, rygsiden op, i lerformen. Placer en dissektionsnål gennem midterlinjen halvvejs ned i fiskens krop og en anden pin ~ 5 mm bag bunden af hovedet.
- Under et dissekeringslymikroskop afskærer du synsnerven rent ud med et par #5 Dumont-sammentrækninger og fjern øjnene (Figur 2A).
- Orienter fisken, så rostralden er længst, når man ser gennem mikroskopet (figur 2B).
BEMÆRK: Følgende trin er for højrehåndede personer. Venstrehåndede personer foretrækker måske at udføre følgende trin i en spejlet retning. - Brug #5 sammenkraktioner til langsomt at placere den ene ende af sammenknetterne under højre parietalplade, hvilket gør en bevidst saksehandling, der bevæger sig mod rostralden og fjerner højre parietal- og frontalplader (Figur 2C).
- Hold sammenkæverne i en vinkel på 45° eller lavere for at undgå at trænge ind i hjernen under dissektion.
- Drej fisken 90° med uret. Placer den ene ende af # 5 sammentrækninger under venstre parietal plade og bruge den samme saks bevægelse til at fjerne venstre parietal og frontal plader udsætter hele dorsal aspekt af hjernen (Figur 2D, E).
- Overfør maxillaen direkte med #5 sammenkriskere. Bevar de olfaktoriske pærer og beskadige dem ikke, hvis dette er det område af interesse.
- Fjern højre operkel, foroperkel, interoperkel og underoperkel med #5 sammenkædninger (Figur 2F).
- Rent ud resect muskulaturen i den kauudale ende af calvarium åbning ved hjælp af # 5 sammentrækninger, udsætter rygmarven.
- Rent transect rygmarven med # 5 kraft. Placer forsigtigt sammenkøjninger under hjernen og fjern forsigtigt hjernen fra calvariumet.
BEMÆRK: Knib aldrig hjernen. Brug sammenkævninger til at "vugge" hjernen eller resect caudally og udnytte den udsatte rygmarv som en knivspids punkt at manøvrere hjernen. - Fix de fjernede hjerner i 9 dele 100% ethanol til 1 del 37% formaldehyd natten over ved 4 ° C på en rocker platform.
4. Ødem undersøgelser i zebrafisk hjernen
- Bedøve og skade fisk i henhold til skadesprotokollen, der er skitseret i afsnit 1, og lad fisken komme sig i en genopretningstank, indtil de begynder at svømme frit.
- Placer fisk tilbage i de normale boligforhold efter skade i 1 dag.
- Aflive fisken i 1:500 2-phenoxyethanol, efter tiden er gået.
- Dissekere hele hjernen eller regionen af interesse i henhold til protokollen skitseret i afsnit 3 og placere hjernen straks på en lille vejer båd.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når du overfører hjernen, ved hjælp af fine sammentrækninger til forsigtigt at placere den på vejebåden uden at stikke eller skrabe hjernen, hvilket kan resultere i tab af væv. - Label (med skade gruppe og hjerne nummer) og tare en ekstra lille tørring vejer båd på en skala. Brug en skala med mulighed for at måle mindst 0,001 g for at få en nøjagtig måling.
- Overfør hjernen til den tjærede tørring vejer båd og registrere den våde vægt af hjernen. Orient hjernen, så de lægger sig fladt på vejebåden med rygsiden vendt op.
- Tørringsvægten og hjernen placeres i en hybridiseringsovn, der er indstillet til 60 °C i 8 timer.
- Efter tørring kan hjernen holde sig til tørringsvægtbåden og kan være vanskelig at fjerne og overføre til en ny tjæret lille vejebåd. Undgå at klemme hjernen med sammentrækninger, da dette kan resultere i skader på den tørre hjerne og tab af væv. Klem i stedet de fine sammentakter sammen, og start ved den ventrale side af hjernen, scoop i en opadgående bevægelse.
