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Neuroscience

वीवो में ट्रांसजेनिक चूहों में ब्रेन पेरिसाइट कैल्शियम और हेमोडायनामिक इमेजिंग

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62725
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1College of Pharmacy, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल एनेस्थेटाइज्ड चूहों में पास के रक्त वाहिकाओं से मस्तिष्क एनेस्थिंग पेरिसाइट्स और रक्त प्रवाह डेटा से फ्लोरोसेंट कैल्शियम छवियों को प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए कदम प्रस्तुत करता है। ये तकनीक भित्ति कोशिका शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए उपयोगी हैं और किसी भी कोशिका प्रकार में कैल्शियम यात्रियों की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

प्रोटीन जीव विज्ञान और माउस जेनेटिक्स में हाल ही में हुई प्रगति ने वीवो में मस्तिष्क कोशिकाओं के इंट्रासेलुलर कैल्शियम के उतार-चढ़ाव को मापना और स्थानीय हेमोडायनामिक्स के साथ इसे सहसंबंधित करना संभव बना दिया है। यह प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करता है जिन्हें एक पुरानी कपाल खिड़की के साथ तैयार किया गया है और α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन प्रमोटर के तहत आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर, RCaMP1.07 को विशेष रूप से भित्ति कोशिकाओं को लेबल करने के लिए व्यक्त करता है, जैसे कि संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और एनेथिंग पेरिसाइट्स। रक्त प्रवाह का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के नसों में इंजेक्शन के लिए पूंछ नस कैथेटर तैयार करने के तरीके के साथ-साथ मस्तिष्क पेरिसाइट कैल्शियम और स्थानीय रक्त वाहिका हीमोडायनामिक्स (व्यास, लाल रक्त कोशिका वेग, आदि) को केटामाइन/जाइलाज़ीन एनेस्थेट में कपाल खिड़की के माध्यम से वीवो में दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा कैसे मापने के लिए कदम रेखांकित किए गए हैं । अंत में, बैरेट एट अल 2018 द्वारा विकसित छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के माध्यम से कैल्शियम में उतार-चढ़ाव और रक्त प्रवाह फिल्मों के विश्लेषण के लिए विवरण प्रदान किए जाते हैं, जिसमें इस बात पर जोर दिया जाता है कि इन प्रक्रियाओं को अन्य सेलुलर इमेजिंग डेटा के अनुकूल कैसे किया जा सकता है।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र वाक्यूलेचर में मर्मज्ञ धमनियों, केशिकाओं और आरोही वेणुओं के होते हैं। इस नेटवर्क के भीतर, भित्ति कोशिकाएं जैसे संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं धमनियों को एनकेस करती हैं और पेरिसाइट्स पहली धमनियों की शाखाओं और केशिकाओं1के साथ सेलुलर प्रक्रियाओं का विस्तार करती हैं। पेरिसाइट्स में मस्तिष्क के भीतर कई भूमिकाएं दिखाई देती हैं जिनमें रक्त-मस्तिष्क-बाधा1,2,माइग्रेशन और गतिशीलता3,संभावित स्टेम-सेल गुण, और मस्तिष्क रक्त प्रवाह4,5, 6का विनियमन शामिल है। पेरिसाइट्स की कई कार्यात्मक भूमिकाओं को इंट्रासेलुलर कैल्शियम में उतार - चढ़ाव से जोड़ा गया है जो इन कोशिकाओं के फैलाव या संकुचन को विनियमित कर सकता है4,5,6.

हाल के कई अध्ययनों में विभिन्न प्रकार के मस्तिष्क परिग्रहों की पहचान करने के लिए मानदंड निर्धारित किए गएहैं. मर्मज्ञ धमनियों की पहली 4 शाखाओं के भीतर भित्ति कोशिकाएं अनुबंधित प्रोटीन α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (αSMA) और उनके फैलाव, ओवॉयड सोमा की प्रक्रियाओं के साथ उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर पेरिसाइट्सको एनेस्थेट कर रही हैं जो7,8,9के चारों ओर घूमते हैं। पेरिसाइट्स को एनशिथिंग में कैल्शियम के उतार-चढ़ाव की कल्पना करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक उपन्यास ट्रांसजेनिक माउस लाइन, Acta2-RCaMP1.07 का उपयोग करता है, जिसे टीजी (RP23-370F21-RCaMP1.07) B3-3Mik/J10के रूप में भी जाना जाता है । ये चूहे लाल आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक, RCaMP1.07, αSMA में कोशिकाओं को व्यक्त करते हुए व्यक्त करते हैं (संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं और एनशेथिंग पेरिसाइट्स)। प्रजनन उपनिवेशों को हेमिज़िगोट्स के साथ गैर-ैरियर जानवरों को पार करके बनाए रखा जाता है। RCaMP1.07 एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जिसमें एक शांत रंग बाध्यकारी डोमेन है, जो इंट्रासेलुलर कैल्शियम10, 11के लिए बाध्यकारी होने पर फ्लोरेसेंस बढ़ाता है। यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट रंगों के पूंछ नस इंजेक्शन के लिए प्रक्रियाओं सहित दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा एनशीथिंग पेरिसाइट्स और रक्त प्रवाह माप के संयुक्त कैल्शियम इमेजिंग के लिए कदमों को रेखांकित करता है, एनेस्थेटाइज्ड चूहों में माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण, और प्रोग्रामिंग प्लेटफार्मों के साथ डेटा विश्लेषण(चित्र 1)। ये तकनीक भित्ति कोशिका शरीर विज्ञान के बारे में सवालों को संबोधित करने के लिए उपयोगी हैं, लेकिन मस्तिष्क या अन्य अंग प्रणाली में किसी भी कोशिका प्रकार में कैल्शियम यात्रियों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस लेख में प्रस्तुत प्रयोग के लिए एक 10 महीने की महिला Acta2-RCaMP1.07 माउस का इस्तेमाल किया गया था । माउस पुरानी कपाल खिड़की और सिर पोस्ट प्रत्यारोपण के लिए दो महीने पहले सर्जरी की गई । सर्जिकल प्रोटोकॉल के विवरण पर पिछले अध्ययनों में चर्चा की गई है12,13 और इसी तरह की प्रक्रियाएं अन्य पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 14,15में की गई हैं । वैक्यूलेचर को ग्रीन फ्लोरोसेइन-डेक्सट्रान (70,000 मेगावाट, एनियोनिक सॉल्यूशन, 2.5% डब्ल्यू/वी) के साथ लेबल किया गया है। यह डाई वाणिज्यिक स्रोतों से लागत प्रभावी और आसानी से उपलब्ध है, लेकिन इसमें एक व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है जो आरसीएएमपी उत्सर्जन के साथ ओवरलैप हो सकता है और माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण के दौरान खून बह सकता है। इस को दरकिनार करने के लिए नीचे धारा 4 में स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के लिए कदम रेखांकित किए गए हैं, लेकिन संकरा उत्सर्जन स्पेक्ट्रा वाले अन्य हरे रंग, जैसे ईजीएफपी पर आधारित, भी उपयोग किया जा सकता है।

Protocol

नीचे उल्लिखित प्रायोगिक जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को मैनिटोबा विश्वविद्यालय की पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है, जो पशु देखभाल पर कनाडा परिषद द्वारा शासित है ।

1. प्रक्रिया सेटअप और तैयारी

नोट: निम्नलिखित वस्तुओं एक पूंछ नस कैथेटर इंजेक्शन के लिए आवश्यक हैं: इंसुलिन सीरिंज, PE10 ट्यूबिंग का एक 15 सेमी टुकड़ा, 30 जी सुई, धुंध, खारा, संदंश, हरी फ्लोरोसिन डेक्सटरान डाई, चिमटा, और कैंची । इसके अलावा, केटामाइन/जाइलाज़ीन संज्ञाहरण के साथ एक सुई तैयार करें जिसे इमेजिंग सत्र से पहले इंजेक्ट किया जाएगा।

