Summary
Мы модифицировали модель снижения веса Мармару для взрослых рыбок данио, чтобы изучить широту патологий после черепно-мозговой травмы тупой силы (ЧМТ) и механизмы, лежащие в основе последующей регенерации нейронов. Эта модель ЧМТ с тупой силой является масштабируемой, индуцирует легкую, умеренную или тяжелую ЧМТ и повторяет гетерогенность травмы, наблюдаемую при ЧМТ человека.
Abstract
Черепно-мозговые травмы тупой силы (ЧМТ) являются наиболее распространенной формой травмы головы, которая охватывает диапазон тяжестей и приводит к сложным и гетерогенным вторичным эффектам. Хотя нет механизма для замены или регенерации потерянных нейронов после ЧМТ у людей, рыбки данио обладают способностью регенерировать нейроны по всему телу, включая мозг. Чтобы изучить широту патологий, проявляющихся у рыбок данио после тупой ЧМТ, и изучить механизмы, лежащие в основе последующего регенеративного ответа нейронов, мы модифицировали обычно используемое падение веса грызунов Мармару для использования у взрослых рыбок данио. Наша простая модель тупой ЧМТ является масштабируемой, вызывая легкую, умеренную или тяжелую ЧМТ, и повторяет многие фенотипы, наблюдаемые после ЧМТ человека, такие как контактные и посттравматические судороги, отеки, субдуральные и внутримозговые гематомы и когнитивные нарушения, каждый из которых проявляется в зависимости от тяжести травмы. Последствия ЧМТ, которые начинают появляться в течение нескольких минут после травмы, стихают и возвращаются к почти неповрежденным контрольным уровням в течение 7 дней после травмы. Регенеративный процесс начинается уже через 48 часов после травмы (hpi), с пиком пролиферации клеток, наблюдаемым при 60 hpi. Таким образом, наша модель тупой ЧМТ рыбок данио производит характерные патологии ЧМТ первичного и вторичного повреждения, аналогичные ЧМТ человека, что позволяет исследовать начало и прогрессирование заболевания, а также механизмы регенерации нейронов, которые являются уникальными для рыбок данио.
Introduction
Черепно-мозговые травмы (ЧМТ) являются глобальным кризисом в области здравоохранения и основной причиной смерти и инвалидности. В Соединенных Штатах примерно 2,9 миллиона человек испытывают ЧМТ каждый год, а в период с 2006 по 2014 год смертность из-за ЧМТ или последствий ЧМТ увеличилась более чем на 50%1. Тем не менее, ЧМТ различаются по своей этиологии, патологии и клинической картине в значительной степени из-за механизма травмы (MOI), который также влияет на стратегии лечения и прогнозируемый прогноз2. Хотя ЧМТ могут быть результатом различных MOI, они преимущественно являются результатом либо проникающей, либо тупой травмы. Проникающие травмы составляют небольшой процент ЧМТ и порождают тяжелую и очаговую травму, которая локализуется в ближайших и окружающих пронзенных областях мозга3. Напротив, ЧМТ тупой силы чаще встречаются в общей популяции, охватывают диапазон тяжестей (легкая, умеренная и тяжелая) и вызывают диффузную, гетерогенную и глобальную травму, затрагивающую несколько областей мозга1,4,5.
Рыбки данио (Danio rerio) были использованы для изучения широкого спектра неврологических повреждений, охватывающих центральную нервную систему (ЦНС)6,7,8,9. Рыбки данио также обладают, в отличие от млекопитающих, врожденной и надежной регенеративной реакцией для восстановления повреждений ЦНС10. Современные модели травм рыбок данио используют различные методы травм, включая проникновение, иссечение, химическое оскорбление или волны давления11,12,13,14,15,16. Тем не менее, каждый из этих методов использует MOI, который редко испытывается человеческой популяцией, не масштабируется в диапазоне тяжести травм и не учитывает гетерогенность или тяжесть зависимых от осложнений ЧМТ, о которых сообщалось после тупой ЧМТ. Эти факторы ограничивают использование модели рыбок данио для понимания основных механизмов патологий, связанных с наиболее распространенной формой ЧМТ в человеческой популяции (легкие тупые травмы).
