Hjerne pericyt calcium og hæmodynamisk billeddannelse i transgene mus In Vivo

Summary

Denne protokol præsenterer trin til at erhverve og analysere fluorescerende calciumbilleder fra hjernen, der opvarmer pericytter og blodgennemstrømningsdata fra nærliggende blodkar i bedøvede mus. Disse teknikker er nyttige til undersøgelser af vægmalericellefysiologi og kan tilpasses til at undersøge calciumtransienter i enhver celletype.

Abstract

Nylige fremskridt inden for proteinbiologi og musegenetik har gjort det muligt at måle intracellulære calciumudsving i hjerneceller in vivo og at korrelere dette med lokal hæmodynamik. Denne protokol bruger transgene mus, der er blevet udarbejdet med et kronisk kranievindue og udtrykker den genetisk kodede calciumindikator, RCaMP1.07, under den α-glatte muskel actin promotor til specifikt at mærke vægmalericeller, såsom vaskulære glatte muskelceller og ophedning pericytter. Trin er skitseret om, hvordan man forbereder en hale venekateter til intravenøs injektion af fluorescerende farvestoffer til at spore blodgennemstrømningen, samt hvordan man måler hjernen pericyt calcium og lokale blodkar hæmodynamik (diameter, rød blodlegemer hastighed, osv.) af to foton mikroskopi in vivo gennem kranievinduet i ketamin / xylazin anæstesiiserede mus. Endelig gives der oplysninger til analyse af calciumudsving og blodgennemstrømningsfilm via billedbehandlingsalgoritmerne udviklet af Barrett et al. 2018 med vægt på, hvordan disse processer kan tilpasses andre cellulære billeddata.

Introduction

Centralnervesystemet vaskulatur består af gennemtrængende arterioler, kapillærer, og stigende venules. Inden for dette netværk, vægmaleri celler såsom vaskulære glatte muskelceller omslutter arterioles og pericytter udvide cellulære processer langs de første arteriole grene og kapillærer¹. Pericytter synes at have flere roller i hjernen, herunder vedligeholdelse af blod -hjerne-barrieren^1,2, migration og motilitet³, potentielle stamcelleegenskaber, og regulering af hjernens blodgennemstrømning^4,5,6. Mange af pericytes funktionelle roller er blevet knyttet til udsving i intracellulært calcium , der kan regulere udvidelse eller sammentrækning af disse celler^4,5,6.

Flere nylige undersøgelser har fastsat kriterier for at identificere forskellige typer hjerne pericytter^7,8. Vægmalericeller inden for de første 4 grene af gennemtrængende arterioler opvarmer pericytter baseret på deres udtryk for det kontraktile protein α-smooth muskel actin (αSMA) og deres fremspringende, ægformede somata med processer, der ombrydes omkring kar^7,8,9. For at visualisere calciumudsving i ensheathing pericytter bruger denne protokol en ny transgen muselinje, Acta2-RCaMP1.07, også kendt som Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J¹⁰. Disse mus udtrykker den røde genetisk kodede calciumindikator, RCaMP1.07, i αSMA udtrykke celler (vaskulære glatte muskelceller og ensheathing pericytter). Avlskolonier opretholdes ved at krydse noncarrier dyr med hemizygotes. RCaMP1.07 er et rødt fluorescerende protein med et calmodulin bindende domæne, som øger fluorescensen ved binding til det intracellulære calcium^10,11. Denne protokol skitserer trinene for kombineret calciumbilleddannelse af ensheathing pericytter og blodgennemstrømningsmålinger ved to fotonmikroskopi, herunder procedurer for haleveninindsprøjtning af fluorescerende farvestoffer, mikroskopbilledopsamling i bedøvede mus og dataanalyse med programmeringsplatforme (Figur 1). Disse teknikker er nyttige til at behandle spørgsmål om vægmalericellefysiologi, men kan tilpasses til at studere calciumtransienter i enhver celletype i hjernen eller et andet organsystem.

En 10 måneder gammel kvindelig Acta2-RCaMP1.07 mus blev brugt til eksperimentet præsenteret i denne artikel. Musen gennemgik kirurgi for kronisk kranievindue og hoved post implantation to måneder før. Detaljer for den kirurgiske protokol diskuteres i tidligere undersøgelser^12,13 og lignende procedurer er blevet udført i andre tidligere offentliggjorte protokoller^14,15. Vaskulaturen er mærket med grøn fluorescein-Dextran (70.000 MW, anionisk opløsning, 2,5% w /v) injiceret intravenøst. Dette farvestof er omkostningseffektivt og let tilgængeligt fra kommercielle kilder, men det har et bredere emissionsspektrum, der kan overlappe med RCaMP-emission og bløde igennem under erhvervelse af mikroskopbilled. Trin til spektral blanding er skitseret i afsnit 4 nedenfor for at omgå dette, men andre grønne farvestoffer med smallere emissionsspektre, såsom dem, der er baseret på EGFP, kan også anvendes.

Protocol

Alle procedurer, der involverer forsøgsdyr, der er skitseret nedenfor, er blevet godkendt af Animal Care Committee ved University of Manitoba, som styres af det canadiske råd for dyrepleje.

