Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מודל מדרגי לחקר ההשפעות של פגיעה בוטה בכוח בדגי זברה בוגרים

Published: May 31, 2021 doi: 10.3791/62709
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 3Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

Summary

שינינו את מודל ירידה במשקל של מרמארו לדגי זברה בוגרים כדי לבחון רוחב של פתולוגיות בעקבות פגיעה מוחית טראומטית בוטה (TBI) והמנגנונים שבבסיס ההתחדשות העצבית שלאחר מכן. מודל TBI קהה זה הוא מדרגי, מעורר TBI מתון, בינוני או חמור, ומשיב הטרוגניות פציעה שנצפו ב- TBI האנושי.

Abstract

פגיעות מוח טראומטיות בוטה (TBI) הן הצורה הנפוצה ביותר של טראומת ראש, המשתרעת על מגוון של חומרות ותוצאות השפעות משניות מורכבות והטרוגניות. אמנם אין מנגנון להחליף או לחדש את הנוירונים האבודים בעקבות TBI בבני אדם, דגי זברה יש את היכולת לחדש נוירונים בכל הגוף שלהם, כולל המוח. כדי לבחון את רוחב הפתולוגיות המוצגות בדגי זברה בעקבות TBI קהה ולחקור את המנגנונים שבבסיס התגובה המתחדשת העצבית שלאחר מכן, שינינו את הירידה הנפוצה במשקל מרמרו המכרסם לשימוש בדגי זברה בוגרים. מודל ה-TBI הפשוט שלנו הוא מדרגי, גורם ל-TBI קל, בינוני או חמור, ומציג מחדש רבים מהפנוטיפים שנצפו בעקבות TBI אנושי, כגון התקפי מגע ופוסט טראומה, בצקת, שטף דם תת-עורי וtracerebral, וליקויים קוגניטיביים, שכל אחד מהם מוצג באופן תלוי חומרת פציעה. רצף TBI, אשר מתחיל להופיע בתוך דקות של הפציעה, שוכך ולחזור לרמות שליטה כמעט ללא פגע בתוך 7 ימים לאחר הפציעה. תהליך הרגנרטיביות מתחיל כבר 48 שעות לאחר הפציעה (hpi), כאשר שיא התפשטות התאים נצפה על ידי 60 כ"ס. לפיכך, מודל ה-TBI שלנו מייצר פתולוגיות TBI פגיעות ראשוניות ומשניות אופייניות הדומות ל- TBI האנושי, המאפשר לחקור את התפרצות המחלה והתקדמותה, יחד עם מנגנוני ההתחדשות העצבית הייחודיים לדגי זברה.

Introduction

פגיעות מוחיות טראומטיות (TBIs) הן משבר בריאותי עולמי וגורם מוביל למוות ונכות. בארצות הברית, כ -2.9 מיליון אנשים חווים TBI מדי שנה, ובין השנים 2006-2014 התמותה עקב TBI או TBI sequelae גדלה ביותר מ -50%1. עם זאת, השחפת משתנה באטיולוגיה, בפתולוגיה ובהצגה הקלינית שלהם בעיקר בשל מנגנון הפציעה (MOI), המשפיע גם על אסטרטגיות הטיפול ועל הפרוגנוזה החזויה2. למרות שחפת יכולה לנבוע MOI שונים, הם בעיקר תוצאה של טראומה חודרת או בוטה כוח. טראומות חודרות מייצגות אחוז קטן של שחפת ומייצרות פגיעה חמורה ומוקדית המותאמת לאזורי המוח המיידיים וסובבים3. לעומת זאת, שחפת בוטה נפוצה יותר באוכלוסייה הכללית, משתרעת על פני מגוון של חומרות (קלות, בינוניות וחמורות), ומייצרת פגיעה מפוזרת, הטרוגנית ועולמית המשפיעה על אזורים מוחיים מרובים1,4,5.

דגי זברה (דניו ריו) נוצלו כדי לבחון מגוון רחב של עלבונות נוירולוגיים המשתרעים על מערכת העצבים המרכזית (CNS)6,7,8,9. דגי זברה מחזיקים גם, בניגוד ליונקים, תגובה רגנרטיבית מולדת וחזקה לתיקון נזקי מערכת NS10. מודלי טראומה הנוכחיים של דגי הזברה משתמשים בשיטות פציעה שונות, כולל חדירה, כריתה, עלבון כימי או גלי לחץ11,12,13,14,15,16. עם זאת, כל אחת משיטות אלה משתמשת MOI כי הוא מנוסה לעתים רחוקות על ידי האוכלוסייה האנושית, אינו מדרגי על פני מגוון של חומרות פגיעה, ואינו מתייחס הטרוגניות או חומרה תלוי TBI sequela שדווח לאחר כוח בוטה TBI. גורמים אלה מגבילים את השימוש במודל דגי הזברה כדי להבין את המנגנונים הבסיסיים של הפתולוגיות הקשורות לצורה הנפוצה ביותר של TBI באוכלוסייה האנושית (פציעות קלות בוטה).

שמנו לנו למטרה לפתח מודל דגי זברה מהירים ומדרגיים המספק אפיקים לחקור פתולוגיית פציעות, התקדמות של SEQUELA TBI, ואת התגובה הרגנרטיבית המולדת. שינינו את הירידה הנפוצה במשקל של המכרסם Marmarou17 והפעלנו אותה על דגי זברה בוגרים. מודל זה מניב טווח חומרה רב-ממדי הנע בין מתון, בינוני ועד חמור. מודל זה גם משחזר היבטים מרובים של פתולוגיה TBI אנושית, באופן תלוי חומרה, כולל התקפים, בצקת, שטף דם תת-עורי וtracerebral, מוות תאי עצבי, ליקויים קוגניטיביים, כגון למידה ופגיעה בזיכרון. ימים לאחר הפציעה, הפתולוגיות והגירעונות מתפוגגים, וחוזרים לרמות הדומה לבקרות שלא ניזוקו. בנוסף, דג זברה זה מציג התפשטות חזקה ותגובת התחדשות עצבית ברחבי הנוירוקסיס בנוגע לחומרת הפציעה.