Мы стремились разработать быструю и масштабируемую модель тупой ЧМТ данио, которая предоставляет возможности для исследования патологии травмы, прогрессирования осложнений ЧМТ и врожденной регенеративной реакции. Мы модифицировали обычно используемое падение веса грызунов Marmarou17 и применили его к взрослым рыбкам данио. Эта модель дает воспроизводимый диапазон тяжестей, варьирующихся от легкой, умеренной до тяжелой. Эта модель также повторяет несколько аспектов патологии ЧМТ человека в зависимости от тяжести, включая судороги, отеки, субдуральные и внутримозговые гематомы, гибель нейронных клеток и когнитивные дефициты, такие как ухудшение обучения и памяти. Через несколько дней после травмы патологии и дефициты рассеиваются, возвращаясь к уровням, напоминающим неповрежденные контрольные группы. Кроме того, эта модель рыбок данио демонстрирует надежную реакцию пролиферации и регенерации нейронов по всей нейрооси в отношении тяжести травмы.
Здесь мы предоставляем подробную информацию о настройке и индукции травмы тупой силы, оценке посттравматических судорог, оценке сосудистых повреждений, инструкциях по подготовке участков мозга, подходах к количественной оценке отека и понимании пролиферативной реакции после травмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Рыбки данио выращивались и содержались на объекте Нотр-Дам Даниофиш в Центре наук о жизни Фраймана. Методы, описанные в этой рукописи, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Нотр-Дам.
1. Парадигма черепно-мозговой травмы
- Добавьте 1 мл 2-феноксиэтанола к 1 л системной воды (60 мг Instant Ocean в 1 л деионизированной воды RO).
- Подготовьте аэрированный резервуар для восстановления, содержащий 2 л системной воды комнатной температуры.
- Выберите желаемый вес шарикоподшипника и желаемую длину и диаметр стальных/пластиковых труб и определите энергию и силу удара.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трубки должны иметь внутренний диаметр, который позволяет шарикоподшипнику проходить без изменения его траектории или скорости движения.- Определите кинетическую энергию при ударе:
Где, KE = кинетическая энергия, m = масса (в кг), g = гравитационная сила, h = высота (в м) от точки падения рыбы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает кинетическую энергию в J. Умножьте значение на 1000, чтобы определить мДж. KE основан на ускоряющемся объекте, который возникает при падении шарикоподшипника из неподвижного положения. - Создайте мягкую ЧМТ (miTBI), используя стальную / пластиковую трубку длиной 7,62 см, которая заканчивается на 1,5 см выше пластины на черепе рыбки данио (общее расстояние 9,1 см) и шарикоподшипник весом 1,5 г (диаметр 6,4 мм). Они производят кинетическую энергию 1,33 мДж. Это повреждение было эмпирически решено быть эквивалентным миТМТ на основе ключевых патофизиологических маркеров ЧМТ, таких как сосудистое повреждение, образование субдуральной / внутримозговой гематомы, гибель нейрональных клеток и когнитивные нарушения, которые в значительной степени повторяли то, что было зарегистрировано в человеческой популяции в зависимости от тяжести.
- Рассчитать кинетическую энергию miTBI =
- Генерируйте умеренную ЧМТ (moTBI), используя стальную / пластиковую трубку длиной 12,7 см, которая заканчивается на 1,5 см выше пластины на черепе рыбки данио (общее расстояние 14,2 см) и шарикоподшипник весом 1,5 г (диаметр 6,4 мм), который производит кинетическую энергию 2,08 мДж.
- Рассчитать кинетическую энергию moTBI =
- Генерируйте тяжелую ЧМТ (sTBI), используя стальную / пластиковую трубку длиной 7,62 см, которая заканчивается на 1,5 см выше пластины на черепе рыбки данио (общее расстояние 9,1 см) и шарикоподшипник весом 3,3 г (диаметр 8,38 мм), который производит кинетическую энергию 2,94 мДж.
- Рассчитать кинетическую энергию sTBI =
- Определите кинетическую энергию при ударе:
- Наполните чашку Петри моделирующей глиной (рисунок 1, шаг 1) и используйте тупой инструмент (т.е. заднюю часть пары щипцов) для создания приподнятой платформы (5 см х 1,5 см) с дополнительной моделирующей глиной (рисунок 1, шаг 2).
- Используйте лезвие бритвы, чтобы разделить поднятую платформу вдоль на две примерно равные половины (рисунок 1, шаг 3, красная пунктирная линия). Сформируйте две половинки в канал, который вмещает длину взрослой рыбы (рисунок 1, шаг 4). Используйте дополнительную глину для строительства стен, которые закрепят ~ 2/3 тела рыбы, оставляя голову открытой.