- Bestem vandindholdet i hver hjerne ved hjælp af formlen (figur 4):
5. Mærkning cellulær spredning på tværs af neuroaxis og forberede fast væv.
- Klargør 10 mM 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) i 2 mL ddH2O.
- Bedøve 3 til 4 fisk ad gangen i 50-100 mL af 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) 2-phenoxyethanol, indtil fisken ikke reagerer på hale knivspids, på det ønskede tidspunkt efter skade (ved hjælp af protokollen beskrevet i afsnit 1).
- Lav et delvist snit på en våd svamp og læg en fisk ad gangen i åbningen, ventral side op.
- Brug en 30 G nål til at injicere ~40 μL på 10 mM EdU i fiskens krop. Returner fisken til en bedrift tank fyldt med systemvand.
BEMÆRK: Gentagne injektioner kan udføres på forskellige tidspunkter for at mærke et større antal spredte celler og kan være nødvendige, hvis der ønskes en jagtperiode på mere end 1 uge. - Saml hjerner som skitseret i afsnit 3 og placere dem som en gruppe i en 5 ML glas hætteglas, der indeholder 2 mL af 9 dele 100% ethanol til 1 del 37% formaldehyd. Fastgør hjernen ved 4 °C på en rockerplatform.
BEMÆRK: En rocker eller shaker platform forbyder hjerner fra at hvile i bunden og telencephalon af hele hjerner fra curling. - Rehydrere hjerner, i samme glas hætteglas bruges til at fastsætte hjerner, i vasker af faldende ethanol-serien, 75%, 50% og 25%, for 15 minutter hver, efterfulgt af en 1,5 h vask i 5% saccharose / PBS på en rocker ved stuetemperatur. Opbevar hjernen i et glasglas natten over i 30% saccharose/PBS ved 4 °C på en rockerplatform.
- Fjern hjerner fra 30% saccharose/PBS og overfør dem med sammentrækninger til en 12-brønds plade (en behandlingsgruppe pr. brønd) med brønde fyldt med en 2:1 opløsning bestående af 2 dele vævsfrysningsmedium og 1 del 30% saccharose /PBS. Inkuber hjernen natten over ved 4 °C på en rockerplatform.
- Overfør hjerner til den næste række af brønde i de 12-brønds pladedykkede hjerner i 100% TFM i 2-24 timer ved 4 °C.
- Brug en kryostat chuck til at integrere hjernen i TFM i den ønskede orientering på tøris.
- Udfør kryosektion (16 μm tykke sektioner) og indsamle sektioner på positivt ladede dias. Tør dias på en glidevarmer i 1 time og opbevares derefter ved -80 °C eller fortsæt med immunohistochemistry.
- Forbered en hydrofob barriere på diaset rundt om vævssektionerne og lad det tørre på en diasvarmer i 20 minutter.
- Vask kortvarigt diasene i PBS i 5 min og derefter to gange i PBS-Tween 20 (0,05%) i 10 min hver.
- Udfør EdU-detektion ved hjælp af EdU Cell Proliferation Kit og producentens instruktioner.
