Summary
私たちは、成人ゼブラフィッシュのマルマルー重量降下モデルを変更し、鈍力外傷性脳損傷(TBI)とその後の神経再生の基礎となるメカニズムに続く幅広い病理を調べた。この鈍力TBIモデルはスケーラブルであり、軽度、中等度、または重度のTBIを誘導し、ヒトTBIで観察された傷害の不均一性を再現する。
Abstract
鈍力外傷性脳損傷(TBI)は、重症の範囲に及び、複雑で異種の二次的な影響をもたらす頭部外傷の最も一般的な形態である。人間のTBIに続いて失われたニューロンを置き換えたり再生したりするメカニズムはありませんが、ゼブラフィッシュは脳を含む全身のニューロンを再生する能力を持っています。鈍い力TBIに続くゼブラフィッシュに示された病理の広さを調べ、その後の神経細胞再生応答の基礎となるメカニズムを研究するために、我々は成体ゼブラフィッシュで使用するために一般的に使用されるげっ歯類マルマルー重量降下を改変した。当社の単純な鈍力TBIモデルは、スケーラブルで、軽度、中等度、または重度のTBIを誘導し、接触および心的外傷後発作、浮腫、硬膜下および脳内血腫、認知障害など、ヒトTBIに続いて観察される表現型の多くを再現し、それぞれ傷害重症性に依存して表示されます。TBIの続編は、怪我の数分以内に現れ始め、治まり、怪我後7日以内に損傷を受けていない制御レベルに戻ります。再生プロセスは、早期に48時間の傷害後(hpi)を開始し、60 hpiによってピーク細胞増殖が観察される。したがって、当社のゼブラフィッシュ鈍力TBIモデルは、ヒトTBIと同様の特徴的な一次および二次傷害TBI病理を産生し、ゼブラフィッシュに特有の神経再生のメカニズムと共に、疾患の発症および進行を調査することを可能にする。
Introduction
外傷性脳損傷(TTB)は、世界的な健康危機であり、死亡および障害の主要な原因です。米国では、毎年約290万人がTBIを経験し、2006年から2014年の間にTBIまたはTBIの後遺による死亡率は50%以上増加しました。しかし、TISは、治療戦略や予後予測に影響を与える傷害のメカニズム(MOI)の一部に大きく起因する病因、病理、および臨床提示が異なる。TIは様々なMOIから生じる可能性がありますが、主に貫通性または鈍い力の外傷の結果です。貫通性外傷は、TIのごく一部を表し、即時および周囲の衝突脳領域3に局在する重度および焦点損傷を生成する。対照的に、鈍力TISは、一般集団でより一般的であり、重症の範囲(軽度、中等度、重度)にまたがり、複数の脳領域に影響を与える拡散、異種、および世界的傷害を生じる1,4,5。
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、中枢神経系(CNS)6,7,8,9に及ぶ広範な神経学的侮辱を調べるために利用されてきた。ゼブラフィッシュはまた、哺乳類とは異なり、CNS損傷を修復するための先天的かつ堅牢な回生応答を有する10。現在のゼブラフィッシュ外傷モデルは、浸透、切除、化学的侮辱、または圧力波11,12,13,14,15,16を含む様々な傷害方法を使用しています。しかしながら、これらの各方法は、ヒト集団がめったに経験しないMOIを利用し、傷害の重大性の範囲にわたってスケーラブルではなく、鈍力TBI後に報告された不均一性または重症度依存性TBIの後遺症に対処しない。これらの要因は、ヒト集団におけるTBIの最も一般的な形態(軽度の鈍い力損傷)に関連する病理の根本的なメカニズムを理解するためにゼブラフィッシュモデルの使用を制限する。
我々は、傷害病理、TBI後遺の進行、および先天的な再生応答を調査する道を提供する、迅速かつスケーラブルな鈍力TBIゼブラフィッシュモデルを開発することを目指した。私たちは、一般的に使用されるげっ歯類Marmarou17 重量低下を変更し、成体ゼブラフィッシュに適用しました。このモデルは、軽度から中程度、重度まで、再現可能な範囲の重症度を生み出します。このモデルはまた、発作、浮腫、硬膜下および脳内血腫、神経細胞死、および学習および記憶障害などの認知障害を含む重症度依存的な方法で、ヒトTBI病理の複数の側面を再現する。怪我の数日後、病理および欠損は消散し、損傷を受けていないコントロールに似たレベルに戻る。さらに、このゼブラフィッシュモデルは、傷害重症度に関する神経軸全体にわたる堅牢な増殖および神経再生応答を示す。
ここでは、鈍い力外傷の設定と誘導、外傷後発作の採点、血管損傷の評価、脳切片の準備に関する指示、浮腫を定量化するアプローチ、および傷害後の増殖反応に関する洞察に向けた詳細を提供する。
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Protocol
ゼブラフィッシュは、フライマン生命科学センターのノートルダム・ゼブラフィッシュ施設で飼育されました。この原稿に記載されている方法は、ノートルダム大学動物のケアと使用委員会によって承認されました.