- Заформуйте небольшую опору в открытой области головы перпендикулярно стенкам, чтобы поддержать голову, чтобы избежать вращения или отдачи головы при травме (рисунок 1, шаг 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Канал должен быть достаточно глубоким, чтобы поддерживать рыбу в спинном положении, но все же должен позволять голове лежать над окружающей глиной. Кроме того, опора головы должна следовать естественному искривлению рыбы, поддерживая нижнюю челюсть и жабры. - Убедитесь, что сброшенный вес не затруднен боковыми сторонами канала (рисунок 1, шаг 4).
- Создайте стальной диск диаметром 3 мм, используя мини-дырокол и мигание стали весом 22 г. Каждый диск может быть использован несколько раз.
- Обезболить одну рыбу, поместив ее в стакан с 50-100 мл 1:1000 (1 мл / 1 л, 0,1%) 2-феноксиэтанола, пока он не перестанет реагировать на защемление хвоста.
- Поместите рыбу, спинную сторону вверх, на глиняную форму в пределах канала так, чтобы тело было закреплено по бокам, и поместите стальной диск размером 3 мм 22 г на голову, центрированный над желаемой точкой удара (рисунок 1, шаг 5).
- Убедитесь, что рыба выровнена как можно более перпендикулярно, чтобы ее голова не наклонялась в одну сторону, что может привести к неравномерному удару.
- Закрепите стальную/пластиковую трубку, используя стандартную кольцевую подставку и зажим для рук, чтобы дно трубки находилось на 1,5 см выше головы рыбки данио (рисунок 1, шаг 6). Убедитесь, что трубка прямая.
- Посмотрите вниз на трубку и убедитесь, что трубка выровнена над стальной пластиной.
- Опустите шарикоподшипник (1,5 г для легкой и умеренной ЧМТ и 3,3 г для тяжелой ЧМТ) с заданной высоты (описанной в шагах 1.3.3-1.3.5) вниз по трубке на стальную пластину, расположенную над желаемой нейроанатомической областью интереса (например, мозжечок, рисунок 1, этап 5), чтобы получить ЧМТ тупой силы для желаемой тяжести травмы. Поместите раненую рыбу в резервуар для восстановления, за которым нужно следить.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от тяжести травмы может возникнуть смертность или тонико-клонические судороги. Если рыба не реагирует в течение длительного периода времени после ЧМТ, используйте переносную пипетку или щипцы для введения защемления хвоста и оценки реакции на боль.
2. Оценка судорог после ЧМТ у взрослых рыбок данио
- Обезболить и ранить рыбу в соответствии с протоколом травм, изложенным в разделе 1, и поместить поврежденную рыбу в аэрированный резервуар для восстановления 2 л системной воды.
- Наблюдайте за рыбой на предмет любых признаков посттравматических припадков, начинающихся сразу после помещения в реабилитационный резервуар. Установите время наблюдения (т.е. 1 ч) и запишите всю судорожную активность, включая оценку судорог (описанную ниже), продолжительность каждого приступа и процент рыб, которые испытали судороги (рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Судороги могут возникнуть сразу после травмы, а также через несколько часов или дней после ЧМТ. Судороги могут сохраняться в течение длительного времени, и у одной рыбы может быть несколько приступов. Установка времени наблюдения в 1 ч или более даст хорошее представление об общей тенденции частоты изъятий. - Оцените рыбу, используя рекомендации Mussulini18 для фенотипов захвата взрослых рыбок данио.
ПРИМЕЧАНИЕ: Без использования программного обеспечения для отслеживания трудно объективно оценить оценки судорог ниже 3. Поэтому при проведении оценки без программного обеспечения следует регистрировать только оценку изъятий 3 или более.
3. Рассечение мозга
- Усыпляют рыб в 1:500 (2 мл/1 л, 0,2%) растворе 2-феноксиэтанола, пока не прекратятся движения жабр, и они не будут реагировать на защемление плавников в нужной конечной точке.
- Наполните чашку Петри моделирующей глиной и создайте небольшую полость для поддержки тела во время рассечения.
- Поместите рыбу спинной стороной вверх в глиняную форму. Поместите один рассеченный штифт через среднюю линию на полпути вниз по телу рыбы и второй штифт ~ 5 мм за основанием головы.
- Под рассекающим световым микроскопом тупо отрежьте зрительный нерв парой щипцов Дюмона No5 и удалите глаза (рисунок 2А).
- Ориентируйте рыбу так, чтобы ростральный конец был самым дальним при взгляде через микроскоп (рисунок 2В).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги предназначены для правшей. Левши могут предпочесть выполнить следующие шаги в зеркальной ориентации. - Используйте щипцы No 5, чтобы медленно поместить один конец щипцов под правую теменную пластину, сделав преднамеренное ножничное действие, двигаясь к ростральному концу, и удалите правые теменные и лобные пластины (рисунок 2C).
