Summary
Dit protocol presenteert stappen om fluorescerende calciumbeelden van hersenverwarmende pericyten en bloedstroomgegevens van nabijgelegen bloedvaten in verdoofde muizen te verkrijgen en te analyseren. Deze technieken zijn nuttig voor studies van de fysiologie van muurschilderingscellen en kunnen worden aangepast om calciumtransiënten in elk celtype te onderzoeken.
Abstract
Recente ontwikkelingen in de eiwitbiologie en muisgenetica hebben het mogelijk gemaakt om intracellulaire calciumfluctuaties van hersencellen in vivo te meten en dit te correleren met lokale hemodynamiek. Dit protocol maakt gebruik van transgene muizen die zijn bereid met een chronisch schedelvenster en de genetisch gecodeerde calciumindicator, RCaMP1.07, tot expressie brengen onder de α-gladde spieractinepromotor om specifiek muurschilderingcellen te labelen, zoals vasculaire gladde spiercellen en ensheathing pericyten. Stappen worden beschreven voor het bereiden van een staartaderkatheter voor intraveneuze injectie van fluorescerende kleurstoffen om de bloedstroom te traceren, evenals hoe hersenpericytencalcium en lokale bloedvathemodynamiek (diameter, rode bloedcelsnelheid, enz.) te meten door twee fotonenmicroscopie in vivo door het schedelvenster in ketamine / xylazine-verdoofde muizen. Ten slotte worden details verstrekt voor de analyse van calciumfluctuaties en bloedstroomfilms via de beeldverwerkingsalgoritmen ontwikkeld door Barrett et al. 2018, met de nadruk op hoe deze processen kunnen worden aangepast aan andere cellulaire beeldvormingsgegevens.
Introduction
De vasculatuur van het centrale zenuwstelsel bestaat uit doordringende arteriolen, haarvaten en opgaande venules. Binnen dit netwerk, muurschildering cellen zoals vasculaire gladde spiercellen omhullen arteriolen en pericyten breiden cellulaire processen langs de eerste arteriole takken en haarvaten1. Pericyten lijken verschillende rollen in de hersenen te hebben, waaronder het onderhoud van de bloed-hersenbarrière1,2,migratie en beweeglijkheid3,potentiële stamceleigenschappen en de regulatie van de bloedstroom in de hersenen4,5,6. Veel van de functionele rollen van pericyten zijn in verband gebracht met fluctuaties in intracellulair calcium die de verwijding of contractie van deze cellen kunnen reguleren4,5,6.
Verschillende recente studies hebben criteria vastgesteld voor het identificeren van verschillende soorten hersenpericyten7,8. Muurschilderingcellen binnen de eerste 4 takken van penetrerende arteriolen zijn ensheathing pericyten op basis van hun expressie van het contractiele eiwit α-gladde spier actine (αSMA) en hun uitstekende, eivormige somata met processen die zich rond bloedvatenwikkelen 7,8,9. Om calciumfluctuaties in ensheathing pericyten te visualiseren, gebruikt dit protocol een nieuwe transgene muislijn, Acta2-RCaMP1.07, ook bekend als Tg (RP23-370F21-RCaMP1.07) B3-3Mik / J10. Deze muizen drukken de rode genetisch gecodeerde calciumindicator, RCaMP1.07, uit in αSMA-expressiecellen (vasculaire gladde spiercellen en ensheathing pericyten). Fokkolonies worden in stand gehouden door niet-carrierdieren te kruisen met hemizygoten. RCaMP1.07 is een rood fluorescerend eiwit met een calmoduline bindend domein, dat de fluorescentie verhoogt bij binding aan het intracellulaire calcium10,11. Dit protocol schetst de stappen voor gecombineerde calciumbeeldvorming van ensheathing pericyten en bloedstroommetingen door twee fotonmicroscopie inclusief procedures voor staartaderinjectie van fluorescerende kleurstoffen, microscoopbeeldacquisitie bij verdoofde muizen en data-analyse met programmeerplatforms (figuur 1). Deze technieken zijn nuttig voor het beantwoorden van vragen over de fysiologie van muurschilderingcellen, maar kunnen worden aangepast om calciumtransiënten in elk celtype in de hersenen of een ander orgaansysteem te bestuderen.
Een 10 maanden oude vrouwelijke Acta2-RCaMP1.07 muis werd gebruikt voor het experiment gepresenteerd in dit artikel. De muis onderging twee maanden eerder een operatie voor chronische schedelvenster- en hoofdimplantatie na implantatie. Details voor het chirurgische protocol worden besproken in eerdere studies12,13 en soortgelijke procedures zijn uitgevoerd in andere eerder gepubliceerde protocollen14,15. De vasculatuur wordt gelabeld met groene fluoresceïne-Dextran (70.000 MW, anionische oplossing, 2,5% w/v) intraveneus geïnjecteerd. Deze kleurstof is kosteneffectief en gemakkelijk verkrijgbaar bij commerciële bronnen, maar het heeft een breder emissiespectrum dat kan overlappen met RCaMP-emissie en doorbloedt tijdens het verkrijgen van microscoopbeelden. Stappen voor spectraal onmengen worden beschreven in punt 4 hieronder om dit te omzeilen, maar andere groene kleurstoffen met smallere emissiespectra, zoals die op basis van EGFP, kunnen ook worden gebruikt.
Protocol
Alle procedures met proefdieren die hieronder worden beschreven, zijn goedgekeurd door het Animal Care Committee van de Universiteit van Manitoba, dat wordt bestuurd door de Canadian Council on Animal Care.
1. Procedure opzet en voorbereiding
OPMERKING: De volgende items zijn vereist voor een injectie van een staartaderkatheter: insulinespuiten, een 15 cm stuk PE10-slang, 30 G naalden, gaas, zoutoplossing, tang, groene fluoresceïne dextran kleurstof, tang en schaar. Houd ook een naald klaar met ketamine / xylazine-anesthesie die vóór de beeldvormingssessie wordt geïnjecteerd.