1. Procedureopsætning og -forberedelse

BEMÆRK: Følgende elementer er nødvendige for en hale venekateter injektion: insulin sprøjter, en 15 cm stykke PE10 slanger, 30 G nåle, gaze, saltvand, tang, grøn fluorescein dextran farvestof, tænger, og saks. Også, har en nål klar med ketamin /xylazine anæstesi, der vil blive injiceret før billeddannelse session.

KRITISK: Alle materialer og udstyr i trin 1 og 2 skal steriliseres, inden de anvendes ved autoklavering eller skylning med 70% ethanol. Hvis tangen ikke kan steriliseres korrekt, anbefales det at bruge et par store nåleholdere. Kateter samling skal ske med tænger og tang for at undgå utilsigtet nål punkteringer.

1. Skåret ca. 15-20 cm polyethylenslange, PE10 (I.D. 28 mm; O.D. 61 mm).
2. Fyld en insulinsprøjte på 27 G med 0,9 % saltvand, og knipse kanylen på sprøjten i spidsen af polyethylenrøret. Skub saltvand gennem røret, og sørg for, at der ikke er lækager.
3. Bøj en 30 G nål (0,3 mm x 25 mm) frem og tilbage, indtil den bryder ud af navet. Nålen skal være ren uden bøjninger.
4. Hold nålen med sammentrækninger, sæt forsigtigt nålen ind i enden af PE10-slangen, der er fastgjort til den saltfyldte sprøjte, og fjern luftbobler. Dette er kateteret til injektion.
5. Filter 30 μL på 2,5% (w/v) fluorescein dextran gennem et 13-25 μm filter før injektionen.
6. Fyld en anden insulinsprøjte med dextranens 30 μL-aliquot, og sørg for, at der ikke er bobler i den fyldte sprøjte.

2. Hale vene injektion

1. Bedøve musen med isoflurane (4% induktion, 1,5% vedligeholdelse) eller ketamin/xylazine (60 mg/kg; 10 mg/kg, dvs.) og anvende øjensmøremiddelgel. Ketamin/xylazin anbefales til mere stabile målinger af blodgennemstrømningen under billeddannelse, og dosis kan øges til 90 mg/kg. 10 mg/kg ketamin/xylazin til længere billeddannelsessessioner.
2. Når musen er på det kirurgiske anæstesiplan, skal du placere en handske fyldt med varmt vand på halen for at udvide den laterale vene.
3. Tag handsken ud efter 30'erne, og rengør halen med ethanol.
4. Placer halen mellem tommelfingeren og langfingeren. Giv tryk med pegefingeren på halen for at udvide venen. Med den anden hånd skal du afhente kateterets nål med sammentrækninger, der orienterer rammen opad mod loftet.
5. Efter rengøring af halen med 70% ethanol skal du sætte nålen i venen i en 0° vinkel og forsigtigt injicere saltvand gennem kateteret for at sikre, at nålen er placeret korrekt.
   BEMÆRK: Hvis der ikke er modstand på stemplet og ingen hævelse af halen, er nålen i venen. Hvis der er betydelig modstand eller hævelse, skal nålen fjernes. Trin 2.2-2.5 kan gentages op til 3 gange på hver side af halen, og udskifte 30G nålen i slutningen af kateteret hvert andet forsøg, indtil placeringen er korrekt.
6. Når nålen er i venen, skal saltvandssprøjten for enden af kateteret skiftes ud med sprøjten, der indeholder fluorescein dextran (trin 1.6). Langsomt injicere dextran i kateteret slanger, at sikre ingen bobler ind i røret. Hvis der er en luftboble, skal slangen, der indeholder boblen, skæres over, for at fjerne den og sætte sprøjten på igen.
7. Når alle dextran (30 μL aliquot) er blevet injiceret, skal du fjerne sprøjten og erstatte den med saltvandssprøjten. Indsprøjt den resterende dextran fra slangen i musen, indtil der ikke er noget farvestof tilbage i røret.
8. Fjern nålen fra halen og giv tryk med gaze i 10-30 s, indtil blødningen stopper.
   KRITISK: Hvis haleåreindsprøjtningen efter 6 forsøg ikke lykkes, skal dyret afbildes i en anden session. Desuden bør den samlede volumen (saltvand og dextran) injiceres i musen bør ikke overstige 100 μL.

