Summary
Vi modifierade Marmarou vikt droppe modell för vuxna zebrafisk att undersöka en bredd av patologier efter trubbigt våld traumatiska hjärnan skada (TBI) och mekanismerna bakom efterföljande neuronal regenerering. Denna trubbiga TBI-modell är skalbar, inducerar en mild, måttlig eller svår TBI och rekapitulerar skada heterogenitet som observerats i mänskliga TBI.
Abstract
Trubbigt våld traumatiska hjärnskador (TBI) är den vanligaste formen av huvudtrauma, som spänner över en rad svårighetsgrader och resulterar i komplexa och heterogena sekundära effekter. Medan det inte finns någon mekanism för att ersätta eller regenerera de förlorade nervcellerna efter en TBI hos människor, zebrafisk har förmågan att regenerera nervceller i hela kroppen, inklusive hjärnan. För att undersöka bredden av patologier som visats i zebrafisk efter en trubbig kraft TBI och för att studera mekanismerna bakom det efterföljande neuronala regenerativa svaret, modifierade vi den vanliga gnagare Marmarou viktfallet för användning i vuxna zebrafisk. Vår enkla trubbigt kraft TBI modell är skalbar, inducera en mild, måttlig eller svår TBI, och rekapitulerar många av de fenotyper som observerats efter mänskliga TBI, såsom kontakt- och posttraumatisk beslag, ödem, subdural och intracerebralt hematomas och kognitiva funktionsnedsättningar, var och en visas på ett skada allvarlighetsgrad-beroende sätt. TBI och sviter, som börjar dyka upp inom några minuter efter skadan, avtar och återgår till nära oskadade kontrollnivåer inom 7 dagar efter skadan. Den regenerativa processen börjar så tidigt som 48 timmar efter skada (hpi), med toppcellsproliferation observerad med 60 hpi. Således producerar vår zebrafisk trubbigt kraft TBI modell karakteristiska primära och sekundära skada TBI patologier som liknar mänskliga TBI, vilket gör det möjligt att undersöka sjukdom debut och progression, tillsammans med mekanismerna för neuronal regenerering som är unik för zebrafisk.
Introduction
Traumatiska hjärnskador (TBC) är en global hälsokris och en ledande orsak till dödsfall och funktionshinder. I USA upplever cirka 2,9 miljoner människor en TBI varje år, och mellan 2006-2014 ökade dödligheten på grund av TBI eller TBI-och sviter med över 50%1. TBC varierar dock i sin etiologi, patologi och kliniska presentation beror till stor del på mekanismen för skada (MOI), vilket också påverkar behandlingsstrategier och förutspådd prognos2. Även om TBC kan vara resultatet av olika MOI, är de främst resultatet av antingen en genomträngande eller trubbigt våld trauma. Penetrerande trauman representerar en liten andel av TBC och genererar en allvarlig och fokal skada som är lokaliserad till de omedelbara och omgivande spetsiga hjärnregionerna3. Däremot är trubbigt våld tBC vanligare i den allmänna befolkningen, spänner över en rad svårighetsgrader (mild, måttlig och svår) och producerar en diffus, heterogen och global skada som påverkar flera hjärnregioner1,4,5.
Zebrafish (Danio rerio) har använts för att undersöka ett brett spektrum av neurologiska förolämpningar som spänner över centrala nervsystemet (CNS)6,7,8,9. Zebrafisk har också, till skillnad från däggdjur, ett medfött och robust regenerativt svar för att reparera CNS-skador10. Nuvarande zebrafisk trauma modeller använder olika skademetoder, inklusive penetration, excision, kemisk förolämpning eller tryckvågor11,12,13,14,15,16. Var och en av dessa metoder använder dock en MOI som sällan upplevs av den mänskliga befolkningen, är inte skalbar över en rad skador allvarlighetsgrad och tar inte itu med heterogenitet eller allvarlighetsgrad-beroende TBI-sequela rapporteras efter trubbigt våld TBI. Dessa faktorer begränsar användningen av zebrafiskmodellen för att förstå de underliggande mekanismerna hos patologierna i samband med den vanligaste formen av TBI i den mänskliga befolkningen (milda trubbiga kraftskador).