- Держите щипцы под углом 45° или ниже, чтобы избежать проникновения в мозг во время рассечения.
- Поверните рыбу на 90° по часовой стрелке. Поместите один конец щипцов No 5 под левую теменную пластину и используйте то же движение ножницами, чтобы удалить левую теменную и фронтальную пластины, обнажая весь дорсальный аспект мозга (рисунок 2D, E).
- Тупо перечеркните верхнюю челюсть с помощью #5 щипцов. Сохраните обонятельные луковицы и не повредите их, если это интересующий регион.
- Удалите правую оперкул, преоперкул, интероперкул и субоперкулу с помощью #5 щипцов (рисунок 2F).
- Тупо резецируют мускулатуру на каудальном конце отверстия кальвария с помощью щипцов No5, обнажая спинной мозг.
- Тупо трансецировать спинной мозг щипцами No5. Осторожно поместите щипцы под мозг и аккуратно удалите мозг из кальвария.
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не щипайте мозг. Используйте щипцы, чтобы «колыбель» головного мозга или резецировать каудально и использовать открытый спинной мозг в качестве точки защемления для маневрирования мозгом. - Зафиксируйте удаленный мозг в 9 частях 100% этанола до 1 части 37% формальдегида на ночь при 4°C на коромысле.
4. Исследования отеков в мозге рыбок данио
- Обезболивайте и повреждайте рыб в соответствии с протоколом травм, изложенным в разделе 1, и позволяйте рыбам восстанавливаться в резервуаре для восстановления, пока они не начнут свободно плавать.
- Поместите рыбу обратно в нормальные условия содержания после травмы на 1 день.
- Усыпить рыбу в 1:500 2-феноксиэтанол, по прошествии времени.
- Рассекните весь мозг или интересующую область в соответствии с протоколом, изложенным в разделе 3, и поместите мозг немедленно на небольшую весовую лодку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность при переносе мозга, используя тонкие щипцы, чтобы аккуратно поместить его на весовую лодку без колющих или соскобленных мозгов, что может привести к потере ткани. - Этикетка (с группой травмы и номером мозга) и тара дополнительной небольшой сушильной весовой лодки на весах. Используйте шкалу с возможностью измерения минимум 0,001 г, чтобы получить точное измерение.
- Перенесите мозг на смоляную сушильную весовую лодку и запишите влажный вес мозга. Сориентируйте мозг так, чтобы они лежали ровно на весовой лодке спинной стороной вверх.
- Поместите сушильную весовую лодку и мозг в гибридизационную печь, установленную на 60 °C в течение 8 ч.
- После высыхания мозг может прилипнуть к сушильной весовой лодке и может быть трудно удалить и перенести на новую смолистую небольшую весовую лодку. Избегайте защемления мозга щипцами, так как это может привести к повреждению сухого мозга и потере ткани. Вместо этого сжимайте тонкие щипцы вместе и, начиная с вентральной стороны мозга, зачерпывайте движение вверх.
- Определите содержание воды в каждом мозге с помощью формулы (рисунок 4):
5. Маркировка клеточной пролиферации по нейрооси и подготовка фиксированной ткани.
- Готовят 10 мМ 5-этинил-2'-дезоксиуридина (ЭдУ) в 2 мл ddH2O.
- Обезболивать от 3 до 4 рыб за один раз в 50-100 мл 1:1000 (1 мл / 1 л, 0,1%) 2-феноксиэтанола до тех пор, пока рыба не перестанет реагировать на защемление хвоста, в желаемый момент времени после травмы (используя протокол, изложенный в разделе 1).
- Сделайте частичный разрез на влажной губке и поместите по одной рыбке за раз в отверстие, вентральной стороной вверх.
- Используйте иглу 30 г для введения ~ 40 мкл 10 мМ EdU в тело рыбы. Верните рыбу в резервуар для хранения, заполненный системной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторные инъекции могут быть выполнены в разные моменты времени для маркировки большего количества пролиферирующих клеток и могут потребоваться, если требуется период погони более 1 недели. - Соберите мозги, как описано в разделе 3, и поместите их как группу в стеклянный флакон объемом 5 мл, содержащий 2 мл из 9 частей 100% этанола до 1 части 37% формальдегида. Зафиксируйте мозг при 4 °C на платформе коромысла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коромыслочка или шейкерная платформа запрещает мозгу отдыхать внизу, а теленцефалону целого мозга скручиваться. - Регидратируйте мозги в том же стеклянном флаконе, который использовался для фиксации мозга, в промывках нисходящей серии этанола, 75%, 50% и 25%, в течение 15 минут каждый, с последующей промывкой 1,5 ч в 5% сахарозы / PBS на коромысле при комнатной температуре. Храните мозги в стеклянном флаконе на ночь в 30% сахарозы/PBS при 4°C на коромысле.