1. 外傷性脳損傷パラダイム
- 1 Lのシステム水(脱イオン化RO水の1 Lで60mgのインスタントオーシャン)に2-フェノキシエタノールを1 mL加えます。
- 室温で2Lのシステム水を含む気泡回収タンクを準備します。
- ボールベアリングの所望の重量と鋼/プラスチックチューブの所望の長さと直径を選択し、エネルギーと衝撃力を決定します。
注:チューブは、ボールベアリングがパスや移動速度を変更せずに通過することを可能にする内径を持っている必要があります。- 衝撃時の運動エネルギーを決定します。
ここで、 KE =運動エネルギー、 m =質量(kg)、 g =重力、 h =高さ(m)はドロップポイントから魚へ。
注: これは J. mJ を決定するために値に 1,000 を掛ける運動エネルギーを提供します。 KE は、ボールベアリングが静止位置から落とされたときに発生する加速物体に基づいています。 - ゼブラフィッシュの頭蓋骨のプレートの上に1.5cm(全距離9.1cm)と1.5g(直径6.4mm)のボールベアリングを終了する長さ7.62cmのスチール/プラスチックチューブを使用して、穏やかなTBI(miTBI)を生成します。これらは1.33 mJの運動エネルギーを生成する。この損傷は、血管損傷、硬膜下/脳内血腫形成、神経細胞死、およびヒト集団で報告されたものを重症度依存的に大部分再現した認知障害などの主要な病態生理学的TBIマーカーに基づくmiTBIと同等であると経験的に決定された。
- 運動エネルギー miTBI を計算する =
- ゼブラフィッシュの頭蓋骨のプレート上の1.5cm(全距離14.2cm)の長さ1.5cmのスチール/プラスチックチューブと、2.08mJの運動エネルギーを生成する1.5g(直径6.4mm)のボールベアリングを使用して、適度なTBI(moTBI)を生成します。
- 運動エネルギー moTBI を計算する =
- ゼブラフィッシュの頭蓋骨のプレートの上に1.5cm(全距離9.1cm)の長さ7.5cmの鋼/プラスチックチューブを使用して、2.94mJの運動エネルギーを生成する3.3g(直径8.38mm)のボールベアリングを使用して、重度のTBI(sTBI)を生成します。
- 運動エネルギー sTBI を計算する =
- 衝撃時の運動エネルギーを決定します。
- ペトリ皿にモデリングクレイ(図1、ステップ1)を充填し、鈍い楽器(すなわち、鉗子の背面)を使用して、追加のモデリングクレイ(図1、ステップ2)で隆起したプラットフォーム(5cm x 1.5 cm)を作成します。
- カミソリのブレードを使用して、上げられたプラットフォームを縦に 2 つのほぼ等しい半分に分割します (図 1、ステップ 3、赤い破線)。2つの半分を成魚の長さに合うチャネルに形成します(図1、ステップ4)。追加の粘土を使用して、魚の体の〜2/3を固定し、頭を露出させたままにする壁を構築します。
- 壁に垂直に露出した頭部領域に小さな支持体を成形し、損傷時に頭部の回転や反動を避けるために頭を支える(図1、ステップ4)。
注:チャネルは、後回しの位置で魚をサポートするのに十分な深さでなければなりませんが、それでも頭が周囲の粘土の上に休むことを許可する必要があります。さらに、ヘッドサポートは、下顎下およびエラを支える魚の自然な湾曲に従う必要があります。 - ドロップされた重みがチャネルの側面によって妨げられないようにします(図 1、ステップ 4)。
- ミニホールパンチと22 gのスチールフラッシュを使用して、直径3mmのスチールディスクを作成します。各ディスクは複数回使用できます。
- 1匹の魚を1:1000(1 mL/1 L,0.1%)の50-100mLでビーカーに入れ、尾ピンチに反応しなくなるまで2フェノキシエタノールを麻酔します。
- 魚、後側を上に、粘土の型をチャネル内に置き、本体が側面に固定され、3mm 22gのスチールディスクをヘッドに配置し、所望の衝撃点を中心にします(図1、ステップ5)。