Vi syftade till att utveckla en snabb och skalbar trubbigt kraft TBI zebrafish modell som ger vägar att undersöka skada patologi, progression av TBI och medfödda regenerativa svar. Vi modifierade den vanliga gnagaren Marmarou17 viktfall och applicerade den på vuxen zebrafisk. Denna modell ger ett reproducerbart intervall av allvarlighetsgrad som sträcker sig från mild, måttlig till svår. Denna modell rekapitulerar också flera aspekter av mänskliga TBI patologi, på ett allvarlighetsgrad-beroende sätt, inklusive beslag, ödem, subdural och intracerebral hematomas, neuronal cell död och kognitiva underskott, såsom lärande och minne nedskrivningar. Dagar efter skada försvinner patologier och underskott, återgår till nivåer som liknar oskadade kontroller. Dessutom visar denna zebrafish modell en robust spridning och neuronal regenerering svar över neuroaxis när det gäller skada allvarlighetsgrad.
Här ger vi detaljer om inläggning och induktion av trubbigt våld trauma, poängsättning posttraumatiskt beslag, bedömning av vaskulär skador, instruktioner om att förbereda hjärnan avsnitt, metoder för att kvantifiera ödem och insikt i proliferative svar efter skada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafisk växte upp och underhålls i Notre Dame Zebrafish anläggning i Freimann Life Sciences Center. De metoder som beskrivs i detta manuskript godkändes av University of Notre Dame Animal Care and Use Committee.
1. Traumatisk hjärnskada paradigm
- Tillsätt 1 ml 2-fenoxietanol till 1 L systemvatten (60 mg Instant Ocean i 1 L avjoniserat RO-vatten).
- Förbered en luftad återvinningstank som innehåller 2 L systemvatten vid rumstemperatur.
- Välj önskad vikt på kullager och önskad längd och diameter på stål/plaströr och bestäm energi- och slagkraften.
OBS: Slangar ska ha en innerdiameter som gör att kullagret kan passera igenom utan att ändra sin rörelsebana eller rörelsehastighet.- Bestäm den kinetiska energin vid kollision:
Var, KE = kinetisk energi, m = massa (i kg), g = gravitationskraft, h = höjd (i m) från släpppunkt till fisk.
OBS: Detta ger kinetisk energi i J. Multiplicera värdet med 1 000 för att bestämma mJ. KE baseras på ett accelererande objekt, som uppstår när kullagret tappas från en stationär position. - Generera en mild TBI (miTBI) med 7,62 cm långa stål/plaströr som slutar 1,5 cm ovanför plattan på zebrafiskskalle (totalt avstånd 9,1 cm) och ett kullager på 1,5 g (6,4 mm i diameter). Dessa producerar en kinetisk energi på 1,33 mJ. Denna skada beslutades empiriskt att motsvara en miTBI baserat på viktiga patofysiologiska TBI markörer, såsom vaskulär skada, subdural/intracerebral hematom bildas, neuronal cell död och kognitiva nedskrivningar som till stor del rekapitulerade vad som rapporterades i den mänskliga befolkningen på ett allvarlighetsgrad-beroende sätt.
- Beräkna kinetisk energi miTBI =
- Generera en måttlig TBI (moTBI) med 12,7 cm långa stål/plaströr som slutar 1,5 cm över plattan på zebrafiskskalle (totalt avstånd 14,2 cm) och ett kullager på 1,5 g (6,4 mm i diameter) som producerar kinetisk energi på 2,08 mJ.
- Beräkna kinetisk energi moTBI =
- Generera en allvarlig TBI (sTBI) med 7,62 cm långa stål/plaströr som slutar 1,5 cm över plattan på zebrafiskskalle (totalt avstånd 9,1 cm) och ett kullager på 3,3 g (8,38 mm i diameter) som ger en kinetisk energi på 2,94 mJ.
- Beräkna kinetisk energi sTBI =
- Bestäm den kinetiska energin vid kollision:
- Fyll en Petri-skål med modelleringslera (figur 1, steg 1) och använd ett trubbigt instrument (dvs. baksidan av ett par tångar) för att skapa en upphöjd plattform (5 cm x 1,5 cm) med ytterligare modelleringslera (figur 1, steg 2).
- Använd ett rakblad för att dela upp den upphöjda plattformen på längden i två ungefär lika stora halvor (figur 1, steg 3, röd streckad linje). Forma de två halvorna till en kanal som rymmer längden på en vuxen fisk (figur 1, steg 4). Använd ytterligare lera för att bygga väggar som säkrar ~ 2/3 av fiskkroppen och lämnar huvudet exponerat.
- Forma ett litet stöd i det exponerade huvudområdet vinkelrätt mot väggarna för att stödja huvudet för att undvika rotation eller rekyl av huvudet vid skada (figur 1, steg 4).