KRITIEK: Alle materialen en apparatuur in stap 1 en 2 moeten vóór het gebruik worden gesteriliseerd door autoclaveren of spoelen met 70% ethanol. Als de tang niet goed kan worden gesteriliseerd, wordt het gebruik van een paar grote naaldhouders aanbevolen. Kathetermontage moet worden gedaan met een tang en tang om onbedoelde naaldpuncties te voorkomen.
- Snijd ongeveer 15-20 cm polyethyleenbuizen, PE10 (I.D. 28 mm; O.D. 61 mm).
- Vul een insulinespuit van 27 G met 0,9% zoutoplossing en veter de naald van de spuit in de punt van de polyethyleenbuis. Duw zoutoplossing door de buis en zorg ervoor dat er geen lekken zijn.
- Buig met een tang een naald van 30 G (0,3 mm x 25 mm) heen en weer totdat deze van de naaf breekt. De naald moet schoon zijn zonder bochten.
- Houd de naald met een tang vast, steek de naald voorzichtig in het uiteinde van de PE10-buis die is bevestigd aan de met zoutoplossing gevulde spuit en verwijder luchtbellen. Dit is de katheter voor injectie.
- Filter 30 μL van 2,5% (w/v) fluoresceïne dextran door een filter van 13-25 μm voorafgaand aan de injectie.
- Vul een andere insulinespuit met de 30 μL aliquot dextran en zorg ervoor dat er geen bubbels in de gevulde spuit zitten.
2. Staartader injectie
- Verdoof de muis met isofluraan (4% inductie, 1,5% onderhoud) of ketamine/xylazine (60 mg/kg; 10 mg/kg; i.p.) en breng oogsmeergel aan. Ketamine/xylazine wordt aanbevolen voor stabielere bloedstroommetingen tijdens beeldvorming en de dosis kan worden verhoogd tot 90 mg/kg; 10 mg/kg ketamine/xylazine voor langere beeldvormingssessies.
- Wanneer de muis zich op het chirurgische vlak van anesthesie bevindt, plaatst u een handschoen gevuld met warm water op de staart om de laterale ader te verwijden.
- Verwijder de handschoen na 30 s en reinig de staart met ethanol.
- Plaats de staart tussen de duim en de middelvinger. Zorg voor druk met de wijsvinger op de staart om de ader te verwijden. Pak met de andere hand de naald van de katheter op met een tang die de ring naar boven naar het plafond richt.
- Na het reinigen van de staart met 70% ethanol, steekt u de naald soepel in de ader in een hoek van 0° en injecteert u voorzichtig zoutoplossing door de katheter om ervoor te zorgen dat de naald correct wordt geplaatst.
OPMERKING: Als er geen weerstand op de zuiger is en geen zwelling van de staart, dan bevindt de naald zich in de ader. Als er aanzienlijke weerstand of zwelling is, moet de naald worden verwijderd. Stap 2.2-2.5 kan tot 3 keer aan elke kant van de staart worden herhaald, waarbij de 30G-naald aan het einde van de katheter elke tweede proef wordt vervangen totdat de plaatsing correct is. - Zodra de naald zich in de ader bevindt, verwisselt u de zoutoplossingspuit aan het uiteinde van de katheter met de spuit met fluoresceïne dextran (stap 1.6). Injecteer de dextran langzaam in de katheterslang, zodat er geen bubbels in de buis komen. Als er een luchtbel zichtbaar is, snijdt u de slang met de bel door om deze te verwijderen en bevestigt u de spuit opnieuw.
- Wanneer alle dextran (30 μL aliquot) is geïnjecteerd, verwijdert u de spuit en vervangt u deze door de zoutoplossingspuit. Injecteer de resterende dextran uit de slang in de muis totdat er geen kleurstof meer in de buis zit.
- Verwijder de naald van de staart en zorg voor druk met gaas gedurende 10-30 s totdat het bloeden stopt.
KRITIEK: Als na 6 pogingen de staartaderinjectie niet succesvol is, moet het dier in een andere sessie in beeld worden gebracht. Ook mag het totale volume (zoutoplossing en dextran) dat in de muis wordt geïnjecteerd niet groter zijn dan 100 μL.
3. Microscopie van twee fotonen
- Focussen op het schedelraam
OPMERKING: Gebruik ketamine / xylazine-anesthesie tijdens gegevensverzameling omdat het minder vasculaire effecten (vaatverwijding) heeft dan isofluraan. Als u isofluraan in de bovenstaande stappen gebruikt, injecteer de muis dan met ketamine/xylazine i.p. (aanbevolen dosis hierboven beschreven) vóór beeldvorming.- Bevestig de muis met een schroef door zijn koppaal aan een platform met een verwarmingskussen onder de microscoop.
- Breng oogsmeermiddel aan op de ogen van de muis.
- Reinig het schedelraam met vochtige tandheelkundige applicators. Zorg ervoor dat er geen deeltjes meer over zijn die het beeldvormingsproces kunnen verstoren.
- Breng ultrasone gel aan op het venster.
- Focus door het microscoopobject van twee fotonen totdat de piale bloedvaten onder het venster te zien zijn.
- Controleer de ademhaling van de muis en zorg ervoor dat het verwarmingskussen voldoende temperatuurondersteuning biedt.
- Beeldverwerving
OPMERKING: De twee-fotonenmicroscoop die in dit experiment wordt gebruikt, heeft een afstembare Ti-Sapphire-laser voor fluorescentie-excitatie met een Pockel-cel die de hoeveelheid laser regelt die het monster bereikt. Het uitgestraalde licht wordt door een 565 lange pass dichroic gesplitst naar twee GaAsP fotomultiplicatorbuizen (PMT's) met 595/50 band pass filter (rood) en 525/70 band pass filter (groen) voor detectie.