क्रिटिकल: चरण 1 और 2 में सभी सामग्रियों और उपकरणों को 70% इथेनॉल के साथ ऑटोक्लेविंग या रिनसिंग द्वारा उपयोग से पहले निष्फल किया जाना चाहिए। यदि चिमटा ठीक से निष्फल नहीं किया जा सकता है, तो बड़े सुई धारकों की एक जोड़ी के उपयोग की सिफारिश की जाती है। कैथेटर असेंबली को आकस्मिक सुई पंचर से बचने के लिए चिमटा और संदंश के साथ किया जाना चाहिए।

  1. पॉलीथीन ट्यूबिंग, PE10 (28 मिमी) के लगभग 15-20 सेमी कटौती; O.D. 61 मिमी) ।
  2. पॉलीथीन ट्यूब की नोक में 0.9% खारा और फीता सिरिंज की सुई के साथ एक 27 जी इंसुलिन सिरिंज भरें। ट्यूब के माध्यम से खारा पुश, यकीन है कि वहां कोई लीक कर रहे हैं ।
  3. चिमटा का उपयोग करके, हब से टूटने तक 30 जी सुई (0.3 मिमी x 25 मिमी) को आगे-पीछे मोड़ें। सुई कोई झुकता के साथ साफ होना चाहिए।
  4. संदंश के साथ सुई पकड़े, ध्यान से PE10 ट्यूबिंग है कि खारा भरा सिरिंज से जुड़ा हुआ है और हवा बुलबुले को दूर करने के अंत में सुई डालें । यह इंजेक्शन के लिए कैथेटर है।
  5. इंजेक्शन से पहले 13-25 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से 2.5% (w/v) फ्लोरोसेइन डेक्सट्रान के 30 माइक्रोन को फ़िल्टर करें।
  6. डेक्सट्रान के 30 माइक्रोन एलिकोट के साथ एक और इंसुलिन सिरिंज भरें और सुनिश्चित करें कि भरी हुई सिरिंज में कोई बुलबुले नहीं हैं।

2. पूंछ नस इंजेक्शन

  1. आइसोफ्लुन (4% इंडक्शन, 1.5% रखरखाव) या केटामाइन/जाइलाज़ीन (60 मिलीग्राम/किलो; 10 मिलीग्राम/किलो; यानी) के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें और आई लुब्रिकेंट जेल लगाएं। इमेजिंग के दौरान अधिक स्थिर रक्त प्रवाह मापन के लिए केटामाइन/जाइलाज़ीन की सिफारिश की जाती है और खुराक को 90 मिलीग्राम/किलो तक बढ़ाया जा सकता है; लंबे इमेजिंग सत्रों के लिए 10 मिलीग्राम/किलो केटामाइन/जाइलाज़ीन ।
  2. जब माउस संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान में हो, तो पार्श्व नस को फैलाने के लिए पूंछ पर गर्म पानी से भरा दस्ताने रखें।
  3. 30 एस के बाद दस्ताने निकालें और इथेनॉल के साथ पूंछ को साफ करें।
  4. पूंछ को अंगूठे और मध्यमा उंगली के बीच रखें। नस को फैलाने के लिए पूंछ पर इंडेक्स फिंगर के साथ दबाव प्रदान करें। दूसरी ओर के साथ, छत की ओर बेज़ेल ऊपर की ओर उन्मुख संदंश के साथ कैथेटर की सुई उठाओ।
  5. 70% इथेनॉल के साथ पूंछ को साफ करने के बाद, आसानी से, सुई को 0 डिग्री कोण पर नस में डालें और धीरे-धीरे कैथेटर के माध्यम से खारा इंजेक्ट करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सुई को सही ढंग से रखा गया है।
    नोट: यदि प्लंजर पर कोई प्रतिरोध नहीं है और पूंछ की सूजन नहीं है, तो सुई नस में है। यदि महत्वपूर्ण प्रतिरोध या सूजन है, तो सुई को हटा दिया जाना चाहिए। कदम 2.2-2.5 पूंछ के प्रत्येक पक्ष पर 3 बार तक दोहराया जा सकता है, कैथेटर के अंत में 30G सुई की जगह हर दूसरे परीक्षण जब तक प्लेसमेंट सही है ।
  6. एक बार सुई नस में है, फ्लोरोसेइन डेक्सट्रान (चरण 1.6) युक्त सिरिंज के साथ कैथेटर के अंत में खारा सिरिंज स्विच करें। धीरे-धीरे डेक्सट्रान को कैथेटर ट्यूबिंग में इंजेक्ट करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई बुलबुले ट्यूब में प्रवेश नहीं करते हैं। यदि एक हवा बुलबुला स्पष्ट है, तो इसे हटाने और सिरिंज को फिर से संलग्न करने के लिए बुलबुले युक्त ट्यूबिंग को काटें।
  7. जब सभी डेक्सट्रान (30 माइक्रोन एलिकोट) को इंजेक्ट किया गया हो, तो सिरिंज निकाल लें, और इसे खारी सिरिंज से बदल दें। ट्यूब में ट्यूबिंग से शेष डेक्सट्रान इंजेक्ट करें जब तक कि ट्यूब में कोई डाई न रह जाए।
  8. पूंछ से सुई निकालें और 10-30 एस के लिए धुंध के साथ दबाव प्रदान जब तक रक्तस्राव बंद हो जाता है ।
    क्रिटिकल: यदि 6 प्रयासों के बाद पूंछ नस इंजेक्शन सफल नहीं होता है, तो जानवर को दूसरे सत्र में चित्रित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, माउस में इंजेक्ट की गई कुल मात्रा (नमकीन और डेक्सट्रान) 100 माइक्रोन से अधिक नहीं होनी चाहिए।

3. दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी

  1. कपाल खिड़की पर ध्यान केंद्रित
    नोट: डेटा अधिग्रहण के दौरान केटामाइन/जाइलाज़ीन संज्ञाहरण का उपयोग करें क्योंकि इसमें आइसोफ्लुन की तुलना में कम संवहनी प्रभाव (वासोडिलेशन) होता है। यदि ऊपर दिए गए चरणों में आइसोफ्लुन का उपयोग कर रहे हैं, तो इमेजिंग से पहले माउस को केटामाइन/जाइलाज़ीन आईपी (ऊपर वर्णित अनुशंसित खुराक) के साथ इंजेक्ट करें।
    1. माइक्रोस्कोप के नीचे एक हीटिंग पैड के साथ एक मंच के लिए अपने सिर पोस्ट के माध्यम से एक पेंच के साथ माउस को ठीक करें।
    2. माउस की आंखों पर आंखों के स्नेहक लगाएं।
    3. नम दंत एप्लीकेटर्स के साथ कपाल खिड़की को साफ करें। सुनिश्चित करें कि कोई कण नहीं बचा है जो इमेजिंग प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकता है।
    4. खिड़की पर अल्ट्रासाउंड जेल लगाएं।
    5. दो फोटॉन माइक्रोस्कोप उद्देश्य के माध्यम से ध्यान केंद्रित जब तक पायल रक्त वाहिकाओं खिड़की के नीचे देखा जा सकता है ।
    6. माउस की श्वास की जांच करें और सुनिश्चित करें कि हीटिंग पैड पर्याप्त तापमान सहायता प्रदान कर रहा है।
  2. छवि अधिग्रहण
    नोट: इस प्रयोग में इस्तेमाल किए जाने वाले दो फोटॉन माइक्रोस्कोप में एक पोकेल सेल के साथ फ्लोरेसेंस उत्तेजना के लिए एक ट्यूनेबल टी-नीलमणि लेजर है जो नमूने तक पहुंचने वाले लेजर की मात्रा को नियंत्रित करता है। उत्सर्जित प्रकाश का पता लगाने के लिए 595/50 बैंड पास फिल्टर (लाल) और 525/70 बैंड पास फिल्टर (ग्रीन) के साथ दो GaAsP फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (PMTs) के लिए एक ५६५ लंबे पास dichroic द्वारा विभाजित है ।
    चरण 3.2 से 3.4 में वर्णित प्रक्रियाएं इस प्रोटोकॉल से दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके की जाती हैं (सामग्री की तालिकादेखें)। इन चरणों को अन्य माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और उपकरणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
    1. कमरे की रोशनी बंद होने के साथ, 2-पी लेजर बॉक्स पर क्लिक करके आरसीएएमपी और फ्लोरोसेइन-डेक्सट्रान दोनों को उत्तेजित करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में वांछित तरंगदैर्ध्य को 990 एनएम तक सेट करें।
    2. पावर/गेन बॉक्स/लेजर सेक्शन पर क्लिक करके लेजर पावर सेट करें और 30% पर पोकल्स 1 सेल वोल्टेज या १००० के पैमाने पर ३०० के मूल्य को एडजस्ट करें । लेजर शक्ति है कि इस सेटिंग में नमूना तक पहुंचता है पहले ~30 mW होना निर्धारित किया गया था ।
    3. पावर/गेन बॉक्स/पीएमटी सेक्शन पर क्लिक करके और वैल्यू को 700-800 तक एडजस्ट करकेपीएमटी डिटेक्टर सेंसिटिविटी सेट करें ।
      नोट: इन मूल्यों को फ्लोरोसेंट नमूने की तीव्रता के सापेक्ष समायोजित किया जा सकता है और कमरे में रोशनी चालू करने से पहले शून्य पर सेट किया जाना चाहिए।
    4. इमेज रिज़ॉल्यूशन सेक्शन पर जाएं और एक बड़ी इमेज साइज के लिए 512 x 512 रेजोल्यूशन पर क्लिक करें।
    5. 2-पी लेजरपर क्लिककरें/
    6. स्कैनिंग सेक्शन पर जाएं और लाइव स्कैन बटन पर क्लिक करें।
      नोट: इन मापदंडों और उच्च संकल्प के साथ लाइव स्कैनिंग, RCaMP सकारात्मक भित्ति कोशिकाओं और फ्लोरोसेंटी लेबल रक्त प्लाज्मा देखा जा सकता है । अगर सिग्नल कमजोर है तो तस्वीर साफ होने तक पोकेल वैल्यू बढ़ाई जा सकती है।
      क्रिटिकल: सतही ऊतक परतों में, लेजर शक्ति 50 एमडब्ल्यू से अधिक नहीं होनी चाहिए, जो इस उदाहरण में पोकेल्स कोशिकाओं सेटिंग्स में लगभग 600 है।
  3. भित्ति कोशिकाओं और संवहनी नेटवर्क की गहराई ढेर प्राप्त करना
    नोट: एक गहराई स्टैक के अधिग्रहण को ठीक से संवहनी नेटवर्क में pericytes का पता लगाने की सिफारिश की है । एनशिथिंग पेरिसाइट्स मर्मज्ञ धमनियों से पहली से चौथी शाखाओं पर स्थित हैं7,8,9. इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर गहराई के ढेर को "जेड-सीरीज" के रूप में संदर्भित करता है।
    1. एक्स, वाई और जेड विमान में माइक्रोस्कोप उद्देश्य को आगे बढ़ाते हुए, RCaMP की चिकनी मांसपेशी कोशिका लेबलिंग के आधार पर मस्तिष्क की सतह पर एक बड़ी धमनी को स्थानीयकृत करें।
    2. जेड-सीरीज बॉक्स पर क्लिक करें।
    3. पायल जहाजों के पास ऊतक के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित करें, इसे वर्तमान जेड-सीरीज/स्टार्ट पोजिशन [माइक्रोन] अनुभाग पर क्लिक करके जेड-सीरीज स्टैक के शून्य बिंदु और शीर्ष के रूप में सेट करें। चार काली धारियों और शीर्ष पर एक लाल धारी के साथ बॉक्स पर क्लिक करें।
    4. वांछित गहराई के लिए ऊतक में नीचे ध्यान केंद्रित करें और वर्तमान जेड-श्रृंखला/स्टॉप स्थिति [μm] अनुभाग पर क्लिक करके स्टैक के नीचे के रूप में इसे सेट करें। चार काली धारियों और नीचे पर एक लाल धारी के साथ बॉक्स पर क्लिक करें ।
    5. "स्टेप साइज" बटन (स्टेप साइज बटन जेड-सीरीज/वर्तमान जेड-सीरीज सेक्शनमें स्थानीयकृत है) के नीचे बॉक्स में वांछित मूल्य टाइप करके प्रत्येक छवि विमान(स्टेप साइज)की मोटाई को 1-2 माइक्रोन करें। यह स्टैक में प्राप्त चित्रों की संख्या को परिभाषित करेगा।
    6. लेजर शक्ति को तेजी से बढ़ाने के लिए सेट करें क्योंकि माइक्रोस्कोप लेजर/पीएमटी क्षतिपूर्ति बॉक्स पर क्लिक करके स्टैक के माध्यम से गहरा चलता है और सापेक्ष (घातीय ढाल)का चयन करता है ।
    7. फ़ाइल का नाम, इसे बचाने के लिए एक फ़ोल्डर चुना और शुरू जेड-श्रृंखलापर क्लिक करें ।
    8. अधिग्रहण के बाद, इमेजिंग प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में जेड-सीरीज खोलें।
    9. रंगीन छवियों के रूप में दो चैनलों को मर्ज करें और बॉक्स इमेज | में क्लिक करके पर्सीट्स और ब्याज की रक्त वाहिकाओं की तलाश में ढेर के माध्यम से स्कैन करें रंग | स्प्लिट चैनल; इमेज | रंग | मर्ज चैनल।
    10. ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करें जिनमें पेरिसाइट्स होते हैं और भविष्य के इमेजिंग सत्रों में इन स्थानों का पता लगाने में मदद करने के लिए पदों को बचाते हैं।
  4. टी-सीरीज कैल्शियम इमेजिंग मूवी अधिग्रहण (समय)
    1. एक संदर्भ के रूप में ऊपर से गहराई ढेर और आरओआई का उपयोग करके, लाइव स्कैन मोड के दौरान एक्स, वाई और जेड एक्सिस में माइक्रोस्कोप उद्देश्य को तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि ब्याज का एक पेरिसाइट न हो जाए।
    2. पेरिसाइट कैल्शियम की घटनाओं की एक फिल्म इकट्ठा करने के लिए, इमेज रिज़ॉल्यूशन सेक्शन पर जाकर अधिग्रहण फ्रेम दर (>10 फ्रेम प्रति सेकंड) बढ़ाएं, और 128x128 बॉक्स पर क्लिक करें।
    3. टी-सीरीज बॉक्स पर क्लिक करके और अवधि बॉक्स में समय दर्ज करके इमेजिंग अवधि को 60 एस तक सेट करें।
    4. सेव पाथ बॉक्स के बगल में, एक अद्वितीय फ़ाइल नाम के साथ सेव पथ को अपडेट करने के लिए तीन डॉट्स के साथ बटन पर क्लिक करें।
    5. कम संकल्प के लिए खाते में और ऑप्टिकल ज़ूम [पत्रिका] अनुभाग में मूल्य को समायोजित करके पेरिसाइट के करीब दृश्य हासिल करने के लिए पोत पर ऑप्टिकल रूप से ज़ूम करें।
    6. स्टार्ट टी-सीरीज पर क्लिक करके टी-सीरीजहासिल करें ।
  5. कामोग्राफ (लाइन स्कैन) के साथ हीमोडायनामिक्स माप
    1. लाइव स्कैन मोड में 512 x 512-पिक्सेल रेजोल्यूशन पर ब्याज के पोत पर ध्यान केंद्रित करें।
    2. रक्त वाहिका व्यास और लाल रक्त कोशिका वेग को मापने के लिए, माइक्रोस्कोप के साथ एक आयामी स्कैन शुरू करने के लिए लाइन स्कैन पर क्लिक करें ।
    3. मिलीसेकंड में स्कैन (30-60 एस) की अवधि निर्धारित करें।
    4. एक रेखा खींचें जो ब्याज के पोत को विभाजित करती है और पोत के साथ समानांतर चलती है। इससे दाईं ओर पोत के माध्यम से चलने वाली लाल रक्त कोशिकाओं के बाईं ओर पोत व्यास का एक कायनोग्राफ उत्पन्न होगा।
      नोट: कई रक्त वाहिकाओं के रूप में लंबे समय के रूप में वे एक ही इमेजिंग विमान में है एक ही लाइन के साथ मापा जा सकता है ।
    5. फाइल का नाम दें और डेटा हासिल करने के लिए स्टार्ट लाइन्सकैन (ओं) पर क्लिक करें।

