Summary
Vi modifiserte Marmarou vektfallsmodell for voksen sebrafisk for å undersøke en bredde av patologier etter stump-force traumatisk hjerneskade (TBI) og mekanismene som ligger til grunn for påfølgende nevronal regenerering. Denne stumpe TBI-modellen er skalerbar, induserer en mild, moderat eller alvorlig TBI, og rekapitulerer skade heterogenitet observert hos human TBI.
Abstract
Blunt-force traumatiske hjerneskader (TBI) er den vanligste formen for hodetraumer, som spenner over en rekke alvorlighetsgrader og resulterer i komplekse og heterogene sekundære effekter. Selv om det ikke er noen mekanisme for å erstatte eller regenerere de tapte nevronene etter en TBI hos mennesker, har sebrafisk evnen til å regenerere nevroner gjennom hele kroppen, inkludert hjernen. For å undersøke bredden av patologier utstilt i sebrafisk etter en stump kraft TBI og for å studere mekanismene som ligger til grunn for den påfølgende nevronale regenerative responsen, endret vi den ofte brukte gnageren Marmarou vektfall for bruk i voksen sebrafisk. Vår enkle blunt-force TBI-modell er skalerbar, induserer en mild, moderat eller alvorlig TBI, og rekapitulerer mange av fenotypene som observeres etter menneskelig TBI, for eksempel kontakt- og posttraumatiske anfall, ødem, subdurale og intracerebrale hematomer og kognitive funksjonshemninger, som hver vises på en skade alvorlighetsgradavhengig måte. TBI-oppfølgeren, som begynner å dukke opp i løpet av minutter etter skaden, avtar og går tilbake til nær uskadede kontrollnivåer innen 7 dager etter skaden. Den regenerative prosessen begynner så tidlig som 48 timer etter skade (hpi), med toppcelleproliferasjon observert av 60 hpi. Dermed produserer vår sebrafisk blunt-force TBI-modell karakteristisk primær og sekundær skade TBI-patologier som ligner på menneskelig TBI, noe som gjør det mulig å undersøke sykdomsdeset og progresjon, sammen med mekanismene for nevronal regenerering som er unik for sebrafisk.
Introduction
Traumatiske hjerneskader (TBIer) er en global helsekrise og en ledende årsak til død og funksjonshemming. I USA opplever omtrent 2,9 millioner mennesker en TBI hvert år, og mellom 2006-2014 økte dødeligheten på grunn av TBI- eller TBI-oppfølgeren med over 50%1. TBIer varierer imidlertid i deres etiologi, patologi og kliniske presentasjon, hovedsakelig delvis på skademekanismen (MOI), som også påvirker behandlingsstrategier og forventet prognose2. Selv om TBIer kan være et resultat av ulike MOI-er, er de hovedsakelig et resultat av enten et gjennomtrengende eller stump krafttraume. Gjennomtrengende traumer representerer en liten prosentandel av TBIer og genererer en alvorlig og fokal skade som er lokalisert til de umiddelbare og omkringliggende impalerte hjerneregionene3. I motsetning til dette er tbier med stump kraft vanligere i befolkningen generelt, spenner over en rekke alvorlighetsgrader (milde, moderate og alvorlige), og produserer en diffus, heterogen og global skade som påvirker flere hjerneregioner1,4,5.
Sebrafisk (Danio rerio) har blitt brukt til å undersøke et bredt spekter av nevrologiske fornærmelser som spenner over sentralnervesystemet (CNS) 6,7,8,9. Sebrafisk har også, i motsetning til pattedyr, en medfødt og robust regenerativ respons for å reparere CNS-skade10. Nåværende sebrafisk traumemodeller bruker ulike skademetoder, inkludert penetrasjon, eksisjon, kjemisk fornærmelse eller trykkbølger11,12,13,14,15,16. Imidlertid bruker hver av disse metodene en MOI som sjelden oppleves av den menneskelige befolkningen, er ikke skalerbar på tvers av en rekke skade alvorlighetsgrader, og adresserer ikke heterogenitet eller alvorlighetsgrad-avhengig TBI sequela rapportert etter stump-force TBI. Disse faktorene begrenser bruken av sebrafiskmodellen for å forstå de underliggende mekanismene til patologiene forbundet med den vanligste formen for TBI i den menneskelige befolkningen (milde stumpe kraftskader).