- 魚が頭が片側に傾くのを避けるためにできるだけ垂直に整列し、不均一な衝撃を引き起こす可能性があることを確認してください。
- 標準的なリングスタンドとアームクランプを使用してスチール/プラスチックチューブを固定し、チューブの底部がゼブラフィッシュの頭の上に1.5cmになるようにします(図1、ステップ6)。チューブがまっすぐであることを確認します。
- チューブを見下ろし、チューブが鋼板の上に揃っていることを確認します。
- ボールベアリング(軽度および中等度のTBIの場合は1.5 g、重度のTBIの場合は3.3 g)を所定の高さ(ステップ1.3.3-1.3.5で説明)から、所望の神経解剖学的領域(例えば、小脳、図1、ステップ5)上に位置する鋼板にチューブを下に落とし(例えば、小脳、 図1、ステップ5)、 所望の重症度に対する鈍い力TBIを生成する。負傷した魚を監視する回復タンクに入れます。
注:傷害の重症度によっては、死亡率または強壮性クロニック発作が起こることがあります。TBIに続いて魚が長期間反応しない場合は、移管ピペットまたは鉗子を使用してテールピンチを投与し、痛みの反応を評価します。
2. 成人ゼブラフィッシュにおけるTBI後のスコアリング
- セクション1に概説されている傷害プロトコルに従って魚を麻酔し、傷付き、負傷した魚をシステム水の2 Lの気泡回収タンクに入れます。
- 回復タンクに入れられた直後に始まる心的外傷後発作の兆候について魚を観察してください。観察時間(すなわち、1時間)を設定し、発作スコア(後述)、各発作の持続時間、および発作を経験した魚の割合を含むすべての発作活動を記録する(図2A)。
注:発作は、傷害時だけでなく、TBI後の時間または日にすぐに発生する可能性があります。発作は長期間持続し、単一の魚は複数の発作を持つことができます。観察時間を1時間以上に設定すると、発作率の全体的な傾向を良好に表現できます。 - 大人のゼブラフィッシュの発作のフェノタイプのためのMussulini18ガイドラインを使用して魚をスコア。
注:トラッキングソフトウェアを使用しないと、3未満の発作スコアを公平に評価することは困難です。したがって、評価をソフトウェアなしで実行する場合は、3以上の発作スコアのみを記録する必要があります。
3. 脳解剖
- 2-フェノキシエタノールの1:500(2 mL/1 L、0.2%)溶液で魚を安楽死させ、ギルの動きが止まるまで、そして彼らは望ましいエンドポイントでフィンピンチに反応しない。
- ペトリ皿をモデリング粘土で満たし、解剖中に体を支えるために小さな空洞を作成します。
- 粘土の型に魚、裏側を上に置きます。魚の体の途中で中線を通して1つの解剖ピンを置き、2番目のピンは頭の基部の後ろに5mm以上置きます。
- 解剖光顕微鏡の下で、#5デュモン鉗子のペアで視神経をぶっきらぼうに切断し、目を取り除く(図2A)。
- 顕微鏡を見ながら、ロストラルの端が最も遠いように魚の向きを付ける(図2B)。
注: 次の手順は、右利きの個人向けです。左利きの個人は、鏡面の向きで次の手順を実行することを好む場合があります。 - #5鉗子を使用して、鉗子の一方の端をゆっくりと右頭頂板の下に置き、下地に向かって意図的にはさみ作用を行い、右頭頂板と前頭板を取り除きます(図2C)。
- 解剖中に脳を貫通しないように、鉗子を45°以下の角度に保ちます。
- 魚を時計回りに90°回転させます。#5鉗子の一端を左頭頂板の下に置き、同じシザーモーションを使用して、脳の裏側面全体を露出させる左頭頂板と前頭板を取り除きます(図2D,E)。
- #5鉗子で上顎をぶっきらぼうにトランセクトします。嗅球を保持し、これが関心のある領域である場合は、それらを損傷しないでください。
- #5 鉗子で右のオーペルクル、前耳、相互運用機能、およびサブパートを取り除きます(図 2F)。
- #5鉗子を使用してカルバリウム開口部の尾部端で筋肉を鈍く切除し、脊髄を露出させる。
