Summary
Modificamos el modelo de caída de peso de Marmarou para peces cebra adultos para examinar una amplia gama de patologías después de una lesión cerebral traumática por fuerza contundente (LCT) y los mecanismos subyacentes a la regeneración neuronal posterior. Este modelo de LCT de fuerza contundente es escalable, induce una LCT leve, moderada o grave y recapitula la heterogeneidad de lesiones observada en una LCT humana.
Abstract
Las lesiones cerebrales traumáticas por fuerza contundente (LCT) son la forma más común de traumatismo craneal, que abarca una variedad de gravedades y da como resultado efectos secundarios complejos y heterogéneos. Si bien no existe un mecanismo para reemplazar o regenerar las neuronas perdidas después de una lesión cerebral traumática en humanos, el pez cebra posee la capacidad de regenerar neuronas en todo su cuerpo, incluido el cerebro. Para examinar la amplitud de las patologías exhibidas en el pez cebra después de una LCT de fuerza contundente y estudiar los mecanismos subyacentes a la respuesta regenerativa neuronal posterior, modificamos la caída de peso de Marmarou en roedores de uso común para el uso en peces cebra adultos. Nuestro modelo de LCT de fuerza contundente simple es escalable, induciendo una LCT leve, moderada o grave, y recapitula muchos de los fenotipos observados después de la LCT humana, como convulsiones de contacto y postraumáticas, edema, hematomas subdurales e intracerebrales y deficiencias cognitivas, cada una de las cuales se muestra de una manera dependiente de la gravedad de la lesión. Las secuelas de LCT, que comienzan a aparecer a los pocos minutos de la lesión, desaparecen y vuelven a niveles de control casi intactos dentro de los 7 días posteriores a la lesión. El proceso regenerativo comienza tan pronto como 48 horas después de la lesión (hpi), con el pico de proliferación celular observado por 60 hpi. Por lo tanto, nuestro modelo de LCT de fuerza contundente del pez cebra produce patologías características de LCT de lesión primaria y secundaria similares a la LCT humana, lo que permite investigar el inicio y la progresión de la enfermedad, junto con los mecanismos de regeneración neuronal que son exclusivos del pez cebra.
Introduction
Las lesiones cerebrales traumáticas (LCT) son una crisis de salud mundial y una de las principales causas de muerte y discapacidad. En los Estados Unidos, aproximadamente 2.9 millones de personas experimentan una LCT cada año, y entre 2006-2014 la mortalidad debido a una LCT o secuelas de LCT aumentó en más del 50%1. Sin embargo, las LCT varían en su etiología, patología y presentación clínica debido en gran parte al mecanismo de lesión (MOI), que también influye en las estrategias de tratamiento y el pronóstico previsto2. Aunque las LCT pueden ser el resultado de varios MOI, son predominantemente el resultado de un trauma penetrante o de fuerza contundente. Los traumatismos penetrantes representan un pequeño porcentaje de LCT y generan una lesión grave y focal que se localiza en las regiones cerebrales empaladas inmediatas y circundantes3. Por el contrario, las LCT de fuerza contundente son más comunes en la población general, abarcan una variedad de gravedades (leve, moderada y grave) y producen una lesión difusa, heterogénea y global que afecta a múltiples regiones cerebrales1,4,5.
El pez cebra (Danio rerio) se ha utilizado para examinar una amplia gama de insultos neurológicos que abarcan el sistema nervioso central (SNC)6,7,8,9. El pez cebra también posee, a diferencia de los mamíferos, una respuesta regenerativa innata y robusta para reparar el daño del SNC10. Los modelos actuales de trauma del pez cebra utilizan varios métodos de lesión, incluyendo penetración, escisión, insulto químico u ondas de presión11,12,13,14,15,16. Sin embargo, cada uno de estos métodos utiliza un MOI que rara vez es experimentado por la población humana, no es escalable en una variedad de gravedades de lesiones y no aborda la heterogeneidad o las secuelas de TBI dependientes de la gravedad reportadas después de una TBI de fuerza contundente. Estos factores limitan el uso del modelo de pez cebra para comprender los mecanismos subyacentes de las patologías asociadas con la forma más común de LCT en la población humana (lesiones leves por fuerza contundente).