- Удалите мозг из 30% сахарозы/PBS и перенесите их щипцами в 12-луночную пластину (по одной группе обработки на лунку) с лунками, заполненными раствором 2:1, состоящим из 2 частей среды замораживания тканей и 1 части 30% сахарозы/PBS. Инкубируйте мозги в течение ночи при 4 °C на коромысле.
- Перенесите мозги в следующий ряд скважин в пределах 12-луночной пластины погружающих мозгов в 100% TFM в течение 2-24 ч при 4 °C.
- Используйте криостатный патрон, чтобы встроить мозг в TFM в нужной ориентации на сухом льду.
- Выполните криосечение (секции толщиной 16 мкм) и соберите секции на положительно заряженных слайдах. Сушите горки на горке грелкой в течение 1 ч, а затем хранят при -80 °C или продолжают иммуногистохимию.
- Подготовьте гидрофобный барьер на горке вокруг участков тканей и дайте высохнуть на горке грелкой в течение 20 минут.
- Кратковременно мойте слайды в PBS в течение 5 мин, а затем дважды в PBS-Tween 20 (0,05%) в течение 10 мин каждый.
- Выполните обнаружение EdU с помощью набора для пролиферации клеток EdU и инструкций производителя.
- Проанализируйте слайды и количественно оцените флуоресцентные клетки, меченые EdU, используя либо эпифлуоресцентный микроскоп, либо конфокальный микроскоп. Для четкого различения отдельных ячеек потребуется как минимум 40-кратный объектив.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подготовка установки для индукции травм позволяет быстро и упрощенно доставить масштабируемую ЧМТ тупой силы взрослой рыбке данио. Градуированная тяжесть модели травмы обеспечивает несколько легко идентифицируемых показателей успешной травмы, хотя повреждение сосудов является одной из самых простых и наиболее заметных патологий (рисунок 3). Штамм рыбы, используемой во время травмы, может облегчить или затруднить идентификацию этого показателя. При использовании рыбы AB дикого типа (WTAB, рисунок 3A-D) идентификацию сосудистого повреждения может быть трудно различить между miTBI или moTBI и неповрежденной контрольной рыбой из-за пигментации (Рисунок 3A-C). После травмы рыбы miTBI демонстрируют минимальные поверхностные ссадины (рисунок 3B), в то время как moTBI демонстрируют ограниченное кровоизлияние в мозг (рисунок 3C). Хотя STBI все еще может быть сложной задачей, степень травмы часто очевидна (рисунок 3D). Напротив, при использовании альбиноса (рисунок 3E-H) или касперной рыбы (рисунок 3I-L) повреждение сосудов легко идентифицируется. Кроме того, ударные судороги часто наблюдаются после травмы, и частота судорог среди группы является еще одним репрезентативным показателем травмы (таблица 1). У травмированных рыб будут наблюдаться тонико-клонические судороги (атаксия, ZBC 1.9, изгиб, ZBC 1.16, кружение, ZBC 1.32 и плавание штопором, ZBC 1.37)19, которые легко наблюдаются после травмы, независимо от фонового напряжения. Судороги будут наблюдаться с возрастающей распространенностью по отношению к тяжести. После травмы миТМ не проявляют судорожного поведения; тем не менее, moTBI будет демонстрировать поведение судорог (10,66% ± 1,37%, p < 0,0001, таблица 1), и заболеваемость еще более повышена у рыб с ЧМТ (19,93% ± 1,49%, p < 0,0001, таблица 1).