- #5鉗子で脊髄をぶっきらぼうにトランセクトする。慎重に脳の下に鉗子を配置し、穏やかにカルバリウムから脳を除去します。
注:決して脳をつまむ。鉗子を使って脳を「揺りかご」にしたり、切除したりして、露出した脊髄をピンチポイントとして利用して脳を操縦します。 - 取り外した脳を9部100%エタノールで1部37%ホルムアルデヒドに1部固定し、ロッカープラットフォーム上で4°Cで一晩で修正します。
4. ゼブラフィッシュ脳における浮腫研究
- セクション1に概説されている傷害プロトコルに従って魚を麻酔し、怪我をさせ、魚が自由に泳ぎ始めるまで回復タンクで回復できるようにします。
- 1日間の通常の住宅条件で魚を置きます。
- 時間が経過した後、1:500 2-フェノキシエタノールで魚を安楽死させます。
- セクション3で概説されているプロトコルに従って脳全体または関心領域を解剖し、小さな計量ボートの上にすぐに脳を置く。
注:脳を移す際は、細かい鉗子を使って脳を刺したり掻いたりすることなく、体重のボートに優しく置き、組織を失う可能性があります。 - ラベル(傷害群および脳番号を有する)およびタンはスケールでボートを重量を量る追加の小さい乾燥を量る。正確な測定を得るために最低0.001 gを測定する能力を持つスケールを使用しなさい。
- タール乾燥重量ボートに脳を移し、脳の濡れた重量を記録する。彼らは後ろ側を上に向けて計量ボートに平らに横たわるように脳の向きを合わせた。
- 乾燥重量のボートと脳を60°Cに設定したハイブリダイゼーションオーブンに8時間置きます。
- 乾燥後、脳は乾燥重量ボートに固執し、取り外し、新しいタール小重量船に移すのが難しい場合があります。これは、乾燥した脳への損傷や組織の損失をもたらす可能性があるため、鉗子で脳をつまむのを避けてください。代わりに、細かい鉗子を一緒につまみ、脳の腹側から始めて、上向きの動きですくいます。
- 式を使用して各脳の水分量を決定します(図4)。
5. 神経軸全体で細胞増殖を標識し、固定組織を準備する。
- ddH2Oの2 mLで10 mM 5-エチニル-2'デオキシウリジン(EdU)を準備します。
- 1:1000(1 mL/1 L,0.1%)の50~100mLで一度に3~4匹の魚を麻酔し、魚が尾ピンチに反応しなくなるまで2-フェノキシエタノールを、損傷後の所望の時点で(セクション1に概説したプロトコルを使用)
- 濡れたスポンジに部分的な切開を行い、開口部に一度に1匹の魚を置き、腹側を上に置きます。
- 魚の体に10 mM EdUの〜40 μLを注入するために30 G針を使用してください。魚をシステム水で満たされた保持タンクに戻します。
注:繰り返し注射は、増殖細胞の数を多くラベル付けするために異なる時点で実行され、1週間を超える追跡期間が望まれる場合に必要になることがあります。 - セクション3で概説されているように脳を収集し、9部の2 mLを含む5mLガラスバイアルにグループとして配置します 100% エタノール 17% ホルムアルデヒド.ロッカープラットフォーム上の4°Cで脳を固定します。
注:ロッカーやシェーカープラットフォームは、脳が底部に休み、脳全体の脳全体のテレンシアロンがカールするのを禁止します。 - 脳を水分補給し、脳を固定するために使用される同じガラスバイアルで、降順エタノールシリーズの洗浄で、75%、50%、および25%、それぞれ15分間、室温でロッカー上の5%スクロース/PBSで1.5時間洗浄する。ロッカープラットフォーム上の4°Cで30%スクロース/PBSで一晩ガラスバイアルに脳を保管してください。
- 30%スクロース/PBSから脳を取り除き、2つの部分組織凍結媒体と1部30%スクロース/PBSからなる2:1溶液で満たされた井戸で満たされた12ウェルプレート(ウェルあたり1つの治療グループ)に鉗子でそれらを移す。ロッカープラットフォーム上の4°Cで一晩脳をインキュベートします。
- 4°Cで2〜24時間100%TFMで脳を12ウェルプレート没入脳内の井戸の次の行に脳を移す。