De procedures beschreven in stappen 3.2 tot en met 3.4 worden uitgevoerd met behulp van specifieke software van de twee-fotonenmicroscoop uit dit protocol (zie Tabel met materialen). Deze stappen kunnen worden aangepast aan andere microscoopsoftware en -apparatuur.- Stel met de kamerverlichting uit de gewenste golflengte in de microscoopsoftware in op 990 nm om zowel RCaMP als fluoresceïne-dextran te prikkelen door op de 2-P Laser box te klikken.
- Stel het laservermogen in door op het gedeelte Power/Gain box/Lasers te klikken en de Pockels 1 celspanning aan te passen op 30% of een waarde van 300 op een schaal van 1000. Het laservermogen dat het monster bij deze instelling bereikt, is eerder bepaald op ~ 30 mW.
- Stel de gevoeligheid van de PMT-detector in door op het gedeelte Power/Gain box/PMTs te klikken en de waarde aan te passen op 700-800.
OPMERKING: Deze waarden kunnen worden aangepast ten opzichte van de intensiteit van het fluorescerende monster en moeten op nul worden ingesteld voordat de lichten in de kamer worden ingeschakeld. - Ga naar het gedeelte Afbeeldingsresolutie en klik op de resolutie van 512 x 512 voor een groter beeldformaat.
- Klik op 2-P Laser/Open om de 2-P Laser sluiter te openen.
- Ga naar het scangedeelte en klik op de knop Live scan.
OPMERKING: Live scannen met deze parameters en hogere resolutie, RCaMP-positieve muurschilderingcellen en het fluorescerend gelabelde bloedplasma kunnen worden gezien. Als het signaal zwak is, kan de pockelwaarde worden verhoogd totdat het beeld duidelijk is.
KRITIEK: In de oppervlakkige weefsellagen mag het laservermogen niet groter zijn dan 50 mW, wat ongeveer 600 is in de Pockels-cellen in dit voorbeeld.
- Het verkrijgen van een dieptestapel van de muurschilderingscellen en het vasculaire netwerk
OPMERKING: Het verwerven van een dieptestapel wordt aanbevolen om pericyten in het vasculaire netwerk goed te lokaliseren. Ensheathing pericyten bevinden zich op de eerste tot vierde takken van de doordringende arteriole7,8,9. De microscoopsoftware die in dit protocol wordt gebruikt, verwijst naar dieptestapels als "Z-serie".- Door het microscoopobject objectief in het X-, Y- en Z-vlak te bewegen, lokaliseert u een grote slagader op het oppervlak van de hersenen op basis van de gladde spierceletikettering van RCaMP.
- Klik op het vak Z-serie.
- Focus op de bovenkant van het weefsel in de buurt van de piale vaten, stel dit in als het nulpunt en de bovenkant van de Z-serie stapel door te klikken op de sectie Huidige Z-serie / Startpositie [μm]. Klik op het vakje met vier zwarte strepen en een rode streep aan de bovenkant.
- Focus in het weefsel tot de gewenste diepte en stel dit in als de onderkant van de stapel door op het gedeelte Huidige Z-serie / Stoppositie [μm] te klikken. Klik op het vakje met vier zwarte strepen en een rode streep aan de onderkant.
- Stel de dikte van elk afbeeldingsvlak (stapgrootte) in op 1-2 μm door de gewenste waarde te typen in het vak onder de knop"Stapgrootte"(knop Stapgrootte is gelokaliseerd in de sectie Z-serie / Huidige Z-serie). Dit definieert het aantal afbeeldingen dat in de stapel wordt verkregen.
- Stel in dat het laservermogen exponentieel toeneemt naarmate de microscoop dieper door de stapel beweegt door op het vak Laser/ PMT-compensatie te klikken en Relatief (exponentiële gradiënt)te selecteren.
- Geef het bestand een naam, kies een map om het op te slaan en klik op Start Z-series.
- Open na acquisitie de Z-serie in de imaging processing software.
- Voeg de twee kanalen samen als gekleurde afbeeldingen en scan door de stapel op zoek naar interessante pericyten en bloedvaten door in het vak Afbeelding | Kleur | Gesplitste kanalen; Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen.
- Selecteer interessante gebieden (ROIs) die pericyten bevatten en sla de posities op om deze plekken opnieuw te lokaliseren in toekomstige beeldvormingssessies.
- T-serie calcium imaging film acquisitie (tijd)
- Gebruik de dieptestapel en ROM's van bovenaf als referentie en verplaats het microscoopobject objectief in de X-, Y- en Z-as tijdens de live scanmodus totdat een pericyte van belang wordt gevonden.
- Als u een film met pericytecalciumgebeurtenissen wilt verzamelen, verhoogt u de framesnelheid van de acquisitie (>10 frames per seconde) door naar het gedeelte Afbeeldingsresolutie te gaan en op het vak 128x128 te klikken.
- Stel de beeldduur in op 60 s door op het vak T-serie te klikken en de tijd in het duurvak in te voeren.
- Klik naast het vak Pad opslaan op de knop met drie stippen om het opslagpad bij te werken met een unieke bestandsnaam.
- Zoom optisch in op het vat om rekening te houden met de lagere resolutie en om een beter beeld van de pericyte te krijgen door de waarde in de sectie Optische zoom [mag] aan te passen.
- Verkrijg de T-serie door te klikken op Start T-serie.
- Hemodynamische metingen met kymografen (lijnscans)
- Focus op het vat van belang met een resolutie van 512 x 512pixels in de live scanmodus.
- Om de bloedvatdiameter en de snelheid van rode bloedcellen te meten, klikt u op de lijnscan om een eendimensionale scan met de microscoop te starten.
- Stel de duur van de scan (30-60 s) in milliseconden in.
- Teken een lijn die het vat van belang doorsnijdt en parallel langs het vat beweegt. Dit genereert een kymograaf van de diameter van het vat aan de linkerkant en strepen van de rode bloedcellen die door het bloedvat aan de rechterkant bewegen.