Nuestro objetivo fue desarrollar un modelo de pez cebra TBI de fuerza contundente rápido y escalable que proporcione vías para investigar la patología de la lesión, la progresión de las secuelas de TBI y la respuesta regenerativa innata. Modificamos la caída de peso del roedor de uso común Marmarou17 y la aplicamos al pez cebra adulto. Este modelo produce un rango reproducible de severidades que van desde leves, moderadas a graves. Este modelo también recapitula múltiples facetas de la patología de TBI humana, de una manera dependiente de la gravedad, incluidas convulsiones, edema, hematomas subdurales e intracerebrales, muerte celular neuronal y déficits cognitivos, como el deterioro del aprendizaje y la memoria. Días después de la lesión, las patologías y los déficits se disipan, volviendo a niveles similares a los controles no dañados. Además, este modelo de pez cebra muestra una respuesta robusta de proliferación y regeneración neuronal a través del neuroeje con respecto a la gravedad de la lesión.
Aquí, proporcionamos detalles sobre la configuración e inducción del trauma por fuerza contundente, la puntuación de las convulsiones postraumáticas, la evaluación de las lesiones vasculares, las instrucciones sobre la preparación de las secciones cerebrales, los enfoques para cuantificar el edema y la comprensión de la respuesta proliferativa después de la lesión.
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Protocol
El pez cebra se crió y mantuvo en las instalaciones de Notre Dame Zebrafish en el Centro de Ciencias de la Vida Freimann. Los métodos descritos en este manuscrito fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Notre Dame.
1. Paradigma de la lesión cerebral traumática
- Agregue 1 ml de 2-fenoxietanol a 1 L de agua del sistema (60 mg de Instant Ocean en 1 L de agua ro desionizada).
- Prepare un tanque de recuperación aireado que contenga 2 L de agua del sistema a temperatura ambiente.
- Seleccione el peso deseado del rodamiento de bolas y la longitud y el diámetro deseados de los tubos de acero / plástico y determine la energía y la fuerza de impacto.
NOTA: El tubo debe tener un diámetro interior que permita el paso del rodamiento de bolas sin cambiar su trayectoria o velocidad de movimiento.- Determinar la energía cinética tras el impacto:
Donde, KE = energía cinética, m = masa (en kg), g = fuerza gravitacional, h = altura (en m) desde el punto de caída hasta el pez.
NOTA: Esto proporciona energía cinética en J. Multiplique el valor por 1,000 para determinar mJ. KE se basa en un objeto de aceleración, que ocurre cuando el rodamiento de bolas se deja caer desde una posición estacionaria. - Genere una LCT suave (miTBI) utilizando tubos de acero/plástico de 7,62 cm de largo que terminan a 1,5 cm por encima de la placa en el cráneo del pez cebra (distancia total de 9,1 cm) y un rodamiento de bolas de 1,5 g (6,4 mm de diámetro). Estos producen una energía cinética de 1,33 mJ. Este daño se decidió empíricamente que era equivalente a un miTBI basado en marcadores clave de TBI fisiopatológicos, como lesión vascular, formación de hematomas subdurales / intracerebrales, muerte celular neuronal y deficiencias cognitivas que recapitularon en gran medida lo que se informó en la población humana de una manera dependiente de la gravedad.
- Calcular la energía cinética miTBI =
- Genere un TBI moderado (moTBI) utilizando tubos de acero /plástico de 12,7 cm de largo que terminan a 1,5 cm por encima de la placa en el cráneo del pez cebra (distancia total 14,2 cm) y un rodamiento de bolas de 1,5 g (6,4 mm de diámetro) que produce una energía cinética de 2,08 mJ.
- Calcular la energía cinética moTBI =
- Genere una LCT severa (sTBI) utilizando tubos de acero /plástico de 7,62 cm de largo que terminan a 1,5 cm por encima de la placa en el cráneo del pez cebra (distancia total de 9,1 cm) y un rodamiento de bolas de 3,3 g (8,38 mm de diámetro) que produce una energía cinética de 2,94 mJ.
- Calcular la energía cinética sTBI =
- Determinar la energía cinética tras el impacto:
- Llene una placa de Petri con arcilla de modelado (Figura 1, paso 1) y use un instrumento contundente (es decir, la parte posterior de un par de pinzas) para crear una plataforma elevada (5 cm x 1,5 cm) con arcilla de modelado adicional (Figura 1, paso 2).
- Use una hoja de afeitar para dividir la plataforma elevada longitudinalmente en dos mitades aproximadamente iguales (Figura 1, paso 3, línea discontinua roja). Forme las dos mitades en un canal que se adapte a la longitud de un pez adulto (Figura 1, paso 4). Use arcilla adicional para construir paredes que aseguren ~ 2/3 del cuerpo del pez, dejando la cabeza expuesta.
- Moldee un pequeño soporte en la región de la cabeza expuesta perpendicular a las paredes para apoyar la cabeza para evitar la rotación o retroceso de la cabeza en caso de lesión (Figura 1, paso 4).