3. To fotonmikroskopi

1. Fokus på kranievinduet
   BEMÆRK: Brug ketamin/xylazin anæstesi under dataindsamling, fordi det har mindre vaskulære virkninger (vasodilation) end isofluran. Hvis du bruger isoflurane i ovenstående trin, skal du injicere musen med ketamin/xylazin i.p. (anbefalet dosis beskrevet ovenfor) før billeddannelse.
   1. Fix musen med en skrue gennem hovedet post til en platform med en varmepude under mikroskopet.
   2. Påfør øjensmøremiddel på musens øjne.
   3. Rengør kranievinduet med fugtige tandlægeapplikatorer. Sørg for, at der ikke er partikler tilbage, der kan forstyrre billeddannelsesprocessen.
   4. Påfør ultralyd gel på vinduet.
   5. Fokus gennem to-foton mikroskop mål, indtil pial blodkarrene kan ses under vinduet.
   6. Kontroller musens vejrtrækning, og sørg for, at varmepuden giver tilstrækkelig temperaturunderstøttelse.
2. Billedopsamling
   BEMÆRK: Det to-foton mikroskop, der anvendes i dette eksperiment har en tunable Ti-Sapphire laser til fluorescens excitation med en Pockel celle, der styrer mængden af laser, der når prøven. Udsendt lys er opdelt af en 565 lang pass dichroic til to GaAsP photomultiplier rør (PMTs) med 595/50 band pass filter (rød) og 525/70 band pass filter (grøn) til detektion.
   De procedurer, der er beskrevet i trin 3.2 til 3.4, udføres ved hjælp af specifik software fra tofotonmikroskopet fra denne protokol (se Materialetabel). Disse trin kan tilpasses til anden mikroskop software og udstyr.
   1. Når rumlysene er slukket, skal du indstille den ønskede bølgelængde i mikroskopsoftwaren til 990 nm for at begejstre både RCaMP og fluorescein-dextran ved at klikke på 2-P Laser-boksen.
   2. Indstil lasereffekten ved at klikke på afsnittet Power/Gain/Lasere og justere Pockels 1-cellespændingen ved 30 % eller en værdi på 300 på en skala fra 1000. Den laserkraft, der når prøven ved denne indstilling, blev tidligere bestemt til at være ~ 30 mW.
   3. Indstil følsomheden over for PMT-detektoren ved at klikke på afsnittet Strøm/Gain/YDELSE'er og justere værdien til 700-800.
      BEMÆRK: Disse værdier kan justeres i forhold til intensiteten af lysstofrørsprøven og skal indstilles til nul, før lyset tændes i rummet.
   4. Gå til afsnittet Billedopløsning, og klik på opløsningen 512 x 512 for at få en større billedstørrelse.
   5. Klik på 2-P Laser/Åben for at åbne 2-P Laser lukkeren.
   6. Gå til scanningssektionen, og klik på knappen Live scan.
      BEMÆRK: Live scanning med disse parametre og højere opløsning, RCaMP positive vægmalericeller og fluorescerende mærket blodplasma kan ses. Hvis signalet er svagt, kan pockelværdien øges, indtil billedet er klart.
      KRITISK: I de overfladiske vævslag bør lasereffekten ikke overstige 50 mW, hvilket er omkring 600 i Pockels cellers indstillinger i dette eksempel.
3. Erhvervelse af en dybdestak af vægmalericellerne og det vaskulære netværk
   BEMÆRK: Det anbefales at erhverve en dybdestak for at finde pericytter korrekt i det vaskulære netværk. Ensheathing pericytter er placeret på den første til fjerde grene fra den gennemtrængende arteriole^7,8,9. Mikroskop software, der anvendes i denne protokol refererer til dybde stakke som "Z-serien".
   1. Flytning af mikroskop mål i X, Y og Z plan, lokalisere en stor arterie på overfladen af hjernen baseret på den glatte muskel celle mærkning af RCaMP.
   2. Klik på Z-serien boks.
   3. Fokuser øverst på vævet nær pialkarrene, sæt dette som nulpunkt og toppen af Z-seriens stak ved at klikke på afsnittet Aktuel Z-serie/ Startposition [μm]. Klik på kassen med fire sorte striber og en rød stribe på toppen.
   4. Fokuser ned i vævet til den ønskede dybde og sæt dette som bunden af stakken ved at klikke på afsnittet Aktuel Z-serie/Stop position [μm]. Klik på kassen med fire sorte striber og en rød stribe i bunden.
   5. Angiv tykkelsen af hvert billedplan (trinstørrelse) til 1-2 μm ved at skrive den ønskede værdi i boksen under knappen "Trinstørrelse" ( KnappenTrinstørrelse er lokaliseret i afsnittet Z-serien/Aktuel Z-serie). Dette definerer antallet af billeder, der er anskaffet i stakken.
   6. Indstil lasereffekten til at stige eksponentielt, efterhånden som mikroskopet bevæger sig dybere gennem stakken ved at klikke på feltet Laser/PMT-kompensation og vælge Relativ (eksponentiel graduering).
   7. Navngiv filen, vælg en mappe til at gemme den, og klik på Start Z-serien.
   8. Efter anskaffelsen skal du åbne Z-serien i billedbehandlingssoftwaren.
   9. Flet de to kanaler som farvede billeder og scanne gennem stakken på udkig efter pericytter og blodkar af interesse ved at klikke i boksen Billede | Farve | Opdelte kanaler; Billede | Farve | Flet kanaler.
   10. Vælg interesseområder, der indeholder pericytter, og gem positionerne for at hjælpe med at finde disse steder igen i fremtidige billedsessioner.
4. T-serien calcium imaging film erhvervelse (tid)
   1. Brug dybdestakken og INVESTERINGSAFKAST ovenfra som reference, skal du flytte mikroskopmålsætningen i X-, Y- og Z-aksen under livescanningstilstand, indtil der findes en pericyte af interesse.
   2. Hvis du vil indsamle en film af pericyte calciumhændelser, skal du øge anskaffelsesrammen (>10 billeder pr. sekund) ved at gå til afsnittet Billedopløsning og klikke på 128x128-boksen.
   3. Indstil billedvarigheden til 60'erne ved at klikke på feltet T-serien og indtaste klokkeslættet i varighedsboksen.
   4. Ved siden af boksen Gem kurve skal du klikke på knappen med tre prikker for at opdatere lagringsstien med et entydigt filnavn.
   5. Zoom optisk på fartøjet for at tage højde for den lavere opløsning og for at få et nærmere overblik over pericytten ved at justere værdien i afsnittet Optisk zoom [mag].
   6. Hent T-serien ved at klikke på Start T-serien.
5. Hæmodynamikmålinger med kymografer (linjescanninger)
   1. Fokuser på det pågældende fartøj ved 512 x 512pixel opløsning i Live Scan-tilstand.
   2. For at måle blodkardiameter og rød blodlegemer hastighed, skal du klikke på Line Scan for at starte en endimensionel scanning med mikroskop.
   3. Angiv scanningens varighed (30-60 s) i millisekunder.
   4. Tegn en linje, der gennemskærer det pågældende fartøj og bevæger sig parallelt langs fartøjet. Dette vil generere en kymograf af fartøjets diameter til venstre og striber af de røde blodlegemer bevæger sig gennem fartøjet til højre.
      BEMÆRK: Flere blodkar kan måles med samme linje, så længe de er i samme billedplan.
   5. Navngiv filen, og klik på startlinjescanningerne for at hente dataene.