4. छवि विश्लेषण

  1. कैल्शियम मूवी विश्लेषण।
    नोट: यह प्रोटोकॉल स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के लिए चरणों को रेखांकित करता है (अंक 2) और मैनुअल, हाथ से चयनित आरओआई का उपयोग करके एनशिथिंग पेरिसाइट कैल्शियम की घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए दो अलग-अलग तरीके (अंक 3) और स्वचालित, गतिविधि आधारित आरओआई चयन (अंक 4)16,17. प्रत्येक आरओआई से सामान्यीकृत कैल्शियम ट्रेस के साथ सिग्नल चोटियों का पता लगाने और वर्गीकृत करने के लिए, डेटा लंबे समय तक पास और बैंड-पास फ़िल्टर किया जाता है जो आयाम और चौड़ाई अनुमानों के लिए डेटा को चिकनी करने में मदद करता है और विभिन्न आकृतियों की चोटियों की पहचान करने में भी मदद करता है: एकल चोटियों, बहु-चोटियों, और पठारों (चित्रा 3B). इस विश्लेषण के लिए मापदंडों को विभिन्न प्रकार के गतिशील सेलुलर संकेतों का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। नीचे दिए गए चरणों में छवि प्रसंस्करण पैकेज के साथ छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर और प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग की आवश्यकता होगी जिसमें ऊपर उल्लिखित कैल्शियम फिल्मों का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न कोड होते हैं। कृपया इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कार्यक्रमों और पैकेजों की पूरी सूची के लिए सामग्री तालिका देखें। छवियों से मेटाडेटा को बनाए रखने वाले इन पैकेजों के साथ विभिन्न प्रकार के माइक्रोस्कोप से इमेजिंग डेटा आयात किया जा सकता है।
    नोट: चरण 4.1.1-4.1.7 मैनुअल कैल्शियम विश्लेषण विधि (चरण 4.1.16) में बाद के उपयोग के लिए छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में हाथ से आरओआई का चयन करने का वर्णन कैसे करें
    1. .xml फाइल को सॉफ्टवेयर टूल बार में खींचकर इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में कैल्शियम इमेजिंग टी सीरीज लोड करें। ओके बॉक्स पर क्लिक करें।
    2. स्टैक का औसत लें (स्टैक का औसत इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर द्वारा"जेड प्रोजेक्शन"के रूप में लेबल किया गया है)। यह किया जा सकता है इमेज | पर क्लिक करके ढेर | उपकरण बार में जेड प्रक्षेपण।
    3. चरण 3.3.9 में दोनों चैनलों से एक रंगीन छवि बनाएं।
    4. बॉक्स विश्लेषण | में क्लिक करके आरओआई प्रबंधक खिड़की खोलें उपकरण | आरओआई प्रबंधक,या बस कीबोर्ड में पत्र"टी"दबाएं।
    5. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर टूल बार पर पॉलीगॉन आकार पर क्लिक करके बहुभुज उपकरण का चयन करें और सोमा और प्रक्रियाओं जैसे दृश्यमान एनशिथिंग पेरिसाइट संरचनाओं को रेखांकित करें।
    6. आरओआई मैनेजर विंडो में स्थित ऐड बटन पर क्लिक करें आरओआई मैनेजर में चयनित आरओआई को जोड़ने के लिए।
    7. ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र को नाम बदलने वाले बटन पर क्लिक करके एक अनूठा नाम दें और उन्हें एक ज़िप फ़ोल्डर के रूप में सहेजें जिसे बाद में प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर में अधिक क्लिक करके लोड किया जा सकता है>> | बचाओ।
      नोट: चरण 4.1.8-4.1.14 का वर्णन है कि प्रोग्रामिंग प्लेटफॉर्म में कैल्शियम टी-सीरीज को कैसे आयात किया जाए और माइक्रोस्कोप पीएमटीएस द्वारा विभिन्न चैनलों(चित्रा 2)में पाए गए विभिन्न फ्लोरोफोरस को कैसे अनमिक्स किया जाए।
    8. प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर खोलें और सुनिश्चित करें कि छवि प्रसंस्करण पैकेज के लिए फ़ोल्डर पथ पर हैं (सामग्री की तालिकादेखें)।
    9. प्रोग्रामिंग प्लेटफॉर्म कमांड विंडो में बायोफॉर्मट्स फंक्शन को कॉल करके कैल्शियम टी-सीरीज को प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर में इम्पोर्ट करें, जो अपने आप फाइल सेलेक्शन विंडो खोलता है ।
    10. वांछित संख्या दर्ज करके प्रत्येक चैनल पर क्या है, इसे परिभाषित करें। इस उदाहरण डेटा में, चैनल 1 उत्तर =6 (cellular_signal), चैनल 2 उत्तर =1 (blood_plasma)।
    11. प्लॉट फ़ंक्शन कॉल करके दृश्य की सुविधा के लिए प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर के भीतर एक फिल्म के रूप में डेटा प्लॉट करें।
    12. फ्लोरोसेइन-डेक्सट्रान से हरे रंग की फ्लोरेसेंस को हटाने के लिए जो लाल आरकेएमपी चैनल में खून बहता है, प्रोग्रामिंग प्लेटफॉर्म कमांड विंडो में unmix_chs फ़ंक्शन को कॉल करके इमेज प्रोसेसिंग पैकेज में चैनलों को अनमिक्स करता है।
    13. एक ऐसे क्षेत्र का चयन करें जिसमें केवल चैनल 1 में इस फ्लोरोफोर से फ्लोरेसेंस हो, जैसे कि इस मामले में RCaMP।
    14. एक ऐसे क्षेत्र का चयन करें जिसमें केवल फ्लोरोफोर 2 से फ्लोरेसेंस होता है, जैसे कि इस उदाहरण में रक्त प्लाज्मा में फ्लोरोसेसिन।
    15. एक पृष्ठभूमि क्षेत्र का चयन करें जिसमें फ्लोरोफोर से फ्लोरेसेंस नहीं है। यह एक स्पेक्ट्रल योगदान मैट्रिक्स उत्पन्न करता है जो प्रत्येक चैनल में प्रत्येक पिक्सेल पर लागू होता है। यह आरसीएएमपी सिग्नल के स्थानीयकरण में काफी सुधार करता है जो इन संरचनाओं में कैल्शियम की घटनाओं का पता लगाने में वृद्धि करेगा।
      नोट: जैसा कि ऊपर बताया गया है, कई तरीके हैं कि कैल्शियम इमेजिंग डेटा का विश्लेषण इमेज प्रोसेसिंग पैकेज के भीतर किया जा सकता है। चरण 4.1.16-4.1.23 मैनुअल, हाथ से चयनित आरओआई का उपयोग करके एनशिथिंग पेरिसाइट कैल्शियम घटनाओं का विश्लेषण करने की विधि का वर्णन करते हैं।
    16. प्रोग्रामिंग प्लेटफॉर्म कमांड विंडो में सेलस्कैन फंक्शन को कॉल करके अनमिक्स कैल्शियम मूवी पर सेलुलर सिग्नलिंग एनालिसिस चलाएं।
    17. कोड पूछेगा "आप किस आरओआई डिटेक्शन विधि का उपयोग करना चाहेंगे?"। हाथ से चयनित आरओआई को प्रोग्रामिंग प्लेटफॉर्म पर लोड करने के लिए नंबर 2 टाइप करें।
    18. जिप फ़ोल्डर से ब्याज के क्षेत्रों को लोड करें जिन्हें पहले हाथ से पेरिसाइट्स से चुना गया था (चरण 4.1.6)।
    19. कोड पूछेगा "स्केल फैक्टर क्या है?"। छवि श्रृंखला का विश्लेषण किया जा रहा है और पैमाने की संख्या टाइप करने के सापेक्ष हाथ से चयनित ROIs के लिए पैमाने कारक का निर्धारण करें । इस उदाहरण में, स्केल फैक्टर 1 है क्योंकि आरओआई को आकार देने की आवश्यकता नहीं है क्योंकि उन्हें 128x128 पिक्सल वाली छवियों पर चुना गया था, मूल कैल्शियम फिल्म के समान संकल्प।