כאן, אנו מספקים פרטים לקראת הקמה וגיוס של טראומה קהה כוח, ניקוד התקפים פוסט טראומטיים, הערכה של פציעות כלי דם, הוראות להכנת מקטעי מוח, גישות לכימות בצקת, ותובנה על התגובה ההתרבותית לאחר פציעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דגי זברה גדלו והתוחזקו במתקן דגי הזברה של נוטרדאם במרכז פריימן למדעי החיים. השיטות המתוארות בכתב יד זה אושרו על ידי אוניברסיטת נוטרדאם טיפול בבעלי חיים ושימוש בוועדה.

1. פרדיגמת פגיעה מוחית טראומטית

  1. הוסף 1 מ"ל של 2-פנוקסיאתנול ל 1 ליטר של מי מערכת (60 מ"ג של אוקיינוס מיידי ב 1 ליטר של מי RO deionized).
  2. הכן מיכל התאוששות מאוורר המכיל 2 ליטר של מי מערכת בטמפרטורת החדר.
  3. בחר את המשקל הרצוי של מיסבים כדוריים ואת האורך וקוטר הרצוי של צינורות פלדה / פלסטיק ולקבוע את האנרגיה ואת כוח ההשפעה.
    הערה: צינורות צריכים להיות קוטר פנימי המאפשר את מיסוי הכדור לעבור מבלי לשנות את הנתיב או את מהירות התנועה שלה.
    1. קבע את האנרגיה הקינטית בעת הפגיעה:
      Equation 1
      איפה, KE = אנרגיה קינטית, m = מסה (בק"ג), g = כוח כבידה, h = גובה (במ') מנקודת טיפה לדגים.
      הערה: פעולה זו מספקת אנרגיה קינטית ב- J. הכפל את הערך ב- 1,000 כדי לקבוע mJ. KE מבוסס על אובייקט מאיץ, המתרחש כאשר נושאת הכדור יורדת ממיקום נייח.
    2. צור TBI מתון (miTBI) באמצעות צינורות פלדה/פלסטיק באורך 7.62 ס"מ המסתיים 1.5 ס"מ מעל הצלחת על גולגולת דג הזברה (מרחק כולל של 9.1 ס"מ) ומסב כדור בקוטר 1.5 גרם (6.4 מ"מ). אלה מייצרים אנרגיה קינטית של 1.33 mJ. נזק זה הוחלט אמפירית להיות שווה ערך miTBI המבוסס על סמני TBI פתופיזיולוגיים מפתח, כגון פגיעה בכלי הדם, היווצרות שטף דם subdural / intracerebral, מוות תאי עצבי, ליקויים קוגניטיביים כי במידה רבה recapitulated מה דווח באוכלוסייה האנושית באופן תלוי חומרה.
    3. חשב אנרגיה קינטית miTBI = Equation 2
    4. צור TBI מתון (moTBI) באמצעות צינורות פלדה/ פלסטיק באורך 12.7 ס"מ המסתיים 1.5 ס"מ מעל הצלחת על גולגולת דג הזברה (מרחק כולל של 14.2 ס"מ) ומסב כדור בקוטר 1.5 גרם (קוטר 6.4 מ"מ) המייצר אנרגיה קינטית של 2.08 mJ.
    5. חשב אנרגיה קינטית moTBI = Equation 3
    6. צור TBI חמור (sTBI) באמצעות צינורות פלדה/ פלסטיק באורך 7.62 ס"מ המסתיים 1.5 ס"מ מעל הצלחת על גולגולת דג הזברה (מרחק כולל של 9.1 ס"מ) ומסב כדור בקוטר 3.3 גרם (8.38 מ"מ) המייצר אנרגיה קינטית של 2.94 mJ.
    7. חשב אנרגיה קינטית sTBI = Equation 4
  4. מלאו צלחת פטרי בחימר דוגמנות (איור 1, שלב 1) והשתמשו בכלי קהה (כלומר, בגב זוג מלקחיים) כדי ליצור פלטפורמה מוגבהת (5 ס"מ על 1.5 ס"מ) עם חימר דוגמנות נוסף (איור 1, שלב 2).
    1. השתמשו בסכין גילוח כדי לחלק את הפלטפורמה המוגבהת לאורכה לשני חצאים שווים בקירוב (איור 1, שלב 3, קו מקווקו אדום). יוצרים את שני החצאים לערוץ המתאים לאורך של דג בוגר (איור 1, שלב 4). השתמש חימר נוסף כדי לבנות קירות שיאבטחו ~ 2/3 של גוף הדג, משאיר את הראש חשוף.
    2. לעצב תמיכה קטנה באזור הראש החשוף בניצב לקירות כדי לתמוך בראש כדי למנוע סיבוב או רהט של הראש על פציעה (איור 1, שלב 4).
      הערה: הערוץ צריך להיות עמוק מספיק כדי לתמוך בדגים במצב של למעלה, אך עדיין צריך לאפשר לראש לנוח מעל החימר שמסביב. בנוסף, תמיכת הראש צריכה לעקוב אחר העקמומיות הטבעית של הדגים, ותמיכה בלסת התחתונה ובזימים.
    3. ודאו שמשקל הירידה אינו מעוקל על ידי הצדדים של הערוץ (איור 1, שלב 4).
  5. צור דיסק פלדה בקוטר 3 מ"מ באמצעות ניקוב חור מיני 22 גרם מהבהב פלדה. ניתן להשתמש בכל דיסק מספר פעמים.
  6. להרדים דג אחד על ידי הצבתו לתוך עם 50-100 מל של 1:1000 (1 מל / 1 L, 0.1%) 2-פנוקסיאתנול עד שהוא אינו מגיב לצבוט זנב.
  7. הניחו את הדג, צד גב למעלה, על תבנית החימר בתוך התעלה כך שהגוף יהיה מאובטח בצדדים והניחו על הראש דיסק פלדה באורך 3 מ"מ 22 גרם, שבמרכזו נקודת הפגיעה הרצויה (איור 1, שלב 5).
    1. ודא כי הדג מיושר בניצב ככל האפשר כדי למנוע את ראשו מלהטות לצד אחד, אשר עלול לגרום לפגיעה לא אחידה.
  8. אבטחו את צינורות הפלדה/פלסטיק, באמצעות מעמד טבעת סטנדרטי ומהדק זרוע, כך שתחתית הצינורות היא 1.5 ס"מ מעל ראש דג הזברה (איור 1, שלב 6). ודאו שהצינורות ישרים.
    1. הביטו מטה בצינורות וודאו שהצינורות מיושרים מעל צלחת הפלדה.
  9. זרוק את מיסוי הכדור (1.5 גרם עבור TBI מתון ומתון, ו 3.3 גרם עבור TBI חמור) מגובה קבוע מראש (מתואר בשלבים 1.3.3-1.3.5) במורד הצינורות על צלחת הפלדה הממוקמת מעל האזור הנוירואנטומי הרצוי של עניין (למשל, המוח הקטן, איור 1, שלב 5) כדי לייצר את TBI כוח קהה לחומרה הרצויה של פציעה. מניחים את הדגים הפצועים במיכל התאוששות כדי להיות במעקב.
    הערה: בהתאם לחומרת הפציעה, תמותה או התקפי טוניק-קלוניים עלולים להתרחש. אם הדגים אינם מגיבים במשך תקופה ממושכת של זמן בעקבות TBI, להשתמש pipette העברה או מלקחיים כדי לנהל זנב קמצוץ ולהעריך לתגובה כאב.