OBS: Kanalen bör vara tillräckligt djup för att stödja fisken i ett dorsala upp-läge men bör fortfarande låta huvudet vila ovanför den omgivande leran. Dessutom bör huvudstödet följa fiskens naturliga krökning, stödja den nedre underkäken och gälarna. - Se till att den nedlagda vikten inte hindras av kanalens sidor (figur 1, steg 4).
- Skapa en stålskiva med 3 mm diameter med en minihålslag och 22 g stålblixt. Varje disk kan användas flera gånger.
- Bedöva en fisk genom att placera den i en bägare med 50-100 ml 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) 2-fenoxietanol tills den inte svarar på svansnyp.
- Placera fisken, dorsala sidan uppåt, på lerformen i kanalen så att kroppen är säkrad på sidorna och placera en 3 mm 22 g stålskiva på huvudet, centrerad över önskad slagpunkt (figur 1, steg 5).
- Se till att fisken är så vinkelrät som möjligt för att undvika att huvudet lutar åt ena sidan, vilket kan orsaka ojämna stötar.
- Säkra stål-/plastslangen med hjälp av ett standardringstativ och armklämma, så att slangens botten är 1,5 cm över zebrafiskens huvud (figur 1, steg 6). Se till att slangen är rak.
- Titta ner i slangen och se till att slangen är i linje ovanför stålplattan.
- Släpp kullagret (1,5 g för mild och måttlig TBI och 3,3 g för svår TBI) från en förutbestämd höjd (beskrivs i steg 1.3.3-1.3.5) ner på slangen på stålplattan som ligger över önskad neuroanatomisk region av intresse (t.ex. lillhjärna, figur 1, steg 5) för att producera trubbigt kraft TBI för önskad allvarlighetsgrad. Placera den skadade fisken i en återhämtningstank som ska övervakas.
OBS: Beroende på skadans svårighetsgrad kan dödlighet eller toniska kloniska anfall uppstå. Om fisken inte svarar under en längre tid efter TBI, använd en överföringspipett eller tång för att administrera en svansknypa och utvärdera för ett smärtsvar.
2. Poäng beslag efter TBI i den vuxna zebrafisken
- Bedöva och skada fisken enligt det skadeprotokoll som anges i avsnitt 1 och placera den skadade fisken i en luftad återhämtningstank på 2 L systemvatten.
- Observera fisken för tecken på posttraumatiska anfall som börjar omedelbart efter att ha placerats i återhämtningstanken. Ställ in en observationstid (dvs. 1 h) och registrera all anfallsaktivitet, inklusive anfallspoängen (beskrivs nedan), varaktigheten för varje anfall och andelen fisk som fick krampanfall (figur 2A).
OBS: Krampanfall kan uppstå omedelbart vid skada, liksom timmar eller dagar efter TBI. Anfall kan kvarstå på lång sikt och en enda fisk kan ha flera anfall. Att fastställa en observationstid på 1 h eller mer kommer att ge en god representation av den övergripande trenden för anfallsfrekvens. - Poäng fisk med hjälp av Mussulini18 riktlinjer för vuxna zebrafisk beslag fenotyper.
OBS: Utan att använda spårningsprogramvaran är det svårt att bedöma anfallspoäng under 3 opartiskt. Därför bör endast beslagspoäng på 3 eller högre registreras när bedömningen utförs utan programvara.
3. Hjärn dissekering
- Avliva fisk i en 1:500 (2 mL/1 L, 0,2%) lösning av 2-fenoxietanol, tills gillrörelser upphör, och de är oaktiva för fin nypa, vid önskat slut punkt.
- Fyll en Petri-skål med modelleringslera och skapa en liten hålighet för att stödja kroppen under dissekering.
- Placera fisken, dorsalsidan upp, i lerformen. Placera en dissekeringsstift genom mittlinjen halvvägs ner i fiskens kropp och en andra stift ~ 5 mm bakom huvudets botten.
- Under ett dissekerande ljusmikroskop bryter du trubbigt synnerven med ett par #5 Dumont-tångar och tar bort ögonen (figur 2A).
- Orientera fisken så att rostraländen är längst när du tittar genom mikroskopet (figur 2B).
OBS: Följande steg är för högerhänta individer. Vänsterhänta individer kanske föredrar att utföra följande steg i en speglad orientering. - Använd #5 tång för att långsamt placera ena änden av tången under den högra parietalplattan, vilket gör en avsiktlig saxåtgärd som rör sig mot rostraländen och ta bort de högra parietal- och frontplattorna (bild 2C).