    20. प्रत्येक आरओआई के भूखंड और सामान्यीकृत कैल्शियम ट्रेस को कमांड विंडो में प्रक्रिया और प्लॉट कार्यों को कॉल करके विभिन्न रंगों(चित्रा 3 ए)में उत्पन्न करें।
    21. यदि कोड व्यक्तिगत निशान में कैल्शियम की घटनाओं के बहुमत का पता नहीं लगाता है, तो opt_config फ़ंक्शन को कॉल करके और मूल्यों को समायोजित करके विन्यास अनुकूलन बॉक्स के भीतर अंतर्निहित मापदंडों को संशोधित करें, जैसे कि कम-पास फ़िल्टर किए गए डेटा के लिए सीमा को कम करना बेसलाइन अवधि के मानक विचलन से तीन गुना तक, जो टी-सीरीज का पहला 30 फ्रेम है।
    22. नए मापदंडों को लागू करने के लिए अनुकूलन बॉक्स में प्रक्रिया बटन का चयन करें।
      नोट: संकेतों का पता लगाने और वर्गीकृत करने के लिए, सामान्यीकृत कैल्शियम ट्रेस लंबे पास और बैंड पास फ़िल्टर किया जाता है, जो आयाम और चौड़ाई अनुमानों के लिए डेटा को सुचारू करने में मदद करता है, लेकिन यह भी निर्धारित करने के लिए कि सिग्नल एकल चोटियों, बहु-चोटियों या पठार(चित्रा 3B)हैं या नहीं।
    23. डेटा को एक .csv फ़ाइल के रूप में आउटपुट करें जिसमें ब्याज के क्षेत्रों और उन चोटियों के बारे में स्थानिक जानकारी होती है जिन्हें कमांड विंडो में output_data फ़ंक्शन कॉल करके पहचाना गया था। एक सांख्यिकी कार्यक्रम में आगे के विश्लेषण के लिए फ़ाइल को एक अनूठा नाम दें।
      नोट: चरण 4.1.24-4.1.31 गतिविधि आधारित आरओआई के विश्लेषण का उपयोग करके एनशिथिंग पेरिसाइट कैल्शियम की घटनाओं का विश्लेषण करने की विधि का वर्णन करते हैं।
    24. कैल्शियम फिल्म आयात करने, चैनलों को अनमिक्स करने और प्रोग्रामिंग प्लेटफॉर्म में सेलस्कैन फ़ंक्शन को कॉल करने के लिए चरण 4.1.8.-4.1.16 दोहराएं।
    25. कोड पूछेगा "आप किस आरओआई डिटेक्शन विधि का उपयोग करना चाहेंगे?"। गतिविधि के आधार पर ब्याज पहचान के स्वचालित क्षेत्र का चयन करने के लिए 6 नंबर टाइप करें और 3 आयामों (x, y, और समय) में फ्लोरेसेंस में परिवर्तन; "3डी FLIKA एल्गोरिथ्म")।
    26. कमांड विंडो में प्रक्रिया और प्लॉट कार्यों को कॉल करके ब्याज के चिन्हित क्षेत्रों को विभिन्न रंगों के रूप में देखने के लिए संसाधित परिणामों को प्लॉट करें। प्रत्येक आरओआई को समय और स्थान में प्रतिष्ठित किया जाता है और इसे ओवरले किए गए मास्क(चित्रा 4)के रूप में दर्शाया जाता है।
    27. यदि एल्गोरिदम आरओआई का पता नहीं लगाता है जो आंखों से स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं, तो opt_config फ़ंक्शन को कॉल करके और मूल्यों को समायोजित करके अनुकूलन बॉक्स के भीतर अंतर्निहित मापदंडों को संशोधित करें, जैसे कि समय में डेटा को स्मूद करने वाले गॉसियन फ़िल्टर को बढ़ाना (2 एस द्वारा) और आरओआई को बेसलाइन के मानक विचलन से 3 गुना तक खोजने की सीमा कम करना।
    28. नए मापदंडों को लागू करने के लिए अनुकूलन बॉक्स में प्रक्रिया बटन का चयन करें। अनुकूलन प्रक्रिया के साथ अधिक आरओआई की पहचान की जानी चाहिए(चित्रा 4B)।
    29. आगे के दृश्य के लिए अनुकूलन खिड़की के भीतर फिल्म के लिए डिफ़ॉल्ट बॉक्स के मोड को बदलकर गतिविधि के क्षेत्रों (इंद्रधनुष रंगों में उल्लिखित) की स्पष्ट रूप से पहचान करने के लिए आरओआई को एक फिल्म के रूप में प्लॉट करें।
    30. कमांड विंडो में output_data फ़ंक्शन को कॉल करके डेटा को सीएसवी फाइल के रूप में आउटपुट करें। इस फ़ाइल का विश्लेषण सांख्यिकी कार्यक्रम में आगे किया जा सकता है।
      नोट: विश्लेषण मापदंडों को किसी भी प्रकार के गतिशील सेलुलर सिग्नल (कैल्शियम, FRET अनुपात, आदि) को फिट करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। एक ही सेटिंग्स के साथ कई कैल्शियम फिल्मों को संसाधित करने के लिए ऊपर दिए गए सभी चरणों को सरल प्रोग्रामिंग कोड के साथ स्वचालित किया जा सकता है।
  2. लाइन रक्त प्रवाह विश्लेषण स्कैन।
    1. सेक्शन 3.5 में अधिग्रहीत लाइन स्कैन काइमोग्राफ डेटा फाइल को प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर में आयात करें।
    2. कोड पूछेगा "चैनल 1 और 2 पर क्या दिखाया गया है?"। जब संकेत दिया जाता है तो प्रत्येक चैनल पर क्या है, इसे परिभाषित करें। इस उदाहरण में, चैनल 1 खाली है (टाइप 0)और चैनल 2 blood_plasma (टाइप 1)है।
    3. लाइनस्कैंडिम फ़ंक्शन को कॉल करके लाइन स्कैन पर व्यास विश्लेषण फ़ंक्शन चलाएं, जो उस क्षेत्र का चयन करने के लिए एक बॉक्स खोलता है जो किमोग्राफ(चित्रा 5B,बाएं)में व्यास से मेल खाता है।
    4. कामोग्राफ फ्लोरेसेंस सीमाओं के बाहर एक बॉक्स ड्रा करें जो पोत व्यास से मेल खाती है।
    5. इस डेटा वर्ग को कॉल करके प्रक्रिया फ़ंक्शन को संसाधित करें ताकि पोत व्यास के लिए आधी अधिकतमा पर पूर्ण चौड़ाई माप सके और प्लॉट फ़ंक्शन के साथ एक भूखंड(चित्रा 5सी)उत्पन्न किया जा सके।
    6. कमांड विंडो में output_data फ़ंक्शन को कॉल करके डेटा को सीएसवी फाइल के रूप में आउटपुट करें। इस फ़ाइल का विश्लेषण सांख्यिकी कार्यक्रम में आगे किया जा सकता है।
    7. लाइनस्कैनवेल फ़ंक्शन को कॉल करके वेग राडॉन परिवर्तन विश्लेषण चलाएं, जो उस क्षेत्र का चयन करने के लिए एक बॉक्स खोलता है जो किग्राफ(चित्रा 5B,दाएं)में आरबीसी वेग से मेल खाता है।
    8. काइमोग्राफ फ्लोरेसेंस की सीमा के अंदर एक बॉक्स ड्रा करें जो पोत वेग से मेल खाती है।
    9. फ्लोरेसेंस में धारियाँ के कोण से लाल रक्त कोशिकाओं के वेग, प्रवाह और रैखिक घनत्व की गणना करने के लिए प्रक्रिया फ़ंक्शन को कॉल करके इस डेटा वर्ग को संसाधित करें। प्लॉट फ़ंक्शन के साथ एक प्लॉट (चित्रा 5D)उत्पन्न करें।
    10. कमांड विंडो में output_data फ़ंक्शन को कॉल करके डेटा को सीएसवी फाइल के रूप में आउटपुट करें। इस फ़ाइल का विश्लेषण सांख्यिकी कार्यक्रम में आगे किया जा सकता है।
      नोट: kymographs व्यास और वेग विश्लेषण के लिए आदेश में काले रिक्त स्थान के बीच अच्छी तरह से परिभाषित किनारों के साथ स्पष्ट फ्लोरेसेंस होना चाहिए सही(चित्रा 5A,बी)। ऑर्थोगोनल और पैरलल लाइनों को सटीक तरीके से खींचना बहुत जरूरी है, अन्यथा कामोग्राफ का विश्वसनीय विश्लेषण संभव नहीं होगा। छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के साथ कैल्शियम विश्लेषण के समान, व्यास और वेग गणना के मापदंडों को अनुकूलित किया जा सकता है।