Vi hadde som mål å utvikle en rask og skalerbar TBI sebrafiskmodell med stump kraft som gir muligheter til å undersøke skadepatologi, progresjon av TBI-oppfølgere og den medfødte regenerative responsen. Vi modifiserte den ofte brukte gnageren Marmarou17 vektfall og påførte den på voksen sebrafisk. Denne modellen gir et reproduserbart utvalg av alvorlighetsgrader som spenner fra mild, moderat og alvorlig. Denne modellen rekapitulerer også flere fasetter av menneskelig TBI-patologi, på en alvorlighetsgradsavhengig måte, inkludert anfall, ødem, subdurale og intracerebral hematomer, nevronal celledød og kognitive underskudd, for eksempel læring og hukommelsessvikt. Dager etter skade, patologier og underskudd sprer seg, tilbake til nivåer som ligner uskadede kontroller. I tillegg viser denne sebrafiskmodellen en robust sprednings- og nevronal regenereringsrespons over nevroaksene angående skade alvorlighetsgrad.
Her gir vi detaljer om oppsett og induksjon av stumpe krafttraumer, skåring av posttraumatiske anfall, vurdering av vaskulære skader, instruksjoner om å forberede hjerneseksjoner, tilnærminger til kvantifisering av ødem og innsikt i spredningsresponsen etter skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sebrafisk ble oppdratt og vedlikeholdt i Notre Dame Zebrafish-anlegget i Freimann Life Sciences Center. Metodene beskrevet i dette manuskriptet ble godkjent av University of Notre Dame Animal Care and Use Committee.
1. Traumatisk hjerneskadeparadigme
- Tilsett 1 ml 2-fenoksyetanol til 1 L systemvann (60 mg Instant Ocean i 1 L deionisert RO-vann).
- Forbered en aerated utvinning tank som inneholder 2 L systemvann ved romtemperatur.
- Velg ønsket vekt på kulelager og ønsket lengde og diameter på stål/ plastrør og bestem energi- og slagkraften.
MERK: Slangen skal ha en indre diameter som gjør at kulelageret kan passere gjennom uten å endre banen eller bevegelseshastigheten.- Bestem kinetisk energi ved påvirkning:
Hvor, KE = kinetisk energi, m = masse (i kg), g = gravitasjonskraft, h = høyde (i m) fra dråpepunkt til fisk.
MERK: Dette gir kinetisk energi i J. Multipliser verdien med 1000 for å bestemme mJ. KE er basert på et akselererende objekt, som oppstår når kulelageret slippes fra en stasjonær posisjon. - Generer en mild TBI (miTBI) ved hjelp av 7,62 cm lange stål/plastrør som ender 1,5 cm over platen på sebrafiskskallen (total avstand 9,1 cm) og et kulelager på 1,5 g (6,4 mm). Disse produserer en kinetisk energi på 1,33 mJ. Denne skaden ble empirisk besluttet å tilsvare en miTBI basert på viktige patofysiologiske TBI-markører, for eksempel vaskulær skade, subdural / intracerebral hematomdannelse, nevronal celledød og kognitive svekkelser som i stor grad rekapitulerte det som ble rapportert i den menneskelige befolkningen på en alvorlighetsgradavhengig måte.
- Beregn kinetisk energi miTBI =
- Generer en moderat TBI (moTBI) ved hjelp av 12,7 cm lange stål/plastrør som ender 1,5 cm over platen på sebrafiskskallen (total avstand 14,2 cm) og et kulelager på 1,5 g (6,4 mm diameter) som produserer kinetisk energi på 2,08 mJ.
- Beregn kinetisk energi moTBI =
- Generer en alvorlig TBI (sTBI) ved hjelp av 7,62 cm lange stål/plastrør som ender 1,5 cm over platen på sebrafiskskallen (total avstand 9,1 cm) og et kulelager på 3,3 g (8,38 mm diameter) som produserer en kinetisk energi på 2,94 mJ.
- Beregn kinetisk energi sTBI =
- Bestem kinetisk energi ved påvirkning:
- Fyll en Petri-tallerken med modelleringsleire (figur 1, trinn 1) og bruk et stumpt instrument (dvs. baksiden av et par tang) for å lage en hevet plattform (5 cm x 1,5 cm) med ekstra modelleringsleire (figur 1, trinn 2).
- Bruk et barberblad til å dele den hevede plattformen på langs i to omtrent like halvdeler (figur 1, trinn 3, rød stiplet linje). Form de to halvdelene i en kanal som passer til lengden på en voksenfisk (figur 1, trinn 4). Bruk ekstra leire til å bygge vegger som vil sikre ~ 2/3 av fiskekroppen, slik at hodet blir utsatt.
- Form en liten støtte i det eksponerte hodeområdet vinkelrett på veggene for å støtte hodet for å unngå rotasjon eller rekyl av hodet ved skade (figur 1, trinn 4).