NOTA: El canal debe ser lo suficientemente profundo como para soportar a los peces en una posición dorsal hacia arriba, pero aún así debe permitir que la cabeza descanse por encima de la arcilla circundante. Además, el soporte de la cabeza debe seguir la curvatura natural de los peces, apoyando la mandíbula inferior y las branquias. - Asegúrese de que el peso caído no se vea obstaculizado por los lados del canal (Figura 1, paso 4).
- Cree un disco de acero de 3 mm de diámetro utilizando un mini taladro y un parpadeo de acero de 22 g. Cada disco se puede utilizar varias veces.
- Anestesiar un pez colocándolo en un vaso de precipitados con 50-100 mL de 1:1000 (1 mL/1 L, 0.1%) 2-fenoxietanol hasta que no responda al pellizco de la cola.
- Coloque el pez, dorsal hacia arriba, sobre el molde de arcilla dentro del canal para que el cuerpo esté asegurado a los lados y coloque un disco de acero de 3 mm y 22 g en la cabeza, centrado sobre el punto de impacto deseado (Figura 1, paso 5).
- Asegúrese de que el pez esté alineado lo más perpendicularmente posible para evitar que su cabeza se incline hacia un lado, lo que podría causar un impacto desigual.
- Asegure el tubo de acero / plástico, utilizando un soporte de anillo estándar y una abrazadera de brazo, de modo que la parte inferior del tubo esté a 1,5 cm por encima de la cabeza del pez cebra (Figura 1, paso 6). Asegúrese de que el tubo esté recto.
- Mire hacia abajo en el tubo y asegúrese de que el tubo esté alineado por encima de la placa de acero.
- Deje caer el rodamiento de bolas (1,5 g para LCT leve y moderada, y 3,3 g para LCT grave) desde una altura predeterminada (descrita en los pasos 1.3.3-1.3.5) por el tubo sobre la placa de acero ubicada sobre la región neuroanatómica de interés deseada (por ejemplo, cerebelo, Figura 1, paso 5) para producir la LCT de fuerza contundente para la gravedad deseada de la lesión. Coloque a los peces heridos en un tanque de recuperación para ser monitoreados.
NOTA: Dependiendo de la gravedad de la lesión, puede ocurrir mortalidad o convulsiones tónico-clónicas. Si los peces no responden durante un período prolongado de tiempo después de la LCT, use una pipeta de transferencia o fórceps para administrar un pellizco de cola y evaluar una respuesta al dolor.
2. Puntuación de las convulsiones post-LCT en el pez cebra adulto
- Anestesiar y lesionar a los peces de acuerdo con el protocolo de lesiones descrito en la sección 1 y colocar los peces heridos en un tanque de recuperación aireado de 2 L de agua del sistema.
- Observe a los peces en busca de signos de convulsiones postraumáticas que comiencen inmediatamente después de ser colocados en el tanque de recuperación. Establezca un tiempo de observación (es decir, 1 h) y registre toda la actividad convulsiva, incluida la puntuación de las convulsiones (que se describe a continuación), la duración de cada convulsión y el porcentaje de peces que experimentaron convulsiones (Figura 2A).
NOTA: Las convulsiones pueden ocurrir inmediatamente después de la lesión, así como horas o días después de una LCT. Las convulsiones pueden persistir a largo plazo y un solo pez puede tener múltiples convulsiones. Establecer un tiempo de observación de 1 h o más producirá una buena representación de la tendencia general de las tasas de incautación. - Puntúe a los peces utilizando las pautas de Mussulini18 para los fenotipos de convulsiones de pez cebra adulto.
NOTA: Sin el uso del software de seguimiento, es difícil evaluar los puntajes de convulsiones por debajo de 3 de manera imparcial. Por lo tanto, solo se deben registrar los puntajes de incautación de 3 o más cuando la evaluación se realiza sin software.
3. Disección cerebral
- Sacrificar a los peces en una solución de 2-fenoxietanol 1:500 (2 ml/1 L, 0,2%), hasta que cesen los movimientos branquiales y no sean reactivos al pellizco de la aleta, en el punto final deseado.
- Llene una placa de Petri con arcilla de modelado y cree una pequeña cavidad para apoyar el cuerpo durante la disección.
- Coloque el pez, dorsal hacia arriba, en el molde de arcilla. Coloque un pasador de disección a través de la línea media hasta la mitad del cuerpo del pez y un segundo pasador ~ 5 mm detrás de la base de la cabeza.