2. הבקעת התקפים לאחר TBI בדגי הזברה הבוגרים

  1. להרדים ולפצוע את הדגים על פי פרוטוקול הפציעה המתואר בסעיף 1 ומניחים את הדגים הפצועים במיכל התאוששות מאוורר של 2 ליטר של מי מערכת.
  2. שימו לב לדגים לסימנים של התקפים פוסט-טראומטיים שמתחילים מיד לאחר שהוכנסו למיכל ההתאוששות. קבע זמן תצפית (כלומר, שעה) ותיעד את כל פעילות ההתקפים, כולל ציון התפיסה (המתואר להלן), משך כל התקף ואחוז הדגים שחוו התקפים (איור 2A).
    הערה: התקפים יכולים להתרחש מיד עם הפציעה, כמו גם שעות או ימים לאחר TBI. התקפים יכולים להימשך לטווח ארוך ודגים בודדים יכולים להיות התקפים מרובים. קביעת זמן תצפית של שעה ומעלה תניב ייצוג טוב למגמה הכוללת של שיעורי תפיסה.
  3. ציון דגים באמצעות הנחיות Mussulini18 עבור פנוטיפים התקפי דגי זברה למבוגרים.
    הערה: ללא שימוש בתוכנת המעקב, קשה להעריך את ציוני ההתקפים מתחת ל-3 באופן בלתי משוחד. לכן, רק ציוני תפיסה של 3 ומעלה יש לרשום כאשר ההערכה מתבצעת ללא תוכנה.

3. ניתוח מוח

  1. המת חסד דגים ב 1:500 (2 מ"ל / 1 L, 0.2%) פתרון של 2-פנוקסיאתנול, עד תנועות זימים להפסיק, והם אינם פעילים סנפיר צביטה, בנקודת הקצה הרצויה.
  2. מלא צלחת פטרי עם חימר דוגמנות וליצור חלל קטן כדי לתמוך בגוף במהלך הניתוח.
  3. מניחים את הדג, צד הגב למעלה, בתבנית החימר. מניחים סיכת ניתוח אחת דרך קו האמצע באמצע גוף הדג וסיכה שנייה ~ 5 מ"מ מאחורי בסיס הראש.
  4. תחת מיקרוסקופ אור ניתח, נתק בבוטות את עצב הראייה עם זוג מלקחיים של דומונט מס' 5 והסר את העיניים (איור 2A).
  5. כוון את הדג כך שקצה הרוסטריאל יהיה הרחוק ביותר כשמסתכלים דרך המיקרוסקופ (איור 2B).
    הערה: השלבים הבאים מיועדים לאנשים ימניים. אנשים שמאליים עשויים להעדיף לבצע את השלבים הבאים בכיוון שיקוף.
  6. השתמשו במלקחיים מס' 5 כדי למקם לאט קצה אחד של המלקחיים מתחת ללוח הקודקוד הימני, תוך ביצוע פעולת מספריים מכוונת הנעה לכיוון קצה הרוסטרלי והסירו את הלוחות הקודקודיים והחזיתיים הימניים (איור 2C).
    1. שמור את המלקחיים בזווית של 45° או נמוך יותר על מנת למנוע חדירה למוח במהלך הניתוח.
  7. סובב את הדג 90° בכיוון השעון. הנח קצה אחד של המלקחיים מס' 5 מתחת ללוח הקודקוד השמאלי והשתמש באותה תנועת מספריים כדי להסיר את הלוחות הקודקודיים והחזיתיים השמאליים החושפים את כל ההיבט העורי של המוח (איור 2D,E).
  8. תעבירו בבוטות את המקסילה עם מלקחיים מס' 5. שמור על נורות הריח ולא לפגוע בהם אם זה אזור העניין.
  9. הסר את האופלקל, הניתוח הקדם-ניתוחי, הניתוח המשולב והתת-ניתוח הימניים עם מלקחיים מס' 5 (איור 2F).
  10. יש לכרות בבוטות את השרירים בקצה הקדחתני של פתח הקלבריום באמצעות מלקחיים מס' 5, וחושפים את חוט השדרה.
  11. תקיף בבוטות את חוט השדרה עם מלקחיים מס' 5. הניחו בזהירות מלקחיים מתחת למוח והוציאו בעדינות את המוח מהקלבריום.
    הערה: לעולם אל תצבט את המוח. השתמש במלקחיים כדי "לערסל" את המוח או לכרות מחדש את חוט השדרה החשוף כנקודת צביטה לתמרן את המוח.
  12. תקן את המוחות שהוסרו ב-9 חלקים 100% אתנול לחלק אחד 37% פורמלדהיד במהלך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על משטח נדנדה.