- クライオスタットチャックを使用して、ドライアイス上の所望の向きでTFMに脳を埋め込みます。
- 凍結切断(16 μm厚いセクション)を実行し、正に帯電したスライド上のセクションを収集します。スライドウォーマー上のドライスライドを1時間スライドし、-80°Cで保存するか、免疫検査を継続します。
- 組織切片の周りのスライドに疎水性バリアを準備し、スライドウォーマーで20分間乾燥させます。
- スライドをPBSで5分間短く洗い、PBS-Tween 20(0.05%)でそれぞれ10分間2回洗浄します。
- EdU細胞増殖キットとメーカーの指示を使用して、EdU検出を実行します。
- スライドを分析し、蛍光性のEdU標識細胞を、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて定量化します。個々の細胞を明確に区別するには、最低40倍の目標が必要です。
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Representative Results
傷害誘導リグを準備することで、大人のゼブラフィッシュにスケーラブルな鈍力TBIを提供する迅速かつ単純な手段が可能になります。傷害モデルの等級重症度は、血管損傷が最も簡単で最も顕著な病理の1つであるが、成功した傷害のいくつかの容易に識別可能な指標を提供する(図3)。怪我の間に使用される魚の株は、この指標を識別しやすくしたり、識別するのが難しくすることができます.野生型AB魚(WTAB,図3A-D)を用いた場合、血管損傷の同定は、miTBIまたはmoTBIと、色素沈着による損傷のない対照魚との区別が困難な場合があります(図3A-C)。損傷後、miTBI魚は最小表面擦過傷(図3B)を示し、一方でmoTBIは限られた脳出血を示す(図3C)。sTBI は依然として困難ですが、損傷の程度は明らかになります (図 3D)。これに対して、アルビノ(図3E-H)またはキャスパー魚(図3I-L)を使用する場合、血管損傷が容易に同定される。さらに、衝撃発作は、グループ間での傷害および発作率の後にしばしば観察され、傷害の別の代表的な指標である(表1)。負傷した魚は、トニッククローニック発作(運動失調、ZBC 1.9、曲がり、ZBC 1.16、旋回、ZBC 1.32、コルクスクリュースイミング、ZBC 1.37)19を表示します。発作は、重症度に関連して有病率の増加とともに観察される。負傷後、miTBIは発作のような行動を示さない。しかし、moTBIは発作行動(10.66%±1.37%、p<0.0001、表1)を表示し、sTBI魚の発生率はさらに上昇します(19.93%±1.49%、p<0.0001、表1)。
脳の除去に成功することは、浮腫や細胞増殖の評価など、無数のさらなる調査にとって重要です。脳領域の損傷を避けるために最大限の注意を払って解剖を行い(ほとんどの場合、意図しない穿刺によって)、すべての領域を保存します(嗅球は簡単に失われる可能性があります)。脳解剖手順および概略図(セクション3、図2A−F)に従って、完全な脳除去を可能にする(図2G、H)。研究者は、彼らの分析が脳全体を必要とするかどうか、または特定の脳領域のコレクションが彼らのニーズに合う可能性があるかどうかを検討する必要があります。傷害の重症度および採取時間に依存して、脳は付着した硬膜下出血を示すかもしれないが、これらはしばしば頭蓋骨の下側に付着し、解剖中に失われる。大脳の腫脹は時々明らかであるが、解剖学的な違いや一般的なサイズの変動のために、浮腫は腫脹を評価するのに最適な方法である。概説されたプロトコル(セクション4)に従って、損傷していない脳は0.80%±73.11%の流体含有量を示し、 miTBIは、わずかに上昇したが、1、3、または5 dpiで浮腫の有意な増加を示していない(1dpi:1.