- Bajo un microscopio de luz de disección, corte sin rodeos el nervio óptico con un par de fórceps Dumont # 5 y retire los ojos (Figura 2A).
- Orientar el pez para que el extremo rostral esté más lejos al mirar a través del microscopio (Figura 2B).
NOTA: Los siguientes pasos son para personas diestras. Las personas zurdas pueden preferir realizar los siguientes pasos en una orientación reflejada. - Use pinzas # 5 para colocar lentamente un extremo de las pinzas debajo de la placa parietal derecha, haciendo una acción deliberada de tijera moviéndose hacia el extremo rostral y retire las placas parietal y frontal derecha (Figura 2C).
- Mantenga los fórceps en un ángulo de 45 ° o menos para evitar penetrar en el cerebro durante la disección.
- Gire el pez 90° en el sentido de las agujas del reloj. Coloque un extremo de las pinzas # 5 debajo de la placa parietal izquierda y use el mismo movimiento de tijera para eliminar las placas parietal y frontal izquierda que exponen todo el aspecto dorsal del cerebro (Figura 2D, E).
- Transecte sin rodeos el maxilar con fórceps #5. Conservar los bulbos olfativos y no dañarlos si esta es la región de interés.
- Retire el opáculo derecho, el preopercle, el interopercle y el subópercle con fórceps #5 (Figura 2F).
- Reseque sin rodeos la musculatura en el extremo caudal de la abertura del calvario usando pinzas # 5, exponiendo la médula espinal.
- Transecte sin rodeos la médula espinal con fórceps # 5. Coloque cuidadosamente los fórceps debajo del cerebro y retire suavemente el cerebro del calvario.
NOTA: Nunca pellizque el cerebro. Use fórceps para "acunar" el cerebro o resecar caudalmente y utilice la médula espinal expuesta como un punto de pellizco para maniobrar el cerebro. - Fije los cerebros eliminados en 9 partes 100% etanol a 1 parte 37% formaldehído durante la noche a 4 ° C en una plataforma basculante.
4. Estudios de edema en el cerebro del pez cebra
- Anestesiar y lesionar a los peces de acuerdo con el protocolo de lesiones descrito en la sección 1 y permitir que los peces se recuperen en un tanque de recuperación hasta que comiencen a nadar libremente.
- Coloque el pescado de nuevo en las condiciones normales de alojamiento después de la lesión durante 1 día.
- Sacrificar los peces en 1:500 2-fenoxietanol, después de que haya transcurrido el tiempo.
- Diseccionar todo el cerebro o la región de interés de acuerdo con el protocolo descrito en la sección 3 y colocar el cerebro inmediatamente en un pequeño bote de pesaje.
NOTA: Tenga cuidado al transferir el cerebro, usando fórceps finos para colocarlo suavemente en el bote de pesaje sin apuñalar o raspar el cerebro, lo que podría resultar en la pérdida de tejido. - Etiqueta (con el grupo de lesiones y el número de cerebros) y tara un pequeño bote de pesaje de secado adicional en una báscula. Utilice una báscula con la capacidad de medir un mínimo de 0,001 g para obtener una medición precisa.
- Transfiera el cerebro al bote de pesaje de secado de alquitranes y registre el peso húmedo del cerebro. Oriente los cerebros para que se acuesten planos en el bote de pesaje con el lado dorsal hacia arriba.
- Coloque el bote de pesaje y el cerebro de secado en un horno de hibridación a 60 ° C durante 8 h.
- Después del secado, el cerebro puede adherirse al bote de pesaje de secado y puede ser difícil de quitar y transferir a un nuevo bote de pesaje pequeño alquitranado. Evite pellizcar el cerebro con fórceps, ya que esto podría provocar daños en el cerebro seco y pérdida de tejido. En su lugar, pellizque las pinzas finas juntas y, comenzando en el lado ventral del cerebro, tome una cuchara en un movimiento hacia arriba.
- Determinar el contenido de agua de cada cerebro utilizando la fórmula (Figura 4):
5. Etiquetado de la proliferación celular a través del neuroeje y preparación de tejido fijo.
- Preparar 10 mM 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) en 2 mL de ddH2O.
- Anestesiar de 3 a 4 peces a la vez en 50-100 mL de 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) 2-fenoxietanol hasta que los peces no respondan al pellizco de la cola, en el punto de tiempo deseado después de la lesión (utilizando el protocolo descrito en la sección 1).
- Haga una incisión parcial en una esponja húmeda y coloque un pez a la vez en la abertura, con el lado ventral hacia arriba.