- Analysere dias og kvantificere fluorescerende EdU-mærkede celler ved hjælp af enten en epifluorescent mikroskop eller en konfokal mikroskop. Der kræves mindst et 40x-mål for klart at skelne mellem de enkelte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forberedelse af skade-induktion rigg giver mulighed for en hurtig og forenklet middel til at levere en skalerbar stump-kraft TBI til voksne zebrafisk. Den graduerede sværhedsgrad af skadesmodellen giver flere let identificerbare målinger af vellykket skade, selvom vaskulær skade er en af de nemmeste og mest fremtrædende patologier (figur 3). Den belastning af fisk, der anvendes under skaden, kan gøre denne indikator lettere eller sværere at identificere. Ved anvendelse af abfisk af vildtypen (WTAB, figur 3A-D) kan identifikation af vaskulær skade være vanskelig at skelne mellem enten miTBI eller moTBI og ubeskadigede kontrolfisk på grund af pigmenteringen (figur 3A-C). Efter skade udviser miTBI-fisk minimale overfladeafskrabninger (figur 3B), mens moTBI udviser begrænset hjerneblødning (Figur 3C). Selv om sTBI stadig kan være udfordrende, er omfanget af skader ofte tydeligt (figur 3D). I modsætning hertil er det let at identificere vaskulær skade ved brug af albino (figur 3E-H) eller casperfisk (figur 3I-L). Derudover observeres der ofte slaganfald efter skades- og krampeanfald blandt gruppen er en anden repræsentativ skadesmåling (tabel 1). Skadet fisk vil vise tonisk-kloniske anfald (ataksi, ZBC 1,9, bøjning, ZBC 1,16, kredser, ZBC 1,32, og proptrækker svømning, ZBC 1,37)19, der er let observeres efter skade, uanset baggrund stamme. Anfald vil blive observeret med stigende prævalens i forhold til sværhedsgraden. Efter skade udviser miTBI ikke anfaldslignende adfærd; MoTBI vil dog udvise beslaglæggelsesadfærd (10,66 % ± 1,37 %, p < 0,0001, tabel 1), og forekomsten er yderligere forhøjet i sTBI-fisk (19,93 % ± 1,49 %, p < 0,0001, tabel 1).
Vellykket fjernelse af hjernen er afgørende for et utal af yderligere undersøgelser, såsom ødem og vurdering af cellespredning. Udfør dissektioner med den største omhu for at undgå at beskadige hjerneområder (oftest ved utilsigtet punktering) og for at bevare alle regioner (de olfaktoriske pærer kan let gå tabt). Efter hjernen dissektion procedure og skematisk (afsnit 3, Figur 2A-F) giver mulighed for en fuldstændig hjernefjernelse (Figur 2G, H). Efterforskere bør overveje, om deres analyse kræver hele hjernen, eller om en samling af specifikke hjerneområder kan passe til deres behov. Afhængig af sværhedsgraden af skaden og tidspunktet for indsamling, hjernen kan udvise vedhæftede subdural blødninger, men disse er ofte klæbet til undersiden af kraniet og tabt under dissektion. Hævelse af cerebrum er til tider tydelig, men på grund af anatomiske forskelle og variation i generel størrelse er ødem den bedste metode til at vurdere hævelse. Efter den beskrevne protokol (afsnit 4) udviser ubeskadigede hjerner et væskeindhold på 73,11 % ± 0,80 %, og miTBI, men lidt forhøjet, ikke vise en betydelig stigning i ødem ved 1, 3 eller 5 dpi (1 dpi: 76,33% ± 1,32%, p = 0,36, 3 dpi: 75,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,14 ± 1,50%, p > 0,99, Figur 4). I modsætning hertil havde både moTBI og sTBI et betydeligt ødem 1 dpi (moTBI: 80,55 ± 0,94%, p < 0,0001, sTBI: 86% ± 1,05%, p < 0,0001) og 3 dpi (moTBI: 78,11 ± 0,93%, p < 0,018, sTBI: 77,77% ± 1,02%, s < 0,036, figur 4). Imidlertid vendte væskeindholdet i både moTBI og sTBI tilbage til niveauer, der ligner ubeskadigede kontroller med 5 dpi (moTBI: 74,42 ± 1,25%, p > 0,99, sTBI: 73,85% ± 1,01%, p > 0,99, figur 4).
Cellespredning efter TBI i zebrafisk er en solid vurdering af skadens omfang. Mens cellen spredning svar er blevet undersøgt tidligere i zebrafisk efter andre former for hjerneskade9,12, i de fleste tilfælde, undersøgelsen var begrænset til skade site. Denne stumpe kraft TBI resulterer i en robust spredning svar spænder over neuroaxis. På en alvorlighedsafhængig måde (viste sTBI-data) observeres øget EDU-mærkning i forhjernens ventrikulære og subventrikulære zoner (telencephalon, figur 5B) i forhold til ubeskadigede kontroller (figur 5A). Da sektioner bevægede sig caudally ind i midbrain (mesencephalon og diencephalon), viste skadede hjerner øget EDU-mærkning i den periventrikulære gråzone (PGZ) de optiske tectallapper (TeO) og aspekter af den forreste hypothalamus sammenlignet med ubeskadiget fisk (henholdsvis figur 5D og figur 5C). I baghjernen udviser neurogene områder, der er tydelige i den ubeskadigede hjerne (figur 5E,G), øget cellespredning efter sTBI (Figur 5F,H).