4. מחקרי בצקת במוח דגי הזברה

  1. להרדים ולפצוע דגים על פי פרוטוקול הפציעה המתואר בסעיף 1 ולאפשר לדגים להתאושש במיכל התאוששות עד שהם מתחילים לשחות בחופשיות.
  2. החזירו את הדגים לתנאי הדיור הרגילים לאחר הפציעה למשך יום אחד.
  3. המתת חסד את הדג ב 1:500 2-פנוקסיאתנול, לאחר שהזמן חלף.
  4. לנתח את כל המוח או אזור העניין על פי הפרוטוקול המתואר בסעיף 3 ולהניח את המוח מיד על סירת שקילה קטנה.
    הערה: היזהר בעת העברת המוח, באמצעות מלקחיים עדינים כדי למקם אותו בעדינות על סירת השקילה מבלי לדקור או לגרד את המוח, אשר עלול לגרום לאובדן רקמות.
  5. תווית (עם קבוצת פציעה ומספר מוח) ו tare ייבוש קטן נוסף שוקל סירה בקנה מידה. השתמש בקנה מידה עם היכולת למדוד מינימום של 0.001 גרם כדי לקבל מדידה מדויקת.
  6. מעבירים את המוח לסירה השקילה של ייבוש זפת ומתעדים את המשקל הרטוב של המוח. כוון את המוח כך שהם ישכבו על סירת השקילה כשצד הגב פונה כלפי מעלה.
  7. מניחים את סירה שוקל ייבוש ואת המוח בתנור הכלאה להגדיר 60 °C (8 שעות).
  8. לאחר הייבוש, המוח עשוי להיצמד לסירה שוקל ייבוש עשוי להיות קשה להסיר ולהעביר לסירה שקל קטנה מזופת חדשה. הימנע צובט את המוח עם מלקחיים, כמו זה עלול לגרום נזק למוח היבש ואובדן רקמות. במקום זאת, לצבוט את המלקחיים העדינות יחד, החל מהצד הגחון של המוח, לגרוף בתנועה כלפי מעלה.
  9. קבעו את תכולת המים של כל מוח באמצעות הנוסחה (איור 4):
    Equation 5

5. תיוג התפשטות תאית על פני הנוירוקסיס והכנת רקמות קבועות.