4. Billedanalyse

1. Calcium film analyse.
   BEMÆRK: Denne protokol beskriver trinnene til spektral blanding (Figur 2) og to forskellige metoder til at analysere opvarmning af pericyt calciumhændelser ved hjælp af manuelle, håndvalgte INVESTERINGSAFKAST (Figur 3) og automatiseret, aktivitetsbaseret valg af investeringsafkast (Figur 4)^16,17. For at opdage og klassificere signaltoppene med det normaliserede calciumspor fra hvert investeringsafkast er dataene lang-pass og band-pass filtreret, hvilket hjælper med at udjævne dataene for amplitud og breddeestimater og også til at identificere toppe af forskellige former: enkelte toppe, multitoppe og plateauer (Figur 3B). Parametrene for denne analyse kan optimeres til at registrere forskellige typer dynamiske mobilsignaler. Nedenstående trin kræver brug af billedbehandlingssoftware og programmeringssoftware med billedbehandlingspakker, der indeholder forskellige koder til at analysere calciumfilm som nævnt ovenfor. Se materialetabellen for at få en komplet liste over programmer og pakker, der bruges i denne protokol. Billeddata fra forskellige typer mikroskoper kan importeres med disse pakker, der vedligeholder metadataene fra billederne.
   BEMÆRK: Trin 4.1.1-4.1.7 beskriver, hvordan du vælger investeringsafkast i hånden i billedbehandlingssoftware til efterfølgende brug i den manuelle calciumanalysemetode (trin 4.1.16)
   1. Indlæs T-serien til calciumbilleddannelse i billedbehandlingssoftwaren ved at trække .xml-filen til softwareværktøjslinjen. Klik på OK-boksen.
   2. Tag gennemsnittet af stakken (gennemsnittet af stakken er mærket som "Z projektion" af billedbehandling software). Dette kan gøres ved at klikke på Billede | Stakke | Z-projektion i værktøjslinjen.
   3. Lav et farvet billede fra begge kanaler som i trin 3.3.9.
   4. Åbn vinduet Roi Manager ved at klikke i boksen Analyser | Værktøjer | ROI Manager, eller blot trykke på bogstavet "T" på tastaturet.
   5. Vælg polygonværktøjet ved at klikke på polygonformen på værktøjslinjen Billedbehandlingssoftware, og omrids de synlige ensheathing pericytestrukturer, f.eks.
   6. Klik på knappen Tilføj i vinduet Roi Manager for at tilføje udvalgte investeringsafkast i ROI Manager.
   7. Giv hvert interesseområde et entydigt navn ved at klikke på knappen Omdøb, og gem dem som en zip-mappe, der kan indlæses senere i programmeringssoftwaren ved at klikke på Mere>> | Gem.
      BEMÆRK: Trin 4.1.8-4.1.14 beskriver, hvordan calcium T-serien importeres til programmeringsplatformen, og hvordan de forskellige fluorophorer, der registreres af mikroskopets PMT'er, til forskellige kanaler (Figur 2).
   8. Åbn programmeringssoftwaren, og kontroller, at mapperne til billedbehandlingspakkerne er på stien (se Materialetabel).
   9. Importer calcium-T-serien til programmeringssoftwaren ved at kalde funktionen BioFormats i kommandovinduet for programmeringsplatformen, som automatisk åbner vinduet filvalg.
   10. Definer, hvad der er på hver kanal, ved at angive det ønskede tal. I dette eksempeldata svarer Kanal 1=6 (cellular_signal), Kanal 2 svar=1 (blood_plasma).
   11. Plot dataene som en film i programmeringssoftwaren for at lette visualiseringen ved at kalde plotfunktionen.
   12. Hvis du vil fjerne grøn fluorescens fra fluorescein-dextran, der bløder igennem i den røde RCaMP-kanal, skal du fjerne kanalerne i billedbehandlingspakken ved at kalde unmix_chs funktion i programmeringsplatformens kommandovindue.
   13. Vælg et område, der kun indeholder fluorescens fra denne fluorophore i Kanal 1, f.eks.
   14. Vælg et område, der kun indeholder fluorescens fra fluorophor 2, f.eks. fluorescein i blodplasmaet i dette eksempel.
   15. Vælg et baggrundsområde, der ikke har fluorescens fra nogen af fluorophoren. Dette genererer en spektral bidragsmatrix, der anvendes på hver pixel i hver kanal. Det forbedrer lokaliseringen af RCaMP-signalet betydeligt, hvilket vil forbedre påvisning af calciumhændelser i disse strukturer.
       BEMÆRK: Som nævnt ovenfor er der flere måder, hvorpå calciumbilleddataene kan analyseres i billedbehandlingspakkerne. Trin 4.1.16-4.1.23 beskriver metoden til analyse af ophedning af pericyte calciumhændelser ved hjælp af manuelle, håndvalgte INVESTERINGSAFKAST.
   16. Kør mobilsignalanalysen på den mixede calciumfilm ved at kalde CellScan-funktionen i programmeringsplatformens kommandovindue.
   17. Koden vil spørge "Hvilken ROI-registreringsmetode vil du bruge?". Skriv tallet 2 for at indlæse de håndvalgte investeringsafkast på programmeringsplatformen.
   18. Indlæs de områder af interesse fra zip-mappen, der blev valgt fra pericytterne i hånden tidligere (trin 4.1.6).
   19. Koden vil spørge "Hvad er skalafaktoren?". Bestem skalafaktoren for de håndvalgte investeringsafkast i forhold til den billedserie, der analyseres, og skriv nummeret på skalaen. I dette eksempel er skalafaktoren 1, fordi investeringsafkast ikke behøver at blive ændret, da de blev valgt på billeder med 128x128 pixels, samme opløsning som den oprindelige calciumfilm.