For at opsummere, en modificeret Marmarou vægt dråbe anvendes til voksne zebrafisk giver en reproducerbar og skalerbar mild, moderat, eller svær stump kraft TBI. Zebrafisk udviser på en alvorlighedsafhængig måde forskellige patologier, herunder anfald og vaskulær skade (dvs. subdurale og intracerebral hæmatomer). Derudover, skadet fisk display nedsat inddrivelse sats (svarende til tab af bevidsthed, kognitive underskud i form af læring og hukommelse spørgsmål, og neuronal celledød (data ikke vist). Patologierne observeret, hurtigt inddrive i løbet af span af 4-7 dage falder sammen med robuste proliferative begivenheder på tværs af neuroaxis.
Figur 1: Opsætning af det skalerbare skadesapparat. Grafisk repræsentation af opsætningen, modellen og leveringen af skalerbare TBIs til zebrafisken. Trin 1-4 giver vejledende overblik over trinene til at danne støtteformen, der immobiliserer fisken og udsætter hovedet under skader. Trin 5-7 indeholder instruktioner om, hvordan skaden leveres med indsigt i aspekter, du skal overveje, når du foretager fejlfinding af modellen. Figuren blev skabt med BioRender.com. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kraniefjernelse til hjerne dissektion. Skematisk af en forenklet zebrafisk kraniet og trin-for-trin fjernelse af knogle (blå sektioner) for at udsætte den voksne zebrafisk hjerne. (A,B) Øjnene er rent ud fjernet med # 5 sammentrækninger afskære synsnervene. (C) Der placeres sammenkædninger i muskulaturen direkte caudal til parietalpladerne (sort pil) for at fjerne højre parietal knogle og derefter højre frontal knogle. (D,E) Venstre parieal knogle og venstre frontal knogle fjernes. (F) Den højre operkel, preopercle, interopercle, og subopercle fjernes, giver lateral og dorsal adgang til hjernen. (G,H) Ubeskadigede og sTBI hjerner blev fjernet. Skalalinje = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vaskulær skade i forskellige baggrunde på tværs af skade-sværhedsgrader. Dorsal opfattelse af ubeskadigede og TBI vilde-type AB, albinob4, og casper voksne zebrafisk viser vaskulær skade. (A-D) Voksne vilde AB fisk er stærkt pigmenteret og hudafskrabninger efter miTBI (B) er vanskelige at visualisere. Vaskulær skade var mere tydelig i moTBI (C) og sTBI (D) fisk i forhold til ubeskadigede kontroller (A). (E-H) albino fisk var mindre pigmenteret og visualisering af hjernen var mere tydelig. Vaskulær skade efter TBI blev tydeligt observeret og skelnet på tværs sværhedsgrader. (I-L) casper fisk gav den mest tilpasningsdygtige baggrund for nybegyndere efterforskere som gennemsigtighed tilladt for nem identifikation af ønskede neuroanatomiske regioner og klar observation og afgrænsning af vaskulær skade ved TBI-sværhedsgrad. Skalalinje = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Zebrafisk oplever skadesfremkaldt ødem efter TBI. Zebrafisk blev udsat for forskellige sværhedsgrader af TBI (ubeskadiget, miTBI, moTBI og sTBI) og vurderet på forskellige dage efter skader for procent væskeindhold (ødem). Statistiske analyser blev udført med en Browns-Forsythe og Welch ANOVA efterfulgt af en Dunnett's T3 multiple sammenligning post-hoc test. n = det samlede antal individuelle fisk. Alle statistiske analyser blev udført med Prism (Graphpad 9.0) softwarepakke. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: TBI-induceret spredning på tværs af neuroaxis. (A-H) Confocal billeder af koronar og sagittal hjerne sektioner af ubeskadigede og sTBI fisk, der blev IP-injiceret med EdU 12 timer før indsamling. Øget EdU-inkorporering blev observeret i flere neurogene nicher efter skade på tværs af forhjernen (A, B), midbrain (C,D) og baghjern (E-H). Lillehjernen, CCe, Granule Layer, GL, Mediale Valvula Cerebelli, Vam, Molekylær Lag, ML, Optic Tectum, TeO, Periventricular Grey Zone, PGZ, Telencephalon, og Tel. Alle skalastænger er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Gruppe | N | n | Gennemsnitlige anfald (%) ± SEM | p |
| Fordr.) | 10 | 74 | 0% | |
| miTBI | 10 | 100 | 0% | >0,99 |
| moTBI | 10 | 184 | 10,66% ± 1,37% | <0.0001 |
| sTBI | 10 | 237 | 19,93% ± 1,49% | <0.0001 |
Tabel 1. Zebrafisk udviser alvorlighedsafhængige nedslagsanfald efter TBI. Kvantificering af tonisk-kloniske anfald, som blev registreret som den procentdel af en eksperimentel skadet gruppe, der blev observeret inden for 1 time efter skade. Statistiske analyser blev udført med en envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post-hoc-test. N = det samlede antal forsøgsgrupper, n = det samlede antal individuelle fisk. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prism (Graphpad 9.0) softwarepakke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelser af neurotrauma og tilhørende følgesygdomme har længe været centreret om traditionelle ikke-regenerative gnavermodeller20. Først for nylig har undersøgelser anvendt forskellige former for CNS-skade på regenerative modeller9,11,13,14,21. Selvom indsigtsfulde, disse modeller er begrænset af enten deres brug af en skade metode ualmindeligt set i den menneskelige befolkning (gennemtrængende traumer, kemisk ablation, blast) og / eller skaden er ikke skalerbar og derfor ikke fuldt ud løse heterogenitet sværhedsgrad-afhængige patologier observeret i den menneskelige befolkning22,23,24,25 . Her giver vi et skadesparadigme, der anvender den mest almindelige form for klinisk relevant hovedtraume (stump kraft)4, der producerer mange af de patologiske målinger, der er etableret i menneskelig diagnose22,23,24,25. Når den anvendes på den regenerative zebrafisk, modellen giver muligheder for at undersøge progression og inddrivelse af skade-induceret patologier på tværs af sværhedsgrader, såsom ødem eller posttraumatiske anfald, samt belyse mekanismerne bag den medfødte regenerative opsving.
Der er to nøglefunktioner i vores model i at producere en stump kraft TBI i zebrafisk. For det første leverer vores model et billigt og simpelt skadeparadigme, der er hurtigt, hvilket gør det muligt for den successive skade på et stort antal personer eller gentagne skader på en person at undersøge den kumulative effekt af stump kraft TBI. For det andet er denne model let skalerbar til at undersøge virkningerne af forskellige kraftpåvirkninger. Ved at ændre længden af røret (den højde, hvorfra kuglelejet er faldet) og vægten af kuglelejet, den energi, der leveres til kraniet af fisken, og virkningen kraft kan let ændres og beregnes. Denne skalerbarhed af skaden giver mulighed for flere undersøgelsesmuligheder med hensyn til sværhedsgradsafhængig TBI-sequelae progression og regenerative mekanismer i CNS-reparation.