  1. הכן 10 מ"מ 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ב 2 מ"ל של ddH2O.
  2. להרדים 3 עד 4 דגים בכל פעם ב 50-100 מ"ל של 1:1000 (1 מ"ל / 1 L, 0.1%) 2-פנוקסיאתנול עד הדגים אינם מגיבים לצבוט זנב, בנקודת הזמן הרצויה לאחר פציעה (באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיף 1).
  3. לעשות חתך חלקי על ספוג רטוב ומניחים דג אחד בכל פעם בפתח, בצד הגחון למעלה.
  4. השתמש מחט 30 G כדי להזריק ~ 40 μL של 10 mM EdU לתוך הגוף של הדג. החזירו את הדג למיכל אחזקה מלא במי מערכת.
    הערה: זריקות חוזרות עשויות להתבצע בנקודות זמן שונות כדי לסמן מספר גדול יותר של תאים מתרבים וייתכן שיהיה צורך לתקופת מרדף של יותר משבוע אחד.
  5. לאסוף מוחות כפי שמתואר בסעיף 3 ולמקם אותם כקבוצה ב בקבוקון זכוכית 5 מ"ל המכיל 2 מ"ל של 9 חלקים 100% אתנול ל 1 חלק 37% פורמלדהיד. תקן את המוח ב 4 °C (5 °F) על פלטפורמת רוקר.
    הערה: פלטפורמת נדנדה או שייקר אוסרת על המוח לנוח בתחתית ועל הטלנספלון של מוחות שלמים מסלסול.
  6. מוחות Rehydrate, באותו בקבוקון זכוכית המשמש לתיקון המוח, בשטיפה של סדרת אתנול יורד, 75%, 50%, ו 25%, במשך 15 דקות כל אחד, ואחריו לשטוף 1.5 שעות ב 5% סוכרוז / PBS על רוקר בטמפרטורת החדר. יש לאחסן את המוח ב בקבוקון זכוכית למשך הלילה ב-30% סוכרוז/PBS ב-4 מעלות צלזיוס על משטח נדנדה.
  7. הסר את המוח מ 30% סוכרוז / PBS ולהעביר אותם עם מלקחיים לתוך צלחת 12 טוב (קבוצת טיפול אחת לבאר) עם בארות מלאות בתמיסה 2:1 המורכבת 2 חלקים רקמות הקפאה בינוני 1 חלק 30% סוכרוז / PBS. לדגור את המוח בלילה ב 4 °C (5 °F) על פלטפורמת רוקר.
  8. העבר את המוח לשורה הבאה של הבא של בארות בתוך 12-טוב צלחת שקוע מוחות ב 100% TFM עבור 2-24 שעות ב 4 °C (70 °F).
  9. השתמש צ'אק cryostat להטמיע את המוח ב- TFM באוריינטציה הרצויה על קרח יבש.
  10. בצע cryosectioning (קטעים בעובי 16 מיקרומטר) ואסוף את המקטעים בשקופיות טעונות חיוביות. מחליק יבש על מחמם שקופיות במשך שעה אחת ולאחר מכן לאחסן ב -80 °C (80 °F) או להמשיך עם אימונוהיסטוכימיה.
  11. הכן מחסום הידרופובי על המגלשה סביב קטעי הרקמה ולאפשר להתייבש על מחמם שקופיות במשך 20 דקות.
  12. לשטוף בקצרה את השקופיות PBS במשך 5 דקות ולאחר מכן פעמיים PBS-Tween 20 (0.05%) במשך 10 דקות כל אחד.
  13. בצע זיהוי EdU באמצעות ערכת התפשטות תאי EdU והוראות היצרן.
  14. נתח את השקופיות וכמת את התאים הניוזרים בתווית EdU באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקל. מינימום של מטרה 40x יידרש להבחין בבירור תאים בודדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכנת אסדת אינדוקציה לפציעות מאפשרת אמצעי מהיר ופשטני של אספקת TBI קהה מדרגית לדגי זברה בוגרים. חומרתו המדורגת של מודל הפציעה מספקת מספר מדדים הניתנים לזיהוי בקלות של פגיעה מוצלחת, אם כי הפגיעה בכלי הדם היא אחת הפתולוגיות הקלות והבולטות ביותר (איור 3). זן הדגים המשמש במהלך הפציעה יכול להפוך מחוון זה קל יותר או קשה יותר לזיהוי. בעת שימוש בדגי AB מסוג בר (WTAB, איור 3A-D), קשה להבחין בזיהוי של פגיעה בכלי הדם בין miTBI או moTBI לבין דגי בקרה שלא ניזוקו בשל הפיגמנטציה (איור 3A-C). בעקבות הפציעה, דגי miTBI מציגים שריטות משטח מינימליות (איור 3B), בעוד ש-moTBI מציגים דימום מוחי מוגבל (איור 3C). בעוד ש-STBI עדיין יכול להיות מאתגר, היקף הפגיעה ניכר לעתים קרובות (איור 3D). לעומת זאת, בעת שימוש בלבקן (איור 3E-H) או בדגי קספר (איור 3I-L), קל לזהות פגיעה בכלי הדם. בנוסף, התקפי השפעה נצפים לעתים קרובות בעקבות פציעה ושיעור תפיסה בקרב הקבוצה הוא מדד מייצג נוסף של פציעה (לוח 1). דגים פצועים יציגו התקפי טוניק-קלוני (אטקסיה, ZBC 1.9, כיפוף, ZBC 1.16, חג, ZBC 1.32, ושחייה חולץ פקקים, ZBC 1.37)19 כי הם נצפים בקלות לאחר פציעה, ללא קשר למתח הרקע. התקפים נצפו עם שכיחות גוברת ביחס לחומרה. לאחר פציעה, miTBI אינם מציגים התנהגויות דמויות פרכוס; עם זאת, moTBI יציג התנהגויות תפיסה (10.66% ± 1.37%, p < 0.0001, טבלה 1) והשכיחות גבוהה עוד יותר בדגי STBI (19.93% ± 1.49%, p < 0.0001, טבלה 1).

הסרה מוצלחת של המוח היא קריטית עבור מספר עצום של חקירות נוספות, כגון בצקת והערכה של התפשטות התא. בצע ניתוחים בזהירות מירבית כדי למנוע פגיעה באזורי המוח (לרוב על ידי ניקוב לא מכוון) ולשמור על כל האזורים (נורות הריח יכולות בקלות ללכת לאיבוד). בעקבות הליך ניתוח המוח והסכמטי (סעיף 3, איור 2A-F) מאפשר הסרה מלאה של המוח (איור 2G,H). החוקרים צריכים לשקול אם הניתוח שלהם דורש את המוח כולו או אם אוסף של אזורי מוח ספציפיים עשוי להתאים לצרכים שלהם. בהתאם לחומרת הפציעה וזמן האיסוף, המוחות עשויים להפגין דימומים תת-קרקעיים מחוברים, עם זאת, אלה דבקים לעתים קרובות בחלק התחתון של הגולגולת ואבדו במהלך הניתוח. נפיחות של המוח הוא לפעמים ניכר, אבל בשל הבדלים אנטומיים וריאציה בגודל הכללי, בצקת היא השיטה הטובה ביותר להעריך נפיחות. בעקבות הפרוטוקול המתואר (סעיף 4), מוחות שלא ניזוקו מציגים תוכן נוזלים של 73.11% ± 0.80%, ו- miTBI, אם כי מעט מוגבה, אינו מציג עלייה משמעותית בבצורת ב- 1, 3 או 5 dpi (1 dpi: 76.33% ± 1.32%, p = 0.36, 3 dpi: 75.33 ± 1.37%, p = 0.84, 5 dpi: 74.14 ± 1.50%, p > 0.99, איור 4). לעומת זאת, הן moTBI והן sTBI היה בצקת משמעותית 1 dpi (moTBI: 80.55 ± 0.94%, p < 0.0001, sTBI: 86% ± 1.05%, p < 0.0001) ו 3 dpi (moTBI: 78.11 ± 0.93%, p < 0.018, sTBI: 77.77% ± 1.02%, p < 0.036, איור 4). עם זאת, התוכן הנוזלי של moTBI ו- sTBI חזר לרמות הדומה לבקרות שלא ניזוקו ב- 5 dpi (moTBI: 74.42 ± 1.25%, p > 0.99, sTBI: 73.85% ± 1.01%, p > 0.99, איור 4).