MERK: Kanalen skal være dyp nok til å støtte fisken i en dorsal-up posisjon, men bør fortsatt la hodet hvile over den omkringliggende leiren. I tillegg bør hodestøtten følge fiskens naturlige krumning, som støtter nedre mandibel og gjeller. - Påse at den nedlagte vekten ikke hindres av kanalens sider (figur 1, trinn 4).
- Lag en stålskive med en diameter på 3 mm ved hjelp av en minihullstans og 22 g stålblinking. Hver disk kan brukes flere ganger.
- Bedøv en fisk ved å plassere den i et beger med 50-100 ml 1:1000 (1 ml / 1 l, 0,1%) 2-fenoksyetanol til den ikke reagerer på haleklemme.
- Plasser fisken, dorsalsiden opp, på leireformen i kanalen slik at kroppen er festet på sidene og legg en 3 mm 22 g stålskive på hodet, sentrert over ønsket slagpunkt (figur 1, trinn 5).
- Sørg for at fisken er justert så vinkelrett som mulig for å unngå at hodet vipper til den ene siden, noe som kan føre til ujevn innvirkning.
- Fest stål-/plastslangen ved hjelp av et standard ringstativ og en armklemme, slik at bunnen av slangen er 1,5 cm over sebrafiskens hode (figur 1, trinn 6). Pass på at slangen er rett.
- Se ned på slangen og sørg for at slangen er justert over stålplaten.
- Slipp kulelageret (1,5 g for mild og moderat TBI, og 3,3 g for alvorlig TBI) fra en forhåndsbestemt høyde (beskrevet i trinn 1.3.3-1.3.5) ned slangen på stålplaten som ligger over ønsket nevroanatomisk interesseområde (f.eks. cerebellum, figur 1, trinn 5) for å produsere den stumpe kraften TBI for ønsket alvorlighetsgrad av skaden. Plasser den skadde fisken i en utvinningstank som skal overvåkes.
MERK: Avhengig av alvorlighetsgraden av skaden, kan det oppstå dødelighet eller tonisk-kloniske anfall. Hvis fisken ikke reagerer over lengre tid etter TBI, bruk en overføringspipette eller tang for å administrere en haleklemme og evaluere for smerterespons.
2. Scoring anfall post-TBI i voksen sebrafisk
- Bedøve og skade fisken i henhold til skadeprotokollen som er skissert i § 1 og plassere den skadede fisken i en aererert utvinningstank på 2 L systemvann.
- Vær oppmerksom på fisken for tegn på posttraumatiske anfall som begynner umiddelbart etter å ha blitt plassert i utvinningstanken. Angi observasjonstid (dvs. 1 t) og registrer all anfallsaktivitet, inkludert beslagsskår (beskrevet nedenfor), varighet av hvert anfall og prosentandelen fisk som opplevde anfall (figur 2A).
MERK: Anfall kan oppstå umiddelbart etter skade, samt timer eller dager etter TBI. Anfall kan vedvare på lang sikt, og en enkelt fisk kan ha flere anfall. Å sette en observasjonstid på 1 t eller mer vil gi en god representasjon av den generelle trenden med beslag. - Skår fisk ved hjelp av Mussulini18-retningslinjene for voksne sebrafiskbeslag fenotyper.
MERK: Uten å bruke sporingsprogramvaren er det vanskelig å vurdere anfallspoeng under 3 objektivt. Derfor bør bare anfallspoeng på 3 eller høyere registreres når vurderingen utføres uten programvare.
3. Hjerne disseksjon
- Euthanize fisk i en 1:500 (2 ml / 1 l, 0,2%) løsning av 2-fenoxyetanol, til gillbevegelser opphører, og de er ikke aktive for finklemme, på ønsket endepunkt.
- Fyll en Petri-tallerken med modellering av leire og lag et lite hulrom for å støtte kroppen under disseksjon.
- Plasser fisken, dorsalsiden opp, i leireformen. Plasser en disseksjonspinne gjennom midtlinjen halvveis ned fiskens kropp og en annen pinne ~ 5 mm bak bunnen av hodet.
- Under et dissekerende lysmikroskop, kutt synsnerven direkte med et par #5 Dumont-tang og fjern øynene (figur 2A).
- Orienter fisken slik at rostralenden er lengst når du ser gjennom mikroskopet (figur 2B).
MERK: Følgende trinn er for høyrehendte personer. Venstrehendte personer foretrekker kanskje å utføre følgende trinn i speilvendt retning. - Bruk #5 tang for å sakte plassere den ene enden av tangene under høyre parietal plate, og gjør en bevisst saksehandling som beveger seg mot rostralenden og fjern de riktige parietal- og frontplatene (figur 2C).