- Use una aguja de 30 G para inyectar ~ 40 μL de 10 mM EdU en el cuerpo del pez. Devuelva los peces a un tanque de retención lleno de agua del sistema.
NOTA: Las inyecciones repetidas se pueden realizar en diferentes puntos de tiempo para etiquetar un mayor número de células proliferantes y pueden ser necesarias si se desea un período de persecución de más de 1 semana. - Recoja los cerebros como se describe en la sección 3 y colóquelos como un grupo en un vial de vidrio de 5 ml que contenga 2 ml de 9 partes de etanol al 100% de etanol a 1 parte de formaldehído al 37%. Fije los cerebros a 4 °C en una plataforma basculante.
NOTA: Una plataforma basculante o agitadora prohíbe que los cerebros descansen en la parte inferior y que el telencéfalo de cerebros enteros se enrosque. - Rehidrate los cerebros, en el mismo vial de vidrio utilizado para fijar los cerebros, en lavados de series de etanol descendente, 75%, 50% y 25%, durante 15 minutos cada uno, seguido de un lavado de 1,5 h en sacarosa / PBS al 5% en un balancín a temperatura ambiente. Guarde los cerebros en un vial de vidrio durante la noche en sacarosa al 30% / PBS a 4 ° C en una plataforma basculante.
- Retire los cerebros del 30% de sacarosa / PBS y transfiéralos con fórceps a una placa de 12 pocillos (un grupo de tratamiento por pozo) con pocillos llenos de una solución 2: 1 que consiste en 2 partes de medio de congelación de tejido y 1 parte de sacarosa / PBS al 30%. Incubar los cerebros durante la noche a 4 °C en una plataforma basculante.
- Transfiera los cerebros a la siguiente fila de pozos dentro de la placa de 12 pocillos sumergiendo los cerebros en 100% TFM durante 2-24 h a 4 ° C.
- Use un mandril de criostato para incrustar los cerebros en TFM en la orientación deseada sobre hielo seco.
- Realice la crioseccionación (secciones de 16 μm de espesor) y recoja las secciones en diapositivas cargadas positivamente. Seque los portaobjetos en un portaobjetos más caliente durante 1 h y luego almacene a -80 °C o continúe con inmunohistoquímica.
- Prepare una barrera hidrofóbica en el portaobjetos alrededor de las secciones de tejido y deje secar en un calentador de diapositivas durante 20 minutos.
- Lave brevemente las diapositivas en PBS durante 5 min y luego dos veces en PBS-Tween 20 (0.05%) durante 10 min cada una.
- Realice la detección de EdU utilizando el kit de proliferación de células EdU y las instrucciones del fabricante.
- Analice las diapositivas y cuantifique las células fluorescentes marcadas con EdU utilizando un microscopio epifluorescente o un microscopio confocal. Se requerirá un mínimo de un objetivo 40x para distinguir claramente las células individuales.
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Representative Results
La preparación de la plataforma de inducción de lesiones permite un medio rápido y simplista de entregar una LCT escalable de fuerza contundente al pez cebra adulto. La gravedad graduada del modelo de lesión proporciona varias métricas fácilmente identificables de una lesión exitosa, aunque la lesión vascular es una de las patologías más fáciles y prominentes (Figura 3). La cepa de pescado utilizada durante la lesión puede hacer que este indicador sea más fácil o más difícil de identificar. Cuando se utilizan peces AB de tipo silvestre (WTAB, Figura 3A-D), la identificación de la lesión vascular puede ser difícil de distinguir entre miTBI o moTBI y los peces de control no dañados debido a la pigmentación (Figura 3A-C). Después de la lesión, los peces miTBI muestran abrasiones superficiales mínimas (Figura 3B), mientras que moTBI exhibe una hemorragia cerebral limitada (Figura 3C). Si bien el sTBI aún puede ser un desafío, el alcance de la lesión a menudo es evidente (Figura 3D). Por el contrario, cuando se utiliza albino (Figura 3E-H) o pez casper (Figura 3I-L), la lesión vascular se identifica fácilmente. Además, las convulsiones de impacto a menudo se observan después de la lesión y la tasa de convulsiones entre el grupo es otra métrica representativa de la lesión (Tabla 1). Los peces lesionados mostrarán convulsiones tónico-clónicas (ataxia, ZBC 1.9, flexión, ZBC 1.16, círculos, ZBC 1.32 y natación de sacacorchos, ZBC 1.37)19 que se observan fácilmente después de la lesión, independientemente de la tensión de fondo. Se observarán convulsiones con una prevalencia creciente en relación con la gravedad. Después de la lesión, los miTBI no muestran comportamientos similares a las convulsiones; sin embargo, moTBI mostrará comportamientos convulsivos (10,66% ± 1,37%, p < 0,0001, Tabla 1) y la incidencia se eleva aún más en peces sTBI (19,93% ± 1,49%, p < 0,0001, Tabla 1).