- Håll tången i en vinkel på 45° eller lägre för att undvika att tränga in i hjärnan under dissekering.
- Rotera fisken 90° medurs. Placera ena änden av de #5 tångarna under den vänstra parietalplattan och använd samma saxrörelse för att ta bort de vänstra parietal- och frontplattorna som exponerar hela hjärnans dorsala aspekt (figur 2D, E).
- Rent utdela överkäken med #5 tång. Bevara luktlamporna och skada dem inte om detta är den region som är av intresse.
- Ta bort höger opercle, preopercle, interopercle och subopercle med #5 tång (bild 2F).
- Reframt omförd muskulaturen i den kaudala änden av golgonöppningen med #5 tång, vilket exponerar ryggmärgen.
- Rent utrett ryggmärgen med #5 tång. Placera försiktigt tång under hjärnan och ta försiktigt bort hjärnan från golgata.
OBS: Nyp aldrig hjärnan. Använd tång för att "vagga" hjärnan eller resect caudally och använda den exponerade ryggmärgen som en nypa punkt för att manövrera hjärnan. - Fixera de borttagna hjärnorna i 9 delar 100% etanol till 1 del 37% formaldehyd över natten vid 4 °C på en vippplattform.
4. Ödem studier i zebrafisk hjärnan
- Bedöva och skada fisk enligt det skadeprotokoll som anges i avsnitt 1 och låt fisken återhämta sig i en återhämtningstank tills de börjar simma fritt.
- Placera fisken tillbaka i normala bostadsförhållanden efter skadan i 1 dag.
- Avliva fisken i 1:500 2-fenoxietanol, efter att tiden har gått.
- Dissekera hela hjärnan eller den intressanta regionen enligt protokollet som beskrivs i avsnitt 3 och placera hjärnan omedelbart på en liten vägbåt.
OBS: Var försiktig när du överför hjärnan, använd fina tångar för att försiktigt placera den på vägbåten utan att hugga eller skrapa hjärnan, vilket kan leda till förlust av vävnad. - Etikett (med skadegrupp och hjärnnummer) och tara en extra liten torkning väger båt på en skala. Använd en skala med möjlighet att mäta minst 0,001 g för att få en korrekt mätning.
- Överför hjärnan till den tjärade torktumlarbåten och registrera hjärnans våta vikt. Orientera hjärnan så att de ligger platt på vägbåten med den dorsala sidan vänd uppåt.
- Placera torkvägsbåten och hjärnan i en hybridiseringsugn inställd på 60 °C i 8 timmar.
- Efter torkning kan hjärnan hålla sig till torkvägsbåten och kan vara svår att ta bort och överföra till en ny tjärad liten vägbåt. Undvik att nypa hjärnan med tång, eftersom detta kan leda till skador på den torra hjärnan och förlust av vävnad. Nyp istället ihop de fina tångarna och, med början på hjärnans ventrala sida, skopa i en uppåtgående rörelse.
- Bestäm vattenhalten i varje hjärna med hjälp av formeln (bild 4):
5. Märka cellulär spridning över neuroaxis och förbereda fast vävnad.
- Förbered 10 mM 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU) i 2 ml ddH2O.
- Bedöva 3 till 4 fiskar åt gången i 50-100 ml 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) 2-fenoxietanol tills fisken inte svarar på svansnypning, vid önskad tidpunkt efter skada (med hjälp av protokollet som beskrivs i avsnitt 1).
- Gör ett partiellt snitt på en våt svamp och placera en fisk i taget i öppningen, ventralsidan upp.
- Använd en 30 G nål för att injicera ~40 μL av 10 mM EdU i fiskens kropp. Sätt tillbaka fisken i en avloppstank fylld med systemvatten.
OBS: Upprepade injektioner kan utföras vid olika tidpunkter för att märka ett större antal prolifererande celler och kan behövas om en jaktperiod på mer än 1 vecka önskas. - Samla hjärnor enligt avsnitt 3 och placera dem som en grupp i en 5 ml glasflaska som innehåller 2 ml 9 delar 100% etanol till 1 del 37% formaldehyd. Fixera hjärnorna vid 4 °C på en vippplattform.
OBS: En rocker- eller shakerplattform förbjuder hjärnan från att vila i botten och telencephalon av hela hjärnor från curling. - Rehydrera hjärnor, i samma glasflaska som används för att fixa hjärnor, i tvättar av fallande etanolserier, 75%, 50% och 25%, i 15 minuter vardera, följt av en 1,5 h tvätt i 5% sackaros / PBS på en rocker vid rumstemperatur. Förvara hjärnorna i en glasflaska över natten i 30% sackaros/PBS vid 4°C på en vippplattform.