התפשטות תאים, בעקבות TBI דגי זברה, היא הערכה חזקה של היקף הפגיעה. בעוד שתגובת התפשטות התא נחקרה בעבר בדגי זברה בעקבות צורות אחרות של פגיעה מוחית9,12, ברוב המקרים, החקירה הוגבלה לאתר הפציעה. TBI בוטה זה גורם לתגובת התפשטות חזקה המשתרעת על פני הנוירוקסיס. באופן תלוי חומרה (מוצג נתוני sTBI), תיוג מוגבר של EdU נצפה באזורי החדר והתת-חדרית של המוח המקדים (טלנספלון, איור 5B) ביחס לבקרות שלא ניזוקו (איור 5A). כאשר חלקים נעו בהתלהבות לתוך המוח האמצעי (mesencephalon ו diencephalon), מוחות פצועים הציגו תיוג מוגבר של EdU באזור האפור הפריבנטרי (PGZ) האונות הקטאליות האופטיות (TeO), והיבטים של ההיפותלמוס הצפי בהשוואה לדגים שלא ניזוקו (איור 5D ואיור 5C, בהתאמה). במוח האחורי, אזורים נוירוגניים הנראים במוח שלא ניזוק (איור 5E,G) מציגים התפשטות תאים מוגברת בעקבות ה-sTBI (איור 5F,H).

לסיכום, טיפת משקל מרמרו שונה החלה על דגי זברה בוגרים מספקת TBI קלה, מתונה או חמורה הניתנת לשחזור, בינונית או חמורה. דגי זברה, באופן תלוי חומרה, מציגים פתולוגיות שונות, כולל התקפים ופגיעה בכלי הדם (כלומר, שטף דם תת-עורי ותוך-מוחי). בנוסף, דגים פצועים מציגים ירידה בשיעור ההתאוששות (מקביל לאובדן הכרה, ליקויים קוגניטיביים בצורה של בעיות למידה וזיכרון, ומוות תאי עצבי (נתונים שאינם מוצגים). הפתולוגיות שנצפו, מתאוששות במהירות על פני טווח של 4-7 ימים במקביל לאירועי שגשוג חזקים ברחבי הנוירוקסיס.

Figure 1
איור 1: הקמת מנגנון הפציעה המדרגית. ייצוג גרפי של ההתקנה, המודל, ואספקה של שחפת מדרגית לדגי הזברה. שלבים 1-4 מספקים סקירה מנחה של השלבים ליצירת תבנית התמיכה שמשתקת את הדגים וחושפת את הראש במהלך הנזק. שלבים 5-7 מספקים הוראות למתן הפציעה עם תובנות לגבי היבטים שיש לקחת בחשבון בעת פתרון בעיות במודל. הדמות נוצרה עם BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הסרת גולגולת לצורך ניתוח מוח. סכמטי של גולגולת דג זברה פשוטה והסרת העצם (חלקים כחולים) צעד אחר צעד כדי לחשוף את מוח דג הזברה הבוגר. (א,ב) העיניים מוסרות בבוטות עם מלקחיים מס' 5 שמנתקים את עצבי הראייה. (C) מלקחיים ממוקמים לתוך השרירים ישירות caudal ללוחות הקודקוד (חץ שחור) כדי להסיר את העצם הקודקודית הימנית ולאחר מכן את העצם הקדמית הימנית. (ד,ה) העצם הקודקודית השמאלית והעצם הקדמית השמאלית מוסרות. (ו) האופלקל הימני, הניתוח הקדם-ניתוחי, הניתוח המשולב והתת-ניתוח מוסרים, ומספקים גישה רוחבית וגופרית למוח. (ז,ה) מוחות לא ניזוקו ו-STBI הוסרו. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פגיעה בכלי הדם ברקעים שונים על פני נפגעים. מבט גב אל-חי ושל AB, לבקן 4 ודגי זברה בוגרים ללא פגע, שאינם ניזוקו ו-TBI, אלבינו- 4 ודגי זברה בוגרים עם קספר המציגים פגיעה בכלי הדם. (א-ד) דגי AB למבוגרים מסוג בר הם פיגמנטים בכבדות ושריטות בעקבות miTBI (B) קשה לדמיין. פגיעה בכלי הדם ניכרה יותר בדגי moTBI (C) ו- sTBI (D) בהשוואה לבקרות שלא ניזוקו (A). (E-H) דגים לבקן היו פחות פיגמנטיים והדמיה של המוח הייתה יותר ברורה. פגיעה בכלי הדם בעקבות TBI נצפתה בבירור ונבדלה על פני חומרות. (י-ל) דג קספר סיפק את הרקע הניתן להתאמה הגבוהה ביותר לחוקרים מתחילים שכן השקיפות אפשרה זיהוי קל של האזורים הנוירואנטומיים הרצויים ותצפית ברורה ותיווג של פגיעה בכלי הדם על ידי חומרת TBI. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דגי זברה חווים בצקת הנגרמת מפציעות בעקבות TBI. דגי זברה נחשפו לחומרות שונות של TBI (לא ניזוקו, miTBI, moTBI ו- sTBI) והוערכה בימים שונים בעקבות נזק לאחוז תכולת הנוזלים (בצקת). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם בראונס-פורסייט ו-וולש אנובה ואחריו מבחן השוואה מרובה T3 של דאנט לאחר ההוק. n = המספר הכולל של דגים בודדים. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו עם חבילת התוכנה פריזמה (Graphpad 9.0). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: התפשטות הנגרמת על ידי TBI ברחבי הנוירוקסיס. (א-ה) תמונות קונפוקליות של מקטעי מוח קורונליים ופצציטים של דגים לא ניזוקו ו- sTBI שהוזרקו ב- IP עם EdU 12 שעות לפני האיסוף. שילוב מוגבר של EdU נצפה בנישות נוירוגניות מרובות בעקבות פציעה על פני המוח המובהק (A,B), מוח-ביניים (C, D) ובבך אחורי (E-H). המוח הקטן, CCe, שכבת גרגר, GL, מודל Valvula Cerebelli, Vam, שכבה מולקולרית, ML, טקטום אופטי, TeO, אזור אפור periventricular, PGZ, Telencephalon, ותל. כל סרגלי קנה המידה הם 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קבוצה N n התקפים ממוצעים (%) ± SEM p
Undam 10 74 0%
miTBI 10 100 0% >0.99
moTBI 10 184 10.66% ± 1.37% <0.0001
STBI 10 237 19.93% ± 1.49% <0.0001