OPMERKING: Meerdere bloedvaten kunnen met dezelfde lijn worden gemeten zolang ze zich in hetzelfde beeldvlak bevinden. - Geef het bestand een naam en klik op de Start Linescan(s) om de gegevens te verkrijgen.
4. Beeldanalyse
- Calcium film analyse.
OPMERKING: Dit protocol beschrijft de stappen voor spectraal onmengen (Figuur 2) en twee verschillende methoden voor het analyseren van pericytencalciumgebeurtenissen met behulp van handmatige, met de hand geselecteerde ROIs (Figuur 3) en geautomatiseerde, op activiteiten gebaseerde ROI-selectie (Figuur 4)16,17. Om de signaalpieken te detecteren en te classificeren met het genormaliseerde calciumspoor van elke ROI, worden de gegevens long-pass en band-pass gefilterd, wat helpt om de gegevens voor amplitude- en breedteschattingen glad te strijken en ook om pieken van verschillende vormen te identificeren: enkele pieken, multi-pieken en plateaus (Figuur 3B). De parameters voor deze analyse kunnen worden geoptimaliseerd om verschillende soorten dynamische cellulaire signalen te detecteren. De onderstaande stappen vereisen het gebruik van beeldverwerkingssoftware en programmeersoftware met beeldverwerkingspakketten die verschillende codes bevatten om calciumfilms te analyseren zoals hierboven vermeld. Raadpleeg de materialentabel voor een volledige lijst van programma's en pakketten die in dit protocol worden gebruikt. Beeldgegevens van verschillende soorten microscopen kunnen worden geïmporteerd met deze pakketten die de metadata van de afbeeldingen behouden.
OPMERKING: Stappen 4.1.1-4.1.7 beschrijven hoe u ROIs handmatig selecteert in beeldverwerkingssoftware voor later gebruik in de handmatige calciumanalysemethode (stap 4.1.16)- Laad de calcium imaging T-serie in de beeldverwerkingssoftware door het .xml bestand naar de software werkbalk te slepen. Klik op het vak OK.
- Neem het gemiddelde van de stapel (het gemiddelde van de stapel wordt door de beeldverwerkingssoftware gelabeld als "Z-projectie"). Dit kan door te klikken op Afbeelding | Stapels | Z-projectie in de werkbalk.
- Maak een gekleurde afbeelding van beide kanalen zoals in stap 3.3.9.
- Open het venster ROI-manager door te klikken in het vak Analyseren | Hulpmiddelen | ROI Manager, of gewoon op de letter "T" in het toetsenbord drukken.
- Selecteer het gereedschap Veelhoek door op de veelhoekvorm op de werkbalk van de beeldverwerkingssoftware te klikken en de zichtbare ensheathing pericytstructuren, zoals soma en processen, te schetsen.
- Klik op de knop Toevoegen in het venster ROI-beheer om geselecteerde ROI's toe te voegen aan de ROI-manager.
- Geef elke interessante regio een unieke naam door op de knop Naam wijzigen te klikken en sla ze op als een zip-map die later in de programmeersoftware kan worden geladen door op Meer te klikken>> | Opslaan.
OPMERKING: Stap 4.1.8-4.1.14 beschrijft hoe de calcium T-serie in het programmeerplatform kan worden geïmporteerd en hoe de verschillende fluoroforen die door de microscoop-PMT's zijn gedetecteerd, in verschillende kanalen kunnen worden gemengd(figuur 2). - Open de programmeersoftware en zorg ervoor dat de mappen voor de beeldverwerkingspakketten op het pad staan (zie Tabel met materialen).
- Importeer de calcium T-serie in de programmeersoftware door de BioFormats-functie aan te roepen in het opdrachtvenster van het programmeerplatform, dat automatisch het bestandsselectievenster opent.
- Definieer wat er op elk kanaal staat door het gewenste nummer in te voeren. In deze voorbeeldgegevens: Kanaal 1 antwoord=6 (cellular_signal), Kanaal 2 antwoord=1 (blood_plasma).
- Plot de gegevens als een film in de programmeersoftware om visualisatie te vergemakkelijken door de plotfunctie aan te roepen.
- Voor het verwijderen van groene fluorescentie van fluoresceïne-dextran dat doorbloedt in het rode RCaMP-kanaal, ontmengt u de kanalen in het beeldverwerkingspakket door de unmix_chs-functie in het opdrachtvenster van het programmeerplatform aan te roepen.
- Selecteer een gebied dat alleen fluorescentie van deze fluorofoor in kanaal 1 bevat, zoals RCaMP in dit geval.
- Selecteer een gebied dat alleen fluorescentie van fluorofoor 2 bevat, zoals fluoresceïne in het bloedplasma in dit voorbeeld.
- Selecteer een achtergrondgebied dat geen fluorescentie van beide fluoroforen heeft. Dit genereert een spectrale bijdragematrix die wordt toegepast op elke pixel in elk kanaal. Het verbetert de lokalisatie van het RCaMP-signaal aanzienlijk, wat de detectie van calciumgebeurtenissen in deze structuren zal verbeteren.
OPMERKING: Zoals hierboven vermeld, zijn er meerdere manieren waarop de calciumbeeldvormingsgegevens kunnen worden geanalyseerd in de beeldverwerkingspakketten. Stappen 4.1.16-4.1.23 beschrijven de methode om ensheathing pericyte calciumgebeurtenissen te analyseren met behulp van handmatige, met de hand geselecteerde ROIs. - Voer de cellulaire signaleringsanalyse uit op de niet-gemengde calciumfilm door de CellScan-functie aan te roepen in het opdrachtvenster van het programmeerplatform.
- De code zal vragen "Welke ROI-detectiemethode zou u willen gebruiken?". Typ het getal 2 om de met de hand geselecteerde ROM's op het programmeerplatform te laden.
- Laad de interessante gebieden uit de zip-map die eerder met de hand uit de pericyten zijn geselecteerd (stap 4.1.6).