- Ta bort hjärnor från 30% sackaros/PBS och överför dem med tång till en 12-välplatta (en behandlingsgrupp per brunn) med brunnar fyllda med en 2:1-lösning bestående av 2 delar vävnadsfrysningsmedium och 1 del 30% sackaros/PBS. Inkubera hjärnorna över natten vid 4 °C på en vippplattform.
- Överför hjärnor till nästa rad av brunnar inom 12-brunnsplattan som dränker hjärnor i 100% TFM för 2-24 h vid 4 °C.
- Använd en kryostatchuck för att bädda in hjärnan i TFM i önskad orientering på torris.
- Utför kryosektion (16 μm tjocka sektioner) och samla sektionerna på positivt laddade diabilder. Torka rutschkanor på en glidvärmare i 1 h och förvara sedan vid -80 °C eller fortsätt med immunohistokemi.
- Förbered en hydrofobisk barriär på glidningen runt vävnadssektionerna och låt torka på en glidvärmare i 20 min.
- Tvätta bilderna kort i PBS i 5 min och sedan två gånger i PBS-Tween 20 (0,05%) i 10 min vardera.
- Utför EdU-detektering med EdU Cell Proliferation Kit och tillverkarens instruktioner.
- Analysera bilderna och kvantifiera de fluorescerande EdU-märkta cellerna med antingen ett epifluorescent mikroskop eller ett konfokalt mikroskop. Ett minimum av ett 40x-mål kommer att krävas för att tydligt skilja enskilda celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att förbereda skadeinduktionsriggen möjliggör ett snabbt och förenklat sätt att leverera en skalbar tbi med trubbigt våld till vuxna zebrafiskar. Den graderade svårighetsgraden av skademodellen ger flera lätt identifierbara mätvärden för framgångsrik skada, även om vaskulär skada är en av de enklaste och mest framträdande patologierna (figur 3). Den fiskstam som används under skadan kan göra denna indikator lättare eller svårare att identifiera. Vid användning av ab-fisk av vild typ (WTAB, figur 3A-D) kan identifiering av kärlskada vara svår att skilja mellan antingen miTBI eller moTBI och oskadad kontrollfisk på grund av pigmenteringen (figur 3A-C). Efter skada visar miTBI fisk minimala yt skrubbsår (figur 3B), medan moTBI uppvisar begränsad cerebral blödning (figur 3C). Även om sTBI fortfarande kan vara utmanande, är skadans omfattning ofta uppenbar (figur 3D). När du däremot använder albino (figur 3E-H) eller casperfisk (figur 3I-L) är kärlskada lätt att identifiera. Dessutom observeras ofta krampanfall efter skada och anfallsfrekvensen bland gruppen är ett annat representativt mått på skada (tabell 1). Skadad fisk kommer att visa tonic-kloniska anfall (ataxi, ZBC 1.9, böjning, ZBC 1.16, cirkling, ZBC 1.32 och korkskruv simning, ZBC 1.37)19 som lätt observeras efter skada, oavsett bakgrundsbelastningen. Anfall kommer att observeras med ökande prevalens i förhållande till svårighetsgraden. Efter skada visar miTBI inte anfallsliknande beteenden; MoTBI kommer dock att visa anfallsbeteenden (10,66% ± 1,37%, p < 0,0001, tabell 1) och incidensen är ytterligare förhöjd i sTBI-fisk (19,93% ± 1,49%, p < 0,0001, tabell 1).