טבלה 1. דגי זברה מציגים התקפי השפעה תלויי חומרה בעקבות TBI. כימות של התקפי טוניק-קלוני, אשר נרשם כאחוז של קבוצה פצועה ניסיונית, שנצפתה בתוך 1 שעות לאחר פציעה. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם ANOVA בכיוון אחד ואחריו הבדיקה שלאחר הוק של טוקי. N = המספר הכולל של קבוצות ניסוי, n = המספר הכולל של דגים בודדים. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות חבילת התוכנה פריזמה (Graphpad 9.0).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חקירות של נוירוטרומה והמשך הקשורים כבר זמן רב התמקדו מודלים מכרסמים מסורתיים שאינם רגנרטיביים20. רק לאחרונה מחקרים יישמו צורות שונות של נזקי מערכות ום ים למודלים רגנרטיביים9,11,13,14,21. למרות תובנה, מודלים אלה מוגבלים על ידי שימוש בשיטת פגיעה נדירה באוכלוסייה האנושית (טראומות חודרות, אבלציה כימית, פיצוץ) ו / או שהפגיעה אינה מדרגית ולכן אינה מטפלת באופן מלא בהטרוגניות של פתולוגיות תלויות חומרה שנצפו באוכלוסייה האנושית22,23,24,25 . כאן, אנו מספקים פרדיגמת נזק המיישמת את הצורה הנפוצה ביותר של טראומת ראש רלוונטית קלינית (כוח קהה)4 המייצרת רבים מהמדדים הפתולוגיים שנקבעו באבחון אנושי22,23,24,25. כאשר מוחל על דג זברה רגנרטיבי, המודל מספק אפיקים לחקור את ההתקדמות וההתאוששות של פתולוגיות הנגרמות מפציעות על פני חומרות, כגון בצקת או התקפים פוסט טראומטיים, כמו גם לבהיר את המנגנונים מאחורי ההתאוששות הרגנרטיבית המולדת.

ישנן שתי תכונות מרכזיות של המודל שלנו בהפקת TBI קהה בזברה. ראשית, המודל שלנו מספק פרדיגמת פציעות זולה ופשוטה מהירה, המאפשרת פגיעה רצופה במספר רב של אנשים או פגיעה חוזרת ונשנית באדם כדי לחקור את ההשפעה המצטברת של TBI בוטה. שנית, מודל זה ניתן להרחבה בקלות כדי לבחון את ההשפעות של השפעות כוח שונות. על ידי שינוי אורך הצינור (הגובה שממנו נופל נושאת הכדור) ואת משקל נושאת הכדור, האנרגיה מועברת לגולגולת של הדג, ואת כוח ההשפעה ניתן לשנות בקלות מחושב. מדרגיות זו של הפגיעה מאפשרת אפיקי חקירה מרובים לגבי התקדמות SEQUELAE TBI תלוית חומרה ומנגנונים רגנרטיביים של תיקון CNS.

עם מדדים מרובים כדי לגשת יישום פגיעה מוצלחת, שיקול זהיר עדיין צריך להינתן לרקע הגנטי של דגים להיות מנוצל. הדגים המוטנטים קספר או לבקן יהיה נוח לחוקרים טירון למקם את הדגים באופן אמין מתחת לפיר טיפה, המיקום של דיסק הפלדה מעל נקודת הפגיעה הנוירואנטומית הרצויה, והערכת פגיעה בכלי הדם. יתר על כן, הסרה זהירה של המוח מפושטת על ידי הנגישות החזותית של העצמות והמוח בדגים המוטנטיים של קספר ולבקן . עם זאת, ניתן להשתמש בדגים מסוג בר פיגמנטי אם כי זיהוי של ציוני דרך וניתוח מוצלח עשוי לבוא עם תרגול ראוי לציון. יתר על כן, דגים פיגמנטיים ניתן להשתמש בעת הפקת עלבון moTBI או sTBI, כמו הפתולוגיות הבאות לאפשר אפיון נאות של פגיעה.