- Hold tangene i en vinkel på 45° eller lavere for å unngå å trenge inn i hjernen under disseksjon.
- Roter fisken 90° med klokken. Plasser den ene enden av #5 tang under venstre parietal plate og bruk samme saks bevegelse for å fjerne venstre parietal og frontal plater utsette hele dorsal aspekt av hjernen (Figur 2D, E).
- Transekter maxillaen direkte med #5 tang. Ta vare på de olfaktoriske pærene og ikke skade dem hvis dette er området av interesse.
- Fjern høyre operkel, preoperkel, interopercle og subopercle med #5 tang (figur 2F).
- Resect muskulaturen på den kaudale enden av golgata åpningen ved hjelp av #5 tang, utsette ryggmargen.
- Transekter ryggmargen direkte med #5 tang. Plasser forsiktig tang under hjernen og fjern hjernen forsiktig fra golgata.
MERK: Klem aldri hjernen. Bruk tang til å "vugge" hjernen eller resect caudally og bruke den eksponerte ryggmargen som et klemmepunkt for å manøvrere hjernen. - Fest de fjernede hjernene i 9 deler 100% etanol til 1 del 37% formaldehyd over natten ved 4 °C på en vippeplattform.
4. Ødemstudier i sebrafiskhjernen
- Bedøve og skade fisk i henhold til skadeprotokollen som er skissert i § 1 og la fisken komme seg i en utvinningstank til de begynner å svømme fritt.
- Plasser fisk tilbake i normale boligforhold etter skade i 1 dag.
- Euthanize fisken i 1:500 2-fenoxyetanol, etter at tiden har gått.
- Disseker hele hjernen eller regionen av interesse i henhold til protokollen som er skissert i avsnitt 3 og plasser hjernen umiddelbart på en liten veiebåt.
MERK: Vær forsiktig når du overfører hjernen, bruk fine tang for å forsiktig plassere den på veiebåten uten å stikke eller skrape hjernen, noe som kan føre til tap av vev. - Merk (med skadegruppe og hjernenummer) og tjære en ekstra liten tørkeveiebåt på en vekt. Bruk en skala med muligheten til å måle minst 0,001 g for å få en nøyaktig måling.
- Overfør hjernen til den tjæretørkende veiebåten og registrer hjernens våte vekt. Orienter hjernen slik at de ligger flatt på veiebåten med dorsalsiden vendt opp.
- Plasser tørkeveiebåten og hjernen i en hybridiseringsovn satt til 60 °C i 8 timer.
- Etter tørking kan hjernen holde seg til tørkeveiebåten og kan være vanskelig å fjerne og overføre til en ny tjære liten veiebåt. Unngå å klemme hjernen med tang, da dette kan føre til skade på den tørre hjernen og tap av vev. Klem i stedet de fine tangene sammen, og start ved den ventrale siden av hjernen, scoop i en oppadgående bevegelse.
- Bestem vanninnholdet i hver hjerne ved hjelp av formelen (figur 4):
5. Merking av cellulær spredning over nevroaksene og forbereder fast vev.
- Forbered 10 mM 5-ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU) i 2 ml ddH2O.
- Bedøv 3 til 4 fisk om gangen i 50-100 ml 1:1000 (1 ml/1 l, 0,1 %) 2-fenoksyetanol til fisken ikke reagerer på haleklemme, på ønsket tidspunkt etter skade (ved hjelp av protokollen som er skissert i avsnitt 1).
- Lag et delvis snitt på en våt svamp og legg en fisk om gangen i åpningen, ventral side opp.
- Bruk en 30 G nål til å injisere ~40 μL 10 mM EdU i fiskens kropp. Returner fisken til en lagertank fylt med systemvann.
MERK: Gjentatte injeksjoner kan utføres på forskjellige tidspunkter for å merke et større antall spredningsceller og kan være nødvendig hvis en jaktperiode på større enn 1 uke er ønsket. - Samle hjerner som beskrevet i seksjon 3 og plasser dem som en gruppe i et 5 ml hetteglass som inneholder 2 ml 9 deler 100% etanol til 1 del 37% formaldehyd. Fest hjernen ved 4 °C på en vippeplattform.
MERK: En rocker- eller shakerplattform forbyr hjernen å hvile i bunnen og telencephalon av hele hjerner fra curling. - Rehydrere hjerner, i samme hetteglass i glass som brukes til å fikse hjerner, i vasker av synkende etanolserie, 75%, 50% og 25%, i 15 minutter hver, etterfulgt av en 1,5 timers vask i 5% sukrose / PBS på en rocker ved romtemperatur. Oppbevar hjernen i et hetteglass med glass over natten i 30 % sukrose/PBS ved 4 °C på en vippeplattform.