- De code zal vragen "Wat is de schaalfactor?". Bepaal de schaalfactor voor de met de hand geselecteerde ROM's ten opzichte van de afbeeldingsreeks die wordt geanalyseerd en typ het nummer van de schaal. In dit voorbeeld is de schaalfactor 1 omdat de ROM's niet hoeven te worden aangepast omdat ze zijn geselecteerd op afbeeldingen met 128x128 pixels, dezelfde resolutie als de oorspronkelijke calciumfilm.
- Genereer plots van elke ROI en de genormaliseerde calciumsporen in verschillende kleuren (Figuur 3A) door de proces- en plotfuncties in het opdrachtvenster aan te roepen.
- Als de code de meeste calciumgebeurtenissen in de afzonderlijke traceringen niet detecteert, wijzigt u de ingebouwde parameters in het configuratieoptimalisatievak door de opt_config functie aan te roepen en de waarden aan te passen, zoals het verlagen van de drempel voor de kortdoorlaat gefilterde gegevens tot drie keer de standaarddeviatie van de basislijnperiode, de eerste 30 frames van de T-serie.
- Selecteer de knop Verwerken in het optimalisatievak om de nieuwe parameters toe te passen.
OPMERKING: Om de signalen te detecteren en te classificeren, wordt het genormaliseerde calciumspoor langdoorlaat en banddoorlaat gefilterd, wat helpt om de gegevens voor amplitude- en breedteschattingen glad te strijken, maar ook om te bepalen of signalen enkele pieken, multi-pieken of plateaus zijn(Figuur 3B). - Voer de gegevens uit als een .csv bestand dat ruimtelijke informatie bevat over de interessegebieden en de pieken die zijn geïdentificeerd door de functie output_data in het opdrachtvenster aan te roepen. Geef het bestand een unieke naam voor verdere analyse in een statistiekprogramma.
OPMERKING: Stappen 4.1.24-4.1.31 beschrijven de methode om ensheathing pericyte calciumgebeurtenissen te analyseren met behulp van analyse van activiteitsgebaseerde ROIs. - Herhaal stap 4.1.8.-4.1.16 om de calciumfilm te importeren, de kanalen te ontmengen en de CellScan-functie in het programmeerplatform aan te roepen.
- De code zal vragen "Welke ROI-detectiemethode zou u willen gebruiken?". Typ het getal 6 om de geautomatiseerde regio van interesse-identificatie te selecteren op basis van de activiteit en verandering in fluorescentie in 3 dimensies (x, y en tijd; "3D FLIKA-algoritme").
- Plot de verwerkte resultaten om de geïdentificeerde interessegebieden als verschillende kleuren weer te geven door de proces- en plotfuncties in het opdrachtvenster aan te roepen. Elke ROI wordt onderscheiden in tijd en ruimte en weergegeven als een overlayed masker(figuur 4).
- Als het algoritme geen RIL's detecteert die duidelijk zichtbaar zijn met het oog, wijzigt u de ingebouwde parameters in het optimalisatievak door de opt_config functie aan te roepen en de waarden aan te passen, zoals het verhogen van het Gauss-filter dat de gegevens op tijd afvlakt (met 2 s) en het verlagen van de drempel voor het vinden van ROM's tot 3 keer de standaarddeviatie van de basislijn.
- Selecteer de procesknop in het optimalisatievak om de nieuwe parameters toe te passen. Met het optimalisatieproces moeten meer ROIs worden geïdentificeerd(Figuur 4B).
- Plot de ROM's als een film om de activiteitsgebieden (omlijnd in regenboogkleuren) duidelijk te identificeren door de modus van het standaardvak te wijzigen in film in het optimalisatievenster voor verdere visualisatie.
- Voer de gegevens uit als een csv-bestand door de output_data-functie in het opdrachtvenster aan te roepen. Dit bestand kan verder geanalyseerd worden in een statistiekprogramma.
OPMERKING: De analyseparameters kunnen worden aangepast aan elk type dynamisch cellulair signaal (calcium, FRET-verhoudingen, enz.). Alle bovenstaande stappen kunnen worden geautomatiseerd met eenvoudige programmeercode om veel calciumfilms met dezelfde instellingen batchgewijs te verwerken.
- Lijnscan bloedstroomanalyse.
- Importeer het in paragraaf 3.5 verkregen kymograafgegevensbestand voor lijnscans in de programmeersoftware.
- De code zal vragen "Wat wordt er getoond op kanaal 1 en 2?". Definieer wat er op elk kanaal staat wanneer daarom wordt gevraagd. In dit voorbeeld is kanaal 1 leeg (type 0)en kanaal 2 blood_plasma (type 1).
- Voer de diameteranalysefunctie op de lijnscan uit door de functie LineScanDiam aan te roepen, die een vak opent om het gebied te selecteren dat overeenkomt met de diameter in de kymograaf(Figuur 5B,links).
- Teken een vak buiten de fluorescentiegrenzen van de kymograaf dat overeenkomt met de diameter van het vat.
- Verwerk deze gegevensklasse door de procesfunctie aan te roepen om de volledige breedte bij halve maxima voor de diameter van het vat te meten en een plot (Figuur 5C) te genereren met de plotfunctie.
- Voer de gegevens uit als een csv-bestand door de output_data-functie in het opdrachtvenster aan te roepen. Dit bestand kan verder geanalyseerd worden in een statistiekprogramma.
- Voer de snelheid radontransformatieanalyse uit door de functie LineScanVel aan te roepen, die een vak opent om het gebied te selecteren dat overeenkomt met de RBC-snelheid in de kymograaf(Figuur 5B,rechts).
- Teken een vak binnen de rand van de kymograaffluorescentie dat overeenkomt met de snelheid van het vat.
- Verwerk deze gegevensklasse door de procesfunctie aan te roepen om de snelheid, flux en lineaire dichtheid van rode bloedcellen te berekenen vanuit de hoek van de strepen in de fluorescentie. Genereer een plot (Figuur 5D) met de plotfunctie.