Framgångsrikt avlägsnande av hjärnan är avgörande för en myriad av ytterligare undersökningar, såsom ödem och bedömning av cellproliferation. Utför dissekeringar med största omsorg för att undvika skadliga hjärnregioner (oftast genom oavsiktlig punktering) och för att bevara alla regioner (luktlamporna kan lätt gå förlorade). Efter hjärn dissekering förfarande och schematiska (avsnitt 3, figur 2A-F) möjliggör en fullständig hjärnan avlägsnande (figur 2G, H). Utredare bör överväga om deras analys kräver hela hjärnan eller om en samling specifika hjärnregioner kan passa deras behov. Beroende på svårighetsgraden av skadan och tiden för insamling, hjärnan kan uppvisa bifogade subdural blödningar, men dessa är ofta vidhäftade på undersidan av skallen och förlorade under dissekering. Svullnad av storhjärnan är ibland uppenbar, men på grund av anatomiska skillnader och variation i allmän storlek är ödem den bästa metoden för att bedöma svullnad. Enligt det protokoll som beskrivs (avsnitt 4) uppvisar oskadade hjärnor ett vätskeinnehåll på 73,11% ± 0,80%, och miTBI, även om den är något förhöjd, visar inte en signifikant ökning av ödem vid 1, 3 eller 5 dpi (1 dpi: 76,33% ± 1,32%, p = 0,36, 3 dpi: 75,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,33 ± 1,37%, > p = 0,84, 5 dpi: 74,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,33 ± 1,37 Däremot hade både moTBI och sTBI betydande ödem 1 dpi (moTBI: 80,55 ± 0,94%, p < 0,0001, sTBI: 86% ± 1,05%, p < 0,0001) och 3 dpi (moTBI: 78,11 ± 0,93%, p < 0,018, sTBI: 77,77% ± 1,02%, s <. 036). Vätskeinnehållet i både moTBI och sTBI återgick dock till nivåer som liknade oskadade kontroller med 5 dpi (moTBI: 74,42 ± 1,25%, p > 0,99, sTBI: 73,85% ± 1,01%, p > 0,99, figur 4).
Cellproliferation, efter TBI i zebrafisk, är en robust bedömning av skadans omfattning. Medan cellproliferationssvaret tidigare har studerats i zebrafisk efter andra former av hjärnskada9,12, var undersökningen i de flesta fall begränsad till skadeplatsen. Denna trubbiga TBI resulterar i en robust spridning svar som spänner över neuroaxis. På ett allvarlighetsgradsberoende sätt (sTBI-data som visas) observeras ökad EdU-märkning i ventrikulära och subventriska zonerna i förhjärnan (telencephalon, figur 5B) i förhållande till oskadade kontroller (figur 5A). Som sektioner flyttade caudally in i midbrain (mesencephalon och diencephalon), visade skadade hjärnor ökad EdU märkning i periventricular gråzonen (PGZ) de optiska tectal lober (TeO), och aspekter av främre hypotalamus jämfört med oskadad fisk (figur 5D respektive figur 5C, respektive). I hindbrain uppvisar neurogena regioner som är uppenbara i den oskadade hjärnan (figur 5E, G) ökad cellproliferation efter sTBI (figur 5F, H).
Sammanfattningsvis ger en modifierad Marmarou viktdroppe som appliceras på vuxna zebrafiskar en reproducerbar och skalbar mild, måttlig eller svår trubbig TBI. Zebrafisk, på ett allvarlighetsgradsberoende sätt, visar olika patologier, inklusive anfall och vaskulär skada (dvs. subdural och intracerebralt hematom). Dessutom visar skadad fisk minskad återhämtningsgrad (analogt med förlust av medvetande, kognitiva underskott i form av inlärnings- och minnesproblem och neuronal celldöd (data visas inte). Patologier observeras, återhämta sig snabbt under 4-7 dagar sammanfaller med robusta proliferative händelser över neuroaxis.
Bild 1: Ställa in den skalbara skadeapparaten. Grafisk representation av installationen, modellen och leverans av skalbara TBC till zebrafisken. Steg 1-4 ger instruktionsöversikt över stegen för att bilda stödformen som immobiliserar fisken och exponerar huvudet under skador. Steg 5-7 ger instruktioner om hur du levererar skadan med insikt om aspekter att tänka på när du felsöker modellen. Figuren skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Skallborttagning för hjärndissekering. Schematik av en förenklad zebrafiskskalle och steg-för-steg borttagning av ben (blå sektioner) för att exponera den vuxna zebrafiskhjärnan. (A,B) Ögonen avlägsnas trubbigt med #5 tång som bryter de optiska nerverna. C) Tång placeras i muskulaturen direkt kausala till parietalplattorna (svart pil) för att avlägsna höger parietalben och sedan höger frontben. (D,E) Vänster parietal ben och vänster frontal ben tas bort. (F) Rätt opercle, preopercle, interopercle och subopercle avlägsnas, vilket ger lateral och dorsal tillgång till hjärnan. (G,H) Oskadade och sTBI hjärnor togs bort. Skalningslist = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Vaskulär skada i olika