La extirpación exitosa del cerebro es fundamental para una gran cantidad de investigaciones adicionales, como el edema y la evaluación de la proliferación celular. Realice disecciones con el máximo cuidado para evitar dañar las regiones cerebrales (la mayoría de las veces por punción involuntaria) y para conservar todas las regiones (los bulbos olfativos se pueden perder fácilmente). Siguiendo el procedimiento de disección cerebral y el esquema (sección 3, Figura 2A-F) permite una extirpación cerebral completa (Figura 2G, H). Los investigadores deben considerar si su análisis requiere todo el cerebro o si una colección de regiones cerebrales específicas puede satisfacer sus necesidades. Dependiendo de la gravedad de la lesión y el tiempo de recolección, los cerebros pueden exhibir hemorragias subdurales adjuntas, sin embargo, a menudo se adhieren a la parte inferior del cráneo y se pierden durante la disección. La hinchazón del cerebro es a veces evidente, pero debido a las diferencias anatómicas y la variación en el tamaño general, el edema es el mejor método para evaluar la hinchazón. Siguiendo el protocolo descrito (sección 4), los cerebros no dañados exhiben un contenido de líquido de 73.11% ± 0.80%, y miTBI, aunque ligeramente elevado, no muestra un aumento significativo del edema a 1, 3 o 5 dpi (1 dpi: 76.33% ± 1.32%, p = 0.36, 3 dpi: 75.33 ± 1.37%, p = 0.84, 5 dpi: 74.14 ± 1.50%, p > 0.99, Figura 4). En contraste, tanto moTBI como sTBI tuvieron edema significativo de 1 dpi (moTBI: 80.55 ± 0.94%, p < 0.0001, sTBI: 86% ± 1.05%, p < 0.0001), y 3 dpi (moTBI: 78.11 ± 0.93%, p < 0.018, sTBI: 77.77% ± 1.02%, p < 0.036, Figura 4). Sin embargo, el contenido de líquido tanto de moTBI como de sTBI volvió a niveles similares a los controles no dañados en 5 dpi (moTBI: 74.42 ± 1.25%, p > 0.99, sTBI: 73.85% ± 1.01%, p > 0.99, Figura 4).
La proliferación celular, después de una LCT en el pez cebra, es una evaluación sólida del alcance de la lesión. Si bien la respuesta de proliferación celular se ha estudiado previamente en el pez cebra después de otras formas de lesión cerebral9,12, en la mayoría de los casos, la investigación se limitó al sitio de la lesión. Esta LCT de fuerza contundente da como resultado una respuesta de proliferación robusta que abarca el neuroeje. De manera dependiente de la gravedad (se muestran los datos de sTBI), se observa un aumento del etiquetado de EdU en las zonas ventricular y subventricular del cerebro anterior (telencéfalo, Figura 5B) en relación con los controles no dañados (Figura 5A). A medida que las secciones se movían caudalmente hacia el mesencéfalo (mesencéfalo y diencéfalo), los cerebros lesionados mostraron un mayor etiquetado de EdU en la zona gris periventricular (PGZ), los lóbulos tectales ópticos (TeO) y aspectos del hipotálamo anterior en comparación con los peces no dañados (Figura 5D y Figura 5C, respectivamente). En el cerebro posterior, las regiones neurogénicas que son evidentes en el cerebro no dañado (Figura 5E, G) exhiben una mayor proliferación celular después de la STBI (Figura 5F, H).
Para resumir, una caída de peso de Marmarou modificada aplicada al pez cebra adulto proporciona una LCT de fuerza contundente leve, moderada o severa reproducible y escalable. El pez cebra, de una manera dependiente de la gravedad, muestra varias patologías, incluidas las convulsiones y la lesión vascular (es decir, hematomas subdurales e intracerebrales). Además, los peces lesionados muestran una disminución de la tasa de recuperación (análoga a la pérdida de conciencia, déficits cognitivos en forma de problemas de aprendizaje y memoria, y muerte celular neuronal (datos no mostrados). Las patologías observadas, se recuperan rápidamente en el lapso de 4-7 días coincidiendo con eventos proliferativos robustos a través del neuroeje.