- Voer de gegevens uit als een csv-bestand door de output_data-functie in het opdrachtvenster aan te roepen. Dit bestand kan verder geanalyseerd worden in een statistiekprogramma.
OPMERKING: De kymografen moeten een duidelijke fluorescentie hebben met goed gedefinieerde randen tussen de zwarte ruimten om de diameter- en snelheidsanalyse nauwkeurig te laten zijn (Figuur 5A, B). Het is erg belangrijk om de orthogonale en parallelle lijnen op een nauwkeurige manier te tekenen, anders is een betrouwbare analyse van de kymografen niet mogelijk. Net als bij calciumanalyse met de beeldverwerkingsalgoritmen kunnen de parameters voor diameter- en snelheidsberekeningen worden geoptimaliseerd.
Representative Results
Fluoresceïne-dextran heeft een breed emissiespectrum dat kan doorbloeden in het rode kanaal, wat van invloed is op RCaMP-detectie in ensheathing pericyten (Figuur 2A). Spectrale ontmenging na gegevensverzameling in het softwareprogramma vermindert de fluoresceïnebloeding door(Figuur 2B, lager), waardoor de calciumsignaaldetectie in volgende analysestappen wordt verbeterd.
Calciumanalyse met de beeldverwerkingsalgoritmen die in dit protocol worden gebruikt, maakt verschillende benaderingen mogelijk om ROIs en intracellulaire calciumfluctuaties (d.w.z. calciumsignalen) te identificeren. Door cellulaire structuren met de hand te selecteren, kunnen calciumfluctuaties binnen deze regio's worden gedetecteerd(figuur 3A),inclusief verschillende soorten signaalpieken, zoals enkele pieken en meerdere pieken, nadat de genormaliseerde calciumsporen low-pass en band-pass gefilterd zijn(Figuur 3B). Bovendien worden ELLE's geïdentificeerd door actieve pixels samen te groeperen waar de fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd verandert met behulp van beeldverwerkingsalgoritmen ontwikkeld door Ellefsen et al.2014 16 en Barrett et al. 201817 (Figuur 4). Dit kan worden toegepast op elk dynamisch cellulair signaal door de tijd, drempel en ruimtelijke parameters aan te passen aan de verwachte grootte en vorm van het signaal. Door de drempel voor signaalidentificatie te verlagen, worden meer interessante regio's gevonden(figuur 4B).
Heldere en heldere hemodynamische kymografen kunnen worden geanalyseerd om de diameter en RBC-snelheid in bloedvaten in de buurt van ensheathing pericyten te meten (Figuur 5A, B). De diameter wordt berekend op basis van de volledige breedte bij de helft van de fluorescentie (figuur 5C). De RBC-snelheid wordt benaderd op basis van de strepen gemaakt van niet-gelabelde RBC's, waarbij de hoek wordt ingevoerd in een Radon-transformatie om de snelheid, flux (cellen / s) en lineaire dichtheid (cellen / mm; Figuur 5D). Kymografen van slechte kwaliteit waarbij er sprake is van fluorescentieverzadiging, slechte signaal-ruisverhouding of beweging van het beeldvormingsveld (figuur 6A) creëert onbetrouwbare plots met foutpunten (rode kruisen) waar gegevens niet kunnen worden bepaald (figuur 6B, C). De kwaliteit van de verkregen gegevens is van cruciaal belang voor een goede uitkomst en het volgen van de stappen die in dit protocol worden beschreven, zorgt voor goede resultaten.
Figuur 1. Samenvatting van het protocol. Het protocol presenteert de stappen om fluorescerende calciumbeelden van hersenverwarmende pericyten en bloedstroomgegevens van nabijgelegen bloedvaten in verdoofde muizen te verkrijgen en te analyseren. Het protocol is verdeeld in 4 stappen. 1) Procedurevoorbereiding: opzetten van apparatuur en kathetervoorbereiding; 2) Staartader injectie; 3) Gegevensverzameling door microscopie met twee fotonen; 4) Data-analyse met beeldverwerkingsalgoritmen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Spectrale ontmenging van fluoroforen. A) Representatief gemiddeld beeld van RCaMP ensheathing pericyte en fluoresceïne-dextran gelabeld bloedvat van een T-serie acquisitie. Schaalbalk = 10 μm.B) Boven: Bij het overwegen van individuele kanalen is doorbloeding van kanaal 2 zichtbaar in kanaal 1 (links). Lager: Na spectraal ontmenging wordt de doorbloeding verminderd en is het signaal van RCaMP prominenter aanwezig in de pericytenstructuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Met de hand geselecteerde ROM's en geoptimaliseerde calciumsporen. A) Interessante regio's die in de gebruikte beeldverwerkingssoftware zijn geselecteerd (regenboogvormen) kunnen worden gebruikt om calciumsignaalsporen te identificeren. B) Signaalpieken van genormaliseerde sporen worden geïdentificeerd door lage doorgang en bandpas die de gegevens filteren. We definieerden de signaaldrempel als 3 keer de standaarddeviatie van de basislijnperiode (eerste 30 frames) en eventuele pieken boven deze drempel werden beschouwd als een signaal (lager spoor). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Geautomatiseerde, op activiteiten gebaseerde ROIs voor calciumanalyse. Dezelfde gegevens werden geanalyseerd met een drempel van 7 keer de standaarddeviatie van de uitgangswaarde (A) en 3 keer de standaarddeviatie van de uitgangswaarde (B). Als u de drempel voor het identificeren van actieve pixels verlaagt, worden meer ROM's (B) en signaalpieken (cirkeldiagram) in de pericyten gevonden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Kymograaf hemodynamische metingen. A) Voorbeeld lijnscan door het schip. B) Voorbeeld van goed gedefinieerde kymografen voor diameter (links) en snelheid (rechts). De zwarte strepen binnen de rechter band van fluorescentie komen overeen met RBC's.C) Diameter analyse met duidelijke vasomotion fluctuaties. D) Snelheidsanalyse met diagrammen voor Y-as = RBC-flux (cellen/s), lijndichtheid (cellen/mm), snelheid (mm/s) en streephoek (graad), signaal-ruisverhouding (willekeurige eenheden, a.u.), X-as=tijd (sec). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Weergave van hemodynamische metingen van slechte kwaliteit. A) Voorbeelden van kymografen van slechte kwaliteit met fluorescentieverzadiging, slechte signaal-ruisverhouding of beweging van het beeldvormingsveld tijdens acquisitie. B en C) Plots vergelijkbaar met figuur 7 van diameter- en snelheidsgegevens die foutpunten (rode stippen) hebben vanwege de slechte kwaliteit van de kymografen. (afbeelding E, Y-as= Diameter (μm), X-as = tijd (sec); afbeelding F, Y-as = RBC-flux (cellen / s), lijndichtheid (cellen / mm), snelheid (mm / s) en streephoek (graad), signaal-ruisverhouding (a.u.), X-as = tijd (sec). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De huidige methode biedt details over muisstaartaderinjectie met een katheter, twee-foton microscoopbeeldacquisitie voor dieptestapels, celcalciumsignaleringsfilms, creatie van hemodynamische kymografen en calcium- en hemodynamische analyse met onze beeldverwerkingsalgoritmen17 (Figuur 1). Er zijn verschillende voordelen aan deze technieken die het in vivo beeldvormingsresultaat verbeteren en tijd, middelen en dierlijke stress tijdens de sessie verminderen. Ten eerste biedt het gebruik van een katheter voor staartaderinjectie meer controle over de naald, de spuit en de hoeveelheid stof die in de circulatie van de muis wordt geïnjecteerd. Bovendien voorkomt het kleurstofinjectie in het staartweefsel, waardoor dure reagentia worden bespaard. Ten tweede gebruiken we transgene muizen die genetisch gecodeerde calciumsensoren tot expressie brengen in ensheathing pericyten en demonstreren hoe ze te lokaliseren in het vasculaire netwerk van de hersenen met een diepte z-stack, wat celidentificatie en verplaatsing in daaropvolgende beeldvormingssessies op lange termijn vergemakkelijkt. Dit is een belangrijke factor in pericytenstudies en zorgt voor een goede celclassificatie6,7. Ten derde bieden we onze parameters voor het verzamelen van calciumfilms en hemodynamische lijnscangegevens die een goed startpunt zijn voor het meten van dynamische cellulaire signalen. Ten slotte presenteren we onze beeldverwerkingsalgoritmen17, een uitgebreide toolbox voor beeldverwerking die meerdere benaderingen bevat voor beeldvoorbewerking (zoals spectraal onmengen), calciumbeeldanalyse en hemodynamische analyse (diameter, snelheid, enz.). Deze algoritmen kunnen plots genereren voor een snelle en eenvoudige visualisatie van de gegevens, terwijl het niveau van gebruikersexpertise dat nodig is om de resultaten te analyseren, wordt geminimaliseerd. Bovendien kan het worden geautomatiseerd met een paar regels code om snel meerdere datasets met dezelfde parameters te verwerken. Dit kan mogelijk de datavisualisatie en de tijdsinvestering van de onderzoeker verbeteren.
De sleutel tot het verzamelen van goede calciumbeeldvormingsgegevens is het aanpassen van het laservermogen en de PMT-instellingen voor duidelijke fluorescentiesignaalacquisitie, maar ook om gegevens te verzamelen met een voldoende framesnelheid om de hele calciumgebeurtenis vast te leggen. De gegevens in dit protocol werden verkregen met 10-11 frames per seconde, die de langzamere calciumoscillaties in ensheathing pericyten vangt. Er zijn ook verschillende stappen tijdens de analyse die de analyse-uitkomst kunnen verbeteren. Ten eerste is spectraal ontmenging gunstig als er een significante overlap is tussen de emissiespectra van fluoroforen (figuur 2). Fluoresceïne-dextran werd in dit protocol gebruikt omdat het een kosteneffectief en in de handel verkrijgbaar dextran-conjugaat is dat vaak wordt gebruikt voor hemodynamische metingen5. Spectrale ontmenging helpt om de gegevens op te ruimen voor verbeterde detectie van calciumsignalen, maar alternatieve fluoroforen met smallere emissiespectra kunnen ook worden gebruikt. Ten tweede is het met de hand selecteren van cellulaire structuren als ROIs (Figuur 3) nuttig voor het classificeren van calciumgebeurtenissen in verschillende subcellulaire regio's zoals de soma of procestakken. Activiteitsgebaseerde ROI-selectie(figuur 4)16 biedt meer ruimtelijke en temporele informatie over individuele calciumgebeurtenissen. Dit kan nuttig zijn bij het bepalen van de frequentie van calciumgebeurtenissen in een bepaald gebied of de voortplanting van gebeurtenissen naar andere cellulaire gebieden. Het gebruik van programmeersoftware om beeldgegevens te analyseren, kan onderzoekers uren tijd besparen wanneer gegevens batchgewijs worden verwerkt, maar het vereist enige initiële tijdsinvestering om de parameters aan te passen voor optimale resultaten. De belangrijkste factoren zijn de verwachte grootte (in μm2) van het actieve gebied en de duur van het signaal (minimale signaaltijd en maximale signaaltijd moeten worden gedefinieerd). Onderzoekers moeten eerst enkele voorbeeldfilms uit de T-serie onderzoeken om te bepalen welke parameters het beste bij hun gegevens passen. Ten slotte kunnen gegevens van slechte kwaliteit die op de microscoop zijn verkregen, de analyse van calcium en hemodynamiek sterk belemmeren(figuur 6). Daarom moet ervoor worden gezorgd dat de microscoopacquisitie-instellingen in het begin worden geoptimaliseerd. Met deze factoren in gedachten, dit protocol dat kan worden aangepast aan calcium beeldvorming of analyse van andere dynamische cellulaire signalen (bijv. Fluorescerend natrium, kalium, metaboliet of spanningsschommelingen) in andere weefsels of celtypen.