   20. Generer plots af hvert investeringsafkast og de normaliserede calciumspor i forskellige farver (Figur 3A) ved at kalde proces- og plotfunktionerne i kommandovinduet.
   21. Hvis koden ikke registrerer størstedelen af calciumhændelserne i de enkelte spor, skal du ændre de indbyggede parametre i konfigurationsoptimeringsboksen ved at kalde opt_config-funktionen og justere værdierne, f.eks.
   22. Vælg knappen Proces i optimeringsboksen for at anvende de nye parametre.
       BEMÆRK: For at registrere og klassificere signalerne er det normaliserede calciumspor langt gennemløb og båndpas filtreret, hvilket hjælper med at udjævne dataene for amplitud- og breddeestimater, men også for at afgøre, om signaler er enkelte toppe, multitoppe eller plateauer (Figur 3B).
   23. Udsout dataene som en .csv fil, der indeholder geografiske oplysninger om de områder af interesse og de spidsbelastninger, der blev identificeret ved at kalde output_data-funktionen i kommandovinduet. Giv filen et entydigt navn til yderligere analyse i et statistikprogram.
       BEMÆRK: Trin 4.1.24-4.1.31 beskriver metoden til analyse af ophedning af pericyt calciumhændelser ved hjælp af analyse af aktivitetsbaserede INVESTERINGSAFKAST.
   24. Gentag trin 4.1.8.-4.1.16 for at importere calciumfilmen, fjerne kanalerne og kalde CellScan-funktionen i programmeringsplatformen.
   25. Koden vil spørge "Hvilken ROI-registreringsmetode vil du bruge?". Skriv tallet 6 for at vælge det automatiserede område med interesseidentifikation baseret på aktiviteten og ændringen i fluorescens i 3 dimensioner (x, y og tid; "3D FLIKA algoritme").
   26. Plot de behandlede resultater for at få vist de identificerede områder af interesse som forskellige farver ved at kalde proces- og plotfunktionerne i kommandovinduet. Hvert investeringsafkast skelnes i tid og rum og repræsenteres som en overlejret maske (Figur 4).
   27. Hvis algoritmen ikke registrerer INVESTERINGSAFKAST, der er tydeligt synlige for øjet, skal du ændre de indbyggede parametre i optimeringsboksen ved at kalde opt_config-funktionen og justere værdierne, f.eks.
   28. Vælg procesknappen i optimeringsboksen for at anvende de nye parametre. Med optimeringsprocessen bør der identificeres flere investeringsafkast (Figur 4B).
   29. Plot rois som en film til klart at identificere de aktivitetsområder (skitseret i regnbue farver) ved at ændre tilstanden af standard boksen til film i optimering vinduet for yderligere visualisering.
   30. Output dataene som en csv-fil ved at kalde funktionen output_data i kommandovinduet. Denne fil kan analyseres yderligere i et statistikprogram.
       BEMÆRK: Analyseparametrene kan justeres, så de passer til enhver form for dynamisk mobilsignal (calcium, FRET-forhold osv.). Alle ovenstående trin kan automatiseres med simpel programmeringskode for at batche mange calciumfilm med de samme indstillinger.
2. Linjescanning af blodgennemstrømningen.
   1. Importer den datafil til linjescanning, der er anskaffet i afsnit 3.5, til programmeringssoftwaren.
   2. Koden vil spørge "Hvad vises på kanal 1 og 2?". Definer, hvad der er på hver kanal, når du bliver bedt om det. I dette eksempel er Kanal 1 tom (type 0), og Kanal 2 er blood_plasma (type 1).
   3. Kør diameteranalysefunktionen på linjescanningen ved at kalde funktionen LineScanDiam, som åbner en boks for at vælge det område, der svarer til diameteren i kymografen (Figur 5B, til venstre).
   4. Tegn en kasse uden for kymograph fluorescensgrænserne, der svarer til fartøjets diameter.
   5. Behandl denne dataklasse ved at kalde procesfunktionen for at måle den fulde bredde ved halv maxima for kardiameter og generere et plot (Figur 5C) med plotfunktionen.
   6. Output dataene som en csv-fil ved at kalde funktionen output_data i kommandovinduet. Denne fil kan analyseres yderligere i et statistikprogram.
   7. Kør hastighed radon transformation analyse ved at kalde LineScanVel funktion, som åbner en boks for at vælge det område, der svarer til RBC hastighed i kymograf (Figur 5B, højre).
   8. Tegn en kasse inde i grænsen af kymograf fluorescens, der svarer til fartøjets hastighed.
   9. Behandl denne dataklasse ved at kalde procesfunktionen for at beregne hastigheden, flux og lineær tæthed af røde blodlegemer fra vinklen på striberne i fluorescensen. Generér et plot (Figur 5D) med plotfunktionen.
   10. Output dataene som en csv-fil ved at kalde funktionen output_data i kommandovinduet. Denne fil kan analyseres yderligere i et statistikprogram.
       BEMÆRK: Kymograferne skal have klar fluorescens med veldefinerede kanter mellem de sorte mellemrum, for at diameter- og hastighedsanalysen kan være nøjagtig (Figur 5A, B). Det er meget vigtigt at tegne de ortogonale og parallelle linjer på en præcis måde, ellers vil pålidelig analyse af kymograferne ikke være mulig. I lighed med calciumanalysen med billedbehandlingsalgoritmerne kan parametrene for diameter- og hastighedsberegninger optimeres.