± 32%、p = 0.36、3 dpi:75.33±1.37%、p = 0.84、5 dpi:74.14 ±1.50%、>0.990%、> 対照的に、moTBIとsTBIの両方が有意な浮腫1 dpi(moTBI:80.55±0.94%、 p < 0.0001, sTBI: 86% ± 1.05%, p < 0.0001), および 3 dpi (moTBI: 78.11 ± 0.93%, p < 0.018, sTBI: 77.77% ± 1.02%, p < 0.036, 図 4).しかし、moTBIとsTBIの両方の流体含有量は、損傷していないコントロールに5 dpi(74.42±1.25%、p>0.99、sTBI:73.85%±1.01%、p>0.99、図4)によって損傷を受けていないコントロールに似たレベルに戻った。
細胞増殖は、ゼブラフィッシュにおけるTBIに続いて、傷害の程度の堅牢な評価である。細胞増殖反応は、他の形態の脳損傷9,12に続くゼブラフィッシュで以前に研究されてきたが、ほとんどの場合、調査は傷害部位に限定された。この鈍い力TBIは神経軸にまたがる強い増殖応答をもたらす。重症度依存的な方法(sTBIデータを示す)では、損傷のないコントロールに対する前脳の心室および脳下脳領域(テレンセバロン、図5B)で増大したEdU標識が観察される(図5A)。切片が中脳(メセンセファロンとジ脳スファル)に進むにつれて、負傷した脳は、骨膜上の灰色帯(PGZ)の眼球体状葉(TeO)、および損傷していない魚と比較して前視床下部の側面(それぞれ図5Dおよび図5C)に増加したEdU標識を表示した。後脳において、損傷を受けていない脳に明らかな神経原性領域(図5E、G)は、sTBIに続く細胞増殖の増加を示す(図5F、H)。
要約すると、成体ゼブラフィッシュに適用される修正されたマルマルー重量降下は、再現可能でスケーラブルな軽度、中等度、または重度の鈍い力TBIを提供する。ゼブラフィッシュは、重症度依存的な方法で、発作および血管損傷(すなわち、硬膜下および脳内血腫)を含む様々な病理を示す。さらに、負傷した魚の表示は回復率を低下させた(意識喪失、学習と記憶の問題の形での認知障害、および神経細胞死(データは示されていない)。.観察された病理は、神経軸全体にわたる堅牢な増殖事象と一致する4〜7日間にわたって急速に回復する。
図1:スケーラブルな損傷装置のセットアップ。 セットアップ、モデル、およびゼブラフィッシュへのスケーラブルなTIの提供をグラフィカルに表現。ステップ 1 から 4 では、魚を固定し、損傷時に頭部を露出させるサポート金型を形成する手順の説明の概要を示します。ステップ 5 ~ 7 では、モデルのトラブルシューティング時に考慮すべき側面に関する洞察を持つ、損傷の発生に関する指示を提供します。フィギュアは BioRender.com で作成されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:脳解剖のための頭蓋骨除去。 単純化されたゼブラフィッシュの頭蓋骨の模式図と、成体ゼブラフィッシュの脳を露出させる骨(青い切片)の段階的な除去。(A,B)目は視神経を切断する#5鉗子でぶっきらぼうに取り除かれる。(C)鉗子は、右頭頂骨と右前頭骨を取り除くために、頭頂板(黒矢印)に直接尾骨に筋肉に置かれます。(D,E)左頭頂骨と左前頭骨を除去する。(F) 右のオペルクル、前脳、相互運用性、およびサブパークルが除去され、脳への横側および後側へのアクセスを提供する。(G,H)損傷を受けていないとsTBI脳が削除されました.スケールバー= 500 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:傷害の極度にわたる様々な背景における血管損傷。損傷を受けていないTBI野生型AB、アルビノブ4、およびキャスパー成ゼブラフィッシュの血管損傷を示す後回り図。(A-D)野生型の野生型の魚は大きく色素化されており、miTBI(B)に続く擦過傷は可視化が困難です。損傷を受けていないコントロール(A)と比較して、moTBI(C)およびsTBI(D)魚における血管損傷がより明らかであった。