bakgrunder över skadebekvämligheter. Dorsal vy av oskadade och TBI vild-typ AB, albinob4 och casper vuxna zebrafisk visar vaskulär skada. (A-D) Vuxna vilda AB fiskar är kraftigt pigmenterade och skrubbsår efter miTBI (B) är svåra att visualisera. Vaskulär skada var tydligare i moTBI (C) och sTBI (D) fisk jämfört med oskadade kontroller (A). (E-H) Albino fisk var mindre pigmenterad och visualisering av hjärnan var mer distinkt. Vaskulär skada efter TBI observerades tydligt och särskiljs över svårighetsgrader. (I-L) Casper fisk gav den mest anpassningsbara bakgrunden för nybörjare utredare som öppenhet möjliggjorde enkel identifiering av önskade neuroanatomical regioner och tydlig observation och avgränsning av vaskulär skada av TBI-svårighetsgrad. Skalningslist = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Zebrafisk upplever skada-inducerad ödem efter TBI. Zebrafisk utsattes för olika svårighetsgrader av TBI (oskadad, miTBI, moTBI och sTBI) och bedömdes vid olika dagar efter skador på procent vätskeinnehåll (ödem). Statistiska analyser utfördes med en Browns-Forsythe och Welch ANOVA följt av en Dunnetts T3 multipla jämförelse post-hoc test. n = totalt antal enskilda fiskar. Alla statistiska analyser utfördes med prism (Graphpad 9.0) mjukvarupaketet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: TBI-inducerad spridning över neuroaxis. (A-H) Confocal bilder av koronal och sagittal hjärnan avsnitt av oskadade och sTBI fisk som var IP-injiceras med EdU 12 h före insamling. Ökad EdU-inkorporering observerades i flera neurogena nischer efter skada över förhjärnan (A, B), mellanhjärnan (C,D) och hindbrain (E-H). Cerebellum, CCe, Granule Layer, GL, Medial Valvula Cerebelli, Vam, Molecular Layer, ML, Optic Tectum, TeO, Periventricular Grey Zone, PGZ, Telencephalon och Tel. Alla skalstänger är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Grupp | N | n | Medelvärden (%) ± SEM | p |
| Undam | 10 | 74 | 0% | |
| miTBI | 10 | 100 | 0% | >0,99 |
| moTBI | 10 | 184 | 10.66% ± 1.37% | <0.0001 |
| sTBI | 10 | 237 | 19.93% ± 1.49% | <0.0001 |
Tabell 1. Zebrafish visar allvarlighetsgrad-beroende inverkan beslag efter TBI. Kvantifiering av tonisk-kloniska anfall, som registrerades som procent av en experimentell skadad grupp, som observerades inom 1 h efter skada. Statistiska analyser utfördes med en enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post-hoc-test. N = totalt antal försöksgrupper, n = totalt antal enskilda fiskar. Statistiska analyser utfördes med hjälp av prism (Graphpad 9.0) mjukvarupaketet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersökningar av neurotrauma och tillhörande och sviter har länge varit centrerade på traditionella icke-regenerativa gnagare modeller20. Först nyligen har studier tillämpat olika former av CNS-skador på regenerativa modeller9,11,13,14,21. Även om dessa modeller är insiktsfulla begränsas de antingen av deras användning av en skademetod som är ovanligt sett i den mänskliga befolkningen (penetrerande trauman, kemisk ablation, sprängning) och/ eller skadan är inte skalbar och tar därför inte helt itu med heterogeniteten hos allvarlighetsgradsberoende patologier som observerats hos den mänskliga befolkningen22,23,24,25 . Här tillhandahåller vi ett skadeparadigm som tillämpar den vanligaste formen av kliniskt relevant huvudtrauma (trubbigt våld)4 som producerar många av de patologiska mätvärden som fastställts i mänsklig diagnos22,23,24,25. När den appliceras på den regenerativa zebrafisken ger modellen vägar för att undersöka progression och återhämtning av skadeinducerade patologier över svårighetsgrader, såsom ödem eller posttraumatiska anfall, samt klargöra mekanismerna bakom den medfödda regenerativa återhämtningen.
Det finns två viktiga egenskaper hos vår modell för att producera en trubbig TBI i zebrafisk. För det första levererar vår modell ett billigt och enkelt skadeparadigm som är snabbt, vilket tillåter successiv skada på ett stort antal individer eller upprepad skada på en individ för att undersöka den kumulativa effekten av trubbigt våld TBI. För det andra är denna modell lätt skalbar för att undersöka effekterna av olika krafteffekter. Genom att ändra rörets längd (höjden från vilken kullagret tappas) och kullagrets vikt kan den energi som levereras till fiskens skalle och slagkraften enkelt modifieras och beräknas. Denna skalbarhet av skadan möjliggör flera undersökningsvägar när det gäller allvarlighetsgrad-beroende TBI och sviter progression och regenerativa mekanismer för CNS reparation.