Representative Results

Fluorescein-dextran har et bredt emissionsspektrum, der kan bløde igennem i den røde kanal, påvirker RCaMP-detektion i ensheathing pericytter (Figur 2A). Spektral ublandet efter dataindsamling i softwareprogrammet reducerer fluorescein blødning gennem (Figur 2B, lavere), forbedre calcium signal afsløring i efterfølgende analyse trin.

Calciumanalyse med de billedbehandlingsalgoritmer, der anvendes i denne protokol, giver mulighed for flere forskellige tilgange til identifikation af ROI'er og intracellulære calciumudsving (dvs. calciumsignaler). Valg af cellestrukturer manuelt tillader påvisning af calciumudsving i disse områder (Figur 3A), herunder forskellige typer signaltoppe, f.eks. Derudover identificeres INVESTERINGSAFKAST ved at gruppere aktive pixels sammen, hvor fluorescensintensiteten ændrer sig over tid ved hjælp af billedbehandlingsalgoritmer udviklet af Ellefsen et al. 2014¹⁶ og Barrett et al. 2018¹⁷ (Figur 4). Dette kan anvendes på ethvert dynamisk mobilsignal ved at justere tid, tærskel og rumlige parametre, så de omfatter signalets forventede størrelse og form. Hvis tærsklen for signalidentifikation sænkes, finder flere interesseområder (figur 4B).

Lyse og klare hæmodynamiske kymografer kan analyseres for at måle diameter og RBC hastighed i blodkar nær ensheathing pericytter (Figur 5A, B). Diameteren beregnes ud fra fuld bredde ved halv maksimum af fluorescens (Figur 5C). RBC-hastigheden tilnærmes fra striberne lavet af umærkede RBC'er, hvor vinklen indtastes i en Radon-transformation for at beregne hastigheden, flux (celler/celler) og den lineære tæthed (celler/mm; Figur 5D). Kymografer af dårlig kvalitet, hvor der er fluorescensmætning, dårligt signal til støjforhold eller bevægelse af billedbehandlingsfeltet (Figur 6A),skaber upålidelige plots med fejlpunkter (røde kryds), hvor data ikke kan bestemmes (Figur 6B, C). Kvaliteten af de erhvervede data er afgørende for et godt resultat og efter de trin, der er beskrevet i denne protokol, sikrer gode resultater.