Er zijn verschillende beperkingen aan dit protocol. Ten eerste worden de gegevens verzameld onder anesthesie, wat de hersenactiviteit beïnvloedt en de bloedstroom kan beïnvloeden. Soortgelijke beeldvorming kan worden gedaan bij wakkere muizen die zijn getraind om hoofdfixatie te accepteren voor meer fysiologische resultaten. Bovendien is het belangrijk om te onthouden dat we 2-dimensionale beelden van een 3-dimensionale cel en bloedvat in vivoverzamelen . Daarom kunnen we slechts een factie van de calciumgebeurtenissen in deze cellen of de bloedstroom in een enkel deel van het bloedvat tegelijk vastleggen.
Een andere beperking om op te merken is dat calciumbeeldvorming met twee fotonen gevoelig is voor bewegingsartefacten, waarbij beweging in en uit het brandpuntsvlak kan worden aangezien voor calciumschommelingen. Dit protocol werd uitgevoerd onder anesthesie, wat de beweging van het dier beperkt; bewegingsartefacten kunnen echter worden geïntroduceerd door de ademhalingsfrequentie van de muis, hartslag, mogelijke zwelling van het weefsel en in het geval van ensheathing pericyten, vaatcontractie of vasomotion 4,6,18,19. Bewegingsartefacten kunnen worden beperkt door verschillende strategieën. De beeldverwerkingspakketten die in dit protocol worden gebruikt, bevatten een optionele bewegingscorrectiestap, die een 2D-convolutie-engine gebruikt om de beelden binnen de T-serie uit te lijnen op basis van de zichtbare vasculatuur13,17. Frames met significante veranderingen in het brandpuntsvlak worden door dit algoritme geïdentificeerd en kunnen worden uitgesloten van analyse. Bovendien is het mogelijk om statistische strategieën te gebruiken binnen de beeldvormingsverwerkingspakketten, zoals een Z-score bij het genereren van de fluorescentiesporen om de door beweging geïnduceerde calciumschommelingen te normaliseren20. De meest robuuste benadering om rekening te houden met bewegingsartefacten in beeldvorming met twee fotonen is het combineren van expressie van twee fluorescerende indicatoren binnen dezelfde cel, zoals een calciumindicator (bijv. GCaMP) en een fluorescerende reporter (bijv. mCherry) die calciumonafhankelijk is. Fluctuaties in de fluorescerende reporter kunnen vervolgens worden toegeschreven aan beweging en worden afgetrokken van het calciumindicatorsignaal om bewegingsartefacten te normaliseren.
Het doel van dit protocol is om een duidelijk inzicht te geven in hoe optimale calciumbeeldvorming en bloedstroomgegevens in vivo kunnen worden verzameld en om nieuwe methoden en analysetools te presenteren die onderzoekers kunnen implementeren om hun resultaten te verbeteren. Deze technieken kunnen worden toegepast om de rol van verschillende pericytenpopulaties in de controle van de bloedstroom of in verschillende hersenziektetoestanden te bestuderen. Deze beeldvormingsparameters kunnen ook worden gebruikt om calcium en bloedstroom in andere celtypen en orgaansystemen te bestuderen en vergelijkbare principes zijn van toepassing op andere dynamische beeldvormingstechnieken die mogelijk worden gemaakt door andere genetisch gecodeerde sensoren, naast calcium.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
J. Meza wordt ondersteund door fellowships van Mitacs en Research Manitoba. Financiering voor dit werk werd verstrekt door Canadian Institutes for Health Research, Research Manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, start-up financiering van de Universiteit van Manitoba en Brain Canada via het Canada Brain Research Fund, met de financiële steun van Health Canada en de Azrieli Foundation. De standpunten die hierin worden uitgedrukt, vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de minister van Volksgezondheid of de regering van Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acta2-RCaMP1.07 | The Jackson Laboratory | 28345 | In the video protocol the animal model used is a female mouse of 10 months, 1 day old. |
| Applicators (Regular) | Bisco | X-80250P | |
| BioFormats package for MATLAB | NA | NA | Denominated in this protocol as "image processing packages". Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ |
| CHIPS MATLAB toolbox | NA | NA | Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS |
| Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity | HealthCare Plus | UGC250 | |
| Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| Eye Lube Plus | Optixcare | NA | |
| FIJI | Image J | NA | Denominated in this protocol as "image processor software". Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GCaMP6sfl/fl | The Jackson Laboratory | ||
| Head Post fixing platform | University of Zurich | NA | |
| Ketamine (Narketan 100 mg/mL) | Vetoquinol | 440893 | |
| MATLAB R2020b | NA | Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/ | |
| Needle 0.3mmx25mm | BD PrecisionGlide | 305128 | |
| Objective XLUMPLFLN20XW | Olympus | NA | https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/ |
| PDGFRβ-CreERT2 | The Jackson Laboratory | 30201 | |
| Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) | BD Intramedic | 427401 | |
| Prairie View | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
| Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
| Under Tank Heater | Reptitherm U.T.H | E169064 | |
| Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |
References
- Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Berthiaume, A. -A., et al. Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -F. F., Charpak, S. Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia. Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Gonzales, A. L., et al. Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).
- Hartmann, D. a, et al. Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice. Neurophotonics. 2 (4), 041402 (2015).
- Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).
- Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes. Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).
- 28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/strain/028345 (2021).
- Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials. PLoS ONE. 7 (7), (2012).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. JoVE. (12), e680 (2008).
- Lin, X., et al. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. JoVE. (143), e56297 (2019).
- Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).
- Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis. Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (1), 55-60 (2014).
- Nilsson, H., Aalkjaer, C. Vasomotion: mechanisms and physiological importance. Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).
- Rungta, R. L., et al. Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex. Communications Biology. , (2021).