- Fjern hjerner fra 30% sukrose / PBS og overfør dem med tang til en 12-brønns plate (en behandlingsgruppe per brønn) med brønner fylt med en 2:1-løsning som består av 2 deler vevsfrysingsmedium og 1 del 30% sukrose / PBS. Inkuber hjernen over natten ved 4 °C på en vippeplattform.
- Overfør hjerner til neste rad med brønner i 12-brønnsplatens nedsenkede hjerner i 100% TFM i 2-24 timer ved 4 °C.
- Bruk en kryostat chuck til å legge inn hjernen i TFM i ønsket retning på tørris.
- Utfør kryosectioning (16 μm tykke seksjoner) og samle seksjonene på positivt ladede lysbilder. Tørk lysbilder på en lysbildevarmer i 1 time og oppbevar deretter ved -80 °C eller fortsett med immunhiistokjemi.
- Forbered en hydrofob barriere på gliden rundt vevsdelene og la tørke på en glidevarmer i 20 minutter.
- Vask lysbildene kort i PBS i 5 minutter og deretter to ganger i PBS-Tween 20 (0,05%) i 10 minutter hver.
- Utfør EdU-deteksjon ved hjelp av EdU Cell Proliferation Kit og produsentens instruksjoner.
- Analyser lysbildene og kvantifiser de fluorescerende EdU-merkede cellene ved hjelp av enten et epifluorescerende mikroskop eller et konfokalt mikroskop. Minimum 40x mål vil være nødvendig for å tydelig skille individuelle celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forberedelse av skadeinduksjonsriggen gir mulighet for en rask og forenklet måte å levere en skalerbar stump kraft TBI til voksen sebrafisk. Den graderte alvorlighetsgraden av skademodellen gir flere lett identifiserbare beregninger av vellykket skade, selv om den vaskulære skaden er en av de enkleste og mest fremtredende patologiene (figur 3). Belastningen av fisk som brukes under skaden kan gjøre denne indikatoren enklere eller vanskeligere å identifisere. Ved bruk av villtype AB-fisk (WTAB, figur 3A-D) kan identifisering av vaskulær skade være vanskelig å skille mellom enten miTBI eller moTBI og uskadet kontrollfisk på grunn av pigmenteringen (figur 3A-C). Etter skade viser miTBI fisk minimale overflateslitasjer (figur 3B), mens moTBI har begrenset hjerneblødninger (figur 3C). Selv om sTBI fortsatt kan være utfordrende, er skadeomfanget ofte tydelig (figur 3D). Når du bruker albino (figur 3E-H) eller casperfisk (figur 3I-L), er det derimot lett å identifisere vaskulær skade. I tillegg observeres slaganfall ofte etter skade og anfallsrate blant gruppen er en annen representativ skademetrikk (tabell 1). Skadet fisk vil vise tonisk-kloniske anfall (ataksi, ZBC 1,9, bøyning, ZBC 1,16, sirkler, ZBC 1,32 og korketrekker svømming, ZBC 1,37)19 som lett observeres etter skade, uavhengig av bakgrunnsstammen. Det vil bli observert beslag med økende prevalens i forhold til alvorlighetsgrad. Etter skade viser miTBI ikke anfallslignende atferd; moTBI vil imidlertid vise anfallsatferd (10,66 % ± 1,37 %, p < 0,0001, tabell 1) og forekomsten er ytterligere forhøyet i sTBI-fisk (19,93 % ± 1,49 %, p < 0,0001, tabell 1).