Representative Results

फ्लोरोसीन-डेक्सट्रान में एक व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है जो लाल चैनल में खून ला सकता है, जो पेरिसाइट्स(चित्रा 2 ए)को एनशिथिंग में RCaMP का पता लगाने को प्रभावित करता है। सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में डेटा अधिग्रहण के बाद स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग फ्लोरोसेइन रक्तस्राव को कम करता है(चित्रा 2 B,कम), बाद के विश्लेषण चरणों में कैल्शियम सिग्नल डिटेक्शन को बढ़ाना।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के साथ कैल्शियम विश्लेषण आरओआई और इंट्रासेलुलर कैल्शियम के उतार-चढ़ाव (यानी कैल्शियम संकेतों) की पहचान करने के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोणों की अनुमति देता है। हाथ से सेलुलर संरचनाओं का चयन इन क्षेत्रों के भीतर कैल्शियम के उतार-चढ़ाव का पता लगाने की अनुमतिदेता है (चित्रा 3 ए),जिसमें विभिन्न प्रकार के सिग्नल चोटियां शामिल हैं, जैसे कि एकल चोटियों और बहु-चोटियों, सामान्यीकृत कैल्शियम के निशान कम पास और बैंड-पास फ़िल्टर(चित्रा 3B)हैं। इसके अतिरिक्त, आरओआई की पहचान सक्रिय पिक्सेल को एक साथ समूहित करके की जाती है जहां एलेफेन एट अल द्वारा विकसित इमेज प्रोसेसिंग एल्गोरिदम का उपयोग करके समय के साथ फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन होता है। 201416 और बैरेट एट अल 201817 (चित्रा 4)। यह संकेत के अपेक्षित आकार और आकार को शामिल करने के लिए समय, सीमा और स्थानिक मापदंडों को समायोजित करके किसी भी गतिशील सेलुलर सिग्नल पर लागू किया जा सकता है। सिग्नल पहचान के लिए सीमा कम करने से ब्याज के अधिक क्षेत्र(चित्रा 4B) मिलते हैं।

एमिटेटिंग पेरिसाइट्स(चित्रा 5 ए,बी)के पास रक्त वाहिकाओं में व्यास और आरबीसी वेग को मापने के लिए उज्ज्वल और स्पष्ट हीमोडायनामिक कामोग्राफ का विश्लेषण किया जा सकता है। व्यास की गणना पूर्ण चौड़ाई से फ्लोरेसेंस(चित्रा 5C)के आधे अधिकतम पर की जाती है। आरबीसी वेग अवेलेबल आरबीसी से बनी धारियों से अनुमानित होता है, जहां कोण वेग, प्रवाह (कोशिकाओं/एस) और रैखिक घनत्व (कोशिकाओं/मिमी) की गणना करने के लिए एक राडॉन परिवर्तन में इनपुट है; चित्रा 5D)। खराब गुणवत्ता वाले केमोग्राफ जहां फ्लोरेसेंस संतृप्ति है, शोर अनुपात या इमेजिंग फील्ड के आंदोलन के लिए खराब संकेत(चित्रा 6 ए)त्रुटि बिंदुओं (रेड क्रॉस) के साथ अविश्वसनीय भूखंड बनाता है जहां डेटा निर्धारित नहीं किया जा सकता है(चित्रा 6B,सी)। अधिग्रहीत डेटा की गुणवत्ता एक अच्छे परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है और इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों का पालन अच्छे परिणाम सुनिश्चित करता है।