Успешное удаление мозга имеет решающее значение для множества дальнейших исследований, таких как отек и оценка пролиферации клеток. Выполняйте рассечения с максимальной осторожностью, чтобы избежать повреждения областей мозга (чаще всего непреднамеренным проколом) и сохранить все области (обонятельные луковицы могут быть легко потеряны). Следование процедуре рассечения мозга и схеме (раздел 3, рисунок 2A-F) позволяет полностью удалить мозг (рисунок 2G, H). Исследователи должны рассмотреть, требует ли их анализ всего мозга или набор конкретных областей мозга может удовлетворить их потребности. В зависимости от тяжести травмы и времени сбора, мозг может проявлять прикрепленные субдуральные кровоизлияния, однако они часто прилипают к нижней стороне черепа и теряются во время рассечения. Отек головного мозга временами очевиден, но из-за анатомических различий и вариаций в общем размере отек является лучшим методом оценки отека. Следуя описанному протоколу (раздел 4), неповрежденный мозг демонстрирует содержание жидкости 73,11% ± 0,80%, а миТБ, хотя и слегка повышен, не показывают значительного увеличения отека при 1, 3 или 5 dpi (1 dpi: 76,33% ± 1,32%, p = 0,36, 3 dpi: 75,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,14 ± 1,50%, p > 0,99, рисунок 4). Напротив, как moTBI, так и sTBI имели значительный отек 1 dpi (moTBI: 80,55 ± 0,94%, p < 0,0001, sTBI: 86% ± 1,05%, p < 0,0001) и 3 dpi (moTBI: 78,11 ± 0,93%, p < 0,018, sTBI: 77,77% ± 1,02%, p < 0,036, рисунок 4). Тем не менее, содержание жидкости как в moTBI, так и в sTBI вернулось к уровням, напоминающим неповрежденный контроль на 5 dpi (moTBI: 74,42 ± 1,25%, p > 0,99, sTBI: 73,85% ± 1,01%, p > 0,99, рисунок 4).
Пролиферация клеток после ЧМТ у рыбок данио является надежной оценкой степени повреждения. В то время как реакция пролиферации клеток была изучена ранее у рыбок данио после других форм черепно-мозговой травмы9,12, в большинстве случаев исследование было ограничено местом травмы. Эта тупая ЧМТ приводит к надежной реакции пролиферации, охватывающей нейрооси. В зависимости от тяжести (показаны данные sTBI) повышенная маркировка EdU наблюдается в желудочковой и субвентрикулярной зонах переднего мозга (теленцефалон, рисунок 5B) по сравнению с неповрежденными контрольными группами (рисунок 5A). По мере того, как участки перемещались каудально в средний мозг (мезенцефалон и диэнцефалон), поврежденный мозг демонстрировал повышенную маркировку EdU в перивентрикулярной серой зоне (PGZ), зрительных тектальных лепестках (TeO) и аспектах переднего гипоталамуса по сравнению с неповрежденными рыбами (рисунок 5D и рисунок 5C соответственно). В заднем мозге нейрогенные области, которые проявляются в неповрежденном мозге (рисунок 5E, G), демонстрируют повышенную пролиферацию клеток после STBI (Рисунок 5F, H).
Подводя итог, можно сказать, что модифицированное снижение веса Мармару, применяемое к взрослым рыбкам данио, обеспечивает воспроизводимую и масштабируемую легкую, умеренную или тяжелую ЧМТ тупой силы. Рыбки данио в зависимости от тяжести проявляют различные патологии, включая судороги и сосудистые повреждения (т.е. субдуральные и внутримозговые гематомы). Кроме того, у травмированных рыб снижается скорость восстановления (аналогично потере сознания, когнитивному дефициту в виде проблем с обучением и памятью, а также гибели нейронных клеток (данные не показаны). Наблюдаемые патологии быстро восстанавливаются в течение 4-7 дней, совпадая с устойчивыми пролиферативными событиями по всей нейрооси.