Vellykket fjerning av hjernen er avgjørende for et utall videre undersøkelser, for eksempel ødem og vurdering av celleproliferasjon. Utfør disseksjoner med største forsiktighet for å unngå å skade hjerneregioner (oftest ved utilsiktet punktering) og for å bevare alle regioner (de olfaktoriske pærene kan lett gå tapt). Etter hjernespredningsprosedyren og skjematisk (avsnitt 3, figur 2A-F) muliggjør fullstendig hjernefjerning (figur 2G,H). Etterforskere bør vurdere om analysen krever hele hjernen eller om en samling av spesifikke hjerneregioner kan passe deres behov. Avhengig av alvorlighetsgraden av skaden og innsamlingstidspunktet, kan hjernene vise vedlagte subdurale blødninger, men disse blir ofte festet til undersiden av skallen og tapt under disseksjon. Hevelse i cerebrum er til tider tydelig, men på grunn av anatomiske forskjeller og variasjon i generell størrelse er ødem den beste metoden for å vurdere hevelse. Etter protokollen som er skissert (avsnitt 4), viser uskadede hjerner et flytende innhold på 73,11% ± 0,80%, og miTBI, selv om de er litt forhøyet, viser ikke en betydelig økning i ødem ved 1, 3 eller 5 dpi (1 dpi: 76,33% ± 1,32%, p = 0,36, 3 ppt: 75,33 ± 1,37 %, p = 0,84, 5 ppt: 74,14 ± 1,50 %, p > 0,99, figur 4). Til sammenligning hadde både moTBI og sTBI signifikant ødem 1 dpi (moTBI: 80,55 ± 0,94 %, p < 0,0001, sTBI: 86 % ± 1,05 %, p < 0,0001) og 3 ppt (moTBI: 78,11 ± 0,93 %, p < 0,018, sTBI: 77,77 % ± 1,02 %, p < 0,036, figur 4). Imidlertid returnerte væskeinnholdet i både moTBI og sTBI til nivåer som ligner uskadede kontroller med 5 dpi (moTBI: 74,42 ± 1,25%, p > 0,99, sTBI: 73,85% ± 1,01%, p > 0,99, figur 4).
Celleproliferasjon, etter TBI i sebrafisk, er en robust vurdering av skadeomfanget. Mens celleproliferasjonsresponsen tidligere har blitt studert i sebrafisk etter andre former for hjerneskade9,12, var undersøkelsen i de fleste tilfeller begrenset til skadestedet. Denne stumpe kraften TBI resulterer i en robust spredningsrespons som spenner over nevroaksen. På en alvorlighetsgradsavhengig måte (sTBI-data vist), observeres økt EdU-merking i ventrikulære og subventrikulære soner i forebrain (telencephalon, figur 5B) i forhold til uskadede kontroller (figur 5A). Etter hvert som seksjoner beveget seg årsaksmessig inn i midbrain (mesencephalon og diencephalon), viste skadede hjerner økt EdU-merking i den periventrikulære grå sonen (PGZ) de optiske tectal lobes (TeO), og aspekter av den fremre hypothalamus sammenlignet med uskadet fisk (henholdsvis figur 5D og figur 5C). I hindbrain viser nevrogene regioner som er tydelige i den uskadede hjernen (figur 5E, G) økt celleproliferasjon etter sTBI (figur 5F, H).
For å oppsummere gir et modifisert Marmarou-vektfall påført voksen sebrafisk en reproduserbar og skalerbar mild, moderat eller alvorlig stump kraft TBI. Sebrafisk, på en alvorlighetsgradavhengig måte, viser ulike patologier, inkludert anfall og vaskulær skade (dvs. subdurale og intrarebrale hematomer). I tillegg viser skadet fisk redusert utvinningsgrad (analogt med tap av bevissthet, kognitive underskudd i form av lærings- og minneproblemer og nevronal celledød (data ikke vist). Patologiene som observeres, gjenoppretter raskt i løpet av 4-7 dager sammenfallende med robuste proliferative hendelser over nevroaksen.
Figur 1: Sette opp det skalerbare skadeapparatet. Grafisk fremstilling av oppsettet, modellen og levering av skalerbare TBIer til sebrafisken. Trinn 1-4 gir instruksjonsoversikt over trinnene for å danne støtteformen som immobiliserer fisken og utsetter hodet under skade. Trinn 5-7 gir instruksjoner om hvordan du gir skaden innsikt i aspekter du bør vurdere når du feilsøker modellen. Figuren ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skull fjerning for hjerne disseksjon. Skjematisk for en forenklet sebrafiskskalle og trinnvis fjerning av bein (blå seksjoner) for å eksponere den voksne sebrafiskhjernen. (A,B) Øynene fjernes direkte med #5 tang som kutter synsnervene. (C) Tang plasseres i muskulaturen direkte årsaksmessig til parietalplatene (svart pil) for å fjerne høyre parietalben og deretter høyre frontben. (D,E) Venstre parietalben og venstre frontben fjernes. (F) Høyre operkel, preoperkel, interopercle og subopercle fjernes, noe som gir lateral og dorsal tilgang til hjernen. (G,H) Uskadede og sTBI hjerner ble fjernet. Skalalinje = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vaskulær skade i ulike bakgrunner på tvers av skade-alvorlighetsgrader. Dorsal syn på uskadet og TBI wild-type