(E-H)アルビノ魚は色素が少なく、脳の視覚化はより明確であった。TBIに続く血管損傷は、重さ全体にわたって明確に観察され、区別された。(I-L)キャスパー魚は、所望の神経解剖学的領域の容易な同定およびTBI重症度による血管損傷の明確な観察および線引きを可能にする透明性として初心者の研究者に最も適応可能な背景を提供した。スケールバー= 500 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ゼブラフィッシュはTBIに続く傷害誘発性浮腫を経験する。 ゼブラフィッシュは、TBI(損傷していない、miTBI、moTBI、およびsTBI)の異なる重症度にさらされ、パーセント流体含有量(浮腫)の損傷の後の異なる日に評価された。統計分析はブラウンズ・フォーサイスとウェルチANOVAで行われ、続いてダネットのT3のT3の複数比較ポストホックテストが行われました。n = 個々の魚の総数。すべての統計解析は、Prism (Graphpad 9.0) ソフトウェア パッケージを使用して実行されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:神経軸全体にわたるTBI誘発増殖 (A-H)コレクションの12時間前にEdU 12 hでIP注入された損傷のないおよびsTBI魚のコロナおよび矢状脳切片の共焦点画像。EUの組み込みの増加は、前脳(A、B)、中脳(C、D)、および後脳(E-H)全体にわたる傷害に続く複数の神経原性ニッチで観察された。小脳、CCe、顆粒層、GL、内側ヴァルヴラ小脳、Vam、分子層、ML、光学テクタム、TeO、室膜グレイゾーン、PGZ、テレンスファロン、およびTel。すべてのスケールバーは200 μmです。
| 群 | N | n | SEM±平均発作(%) | p |
| ウンダム | 10 | 74 | 0% | |
| ミトビ | 10 | 100 | 0% | >0.99 |
| モトビ | 10 | 184 | 10.66% ± 1.37% | <0.0001 |
| STBI | 10 | 237 | 19.93% ± 1.49% | <0.0001 |
表 1.ゼブラフィッシュは、TBIに続く重症度依存性影響発作を示す。 実験的な負傷群の割合として記録された強壮性クローニック発作の定量化は、1時間以内に傷害後に観察された。統計分析は、一方向のANOVAを用いて、Tukeyのポストホックテストを行った。N = 実験群の総数、n = 個々の魚の総数。プリズム(Graphpad 9.0)ソフトウェアパッケージを使用して統計解析を行いました。
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Discussion
神経外傷および関連する後遺症の調査は、長い間、伝統的な非再生げ歯類モデル20を中心としてきた。最近になってようやく、再生モデル9,11,13,14,21に様々な形態のCNS損傷を適用した研究が行なわれます。洞察力はありますが、これらのモデルは、人間の集団で珍しく見られる傷害方法(外傷、化学アブレーション、爆風)の使用によって制限され、損傷はスケーラブルではなく、したがって、ヒト集団で観察された重症度依存病理の不均一性に完全には対処していません22,23,24,25.ここでは、ヒト診断で確立された病理学的指標の多くを生み出す最も一般的な形態の臨床的に関連する頭部外傷(鈍力)4を適用する損傷パラダイムを提供する22,23,24,25。再生ゼブラフィッシュに適用すると、このモデルは、浮腫や心的外傷後発作などの重性を越えた傷害誘発病理の進行と回復を調査し、自然の再生回復の背後にあるメカニズムを解明する手段を提供する。