Med flera mätvärden för att få tillgång till framgångsrik skadeansökan bör man fortfarande noga överväga den genetiska bakgrunden hos fisk som ska användas. Casper eller albino mutant fisk kommer att vara gynnsam för nybörjare utredare att tillförlitligt placera fisken under droppaxeln, placeringen av stålskivan över önskad neuroanatomical stötpunkten och bedöma vaskulär skada. Dessutom förenklas noggrann borttagning av hjärnan av den visuella tillgängligheten av ben och hjärna i casper och albino mutant fisk. Pigmenterad vild-typ fisk kan dock användas även om identifiering av landmärken och framgångsrik dissekering kan komma med anmärkningsvärd praxis. Dessutom kan pigmenterad fisk användas när man producerar antingen en moTBI eller sTBI förolämpning, eftersom de efterföljande patologierna möjliggör korrekt karakterisering av skada.
En viktig anledning att studera effekterna av trubbigt våld TBI i zebrafisk är att undersöka källan till skada-inducerad cell spridning och mekanismerna bakom neuronal regenerering. Utvecklingsmässiga och basala nivåer av konstituerande spridning har identifierats i neurogena nischer över zebrafisk neuroaxis26,27, och skada-inducerad regenerering har observerats lokaliserad eller intill skadeplatsen hos vuxna zebrafiskar8,12,15. Vår trubbiga TBI-modell visar dock att den diffusa skadan också resulterar i en allvarlighetsgrad-beroende cell spridning händelse inom neurogenic nischer över neuroaxis. Identifiering av källan till och omfattningen av cellproliferation efter TBI kommer att göra det möjligt att tillämpa encelliga RNA-Seq för att identifiera förändringarna i genuttrycket i den proliferativa nischen och testa olika signalvägars roll, genom tillämpning av specifika agonister och antagonister, för att reglera detta regenereringssvar. Detta tillvägagångssätt har visat sig användbart för att klargöra mekanismerna bakom neuronal regenerering i den skadade zebrafisk näthinnan28 och bör vara lika användbar i hjärnan efter TBI.
Sammanfattningsvis ger vår modell en snabb, enkel och kostnadseffektiv skademetod för att leverera en skalbar TBI med trubbigt våld. Denna modell kommer att vara användbar för att ytterligare undersöka effekterna av svårighetsgrad-beroende eller upprepade trubbigt-kraft TBI, liksom klargöra terapeutiska mål för genetisk reglering förbättra neuronal skydd eller inducera neuronal regenerering för funktionell kognitiv återhämtning hos vuxna ryggradsdjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Hyde-labbmedlemmarna för deras tankeväckande diskussioner, Freimann Life Sciences Center-teknikerna för zebrafiskvård och djurhållning och University of Notre Dame Optical Microscopy Core / NDIIF för användningen av instrument och deras tjänster. Detta arbete stöddes av Center for Zebrafish Research vid University of Notre Dame, Center for Stem Cells and Regenerative Medicine vid University of Notre Dame, och bidrag från National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) och Pat Tillman-stipendiet (JTH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).
- Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
- Santiago, L. A., Oh, B. C., Dash, P. K., Holcomb, J. B., Wade, C. E. A clinical comparison of penetrating and blunt traumatic brain injuries. Brain injury. 26 (2), 107-125 (2012).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (6), 379-387 (2016).
- Faul, M., Xu, L., Wald, M., Coronado, V. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths. , (2010).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Alyenbawwi, H., et al. Seizures are a druggable mechanistic link between TBI and subsequent tauopathy. eLife. 10, 58744 (2021).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelia-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- McCutcheon, V., et al. A novel model of traumatic brain injury in adult zebrafish demonstrates response to injury and treatment comparable with mammalian models. Journal of Neurotrauma. 34 (7), 1382-1393 (2017).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Mussulini, B. H., et al. Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization. PloS One. 8 (1), 54515 (2013).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Amamoto, R., et al. Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury. eLife. 5, 13998 (2016).
- Yamamoto, S., Levin, H., Prough, D. Mild, moderate and severe: terminology implications for clinical and experimental traumatic brain injury. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 672-680 (2008).
- Lund, S., et al. Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77 (2016).
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).
- Ruff, R. M., et al. Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper. Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).
- Ganz, J., Brand, M.
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).