Figur 1. Oversigt over protokollen. Protokollen præsenterer trinene til at erhverve og analysere fluorescerende calciumbilleder fra hjernen, der opvarmer pericytter og blodgennemstrømningsdata fra nærliggende blodkar i bedøvede mus. Protokollen er opdelt i 4 trin. 1) Procedureforberedelse: opsætning af udstyr og kateterforberedelse; 2) Hale vene injektion; 3) Dataindsamling ved to-foton mikroskopi; 4) Dataanalyse med billedbehandlingsalgoritmer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Spektral blanding af fluorophorer. A) Repræsentativt gennemsnitligt billede af RCaMP, der opvarmer pericyt og fluorescein-dextran-mærket blodkar fra en erhvervelse af T-serien. Skalalinje= 10 μm.B) Øvre: Når man overvejer individuelle kanaler, er gennemblødning fra Kanal 2 tydelig i Kanal 1 (venstre). Lavere: Efter spektral ublandet er blødningen reduceret, og signalet fra RCaMP er mere fremtrædende i pericytestrukturen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Håndvalgte ROI'er og optimerede kalkspor. A) Interesseområder, der er valgt i den anvendte billedbehandlingssoftware (regnbueformer), kan bruges til at identificere calciumsignalspor. B) Signaltoppe fra normaliserede spor identificeres ved lavpas og båndpas, der filtrerer dataene. Vi definerede signaltærsklen som 3 gange standardafvigelsen for basisperioden (de første 30 rammer), og eventuelle toppe over denne tærskel blev betragtet som et signal (lavere spor). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Automatiserede, aktivitetsbaserede INVESTERINGSAFKAST til calciumanalyse. De samme data blev analyseret med en tærskel på 7 gange standardafvigelsen for grundlinjen (A) og 3 gange standardafvigelsen for grundlinjen (B). Hvis du sænker grænsen for identifikation af aktive pixel, finder du flere investeringsafkast (B) og signaltoppe (cirkeldiagram) i pericytterne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Kymograph hæmodynamiske målinger. A) Eksempel linjescanning gennem fartøjet. B) Eksempel på veldefinerede kymografer for diameter (venstre) og hastighed (højre). De sorte striber inden for højre bånd af fluorescens svarer til RBCs.C) Diameter analyse med klare vasomotion udsving. D) Hastighedsanalyse med plots for Y axis= RBC flux(celler/celler), linjetæthed (celler/mm), hastighed (mm/s) og stribevinkel (grad), signal-til-støj-forhold (vilkårlige enheder, alias), X axis=time (sek.). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. Repræsentation af hæmodynamiske målinger af dårlig kvalitet. A) Eksempler på kymografer af dårlig kvalitet med fluorescensmætning, dårligt signal til støjforhold eller bevægelse af billeddannelsesfeltet under erhvervelsen. B og C) Plots svarende til figur 7 af diameter og hastighed data, der har fejlpunkter (røde prikker) på grund af den dårlige kvalitet af kymografer. (billede E, Y axis=Diameter (μm), X axis=time (sek),image F, Y axis= RBC flux(celler/celler), linjetæthed (celler/mm), hastighed (mm/s) og streakvinkel (grad), signal til støjforhold (alias), X axis=time (sek).). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den nuværende metode giver detaljer om mus hale vene injektion med et kateter, to-foton mikroskop billede erhvervelse for dybde stakke, celle calcium signalering film, oprettelse af hæmodynamiske kymografer, og calcium og hæmodynamisk analyse med vores billedbehandling algoritmer¹⁷ (Figur 1). Der er flere fordele ved disse teknikker, der forbedrer in vivo imaging resultatet og reducere tid, ressourcer og dyr stress i løbet af sessionen. For det første giver brugen af et kateter til haleåreindsprøjtning mere kontrol over nålen, sprøjten og mængden af stof, der injiceres i musens cirkulation. Derudover forhindrer det farvestofindsprøjtning i halevævet, hvilket sparer dyre reagenser. For det andet bruger vi transgene mus, der udtrykker genetisk kodede calciumsensorer i ophedning af pericytter og demonstrerer, hvordan man lokaliserer dem i hjernens vaskulære netværk med en dybde z-stak, hvilket letter celleidentifikation og flytning i efterfølgende billeddannelsessessioner på lang sigt. Dette er en vigtig faktor i pericyte undersøgelser og sikrer korrekt celle klassificering^6,7. For det tredje leverer vi vores parametre til indsamling af calciumfilm og hæmodynamiske linjescanningsdata, som er et godt udgangspunkt for måling af dynamiske cellulære signaler. Endelig præsenterer vi vores billedbehandlingsalgoritmer¹⁷, en omfattende billedbehandlingsværktøjskasse, der indeholder flere tilgange til billedforbehandling (såsom spektral unmixing), calciumbilledanalyse og hæmodynamisk analyse (diameter, hastighed osv.). Disse algoritmer kan generere plots til en hurtig og nem visualisering af dataene, samtidig med at det niveau af brugerekspertise, der kræves for at analysere resultaterne, minimeres. Desuden kan det automatiseres med et par linjer kode til hurtigt batch behandle flere datasæt med de samme parametre. Dette kan potentielt forbedre datavisualisering og forskeren.

Nøglen til at indsamle gode calcium imaging data er at justere laser magt og PMT indstillinger for klar fluorescens signal erhvervelse, men også at indsamle data med en tilstrækkelig billedhastighed til at fange hele calcium begivenhed. Dataene i denne protokol blev erhvervet med 10-11 billeder i sekundet, hvilket fanger de langsommere calciumsvingninger i ensheathing pericytter. Der er også flere trin under analysen, der kan forbedre analyseresultatet. For det første er spektral ub blanding gavnligt, hvis der er en betydelig overlapning mellem emissionsspektre af fluorophorer (Figur 2). Fluorescein-dextran blev brugt i denne protokol, fordi det er en omkostningseffektiv og kommercielt tilgængelig dextran konjugat, der er almindeligt anvendt til hæmodynamiske målinger⁵. Spektral ublandet hjælper med at rydde op i dataene til forbedret påvisning af calciumsignaler, men alternative fluorophorer med smallere emissionsspektre kan også bruges. For det andet er det nyttigt at vælge cellestrukturer som INVESTERINGSAFKAST (Figur 3) til klassificering af calciumhændelser i forskellige subcellulære områder, f.eks. Aktivitetsbaseret valg af investeringsafkast (figur 4)¹⁶ giver mere rumlig og tidsmæssig information om individuelle calciumhændelser. Dette kan være nyttigt, når du bestemmer hyppigheden af calciumhændelser i et givet område eller formering af begivenheder til andre cellulære områder. Brugen af programmeringssoftware til at analysere billeddata kan spare forskerne timer, når data batchbehandles, men det kræver en indledende tidsinvestering at justere parametrene for optimale resultater. De vigtigste faktorer er den forventede størrelse (i μm²) i det aktive område samt signalets varighed (minimum signaltid og maksimal signaltid skal defineres). Forskere skal undersøge nogle eksempel T-serie film først for bedst at afgøre, hvilke parametre der passer til deres data. Endelig kan data af dårlig kvalitet, der er indsamlet på mikroskopet, i høj grad hindre analysen af calcium og hæmodynamik (Figur 6). Derfor bør man passe på at optimere indstillingerne for anskaffelse af mikroskop i begyndelsen. Med disse faktorer i tankerne, denne protokol, der kan tilpasses til at passe calcium billeddannelse eller analyse af andre dynamiske cellulære signaler (f.eks fluorescerende natrium, kalium, metabolit, eller spænding udsving) i andre væv eller celletyper.