Рисунок 1: Настройка масштабируемого травматологического аппарата. Графическое представление установки, модели и доставки масштабируемых ЧМТ рыбкам данио. Шаги 1-4 дают инструктивный обзор шагов для формирования опорной формы, которая обездвиживает рыбу и обнажает голову во время повреждения. Шаги 5-7 содержат инструкции по доставке травмы с пониманием аспектов, которые следует учитывать при устранении неполадок модели. Рисунок был создан с BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Удаление черепа для рассечения мозга. Схема упрощенного черепа рыбки данио и поэтапное удаление кости (синие срезы) для обнажения мозга взрослой рыбки данио. (А,Б) Глаза тупо удаляются щипцами No5, перерезающими зрительные нервы. (C) Щипцы помещаются в мускулатуру непосредственно каудально к теменным пластинам (черная стрелка), чтобы удалить правую теменную кость, а затем правую лобную кость. (Д,Д) Удаляется левая теменная кость и левая лобная кость. (F) Правый оперкул, преоперкл, интероперкл и субоперкл удаляются, обеспечивая боковой и дорсальный доступ к мозгу. (Г,Ч) Неповрежденный и STBI мозг были удалены. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Повреждение сосудов в различных фонах по степени тяжести травмы. Дорсальный вид неповрежденных и ЧМТ дикого типа AB, альбиноб4 и каспер взрослых рыбок данио с сосудистым повреждением. (А-Д) Взрослые дикие рыбы AB сильно пигментированы, и ссадины после miTBI (B) трудно визуализировать. Повреждение сосудов было более очевидным у моТБ (C) и STBI (D) рыб по сравнению с неповрежденными контрольными группами (A). (Э-Н) Рыбы-альбиносы были менее пигментированы, а визуализация мозга была более отчетливой. Повреждение сосудов после ЧМТ четко наблюдалось и различалось по степени тяжести. (И-Л) Рыба-каспер обеспечила наиболее адаптируемый фон для начинающих исследователей, поскольку прозрачность позволила легко идентифицировать желаемые нейроанатомические области и четко наблюдать и разграничивать повреждение сосудов тяжестью ЧМТ. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Рыбки данио испытывают отек, вызванный травмой, после ЧМТ. Рыбки данио подвергались воздействию различной тяжести ЧМТ (неповрежденные, миТМТ, мотМТ И ЧМТ) и оценивались в разные дни после повреждения на процентное содержание жидкости (отек). Статистический анализ проводился с помощью Browns-Forsythe и Welch ANOVA, за которым последовал тест Даннетта на множественное сравнение T3 после специального исследования. n = общее количество отдельных рыб. Все статистические анализы проводились с помощью программного комплекса Prism (Graphpad 9.0). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Вызванная ЧМТ пролиферация по нейрооси. (А-Н) Конфокальные изображения корональных и сагиттальных отделов мозга неповрежденных и sTBI рыб, которым вводили EdU за 12 ч до сбора. Увеличение включения EdU наблюдалось в нескольких нейрогенных нишах после повреждения переднего мозга (A,B), среднего мозга (C,D) и заднего мозга (E-H). Мозжечок, CCe, Гранулярный слой, GL, Медиальный клапан cerebelli, Vam, Молекулярный слой, ML, Optic Tectum, TeO, Перивентрикулярная серая зона, PGZ, Теленцефалон и Тел. Все шкалы имеют размер 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Группа | N | n | Среднее значение судорог (%) ± SEM | p |
| Ундам | 10 | 74 | 0% | |
| миТБИ | 10 | 100 | 0% | >0,99 |
| мотБИ | 10 | 184 | 10.66% ± 1.37% | <0.0001 |
| стБИ | 10 | 237 | 19.93% ± 1.49% | <0.0001 |
Таблица 1. У рыбок данио наблюдаются зависимые от тяжести ударные судороги после ЧМТ. Количественная оценка тонико-клонических припадков, которая была зарегистрирована как процент экспериментальной травмированной группы, которые наблюдались в течение 1 ч после травмы. Статистический анализ проводился с помощью одностороннего ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест Туки. N = общее число экспериментальных групп, n = общее количество отдельных рыб. Статистический анализ проводился с использованием программного комплекса Prism (Graphpad 9.0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования нейротравм и связанных с ними последствий уже давно сосредоточены на традиционных нерегенеративных моделях грызунов20. Только недавно исследования применили различные формы повреждения ЦНС к регенеративным моделям9,11,13,14,21. Несмотря на проницательность, эти модели ограничены либо использованием метода травмы, редко встречающегося в человеческой популяции (проникающие травмы, химическая абляция, взрыв), и / или травма не масштабируется и, следовательно, не полностью учитывает гетерогенность зависимых от тяжести патологий, наблюдаемых в человеческой популяции22,23,24,25 . Здесь мы приводим парадигму повреждения, которая применяет наиболее распространенную форму клинически значимой травмы головы (тупая сила)4, которая производит многие патологические метрики, установленные в диагнозе человека22,23,24,25. При применении к регенеративным рыбкам данио модель предоставляет возможности для исследования прогрессирования и восстановления патологий, вызванных травмой, по степени тяжести, таких как отек или посттравматические судороги, а также выяснение механизмов, лежащих в основе врожденного регенеративного восстановления.
Есть две ключевые особенности нашей модели в производстве тупой ЧМТ у рыбок данио. Во-первых, наша модель обеспечивает недорогую и простую парадигму травмы, которая является быстрой, которая позволяет последовательно травмировать большое количество людей или повторные травмы человека исследовать кумулятивный эффект тупой ЧМТ. Во-вторых, эта модель легко масштабируется для изучения эффектов различных силовых воздействий. Изменяя длину трубки (высоту, с которой сбрасывается шарикоподшипник) и вес шарикоподшипника, можно легко модифицировать и вычислять энергию, доставляемую к черепу рыбы, и силу удара. Эта масштабируемость травмы позволяет проводить несколько направлений исследования в отношении прогрессирования последствий ЧМТ, зависящих от тяжести, и регенеративных механизмов восстановления ЦНС.