AB, albinob4, og casper voksen sebrafisk viser vaskulær skade. (A-D) Adult wild-type AB fisk er tungt pigmentert og slitasje etter miTBI (B) er vanskelig å visualisere. Vaskulær skade var tydeligere hos moTBI (C) og sTBI (D) fisk sammenlignet med uskadede kontroller (A). (E-H) albinofisk var mindre pigmentert og visualisering av hjernen var tydeligere. Vaskulær skade etter TBI ble tydelig observert og utmerket på tvers av alvorlighetsgrader. (I-L) casper fisk ga den mest tilpasningsdyktige bakgrunnen for nybegynnere etterforskere som åpenhet tillatt for enkel identifisering av ønskede nevroanatomiske regioner og klar observasjon og avgrensning av vaskulær skade ved TBI-alvorlighetsgrad. Skalalinje = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sebrafisk opplever skadeindusert ødem etter TBI. Sebrafisk ble utsatt for ulike alvorlighetsgrader av TBI (uskadet, miTBI, moTBI og sTBI) og vurdert på forskjellige dager etter skade for prosentvæskeinnhold (ødem). Statistiske analyser ble utført med en Browns-Forsythe og Welch ANOVA etterfulgt av en Dunnetts T3 multippel sammenligning post-hoc test. n = totalt antall individuelle fisk. Alle statistiske analyser ble utført med Prism (Graphpad 9.0)-programvarepakken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: TBI-indusert spredning over nevroaksen. (A-H) Confocal bilder av coronal og sagittal hjerne seksjoner av uskadet og sTBI fisk som ble IP-injisert med EdU 12 h før innsamling. Økt EdU-inkorporering ble observert i flere nevrogene nisjer etter skade over forebrain (A, B), midbrain (C, D) og hindbrain (E-H). Cerebellum, CCe, Granule Layer, GL, Medial Valvula Cerebelli, Vam, Molecular Layer, ML, Optic Tectum, TeO, Periventricular Grey Zone, PGZ, Telencephalon og Tel. Alle skalastenger er 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Gruppe | N | n | Gjennomsnittlige anfall (%) ± SEM | p |
| Undam | 10 | 74 | 0% | |
| miTBI | 10 | 100 | 0% | >0,99 |
| moTBI | 10 | 184 | 10,66 % ± 1,37 % | <0.0001 |
| sTBI | 10 | 237 | 19,93 % ± 1,49 % | <0.0001 |
Tabell 1. Sebrafisk viser alvorlighetsgradsavhengige slaganfall etter TBI. Kvantifisering av tonisk-kloniske anfall, som ble registrert som prosentandelen av en eksperimentell skadet gruppe, som ble observert innen 1 time etter skade. Statistiske analyser ble utført med en enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post-hoc-test. N = totalt antall eksperimentelle grupper, n = totalt antall individuelle fisk. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Prism (Graphpad 9.0)-programvarepakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøkelser av neurotrauma og tilhørende oppfølger har lenge vært sentrert om tradisjonelle ikke-regenerative gnagermodeller20. Først nylig har studier brukt ulike former for CNS skade på regenerative modeller9,11,13,14,21. Selv om de er innsiktsfulle, er disse modellene begrenset av enten deres bruk av en skademetode som er uvanlig sett i den menneskelige befolkningen (gjennomtrengende traumer, kjemisk ablasjon, eksplosjon) og / eller skaden er ikke skalerbar og adresserer derfor ikke fullt ut heterogeniteten til alvorlighetsgradsavhengige patologier observert i den menneskelige befolkningen22,23,24,25 . Her tilbyr vi et skadeparadigme som bruker den vanligste formen for klinisk relevante hodetraumer (stump kraft)4 som produserer mange av de patologiske beregningene som er etablert i menneskelig diagnose22,23,24,25. Når den brukes på regenerativ sebrafisk, gir modellen veier for å undersøke progresjon og gjenoppretting av skadeinduserte patologier på tvers av alvorlighetsgrader, for eksempel ødem eller posttraumatiske anfall, samt belyse mekanismene bak den medfødte regenerative utvinningen.
Det er to viktige trekk ved vår modell i å produsere en stump kraft TBI i sebrafisk. For det første leverer modellen vår et billig og enkelt skadeparadigme som er raskt, noe som tillater den påfølgende skaden på et stort antall individer eller gjentatt skade på en person for å undersøke den kumulative effekten av stump kraft TBI. For det andre er denne modellen lett skalerbar for å undersøke effekten av forskjellige kraftpåvirkninger. Ved å endre lengden på røret (høyden som kulelageret slippes fra) og vekten av kulelageret, kan energien som leveres til fiskens skalle, og slagkraften enkelt endres og beregnes. Denne skalerbarheten av skaden tillater flere veier for undersøkelse med hensyn til alvorlighetsgradsavhengig TBI-oppfølgerprogresjon og regenerative mekanismer for CNS-reparasjon.