Figura 1: Configuración del aparato de lesiones escalable. Representación gráfica de la configuración, el modelo y la entrega de TBI escalables al pez cebra. Los pasos 1-4 proporcionan una visión general instructiva de los pasos para formar el molde de soporte que inmoviliza a los peces y expone la cabeza durante el daño. Los pasos 5-7 proporcionan instrucciones sobre la entrega de la lesión con información sobre los aspectos a considerar al solucionar problemas del modelo. La figura fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Extracción del cráneo para la disección cerebral. Esquema de un cráneo de pez cebra simplificado y la extracción paso a paso del hueso (secciones azules) para exponer el cerebro adulto del pez cebra. (A,B) Los ojos se eliminan sin rodeos con fórceps # 5 que cortan los nervios ópticos. (C) Los fórceps se colocan en la musculatura directamente caudal a las placas parietales (flecha negra) para extraer el hueso parietal derecho y luego el hueso frontal derecho. (D,E) Se extirpan el hueso parietal izquierdo y el hueso frontal izquierdo. (F) Se extirpan el opérculo derecho, el preopérculo, el interórculo y el subópercle, proporcionando acceso lateral y dorsal al cerebro. (G,H) Se extirparon los cerebros no dañados y con STBI. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Lesión vascular en varios contextos a través de la gravedad de la lesión. Vista dorsal de peces cebra adultos AB, albinob4 y casper de tipo salvaje no dañados y con LCT que muestran lesión vascular. (A-D) Los peces AB adultos de tipo salvaje están muy pigmentados y las abrasiones después de miTBI (B) son difíciles de visualizar. La lesión vascular fue más evidente en los peces moTBI (C) y sTBI (D) en comparación con los controles no dañados (A). (E-H) los peces albinos estaban menos pigmentados y la visualización del cerebro era más distinta. La lesión vascular después de una LCT se observó claramente y se distinguió entre las gravedades. (I-L) El pez casper proporcionó el fondo más adaptable para los investigadores novatos, ya que la transparencia permitió una fácil identificación de las regiones neuroanatómicas deseadas y una clara observación y delineación de la lesión vascular por gravedad de TBI. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El pez cebra experimenta edema inducido por lesiones después de una LCT. El pez cebra fue expuesto a diferentes severidades de TBI (sin daños, miTBI, moTBI y sTBI) y evaluado en diferentes días después del daño por porcentaje de contenido de líquido (edema). Los análisis estadísticos se realizaron con un ANOVA de Browns-Forsythe y Welch seguido de una prueba post-hoc de comparación múltiple T3 de Dunnett. n = número total de peces individuales. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete de software Prism (Graphpad 9.0). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Proliferación inducida por LCT a través de los neuroejes. (A-H) Imágenes confocales de secciones cerebrales coronales y sagitales de peces no dañados y con STBI que fueron inyectados por IP con EdU 12 h antes de la recolección. Se observó un aumento de la incorporación de EdU en múltiples nichos neurogénicos después de una lesión en el cerebro anterior (A, B), el mesencéfalo (C, D) y el cerebro posterior (E-H). Cerebelo, CCe, Capa granulada, GL, Valvula cerebelli medial, Vam, Capa molecular, ML, Tectum óptico, TeO, Zona gris periventricular, PGZ, Teleencéfalo y Tel. Todas las barras de escala son de 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grupo | N | n | Convulsiones medias (%) ± SEM | p |
| Undam | 10 | 74 | 0% | |
| miTBI | 10 | 100 | 0% | >0,99 |
| moTBI | 10 | 184 | 10,66% ± 1,37% | <0.0001 |
| sTBI | 10 | 237 | 19,93% ± 1,49% | <0.0001 |
Tabla 1. El pez cebra muestra convulsiones de impacto dependientes de la gravedad después de una LCT. Cuantificación de las convulsiones tónico-clónicas, que se registró como el porcentaje de un grupo lesionado experimental, que se observaron dentro de 1 h después de la lesión. Los análisis estadísticos se realizaron con un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey. N = número total de grupos experimentales, n = número total de peces individuales. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software Prism (Graphpad 9.0).
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Discussion
Las investigaciones de neurotraumatismos y secuelas asociadas se han centrado durante mucho tiempo en modelos tradicionales de roedores no regenerativos20. Sólo recientemente los estudios han aplicado diversas formas de daño del SNC a modelos regenerativos9,11,13,14,21. Aunque perspicaces, estos modelos están limitados por el uso de un método de lesión que se observa con poca frecuencia en la población humana (traumas penetrantes, ablación química, explosión) y/o la lesión no es escalable y, por lo tanto, no aborda completamente la heterogeneidad de las patologías dependientes de la gravedad observadas en la población humana22,23,24,25 . Aquí, proporcionamos un paradigma de daño que aplica la forma más común de traumatismo craneoencefálico clínicamente relevante (fuerza contundente)4 que produce muchas de las métricas patológicas establecidas en el diagnóstico humano22,23,24,25. Cuando se aplica al pez cebra regenerativo, el modelo proporciona vías para investigar la progresión y la recuperación de patologías inducidas por lesiones en todas las gravedades, como el edema o las convulsiones postraumáticas, así como para dilucidar los mecanismos detrás de la recuperación regenerativa innata.