Figure 1
चित्रा 1। प्रोटोकॉल का सारांश। प्रोटोकॉल मस्तिष्क ensheathing pericytes और एनेस्थेटाइज्ड चूहों में पास के रक्त वाहिकाओं से रक्त प्रवाह डेटा से फ्लोरोसेंट कैल्शियम छवियों को प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए कदम प्रस्तुत करता है । प्रोटोकॉल को 4 चरणों में विभाजित किया गया है। 1) प्रक्रिया तैयारी: उपकरण और कैथेटर तैयारी की स्थापना; 2) पूंछ नस इंजेक्शन; 3) दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा डेटा अधिग्रहण; 4) छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के साथ डेटा विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। फ्लूरोफोरस का स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग। ए) RCaMP ensheathing pericyte और फ्लोरोसेइन-डेक्सट्रान की प्रतिनिधि औसत छवि एक टी श्रृंखला अधिग्रहण से रक्त वाहिका लेबल । स्केल बार = 10 μm.B) ऊपरी: जब व्यक्तिगत चैनलों पर विचार, चैनल 2 से खून के माध्यम से चैनल 1 (बाएं) में स्पष्ट है । लोअर: स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के बाद, खून-थ्र-थ्र कम हो जाता है और आरसीएमपी से सिग्नल पेरिसाइट संरचना में अधिक प्रमुख है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। हाथ से चयनित आरओआई और अनुकूलित कैल्शियम के निशान। ए) इस्तेमाल किए गए इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (इंद्रधनुष आकार) में चुने गए ब्याज के क्षेत्रों का उपयोग कैल्शियम सिग्नल निशान की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। ख) सामान्यीकृत निशान से सिग्नल चोटियों की पहचान कम पास और बैंड पास डेटा को फ़िल्टर करने से की जाती है । हमने सिग्नल सीमा को बेसलाइन अवधि (पहले 30 फ्रेम) के मानक विचलन के रूप में परिभाषित किया और इस सीमा पर किसी भी चोटियों को सिग्नल (लोअर ट्रेस) माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। कैल्शियम विश्लेषण के लिए स्वचालित, गतिविधि आधारित आरओआई। एक ही डेटा बेसलाइन (ए) के मानक विचलन 7 गुना और बेसलाइन (बी) के मानक विचलन के 3 गुना की दहलीज के साथ विश्लेषण किया गया था । सक्रिय पिक्सेल की पहचान करने के लिए सीमा को कम करने से पेरिसाइट्स के भीतर अधिक आरओआई (बी) और सिग्नल चोटियों (पाई चार्ट) मिलते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। कामोग्राफ हीमोडायनामिक माप। A) उदाहरण लाइन पोत के माध्यम से स्कैन । ख) व्यास (बाएं) और वेग (दाएं) के लिए अच्छी तरह से परिभाषित kymographs का उदाहरण । फ्लोरेसेंस के दाहिने बैंड के भीतर काली धारियाँ स्पष्ट वासोमोशन उतार-चढ़ाव के साथ आरबीसी.C) व्यास विश्लेषण के अनुरूप हैं। घ) वाई एक्सिस के लिए भूखंडों के साथ वेग विश्लेषण = आरबीसी फ्लक्स (कोशिकाएं/एस), लाइन घनत्व (कोशिका/मिमी), वेग (मिमी/एस), और लकीर कोण (डिग्री), शोर अनुपात के लिए संकेत (मनमाने ढंग से इकाइयों, a.u.), एक्स अक्ष = समय (सेकंड) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6। खराब गुणवत्ता वाले हेमोडायनामिक मापों का प्रतिनिधित्व। ए) फ्लोरेसेंस संतृप्ति के साथ खराब गुणवत्ता वाले केमोग्राफ, शोर अनुपात के लिए खराब संकेत, या अधिग्रहण के दौरान इमेजिंग क्षेत्र की आवाजाही के उदाहरण । बी और सी) व्यास और वेग डेटा के चित्रा 7 के समान भूखंड जिनमें किमोग्राफ की खराब गुणवत्ता के कारण त्रुटि अंक (लाल बिंदु) होते हैं। (छवि ई, वाई एक्सिस = व्यास (μm), एक्स अक्ष = समय (सेकंड); छवि एफ, वाई एक्सिस = आरबीसी फ्लक्स (कोशिकाएं/एस), लाइन घनत्व (कोशिकाएं/मिमी), वेग (मिमी/एस), और लकीर कोण (डिग्री), शोर अनुपात (a.u.), एक्स अक्ष = समय (सेकंड) के लिए संकेत । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

वर्तमान विधि एक कैथेटर के साथ माउस पूंछ नस इंजेक्शन पर विवरण प्रदान करता है, गहराई के ढेर के लिए दो फोटॉन माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण, सेल कैल्शियम सिग्नलिंग फिल्में, हीमोडायनामिक कायनोग्राफ का निर्माण, और कैल्शियम और हमारे छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम17 (चित्रा 1)के साथ हीमोडायनामिक विश्लेषण। इन तकनीकों के कई फायदे हैं जो वीवो इमेजिंग परिणाम में सुधार करते हैं और सत्र के दौरान समय, संसाधनों और पशु तनाव को कम करते हैं। सबसे पहले, पूंछ नस इंजेक्शन के लिए कैथेटर का उपयोग सुई, सिरिंज और माउस के परिसंचरण में इंजेक्शन पदार्थ की मात्रा पर अधिक नियंत्रण प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, यह पूंछ के ऊतकों में डाई इंजेक्शन को रोकता है, महंगे अभिकर् स की बचत करता है। दूसरा, हम ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करते हैं जो आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर को एनशेथिंग पेरिसाइट्स में व्यक्त करते हैं और यह प्रदर्शित करते हैं कि मस्तिष्क संवहनी नेटवर्क के भीतर उन्हें गहराई जेड-स्टैक के साथ कैसे स्थानीयकृत किया जाए, जो बाद के इमेजिंग सत्रों में लंबे समय तक सेल पहचान और स्थानांतरण की सुविधा प्रदान करता है। यह पेरिसाइट अध्ययन में एक महत्वपूर्ण कारक है और उचित कोशिका वर्गीकरण सुनिश्चित करता है6,7. तीसरा, हम कैल्शियम फिल्मों और हेमोडायनामिक लाइन स्कैन डेटा एकत्र करने के लिए अपने पैरामीटर प्रदान करते हैं जो गतिशील सेलुलर संकेतों को मापने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। अंत में, हम अपनी छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम17,एक व्यापक छवि प्रसंस्करण टूलबॉक्स प्रस्तुत करते हैं जिसमें छवि पूर्व-प्रसंस्करण (जैसे स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग), कैल्शियम छवि विश्लेषण, और हीमोडायनामिक विश्लेषण (व्यास, वेग, आदि) के लिए कई दृष्टिकोण शामिल हैं। ये एल्गोरिदम परिणामों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक उपयोगकर्ता विशेषज्ञता के स्तर को कम करते हुए डेटा के त्वरित और आसान दृश्य के लिए भूखंड उत्पन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, इसे कोड की कुछ लाइनों के साथ स्वचालित किया जा सकता है ताकि एक ही पैरामीटर के साथ कई डेटासेट को जल्दी से बैच किया जा सके। यह संभावित रूप से डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और शोधकर्ता के समय निवेश में सुधार कर सकता है।

अच्छा कैल्शियम इमेजिंग डेटा इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण स्पष्ट फ्लोरेसेंस सिग्नल अधिग्रहण के लिए लेजर पावर और पीएमटी सेटिंग्स को समायोजित करना है, लेकिन पूरे कैल्शियम इवेंट को कैप्चर करने के लिए पर्याप्त फ्रेम दर पर डेटा एकत्र करना भी है। इस प्रोटोकॉल में डेटा प्रति सेकंड 10-11 फ्रेम पर प्राप्त किया गया था, जो पेरिसाइट्स को एनशिथिंग में धीमी कैल्शियम दोलनों को कैप्चर करता है। विश्लेषण के दौरान कई कदम भी हैं जो विश्लेषण परिणाम में सुधार कर सकते हैं। सबसे पहले, यदि फ्लोरोफोरस(चित्रा 2)के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच महत्वपूर्ण ओवरलैप होता है तो स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग फायदेमंद है। फ्लोरोसेसिन-डेक्सट्रान का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया गया था क्योंकि यह एक लागत प्रभावी और वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध डेक्सट्रान कंजूगेट है जिसका उपयोग आमतौर पर हीमोडायनामिक माप 5 के लिए कियाजाताहै। स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग कैल्शियम संकेतों का बेहतर पता लगाने के लिए डेटा को साफ करने में मदद करता है, लेकिन संकरा उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ वैकल्पिक फ्लोरोफोरस का भी उपयोग किया जा सकता है। दूसरा, आरओआई(चित्रा 3)के रूप में सेलुलर संरचनाओं का चयन करना सोमा या प्रक्रिया शाखाओं जैसे विभिन्न उप-सेलुलर क्षेत्रों में कैल्शियम की घटनाओं को वर्गीकृत करने के लिए उपयोगी है। गतिविधि आधारित आरओआई चयन(चित्रा 4)16 व्यक्तिगत कैल्शियम घटनाओं के बारे में अधिक स्थानिक और लौकिक जानकारी प्रदान करता है। किसी दिए गए क्षेत्र में कैल्शियम की घटनाओं की आवृत्ति या अन्य सेलुलर क्षेत्रों में घटनाओं के प्रचार का निर्धारण करते समय यह सहायक हो सकता है। इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग शोधकर्ताओं को घंटों समय बचा सकता है जब डेटा बैच-प्रोसेस्ड होता है, लेकिन इष्टतम परिणामों के मापदंडों को समायोजित करने के लिए कुछ प्रारंभिक समय निवेश की आवश्यकता होती है। सबसे महत्वपूर्ण कारक सक्रिय क्षेत्र के अपेक्षित आकार(माइक्रोन 2में) के साथ-साथ सिग्नल की अवधि (न्यूनतम सिग्नल समय और अधिकतम सिग्नल समय परिभाषित किया जाना चाहिए) हैं। शोधकर्ताओं ने कुछ उदाहरण टी श्रृंखला फिल्मों की जांच करने के लिए सबसे अच्छा निर्धारित करने के लिए जो मापदंडों उनके डेटा फिट चाहिए । अंत में, माइक्रोस्कोप पर प्राप्त खराब गुणवत्ता वाले डेटा कैल्शियम और हीमोडायनामिक्स(चित्र 6)के विश्लेषण में काफी बाधा डाल सकते हैं। इसलिए, शुरुआत में माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इन कारकों को ध्यान में रखते हुए, यह प्रोटोकॉल जिसे अन्य ऊतकों या सेल प्रकारों में कैल्शियम इमेजिंग या अन्य गतिशील सेलुलर संकेतों (जैसे, फ्लोरोसेंट सोडियम, पोटेशियम, मेटाबोलाइट, या वोल्टेज में उतार-चढ़ाव) के विश्लेषण को फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल की कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, डेटा संज्ञाहरण के तहत एकत्र किया जाता है, जो मस्तिष्क गतिविधि को प्रभावित करता है और रक्त प्रवाह को प्रभावित कर सकता है । इसी तरह इमेजिंग जाग चूहों में किया जा सकता है कि अधिक शारीरिक परिणामों के लिए सिर निर्धारण स्वीकार करने के लिए प्रशिक्षित किया जाता है । इसके अतिरिक्त, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि हम वीवो में3-आयामी कोशिका और रक्त वाहिका की 2-आयामी छवियों को इकट्ठा करते हैं। इसलिए, हम केवल इन कोशिकाओं के भीतर कैल्शियम की घटनाओं के एक गुट या एक समय में रक्त वाहिका के एक वर्ग में रक्त प्रवाह पर कब्जा कर सकते हैं ।