Der er flere begrænsninger i denne protokol. For det første indsamles dataene under anæstesi, hvilket påvirker hjernens aktivitet og kan påvirke blodgennemstrømningen. Lignende billeddannelse kan gøres i vågen mus, der er uddannet til at acceptere hovedfiksering for mere fysiologiske resultater. Derudover er det vigtigt at huske, at vi indsamler 2-dimensionelle billeder af en 3-dimensionel celle og blodkar in vivo. Derfor kan vi kun fange en fraktion af calciumhændelserne i disse celler eller blodgennemstrømningen i en enkelt del af blodkarret ad gangen.

En anden begrænsning at bemærke er, at to-foton calcium imaging er følsom over for bevægelse artefakter, hvor bevægelse ind og ud af brændpunktet flyet kan forveksles med calcium udsving. Denne protokol blev udført under anæstesi, hvilket begrænser dyrets bevægelse; bevægelsesartefakter kan dog introduceres ved musens vejrtrækningshastighed, puls, mulig vævs hævelse og i tilfælde af ophedning af pericytter, karsammentrækning eller vasomotion ^4,6,18,19. Bevægelse artefakter kan afbødes af flere strategier. De billedbehandlingspakker, der bruges i denne protokol, omfatter et valgfrit bevægelseskorrektionstrin, som bruger et 2D-bøjningsprogram til at justere billederne i T-serien baseret på den synlige vaskulatur^13,17. Rammer med væsentlige ændringer i fokusplanet identificeres af denne algoritme og kan udelukkes fra analyse. Derudover er det muligt at bruge statistiske strategier inden for billedbehandlingspakkerne, såsom en Z-score, når fluorescenssporene genereres, for at normalisere bevægelsen inducerede calciumudsving²⁰. Den mest robuste tilgang til at tage højde for bevægelse artefakter i to-foton imaging er at kombinere udtryk for to fluorescerende indikatorer inden for samme celle, såsom en calcium indikator (f.eks GCaMP) og en fluorescerende reporter (f.eks mCherry), der er calcium-uafhængig. Udsving i fluorescerende reporter kan derefter tilskrives bevægelse og trækkes fra calcium indikator signal til at normalisere bevægelse artefakter.

Formålet med denne protokol er at give en klar forståelse af, hvordan man indsamler optimale calcium imaging og blodgennemstrømning data in vivo og at præsentere nye metoder og analyseværktøjer, som forskerne kan gennemføre for at forbedre deres resultater. Disse teknikker kan anvendes til at studere den rolle, forskellige pericytes populationer i blodgennemstrømningen kontrol eller i forskellige hjernesygdom stater. Disse billeddannelse parametre kan også bruges til at studere calcium og blodgennemstrømning i andre celletyper og organsystemer og lignende principper gælder for andre dynamiske billeddannelse teknikker, der er muliggjort af andre genetisk kodede sensorer, ud over calcium.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acta2-RCaMP1.07	The Jackson Laboratory	28345	In the video protocol the animal model used is a female mouse  of  10 months, 1 day old.
Applicators (Regular)	Bisco	X-80250P
BioFormats package for MATLAB	NA	NA	Denominated in this protocol as "image processing packages".  Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/
CHIPS MATLAB toolbox	NA	NA	Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS
Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity	HealthCare Plus	UGC250
Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic	Thermo Fisher Scientific	D1823
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral	Thermo Fisher Scientific	D1830
Eye Lube Plus	Optixcare	NA
FIJI	Image J	NA	Denominated in this protocol as "image processor software".  Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GCaMP6sfl/fl	The Jackson Laboratory
Head Post fixing platform	University of Zurich	NA
Ketamine (Narketan 100 mg/mL)	Vetoquinol	440893
MATLAB R2020b		NA	Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/
Needle 0.3mmx25mm	BD PrecisionGlide	305128
Objective XLUMPLFLN20XW	Olympus	NA	https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/
PDGFRβ-CreERT2	The Jackson Laboratory	30201
Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”)	BD Intramedic	427401
Prairie View	Bruker Fluorescence Microscopy	NA	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Ultima In Vitro Multiphoton Microscope	Bruker Fluorescence Microscopy	NA	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Under Tank Heater	Reptitherm U.T.H	E169064
Xylazine (Rompun 20 mg/mL)	Bayer HealthCare	2169592