Med flere beregninger for å få tilgang til vellykket skadeapplikasjon, bør det fortsatt tas nøye hensyn til den genetiske bakgrunnen til fisk som skal brukes. Den casper eller albino mutant fisk vil være gunstig for nybegynnere etterforskere å pålitelig plassere fisken under dråpeakselen, plasseringen av stålskiven over ønsket nevroanatomisk slagpunkt, og vurdere vaskulær skade. Videre forenkles forsiktig fjerning av hjernen av den visuelle tilgjengeligheten av bein og hjerne i casper og albino mutant fisk. Pigmentert villfisk kan imidlertid brukes til å identifisere landemerker og vellykket disseksjon kan komme med bemerkelsesverdig praksis. Videre kan pigmentert fisk brukes når du produserer enten en moTBI eller sTBI fornærmelse, da de påfølgende patologiene tillater riktig karakterisering av skade.
En viktig grunn til å studere effekten av stump kraft TBI i sebrafisk er å undersøke kilden til skadeindusert celleproliferasjon og mekanismene som ligger til grunn for nevronal regenerering. Utviklingsmessige og basale nivåer av konstituerende spredning har blitt identifisert i nevrogene nisjer på tvers av sebrafisk neuroaxis26,27, og skadeindusert regenerering har blitt observert lokalisert eller ved siden av skadestedet i voksen sebrafisk8,12,15. Imidlertid viser vår blunt-force TBI-modell at den diffuse skaden også resulterer i en alvorlighetsgradsavhengig celleproliferasjonshendelse innenfor nevrogene nisjer over nevroaksen. Identifisering av kilden og omfanget av celleproliferasjon etter TBI vil tillate anvendelsen av encellede RNA-Seq å identifisere endringene i genuttrykk i den proliferative nisjen og teste rollen til forskjellige signalveier, gjennom anvendelse av spesifikke agonister og antagonister, for å regulere denne regenereringsresponsen. Denne tilnærmingen har vist seg nyttig for å belyse mekanismene som ligger til grunn for nevronal regenerering i den skadede sebrafisk netthinnen28 og bør være like nyttig i hjernen etter TBI.
Til slutt gir modellen vår en rask, enkel og kostnadseffektiv skademetode for å levere en skalerbar TBI med stump kraft. Denne modellen vil være nyttig for å undersøke effekten av alvorlighetsgradsavhengig eller gjentatt stump kraft TBI, samt belyse terapeutiske mål for genetisk regulering som forbedrer nevronbeskyttelse eller induserer nevronal regenerering for funksjonell kognitiv utvinning hos voksne vertebrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Hyde lab-medlemmene for deres gjennomtenkte diskusjoner, Freimann Life Sciences Center-teknikere for sebrafiskpleie og husdyrhold, og University of Notre Dame Optical Microscopy Core / NDIIF for bruk av instrumenter og deres tjenester. Dette arbeidet ble støttet av Center for Zebrafish Research ved University of Notre Dame, Center for Stem Cells and Regenerative Medicine ved University of Notre Dame, og tilskudd fra National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) og Pat Tillman Scholarship (JTH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).
- Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
- Santiago, L. A., Oh, B. C., Dash, P. K., Holcomb, J. B., Wade, C. E. A clinical comparison of penetrating and blunt traumatic brain injuries. Brain injury. 26 (2), 107-125 (2012).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (6), 379-387 (2016).
- Faul, M., Xu, L., Wald, M., Coronado, V. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths. , (2010).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Alyenbawwi, H., et al. Seizures are a druggable mechanistic link between TBI and subsequent tauopathy. eLife. 10, 58744 (2021).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelia-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- McCutcheon, V., et al. A novel model of traumatic brain injury in adult zebrafish demonstrates response to injury and treatment comparable with mammalian models. Journal of Neurotrauma. 34 (7), 1382-1393 (2017).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Mussulini, B. H., et al. Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization. PloS One. 8 (1), 54515 (2013).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injuries. Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
- Amamoto, R., et al. Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury. eLife. 5, 13998 (2016).
- Yamamoto, S., Levin, H., Prough, D. Mild, moderate and severe: terminology implications for clinical and experimental traumatic brain injury. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 672-680 (2008).
- Lund, S., et al. Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77 (2016).
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).
- Ruff, R. M., et al. Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper. Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).
- Ganz, J., Brand, M. Adult neurogenesis in fish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (7), 019018 (2016).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).