С несколькими метриками для доступа к успешному применению травм, все же следует тщательно рассмотреть генетический фон рыбы, которая будет использоваться. Рыба-мутант каспер или альбинос будет выгодна для начинающих исследователей, чтобы надежно поместить рыбу под стержень капли, размещение стального диска над желаемой нейроанатомической точкой удара и оценка сосудистого повреждения. Кроме того, тщательное удаление мозга упрощается визуальной доступностью костей и мозга у рыб-мутантов каспера и альбиноса . Тем не менее, пигментированная рыба дикого типа может быть использована, хотя идентификация ориентиров и успешное рассечение могут сопровождаться заметной практикой. Кроме того, пигментированная рыба может быть использована при производстве либо moTBI, либо sTBI инсульта, так как последующие патологии позволяют правильно охарактеризовать травму.
Одной из основных причин для изучения эффектов тупой ЧМТ у рыбок данио является изучение источника вызванной травмой пролиферации клеток и механизмов, лежащих в основе регенерации нейронов. Уровни развития и базальные уровни конститутивной пролиферации были идентифицированы в нейрогенных нишах нейроаксис рыбок данио26,27, а вызванная травмой регенерация наблюдалась локализованной или прилегающей к месту повреждения у взрослых рыбок данио8,12,15. Тем не менее, наша модель тупой ЧМТ демонстрирует, что диффузное повреждение также приводит к зависимому от тяжести событию пролиферации клеток в нейрогенных нишах по всей нейрооси. Идентификация источника и степени пролиферации клеток после ЧМТ позволит применять одноклеточную РНК-Seq для выявления изменений в экспрессии генов в пролиферативной нише и проверки роли различных сигнальных путей путем применения специфических агонистов и антагонистов в регулировании этого ответа регенерации. Этот подход оказался полезным для выяснения механизмов, лежащих в основе регенерации нейронов в поврежденной сетчатке рыбок данио28, и должен быть одинаково полезен в мозге после ЧМТ.
В заключение, наша модель обеспечивает быстрый, простой и экономически эффективный метод травмирования для обеспечения масштабируемой ЧМТ тупой силы. Эта модель будет полезна для дальнейшего изучения эффектов зависимой от тяжести или повторяющейся тупой ЧМТ, а также для выяснения терапевтических целей генетической регуляции, улучшающих защиту нейронов или индуцирующих регенерацию нейронов для функционального когнитивного восстановления у взрослых позвоночных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Хайда за их вдумчивые дискуссии, техников Центра наук о жизни Фрайманна по уходу за рыбками данио и разведению рыбок данио и Университет Нотр-Дам Оптическая микроскопия Core / NDIIF за использование инструментов и их услуг. Эта работа была поддержана Центром исследований рыбок данио в Университете Нотр-Дам, Центром стволовых клеток и регенеративной медицины в Университете Нотр-Дам, а также грантами Национального института глаз NIH R01-EY018417 (DRH), Программы стипендий выпускников Национального научного фонда (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Стипендия Стражей Свободы (JTH) и Стипендия Пэта Тиллмана (JTH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).
- Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
- Santiago, L. A., Oh, B. C., Dash, P. K., Holcomb, J. B., Wade, C. E. A clinical comparison of penetrating and blunt traumatic brain injuries. Brain injury. 26 (2), 107-125 (2012).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (6), 379-387 (2016).
- Faul, M., Xu, L., Wald, M., Coronado, V. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths. , (2010).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Alyenbawwi, H., et al. Seizures are a druggable mechanistic link between TBI and subsequent tauopathy. eLife. 10, 58744 (2021).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelia-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- McCutcheon, V., et al. A novel model of traumatic brain injury in adult zebrafish demonstrates response to injury and treatment comparable with mammalian models. Journal of Neurotrauma. 34 (7), 1382-1393 (2017).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Mussulini, B. H., et al. Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization. PloS One. 8 (1), 54515 (2013).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Amamoto, R., et al. Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury. eLife. 5, 13998 (2016).
- Yamamoto, S., Levin, H., Prough, D. Mild, moderate and severe: terminology implications for clinical and experimental traumatic brain injury. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 672-680 (2008).
- Lund, S., et al. Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77 (2016).
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).
- Ruff, R. M., et al. Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper. Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).
- Ganz, J., Brand, M.
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).