ध्यान देने की एक और सीमा यह है कि दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग गति कलाकृतियों के प्रति संवेदनशील है, जहां फोकल विमान में और बाहर आंदोलन कैल्शियम के उतार-चढ़ाव के लिए गलत हो सकता है। यह प्रोटोकॉल संज्ञाहरण के तहत किया गया था, जो जानवर के आंदोलन को सीमित करता है; हालांकि, गति कलाकृतियों को माउस की श्वास दर, हृदय गति, संभावित ऊतक सूजन, और एनशिथिंग पेरिसाइट्स, पोत संकुचन या वासोमोशन 4, 6,18,19के मामले में पेश किया जा सकता है। मोशन कलाकृतियों को कई रणनीतियों द्वारा कम किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले छवि प्रसंस्करण पैकेजों में एक वैकल्पिक गति सुधार चरण शामिल है, जो दृश्यमान वाक्यूलेचर13, 17के आधार पर टी-श्रृंखला के भीतर छवियों को संरेखित करने के लिए 2डी कन्वोोल्यूशन इंजन का उपयोग करता है। फोकल विमान में महत्वपूर्ण परिवर्तन वाले फ्रेम इस एल्गोरिदम द्वारा पहचाने जाते हैं और विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इमेजिंग प्रोसेसिंग पैकेजों के भीतर सांख्यिकीय रणनीतियों का उपयोग करना संभव है, जैसे कि एक जेड-स्कोर जब आंदोलन को सामान्य बनाने के लिए फ्लोरेसेंस निशान उत्पन्न करते हैं कैल्शियम के उतार-चढ़ाव20प्रेरित होते हैं। दो फोटॉन इमेजिंग में गति कलाकृतियों के लिए खाते में सबसे मजबूत दृष्टिकोण एक ही कोशिका के भीतर दो फ्लोरोसेंट संकेतकों की अभिव्यक्ति को जोड़ना है, जैसे कैल्शियम संकेतक (जैसे, जीसीएएमपी) और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (जैसे, एमसीएचरी) जो कैल्शियम-स्वतंत्र है। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर में उतार-चढ़ाव को तब आंदोलन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है और गति कलाकृतियों को सामान्य बनाने के लिए कैल्शियम संकेतक संकेत से घटाया जाता है।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य वीवो में इष्टतम कैल्शियम इमेजिंग और रक्त प्रवाह डेटा एकत्र करने और नए तरीकों और विश्लेषण उपकरणों को पेश करने के तरीके की स्पष्ट समझ प्रदान करना है जिन्हें शोधकर्ता अपने परिणामों में सुधार करने के लिए लागू कर सकते हैं। इन तकनीकों को रक्त प्रवाह नियंत्रण में या विभिन्न मस्तिष्क रोग राज्यों में विभिन्न पेरिसाइट्स आबादी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। इन इमेजिंग मापदंडों का उपयोग अन्य कोशिका प्रकारों और अंग प्रणालियों में कैल्शियम और रक्त प्रवाह का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है और इसी तरह के सिद्धांत अन्य गतिशील इमेजिंग तकनीकों पर लागू होते हैं जो कैल्शियम से परे अन्य आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर द्वारा संभव बनाए जाते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

जे मेज़ा को मिटेक्स और रिसर्च मैनिटोबा से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है। इस काम के लिए फंडिंग कनाडा के इंस्टीट्यूट्स फॉर हेल्थ रिसर्च, रिसर्च मैनिटोबा, मैनिटोबा मेडिकल सर्विस फाउंडेशन, यूनिवर्सिटी ऑफ मैनिटोबा और ब्रेन कनाडा से कनाडा ब्रेन रिसर्च फंड के जरिए स्टार्ट-अप फंडिंग, हेल्थ कनाडा और अज्रिली फाउंडेशन की वित्तीय मदद से प्रदान की गई । यहां व्यक्त किए गए विचार स्वास्थ्य मंत्री या कनाडा सरकार के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acta2-RCaMP1.07 The Jackson Laboratory 28345 In the video protocol the animal model used is a female mouse  of  10 months, 1 day old.
Applicators (Regular) Bisco X-80250P
BioFormats package for MATLAB NA NA Denominated in this protocol as "image processing packages".  Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/
CHIPS MATLAB toolbox NA NA Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS
Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity HealthCare Plus UGC250
Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic Thermo Fisher Scientific D1823
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral Thermo Fisher Scientific D1830
Eye Lube Plus Optixcare NA
FIJI Image J NA Denominated in this protocol as "image processor software".  Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GCaMP6sfl/fl The Jackson Laboratory
Head Post fixing platform University of Zurich NA
Ketamine (Narketan 100 mg/mL) Vetoquinol 440893
MATLAB R2020b NA Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/
Needle 0.3mmx25mm BD PrecisionGlide 305128
Objective XLUMPLFLN20XW Olympus NA https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/
PDGFRβ-CreERT2 The Jackson Laboratory 30201
Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) BD Intramedic 427401
Prairie View Bruker Fluorescence Microscopy NA https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Ultima In Vitro Multiphoton Microscope Bruker Fluorescence Microscopy NA https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Under Tank Heater Reptitherm U.T.H E169064
Xylazine (Rompun 20 mg/mL) Bayer HealthCare 2169592

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 177
<em>वीवो</em> में ट्रांसजेनिक चूहों में ब्रेन पेरिसाइट कैल्शियम और हेमोडायनामिक इमेजिंग
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Meza-Resillas, J., Ahmadpour, N.,… More

Meza-Resillas, J., Ahmadpour, N., Stobart, M., Stobart, J. Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo. J. Vis. Exp. (177), e62725, doi:10.3791/62725 (2021).

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