ゼブラフィッシュで鈍い力TBIを生産する上で、私たちのモデルの2つの重要な特徴があります。まず、当社のモデルは、多数の個人に連続した傷害を可能にする、または鈍い力TBIの累積効果を調査するために個人に繰り返し傷害を可能にする、急速な安価で単純な傷害パラダイムを提供します。第二に、このモデルは、異なる力の影響の影響を調べるために容易に拡張可能である。管の長さ(ボールベアリングの高さ)とボールベアリングの重量を変更することで、魚の頭蓋骨に届くエネルギー、衝撃力を簡単に変更して計算することができます。この損傷のスケーラビリティにより、重症度に依存するTBIの進行とCNS修復の再生メカニズムに関する複数の調査手段が可能になります。
成功した傷害アプリケーションにアクセスするための複数の指標では、引き続き慎重に検討する必要があります魚の遺伝的背景を利用する必要があります。 キャスパー または アルビノ 変異魚は、初心者の研究者が確実にドロップシャフトの下に魚を配置し、所望の神経解剖学的衝撃点の上にスチールディスクを配置し、血管損傷を評価するために有利になります。さらに、脳の慎重な除去は 、キャスパー および アルビノ 変異魚の骨および脳の視覚的なアクセシビリティによって単純化される。しかし、色素性の野生型魚は、ランドマークの同定と解剖の成功が顕著な慣行で来るかもしれないが、使用することができます。さらに、色素化された魚は、その後の病理が傷害の適切な特徴付けを可能にするので、moTBIまたはsTBI侮辱のいずれかを産生する際に使用することができる。
ゼブラフィッシュにおける鈍力TBIの効果を研究する大きな理由の1つは、傷害による細胞増殖の原因と神経再生の基礎となるメカニズムを調べることである。ゼブラフィッシュ神経軸26,27の神経原性ニッチでは構成的増殖の発達および基礎的レベルが同定されており、傷害誘発性再生は成人ゼブラフィッシュ8,12,15の傷害部位に局在または隣接することが観察されている。しかし、我々の鈍力TBIモデルは、びまん性傷害が神経軸全体の神経原性ニッチ内で重症度依存性細胞増殖事象をもたらすことを示している。TBIに続く細胞増殖の発生源および範囲の同定により、単細胞RNA-Seqの適用により、増殖性ニッチにおける遺伝子発現の変化を同定し、特定のアゴニストおよびアンタゴニストの適用を通じて異なるシグナル伝達経路の役割をテストし、この再生応答を調節する。このアプローチは、損傷したゼブラフィッシュretina28における神経再生の基礎となるメカニズムを解明するのに有用であることが証明されており、TBIに続く脳でも同様に有用であるべきである。
結論として、当社のモデルは、スケーラブルな鈍力TBIを提供するための迅速でシンプルで費用対効果の高い傷害方法を提供します。このモデルは、重症度依存または反復的な鈍力TBIの効果をさらに調査するとともに、成人脊椎動物における機能的認知回復のための神経機能の保護を改善または神経再生を誘導する遺伝的調節の治療目標を解明するのに有用である。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ハイドラボのメンバーが思慮深い議論をしてくれたことに感謝し、ゼブラフィッシュケアと畜産のためのフライマンライフサイエンスセンターの技術者、およびノートルダム大学光学顕微鏡コア/NDIIFが機器とそのサービスを使用してくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、ノートルダム大学ノートルダム大学ゼブラフィッシュ研究センター、ノートルダム大学幹細胞再生医療センター、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム(JTH)NIH R01-EY018417(DRH)の国立眼科研究所からの助成金によって支援されました。 自由フェローシップのセンチネル(JTH)とパット・ティルマン奨学金(JTH)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
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