Hay dos características clave de nuestro modelo en la producción de una LCT de fuerza contundente en el pez cebra. En primer lugar, nuestro modelo ofrece un paradigma de lesión económico y simple que es rápido, que permite la lesión sucesiva a un gran número de individuos o la lesión repetida a un individuo para investigar el efecto acumulativo de la LCT de fuerza contundente. En segundo lugar, este modelo es fácilmente escalable para examinar los efectos de diferentes impactos de fuerza. Al cambiar la longitud del tubo (la altura desde la que se deja caer el rodamiento de bolas) y el peso del rodamiento de bolas, la energía entregada al cráneo del pez y la fuerza de impacto se pueden modificar y calcular fácilmente. Esta escalabilidad de la lesión permite múltiples vías de investigación con respecto a la progresión de las secuelas de TBI dependientes de la gravedad y los mecanismos regenerativos de reparación del SNC.
Con múltiples métricas para acceder a la aplicación exitosa de lesiones, aún se debe considerar cuidadosamente el fondo genético de los peces que se utilizarán. El pez mutante casper o albino será favorable para que los investigadores novatos coloquen de manera confiable al pez debajo del eje de caída, la colocación del disco de acero sobre el punto de impacto neuroanatómico deseado y la evaluación de la lesión vascular. Además, la eliminación cuidadosa del cerebro se simplifica por la accesibilidad visual de los huesos y el cerebro en el casper y el pez mutante albino . Sin embargo, se pueden usar peces pigmentados de tipo silvestre, aunque la identificación de puntos de referencia y la disección exitosa pueden venir con una práctica notable. Además, el pescado pigmentado se puede utilizar cuando se produce un insulto moTBI o sTBI, ya que las patologías posteriores permiten una caracterización adecuada de la lesión.
Una razón importante para estudiar los efectos de la LCT de fuerza contundente en el pez cebra es examinar la fuente de proliferación celular inducida por lesiones y los mecanismos subyacentes a la regeneración neuronal. Se han identificado niveles basales y de desarrollo de proliferación constitutiva en nichos neurogénicos a través de la neuroeje del pez cebra26,27, y se ha observado regeneración inducida por lesiones localizada o adyacente al sitio de la lesión en peces cebra adultos8,12,15. Sin embargo, nuestro modelo de LCT de fuerza contundente demuestra que la lesión difusa también resulta en un evento de proliferación celular dependiente de la gravedad dentro de los nichos neurogénicos a través del neuroeje. La identificación de la fuente y el alcance de la proliferación celular después de una LCT permitirá la aplicación de RNA-Seq unicelular para identificar los cambios en la expresión génica en el nicho proliferativo y probar el papel de diferentes vías de señalización, a través de la aplicación de agonistas y antagonistas específicos, en la regulación de esta respuesta de regeneración. Este enfoque ha demostrado ser útil para dilucidar los mecanismos subyacentes a la regeneración neuronal en la retina dañada del pez cebra28 y debería ser igualmente útil en el cerebro después de una LCT.
En conclusión, nuestro modelo proporciona un método de lesión rápido, simple y rentable para ofrecer una LCT de fuerza contundente escalable. Este modelo será útil para investigar más a fondo los efectos de la LCT de fuerza contundente dependiente de la gravedad o repetida, así como para dilucidar los objetivos terapéuticos de la regulación genética que mejoran la protección neuronal o inducen la regeneración neuronal para la recuperación cognitiva funcional en vertebrados adultos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Hyde por sus discusiones reflexivas, a los técnicos del Centro de Ciencias de la Vida Freimann para el cuidado y la cría del pez cebra, y al Núcleo de Microscopía Óptica / NDIIF de la Universidad de Notre Dame por el uso de instrumentos y sus servicios. Este trabajo fue apoyado por el Centro de Investigación del Pez Cebra de la Universidad de Notre Dame, el Centro de Células Madre y Medicina Regenerativa de la Universidad de Notre Dame, y subvenciones del Instituto Nacional del Ojo de NIH R01-EY018417 (DRH), el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship de Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH), y la Beca Pat Tillman (JTH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
References
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