Med flere målinger for at få adgang til vellykket skade ansøgning, bør der stadig nøje overvejes den genetiske baggrund af fisk, der skal anvendes. Den casper eller albino mutant fisk vil være gunstig for nybegyndere efterforskere til pålideligt placere fisk under drop aksel, placeringen af stålskiven over den ønskede neuroanatomiske slagpunkt, og vurdere vaskulær skade. Desuden forenkles omhyggelig fjernelse af hjernen af den visuelle tilgængelighed af knogler og hjerne i casper og albino mutant fisk. Men pigmenteret vilde fisk kan bruges selv identifikation af vartegn og vellykket dissektion kan komme med bemærkelsesværdig praksis. Desuden kan pigmenterede fisk anvendes, når der produceres enten en moTBI eller sTBI fornærmelse, da de efterfølgende patologier giver mulighed for korrekt karakterisering af skade.
En væsentlig grund til at studere virkningerne af stump-kraft TBI i zebrafisk er at undersøge kilden til skade-induceret celle spredning og de mekanismer, der ligger til grund for neuronal regenerering. Udviklingsmæssige og basale niveauer af konstituerende spredning er blevet identificeret i neurogene nicher på tværs af zebrafisk neuroaxis26,27, og skade-induceret regenerering er blevet observeret lokaliseret eller støder op til skadestedet i voksne zebrafisk8,12,15. Men vores stump-kraft TBI model viser, at den diffuse skade også resulterer i en sværhedsgrad-afhængige celle spredning begivenhed inden for neurogene nicher på tværs af neuroaxis. Identifikation af kilden til og omfanget af cellespredning efter TBI vil gøre det muligt at anvende encellet RNA-Seq til at identificere ændringer i genekspression i den proliferative niche og teste forskellige signalvejes rolle gennem anvendelse af specifikke agonister og antagonister i reguleringen af dette regenereringsrespons. Denne tilgang har vist sig nyttig til at belyse de mekanismer, der ligger til grund for neuronal regenerering i den beskadigede zebrafisk retina28 og bør være lige så nyttig i hjernen efter TBI.
Afslutningsvis giver vores model en hurtig, enkel og omkostningseffektiv skadesmetode til at levere en skalerbar stump kraft TBI. Denne model vil være nyttig til yderligere at undersøge virkningerne af sværhedsgrad-afhængige eller gentagne stump-kraft TBI, samt belyse terapeutiske mål for genetisk regulering forbedre neuronal beskyttelse eller fremkalde neuronal regenerering for funktionel kognitiv genopretning i voksne hvirveldyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Hyde lab medlemmer for deres tankevækkende diskussioner, Freimann Life Sciences Center teknikere til zebrafisk pleje og opdræt, og University of Notre Dame Optical Microscopy Core / NDIIF for brugen af instrumenter og deres tjenester. Dette arbejde blev støttet af Center for Zebrafish Research ved University of Notre Dame, Center for Stamceller og Regenerativ Medicin ved University of Notre Dame, og tilskud fra National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH), og Pat Tillman Scholarship (JTH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).
- Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
- Santiago, L. A., Oh, B. C., Dash, P. K., Holcomb, J. B., Wade, C. E. A clinical comparison of penetrating and blunt traumatic brain injuries. Brain injury. 26 (2), 107-125 (2012).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (6), 379-387 (2016).
- Faul, M., Xu, L., Wald, M., Coronado, V. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths. , (2010).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Alyenbawwi, H., et al. Seizures are a druggable mechanistic link between TBI and subsequent tauopathy. eLife. 10, 58744 (2021).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelia-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- McCutcheon, V., et al. A novel model of traumatic brain injury in adult zebrafish demonstrates response to injury and treatment comparable with mammalian models. Journal of Neurotrauma. 34 (7), 1382-1393 (2017).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Mussulini, B. H., et al. Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization. PloS One. 8 (1), 54515 (2013).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Amamoto, R., et al. Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury. eLife. 5, 13998 (2016).
- Yamamoto, S., Levin, H., Prough, D. Mild, moderate and severe: terminology implications for clinical and experimental traumatic brain injury. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 672-680 (2008).
- Lund, S., et al. Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77 (2016).
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).
- Ruff, R. M., et al. Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper. Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).
- Ganz, J., Brand, M.
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).