אחת הסיבות העיקריות לחקור את ההשפעות של TBI קהה כוח דגי זברה היא לבחון את המקור של התפשטות תאים הנגרמת מפציעה ואת המנגנונים שבבסיס התחדשות עצבית. רמות התפתחותיות ובסיסיות של התפשטות מכוננת זוהו בנישות נוירוגניות ברחבי הנוירוקסיס הנוירוקסיס של דג הזברה26,27, והתחדשות הנגרמת מפציעה נצפתה מקומית או בסמוך לאתר הפציעה בדגי זברה למבוגרים8,12,15. עם זאת, מודל TBI הקהה שלנו מדגים כי הפגיעה המפוזרת גורמת גם לאירוע התפשטות תאים תלוי חומרה בתוך הנישות הנוירוגניות ברחבי הנוירוקסיס. זיהוי המקור והיקף התפשטות התאים בעקבות TBI יאפשר את היישום של RNA-Seq חד-תאי לזהות את השינויים בביטוי הגנים בנישה המתפשטת ובדיקת תפקידם של מסלולי איתות שונים, באמצעות יישום של אגוניסטים ואנטגוניסטים ספציפיים, בוויסות תגובת התחדשות זו. גישה זו הוכיחה שימושית בהבהרת המנגנונים שבבסיס התחדשות עצבית ב retina דג זברה פגום28 צריך להיות שימושי באותה מידה במוח בעקבות TBI.

לסיכום, המודל שלנו מספק שיטת פגיעה מהירה, פשוטה וחסכונית כדי לספק TBI בעל כוח קהה מדרגי. מודל זה יהיה שימושי כדי לחקור עוד יותר את ההשפעות של חומרה תלוי או חוזר על עצמו כוח בוטה TBI, כמו גם לפרט מטרות טיפוליות של רגולציה גנטית שיפור ההגנה העצבית או גרימת התחדשות עצבית להתאוששות קוגניטיבית תפקודית בחולייתנים מבוגרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לחברי המעבדה בהייד על הדיונים המהורהרים שלהם, לטכנאי המרכז למדעי החיים של פריימן על טיפול וגידים של דגי זברה, ולאוניברסיטת נוטרדאם אופטי מיקרוסקופיה Core/NDIIF על השימוש במכשירים ובשירותיהם. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לחקר דגי זברה באוניברסיטת נוטרדאם, המרכז לתאי גזע ורפואה רגנרטיבית באוניברסיטת נוטרדאם, ומענקים ממכון העיניים הלאומי של NIH R01-EY018417 (DRH), תוכנית מלגת המחקר לתואר שני של הקרן הלאומית למדע (JTH), מלגת LTC ניל היילנד מנוטרדאם (JTH), זקיפים של מלגת חופש (JTH) ומלגת פט טילמן (JTH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-phenoxyethanol Sigma Alderich 77699
#00 buckshot Remington RMS23770 3.3g weight for sTBI
#3 buckshot Remington RMS23776 1.5g weight for miTBI/moTBI
#5 Dumont forceps WPI 14098
5-ethynyl-2’-deoxyuridine Life Technologies A10044 EdU
5ml glass vial VWR 66011-063
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit Life Technologies C10340
CytoOne 12-well plate USA Scientific CC7682-7512
Instant Ocean Instant Ocean SS15-10
Super frost postiviely charged slides VWR 48311-703
Super PAP Pen Liquid Blocker Ted Pella 22309
Tissue freezing medium VWR 15148-031

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).
  2. Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
  3. Santiago, L. A., Oh, B. C., Dash, P. K., Holcomb, J. B., Wade, C. E. A clinical comparison of penetrating and blunt traumatic brain injuries. Brain injury. 26 (2), 107-125 (2012).
  4. Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (6), 379-387 (2016).
  5. Faul, M., Xu, L., Wald, M., Coronado, V. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths. , (2010).
  6. Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
  7. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
  8. Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
  9. Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
  10. Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  11. Alyenbawwi, H., et al. Seizures are a druggable mechanistic link between TBI and subsequent tauopathy. eLife. 10, 58744 (2021).
  12. Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelia-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
  13. McCutcheon, V., et al. A novel model of traumatic brain injury in adult zebrafish demonstrates response to injury and treatment comparable with mammalian models. Journal of Neurotrauma. 34 (7), 1382-1393 (2017).
  14. Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
  15. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
  16. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  17. Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
  18. Mussulini, B. H., et al. Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization. PloS One. 8 (1), 54515 (2013).
  19. Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  20. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injuries. Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
  21. Amamoto, R., et al. Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury. eLife. 5, 13998 (2016).
  22. Yamamoto, S., Levin, H., Prough, D. Mild, moderate and severe: terminology implications for clinical and experimental traumatic brain injury. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 672-680 (2008).
  23. Lund, S., et al. Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77 (2016).
  24. Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).
  25. Ruff, R. M., et al. Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper. Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).
  26. Ganz, J., Brand, M. Adult neurogenesis in fish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (7), 019018 (2016).
  27. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).
  28. Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).

Tags

מדעי המוח גיליון 171 דג זברה התחדשות פגיעה מוחית טראומטית טראומה קהה מוח דג זברה התקף בצקת התפשטות
מודל מדרגי לחקר ההשפעות של פגיעה בוטה בכוח בדגי זברה בוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, … More

Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e62709, doi:10.3791/62709 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter