Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hjernen pericyte kalsium og hemodynamisk avbildning i transgene mus i Vivo

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62725
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1College of Pharmacy, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen presenterer trinn for å skaffe og analysere fluorescerende kalsiumbilder fra hjernen som omkranser pericytter og blodstrømsdata fra nærliggende blodkar i bedøvede mus. Disse teknikkene er nyttige for studier av veggmalericellefysiologi og kan tilpasses for å undersøke kalsiumtransienter i enhver celletype.

Abstract

Nylige fremskritt innen proteinbiologi og musegenetikk har gjort det mulig å måle intracellulære kalsiumsvingninger i hjerneceller in vivo og å korrelere dette med lokal hemodynamikk. Denne protokollen bruker transgene mus som er utarbeidet med et kronisk kranialvindu og uttrykker den genetisk kodede kalsiumindikatoren, RCaMP1.07, under den α glatte muskel actin-promotoren for å spesifikt merke veggmalericeller, for eksempel vaskulære glatte muskelceller og omsluttende pericytter. Trinn er skissert om hvordan du lager et hale venekateter for intravenøs injeksjon av fluorescerende fargestoffer for å spore blodstrømmen, samt hvordan du måler hjernen pericyte kalsium og lokale blodkar hemodynamikk (diameter, rød blodcellehastighet, etc.) av to fotonmikroskopi in vivo gjennom kranialvinduet i ketamin / xylazine bedøvede mus. Til slutt er det gitt detaljer for analyse av kalsiumsvingninger og blodstrømsfilmer via bildebehandlingsalgoritmene utviklet av Barrett et al. 2018, med vekt på hvordan disse prosessene kan tilpasses andre cellulære bildedata.

Introduction

Sentralnervesystemets vaskulatur består av gjennomtrengende arterioler, kapillærer og stigende venules. Innenfor dette nettverket utvider veggmalericeller som vaskulære glatte muskelceller arterioler og pericytter cellulære prosesser langs de første arteriole grenene og kapillærene1. Pericytter ser ut til å ha flere roller i hjernen, inkludert vedlikehold av blod-hjerne-barrieren1,2, migrasjon og motilitet3, potensielle stamcelleegenskaper og regulering av hjerneblodstrømmen4,5,6. Mange av pericytes funksjonelle roller har vært knyttet til svingninger i intracellulært kalsium som kan regulere utvidelse eller sammentrekning av disse cellene4,5,6.

Flere nyere studier har satt kriterier for å identifisere ulike typer hjernepericytter7,8. Veggmalericeller i de første 4 grenene av gjennomtrengende arterioler er omsluttende pericytter basert på deres uttrykk for det kontraktile proteinet α glatt muskel actin (αSMA) og deres fremspringende, ovoid somata med prosesser som vikler seg rundt kar7,8,9. For å visualisere kalsiumsvingninger i omsluttende pericytter, bruker denne protokollen en ny transgen muselinje, Acta2-RCaMP1.07, også kjent som Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Disse musene uttrykker den røde genetisk kodede kalsiumindikatoren, RCaMP1.07, i αSMA som uttrykker celler (vaskulære glatte muskelceller og ensheathing pericytes). Avlskolonier opprettholdes ved å krysse ikke-carrier dyr med hemizygoter. RCaMP1.07 er et rødt fluorescerende protein med et calmodulinbindingsdomene, noe som øker fluorescensen ved binding til det intracellulærekalsiumet 10,11. Denne protokollen skisserer trinnene for kombinert kalsiumavbildning av omsluttende pericytter og blodstrømsmålinger av to fotonmikroskopi, inkludert prosedyrer for haleveneinjeksjon av fluorescerende fargestoffer, oppkjøp av mikroskopbilder i bedøvede mus og dataanalyse med programmeringsplattformer (figur 1). Disse teknikkene er nyttige for å ta opp spørsmål om veggmalericellefysiologi, men kan tilpasses for å studere kalsiumtransienter i enhver celletype i hjernen eller et annet organsystem.

En 10 måneder gammel kvinnelig Acta2-RCaMP1.07-mus ble brukt til eksperimentet som presenteres i denne artikkelen. Musen gjennomgikk kirurgi for kronisk kranialvindu og hodepostimplantasjon to måneder før. Detaljer for den kirurgiske protokollen er diskutert i tidligere studier12,13 og lignende prosedyrer har blitt utført i andre tidligere publiserte protokoller14,15. Vaskulaturen er merket med grønn fluorescein-Dextran (70 000 MW, anionisk oppløsning, 2,5% m/v) injisert intravenøst. Dette fargestoffet er kostnadseffektivt og lett tilgjengelig fra kommersielle kilder, men det har et bredere utslippsspekter som kan overlappe med RCaMP-utslipp og blø gjennom under oppkjøp av mikroskopbilder. Trinn for spektral unmixing er skissert i avsnitt 4 nedenfor for å omgå dette, men andre grønne fargestoffer med smalere utslippsspektra, som de som er basert på EGFP, kan også brukes.

Protocol

Alle prosedyrene som involverer eksperimentelle dyr skissert nedenfor er godkjent av Animal Care Committee ved University of Manitoba, som styres av Canadian Council on Animal Care.

1. Prosedyreoppsett og forberedelse

MERK: Følgende elementer er nødvendig for en hale vene kateter injeksjon: insulin sprøyter, en 15 cm stykke PE10 rør, 30 G nåler, gasbind, saltvann, tang, grønn fluorescein dextran fargestoff, tang og saks. Ha også en nål klar med ketamin/xylazinbedøvelse som vil bli injisert før bildebehandlingsøkten.

KRITISK: Alle materialer og utstyr i trinn 1 og 2 må steriliseres før bruk ved autoklavering eller skylling med 70 % etanol. Hvis tangene ikke kan steriliseres riktig, anbefales det å bruke et par store nåleholdere. Katetermontering må gjøres med tanger og tanger for å unngå utilsiktet nåle punktering.

  1. Klipp ca 15-20 cm polyetylenrør, PE10 (I.D. 28 mm; O.D. 61 mm).
  2. Fyll en 27 G insulinsprøyte med 0,9% saltvann og liss sprøytens nål inn i spissen av polyetylenrøret. Skyv saltvann gjennom røret, og pass på at det ikke er noen lekkasjer.
  3. Bruk tang til å bøye en 30 G nål (0,3 mm x 25 mm) frem og tilbake til den går i stykker fra navet. Nålen må være ren uten bøyninger.
  4. Hold kanylen med tang, sett nålen forsiktig inn i enden av PE10-slangen som er festet til saltvannsfylt sprøyte og fjern luftbobler. Dette er kateteret for injeksjon.
  5. Filter 30 μL 2,5% (w/v) fluorescein dextran gjennom et 13-25 μm filter før injeksjonen.
  6. Fyll en annen insulinsprøyte med 30 μL aliquot dextran og sørg for at det ikke er bobler i den fylte sprøyten.

2. Hale vene injeksjon

  1. Bedøv musen med isofluran (4% induksjon, 1,5% vedlikehold) eller ketamin/xylazin (60 mg/kg; 10 mg/kg; dvs.) og påfør øyesmøremiddelgel. Ketamin/xylazin anbefales for mer stabile blodstrømsmålinger under avbildning, og dosen kan økes til 90 mg/kg; 10 mg/kg ketamin/xylazin for lengre bildebehandlingsøkter.
  2. Når musen er på det kirurgiske planet av anestesi, legg en hanske fylt med varmt vann på halen for å utvide lateralvenen.
  3. Fjern hansken etter 30 s og rengjør halen med etanol.
  4. Plasser halen mellom tommelen og langfingeren. Gi trykk med pekefingeren på halen for å utvide venen. Med den andre hånden, plukk opp nålen på kateteret med tang som orienterer rammen oppover mot taket.
  5. Etter rengjøring av halen med 70% etanol, jevnt, sett nålen inn i venen i 0 ° vinkel og injiser saltvann forsiktig gjennom kateteret for å sikre at nålen er plassert riktig.
    MERK: Hvis det ikke er motstand på stempelet og ingen hevelse i halen, er nålen i venen. Hvis det er betydelig motstand eller hevelse, bør nålen fjernes. Trinn 2.2-2.5 kan gjentas opptil 3 ganger på hver side av halen, og erstatter 30G-nålen i enden av kateteret hvert sekund prøve til plasseringen er riktig.
  6. Når kanylen er i venen, bytter du saltvannssprøyten på slutten av kateteret med sprøyten som inneholder fluorescein dextran (trinn 1.6). Injiser dekstranen langsomt inn i kateterslangen, slik at ingen bobler kommer inn i røret. Hvis det er en luftboble, kutt slangen som inneholder boblen for å fjerne den og fest sprøyten igjen.
  7. Når all dekstran (30 μL aliquot) er injisert, fjern sprøyten og erstatt den med saltvannssprøyten. Injiser den gjenværende dextranen fra slangen inn i musen til det ikke er noe fargestoff igjen i røret.
  8. Fjern nålen fra halen og gi trykk med gasbind i 10-30 s til blødningen stopper.
    KRITISK: Hvis haleveneinjeksjonen etter 6 forsøk ikke lykkes, bør dyret avbildes i en annen økt. Også det totale volumet (saltvann og dextran) injisert i musen bør ikke overstige 100 μL.

3. To fotonmikroskopi

  1. Fokusere på kranialvinduet
    MERK: Bruk ketamin/xylazinbedøvelse under datainnsamling fordi den har mindre vaskulære effekter (vasodilatasjon) enn isofluran. Hvis du bruker isofluran i trinnene ovenfor, injiser musen med ketamin/xylazin i.p. (anbefalt dose beskrevet ovenfor) før avbildning.
    1. Fest musen med en skrue gjennom hodestolpen til en plattform med en varmepute under mikroskopet.
    2. Påfør øyesmøremiddel på musens øyne.
    3. Rengjør kranialvinduet med fuktige tannapplikatorer. Kontroller at det ikke er noen partikler igjen som kan forstyrre bildebehandlingsprosessen.
    4. Påfør ultralydgel på vinduet.
    5. Fokuser gjennom det to-fotoniske mikroskopmålet til pialblodkarene kan ses under vinduet.
    6. Kontroller musens pust og sørg for at varmeputen gir tilstrekkelig temperaturstøtte.
  2. Bildeanskaffelse
    MERK: Det tofotoniske mikroskopet som brukes i dette eksperimentet har en justerbar Ti-Sapphire-laser for fluorescenseksitasjon med en Pockel-celle som styrer mengden laser som når prøven. Avgitt lys er delt av en 565 lang pass dikroic til to GaAsP photomultiplier rør (PMTs) med 595/50 bånd pass filter (rød) og 525/70 band pass filter (grønn) for deteksjon.
    Prosedyrene som er beskrevet i trinn 3.2 til 3.4, utføres ved hjelp av spesifikk programvare for det tofotoniske mikroskopet fra denne protokollen (se Tabell over materialer). Disse trinnene kan tilpasses annen mikroskopprogramvare og -utstyr.
    1. Når romlysene er slått av, setter du ønsket bølgelengde i mikroskopprogramvaren til 990 nm for å begeistre både RCaMP og fluorescein-dextran ved å klikke på 2-P Laser-boksen.
    2. Still inn lasereffekten ved å klikke på Power/Gain box/Lasers-delen og justere Pockels 1-cellespenningen til 30 % eller en verdi på 300 på en skala fra 1000. Lasereffekten som når prøven ved denne innstillingen, ble tidligere fastslått å være ~ 30 mW.
    3. Sett PMT-detektorens følsomhet ved å klikke på Power / Gain-boksen /PMTs-delen og justere verdien til 700-800.
      MERK: Disse verdiene kan justeres i forhold til intensiteten til fluorescerende prøve og bør settes til null før du slår på lysene i rommet.
    4. Gå til Bildeoppløsning-delen og klikk på oppløsningen 512 x 512 for en større bildestørrelse.
    5. Klikk på 2-P Laser/Open for å åpne 2-P Laser lukkeren.
    6. Gå til Skanneseksjonen og klikk på Live Scan-knappen.
      MERK: Live skanning med disse parametrene og høyere oppløsning, RCaMP positive veggmalericeller og det fluorescerende merkede blodplasmaet kan sees. Hvis signalet er svakt, kan sokkelverdien økes til bildet er klart.
      KRITISK: I overfladiske vevslag bør laserkraften ikke overstige 50 mW, som er ca. 600 i Pockels-celleinnstillingene i dette eksemplet.
  3. Anskaffe en dybdestabel av veggmalericellene og det vaskulære nettverket
    MERK: Anskaffelse av en dybdestabel anbefales å finne pericytter i det vaskulære nettverket på riktig måte. Ensheathing pericytes ligger på første til fjerde grener fra den gjennomtrengende arteriolen7,8,9. Mikroskopprogramvaren som brukes i denne protokollen refererer til dybdestakker som "Z-serien".
    1. Flytte mikroskopmålet i X-, Y- og Z-planet, lokalisere en stor arterie på overflaten av hjernen basert på den glatte muskelcellemerkingen av RCaMP.
    2. Klikk på Z-Series-boksen.
    3. Fokuser på toppen av vevet nær pialfartøyene, sett dette som nullpunkt og toppen av Z-seriestakken ved å klikke på delen Gjeldende Z-serie / Startposisjon [μm]. Klikk på boksen med fire svarte striper og en rød stripe på toppen.
    4. Fokuser ned i vevet til ønsket dybde og sett dette som bunnen av stabelen ved å klikke på den nåværende Z-serien / Stoppposisjon [μm] -delen. Klikk på boksen med fire svarte striper og en rød stripe nederst.
    5. Angi tykkelsen på hvert bildeplan (trinnstørrelse) til 1-2 μm ved å skrive inn ønsket verdi i boksen under"Trinnstørrelse" -knappen (Trinnstørrelse -knappen er lokalisert i Z-serien / Gjeldende Z-seriedel). Dette definerer antall bilder som hentes i stakken.
    6. Angi at laserkraften skal øke eksponentielt når mikroskopet beveger seg dypere gjennom stabelen ved å klikke på boksen Laser/PMT-kompensasjon og velge Relativ (eksponentiell gradering).
    7. Gi filen et navn, velg en mappe for å lagre den, og klikk start Z-serien.
    8. Etter oppkjøpet åpner du Z-serien i bildebehandlingsprogramvaren.
    9. Slå sammen de to kanalene som fargede bilder og skann gjennom stabelen på jakt etter pericytter og blodkar av interesse ved å klikke i boksen Bilde | Farge | Delte kanaler; Bilde | Farge | Slå sammen kanaler.
    10. Velg interesseområder (ROIer) som inneholder pericytter, og lagre posisjonene for å finne disse stedene igjen i fremtidige bildebehandlingsøkter.
  4. Oppkjøp av kalsiumavbildningsfilm i T-serien (tid)
    1. Bruk dybdestakken og ROIene ovenfra som referanse, flytt mikroskopmålet i X-, Y- og Z-aksen i live skannemodus til en pericyte av interesse blir funnet.
    2. For å samle en film med pericyte kalsiumhendelser, øk oppkjøpsrammen (>10 bilder per sekund) ved å gå til Bildeoppløsning-delen og klikke på 128x128-boksen.
    3. Sett bildebehandlingsvarigheten til 60 s ved å klikke T-serie -boksen og skrive inn klokkeslettet i varighetsboksen.
    4. Ved siden av Lagre bane-boksen klikker du på knappen med tre prikker for å oppdatere lagringsbanen med et unikt filnavn.
    5. Zoom optisk på fartøyet for å ta høyde for den lavere oppløsningen og for å få en nærmere oversikt over pericytten ved å justere verdien i delen Optisk zoom [mag].
    6. Skaff deg T-serien ved å klikke på Start T-serien.
  5. Hemodynamikkmålinger med kymografer (linjeskanninger)
    1. Fokuser på fartøyet av interesse med en oppløsning på 512 x 512piksler i Live Scan-modus.
    2. For å måle blodkardiameter og rød blodcellehastighet, klikk på Linjeskanning for å starte en endimensjonal skanning med mikroskopet.
    3. Angi varigheten på skanningen (30-60 s) i millisekunder.
    4. Tegn en linje som krysser fartøyet av interesse og beveger seg parallelt langs fartøyet. Dette vil generere en kymografi av kardiameteren til venstre og striper av de røde blodcellene som beveger seg gjennom fartøyet til høyre.
      MERK: Flere blodårer kan måles med samme linje så lenge de er i samme bildeplan.
    5. Gi filen et navn, og klikk startlinjeskanning(er) for å hente dataene.

4. Bildeanalyse

  1. Kalsiumfilmanalyse.
    MERK: Denne protokollen beskriver trinnene for spektral unmixing (Figur 2) og to forskjellige metoder for å analysere pericyttkalsiumhendelser ved hjelp av manuelle, håndplukkede ROIer (Figur 3) og automatisert, aktivitetsbasert avkastningsvalg (Figur 4)16,17. For å oppdage og klassifisere signaltoppene med det normaliserte kalsiumsporet fra hver avkastning, er dataene langpass- og båndpassfiltrert, noe som bidrar til å jevne ut dataene for amplitude- og breddeestimater og også for å identifisere topper av forskjellige former: enkelttopper, flere topper og platåer (Figur 3B). Parametrene for denne analysen kan optimaliseres for å oppdage forskjellige typer dynamiske mobilsignaler. Trinnene nedenfor vil kreve bruk av bildebehandlingsprogramvare og programmeringsprogramvare med bildebehandlingspakker som inneholder forskjellige koder for å analysere kalsiumfilmer som nevnt ovenfor. Se materialtabellen for en fullstendig liste over programmer og pakker som brukes i denne protokollen. Bildedata fra forskjellige typer mikroskoper kan importeres med disse pakkene som vedlikeholder metadataene fra bildene.
    MERK: Trinn 4.1.1-4.1.7 beskriver hvordan du velger ROIer for hånd i bildebehandlingsprogramvare for senere bruk i den manuelle kalsiumanalysemetoden (trinn 4.1.16)
    1. Last inn kalsiumavbildningS T-serien i bildebehandlingsprogramvaren ved å dra .xml-filen til programvareverktøylinjen. Klikk på OK-boksen.
    2. Ta gjennomsnittet av stakken (gjennomsnittet av stakken er merket som "Z-projeksjon" av bildebehandlingsprogramvaren). Dette kan gjøres ved å klikke på Bilde | Stabler | Z-projeksjon på verktøylinjen.
    3. Lag et farget bilde fra begge kanalene som i trinn 3.3.9.
    4. Åpne ROI manager-vinduet ved å klikke i boksen Analyser | Verktøy | ROI Manager, eller bare trykke bokstaven "T" på tastaturet.
    5. Velg polygonverktøyet ved å klikke på polygonfiguren på verktøylinjen for bildebehandlingsprogramvare og skissere de synlige pericytestrukturene, for eksempel soma og prosesser.
    6. Klikk på Legg til-knappen i ROI manager-vinduet for å legge til valgte ROIer i ROI-behandling.
    7. Gi hvert interesseområde et unikt navn ved å klikke Gi nytt navn og lagre dem som en zip-mappe som kan lastes inn senere i programmeringsprogramvaren ved å klikke Mer>> | Lagre.
      MERK: Trinn 4.1.8-4.1.14 beskriver hvordan du importerer kalsium-T-serien til programmeringsplattformen og hvordan du unmix de forskjellige fluoroforene som oppdages av mikroskopet PMTs i forskjellige kanaler (Figur 2).
    8. Åpne programmeringsprogramvaren, og kontroller at mappene for bildebehandlingspakkene er på banen (se Tabell over materialer).
    9. Importer kalsium-T-serien til programmeringsprogramvaren ved å kalle BioFormats-funksjonen i kommandovinduet for programmeringsplattformen, som automatisk åpner filvalgvinduet.
    10. Definer hva som er på hver kanal ved å angi ønsket nummer. I dette eksemplet svarer kanal 1 =6 (cellular_signal), kanal 2 svar =1 (blood_plasma).
    11. Tegn inn dataene som en film i programmeringsprogramvaren for å lette visualiseringen ved å kalle plottfunksjonen.
    12. For å fjerne grønn fluorescens fra fluorescein-dextran som blør gjennom i den røde RCaMP-kanalen, løsner du kanalene i bildebehandlingspakken ved å kalle unmix_chs funksjon i kommandovinduet for programmeringsplattformen.
    13. Velg en region som bare inneholder fluorescens fra denne fluoroforen i kanal 1, for eksempel RCaMP i dette tilfellet.
    14. Velg en region som bare inneholder fluorescens fra fluorofor 2, for eksempel fluorescein i blodplasmaet i dette eksemplet.
    15. Velg et bakgrunnsområde som ikke har fluorescens fra noen av fluoroforene. Dette genererer en spektral bidragsmatrise som brukes på hver piksel i hver kanal. Det forbedrer lokaliseringen av RCaMP-signalet betydelig, noe som vil forbedre påvisning av kalsiumhendelser i disse strukturene.
      MERK: Som nevnt ovenfor er det flere måter kalsiumavbildningsdataene kan analyseres i bildebehandlingspakkene. Trinn 4.1.16-4.1.23 beskriver metoden for å analysere pericyte kalsiumhendelser ved hjelp av manuelle, håndplukkede ROIer.
    16. Kjør den cellulære signalanalysen på den umiksede kalsiumfilmen ved å kalle CellScan-funksjonen i kommandovinduet for programmeringsplattformen.
    17. Koden vil spørre "Hvilken ROI-gjenkjenningsmetode vil du bruke?". Skriv inn tallet 2 for å laste de håndvalgte ROIene til programmeringsplattformen.
    18. Last inn interesseområdene fra zip-mappen som ble valgt fra pericyttene for hånd tidligere (trinn 4.1.6).
    19. Koden vil spørre "Hva er skaleringsfaktoren?". Bestem skaleringsfaktoren for håndvalgte ROIer i forhold til bildeserien som analyseres, og skriv inn nummeret på skalaen. I dette eksemplet er skaleringsfaktoren 1 fordi ROIene ikke trenger å endres siden de ble valgt på bilder med 128 x 128 piksler, samme oppløsning som den opprinnelige kalsiumfilmen.
    20. Generer plott av hver avkastning og normaliserte kalsiumspor i forskjellige farger (figur 3A) ved å kalle prosessen og tegne inn funksjoner i kommandovinduet.
    21. Hvis koden ikke oppdager de fleste kalsiumhendelser i de enkelte sporene, endrer du de innebygde parameterne i konfigurasjonsoptimaliseringsboksen ved å kalle opt_config-funksjonen og justere verdiene, for eksempel å redusere terskelen for filtrerte kortpasningsdata til tre ganger standardavviket for grunnlinjeperioden, som er de første 30 rammene i T-serien.
    22. Velg Prosess-knappen i optimaliseringsboksen for å bruke de nye parameterne.
      MERK: For å oppdage og klassifisere signalene er det normaliserte kalsiumsporet langpass og båndpass filtrert, noe som bidrar til å jevne ut dataene for amplitude- og breddeestimater, men også for å avgjøre om signaler er enkelttopper, multitopper eller platåer (Figur 3B).
    23. Skriv ut dataene som en .csv fil som inneholder romlig informasjon om interesseområdene og toppene som ble identifisert ved å kalle output_data funksjon i kommandovinduet. Gi filen et unikt navn for videre analyse i et statistikkprogram.
      MERK: Trinn 4.1.24-4.1.31 beskriver metoden for å analysere pericyte kalsiumhendelser ved hjelp av analyse av aktivitetsbaserte ROIer.
    24. Gjenta trinn 4.1.8.-4.1.16 for å importere kalsiumfilmen, løsne kanalene og kalle CellScan-funksjonen i programmeringsplattformen.
    25. Koden vil spørre "Hvilken ROI-gjenkjenningsmetode vil du bruke?". Skriv inn tallet 6 for å velge det automatiserte interesseområdet basert på aktiviteten og endringen i fluorescens i 3 dimensjoner (x, y og tid; "3D FLIKA-algoritme").
    26. Tegn inn de behandlede resultatene for å vise de identifiserte områdene av interesse som forskjellige farger ved å kalle prosess- og tegnefunksjonene i kommandovinduet. Hver avkastning skilles ut i tid og rom og representeres som en overleggsmaske (figur 4).
    27. Hvis algoritmen ikke oppdager ROIer som er tydelig synlige for øyet, endrer du de innebygde parameterne i optimaliseringsboksen ved å kalle opt_config-funksjonen og justere verdiene, for eksempel å øke det gaussiske filteret som jevner ut dataene i tide (med 2 s) og redusere terskelen for å finne ROIer til 3 ganger standardavviket for grunnlinjen.
    28. Velg prosessknappen i optimaliseringsboksen for å bruke de nye parameterne. Med optimaliseringsprosessen bør flere ROIer identifiseres (Figur 4B).
    29. Tegn inn ROIene som en film for å tydelig identifisere aktivitetsområdene (skissert i regnbuefarger) ved å endre modusen for standardboksen til film i optimaliseringsvinduet for videre visualisering.
    30. Skriv ut dataene som en CSV-fil ved å kalle output_data funksjon i kommandovinduet. Denne filen kan analyseres videre i et statistikkprogram.
      MERK: Analyseparametrene kan justeres slik at de passer til alle typer dynamiske mobilsignaler (kalsium, FRET-forhold osv.). Alle trinnene ovenfor kan automatiseres med enkel programmeringskode for å batchbehandle mange kalsiumfilmer med samme innstillinger.
  2. Linjeskanning blodstrømsanalyse.
    1. Importer datafilen for linjeskanning kymografi som er anskaffet i avsnitt 3.5, til programmeringsprogramvaren.
    2. Koden vil spørre "Hva vises på kanal 1 og 2?". Definer hva som er på hver kanal når du blir bedt om det. I dette eksemplet er Kanal 1 tom (type 0) og Kanal 2 er blood_plasma (type 1).
    3. Kjør funksjonen for diameteranalyse på linjeskanningen ved å kalle LineScanDiam -funksjonen, som åpner en boks for å velge området som tilsvarer diameteren i kymografien (Figur 5B, venstre).
    4. Tegn en boks utenfor kymografiens fluorescensgrenser som tilsvarer kardiameteren.
    5. Behandle denne dataklassen ved å kalle prosessfunksjonen for å måle hele bredden ved halv maksimala for kardiameter og generere en tomt (figur 5C) med plottfunksjonen.
    6. Skriv ut dataene som en CSV-fil ved å kalle output_data funksjon i kommandovinduet. Denne filen kan analyseres videre i et statistikkprogram.
    7. Kjør hastighetsradiontransformasjonsanalysen ved å kalle funksjonen LineScanVel , som åpner en boks for å velge området som tilsvarer RBC-hastigheten i kymoografien (Figur 5B, høyre).
    8. Tegn en boks innenfor grensen til kymografifluorescensen som tilsvarer fartøyets hastighet.
    9. Behandle denne dataklassen ved å kalle prosessfunksjonen for å beregne hastigheten, fluksen og den lineære tettheten til røde blodlegemer fra stripens vinkel i fluorescensen. Generer et plott (Figur 5D) med plottfunksjonen.
    10. Skriv ut dataene som en CSV-fil ved å kalle output_data funksjon i kommandovinduet. Denne filen kan analyseres videre i et statistikkprogram.
      MERK: Kymografiene må ha klar fluorescens med veldefinerte kanter mellom de svarte mellomrommene for at diameter- og hastighetsanalysen skal være nøyaktig (Figur 5A, B). Det er svært viktig å tegne ortogonale og parallelle linjer på en presis måte, ellers vil pålitelig analyse av kymografene ikke være mulig. I likhet med kalsiumanalyse med bildebehandlingsalgoritmene, kan parametrene for diameter- og hastighetsberegninger optimaliseres.

Representative Results

Fluorescein-dextran har et bredt utslippsspekter som kan blø gjennom i den røde kanalen, noe som påvirker RCaMP-deteksjon i omsluttende pericytter (figur 2A). Spektral unmixing etter datainnsamling i programmet reduserer fluorescein blødning gjennom (Figur 2B, lavere), forbedre kalsium signal deteksjon i etterfølgende analyse trinn.

Kalsiumanalyse med bildebehandlingsalgoritmene som brukes i denne protokollen tillater flere forskjellige tilnærminger for å identifisere ROIer og intracellulære kalsiumsvingninger (dvs. kalsiumsignaler). Valg av cellulære strukturer for hånd tillater deteksjon av kalsiumsvingninger i disse regionene (figur 3A), inkludert forskjellige typer signaltopper, for eksempel enkelttopper og multitopper, etter at de normaliserte kalsiumsporene er lavpass og båndpassfiltrert (Figur 3B). I tillegg identifiseres ROIer ved å gruppere aktive piksler sammen der fluorescensintensiteten endres over tid ved hjelp av bildebehandlingsalgoritmer utviklet av Ellefsen et al. 201416 og Barrett et al. 201817 (Figur 4). Dette kan brukes på et dynamisk mobilsignal ved å justere tid, terskel og romlige parametere for å omfatte signalets forventede størrelse og form. Hvis du reduserer terskelen for signalidentifikasjon, finner du flere interesseområder (Figur 4B).

Lyse og klare hemodynamiske kymografer kan analyseres for å måle diameter og RBC-hastighet i blodkar nær ensheathing pericytter (Figur 5A, B). Diameteren beregnes fra full bredde ved halv maksimum av fluorescensen (Figur 5C). RBC-hastigheten er tilnærmet fra stripene laget av umerkede RBCer, der vinkelen legges inn i en Radon-transformasjon for å beregne hastighet, flux (celler/ s) og lineær tetthet (celler / mm; Figur 5D). Kymografer av dårlig kvalitet der det er fluorescensmetning, dårlig signal-til-støy-forhold eller bevegelse av bildefeltet (figur 6A) skaper upålitelige plott med feilpunkter (røde kryss) der data ikke kan bestemmes (Figur 6B, C). Kvaliteten på de innsamvede dataene er avgjørende for et godt resultat, og å følge trinnene som er beskrevet i denne protokollen sikrer gode resultater.

Figure 1
Figur 1. Sammendrag av protokoll. Protokollen presenterer trinnene for å skaffe og analysere fluorescerende kalsiumbilder fra hjernen som omkranser pericytter og blodstrømsdata fra nærliggende blodkar i bedøvede mus. Protokollen er delt i 4 trinn. 1) Prosedyre forberedelse: oppsett av utstyr og kateter forberedelse; 2) Hale vene injeksjon; 3) Datainnsamling ved to-foton mikroskopi; 4) Dataanalyse med bildebehandlingsalgoritmer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Spektral unmixing av fluoroforer. A) Representativt gjennomsnittsbilde av RCaMP som omkranser pericytt og fluorescein-dextran merket blodkar fra et oppkjøp av T-serien. Skalastang = 10 μm.B) Øvre: Når du vurderer individuelle kanaler, er utfallende fra kanal 2 tydelig i kanal 1 (venstre). Lavere: Etter spektral unmixing reduseres blødningen og signalet fra RCaMP er mer fremtredende i pericyttstrukturen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Håndvalgte ROIer og optimaliserte kalsiumspor. A) Interesseområder valgt i den brukte bildebehandlingsprogramvaren (regnbueformer) kan brukes til å identifisere kalsiumsignalspor. B) Signaltopper fra normaliserte spor identifiseres ved lavpass og båndpassfiltrering av dataene. Vi definerte signalterskelen som 3 ganger standardavviket for basisperioden (de første 30 rammene), og eventuelle topper over denne terskelen ble ansett som et signal (lavere spor). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Automatiserte, aktivitetsbaserte ROIer for kalsiumanalyse. De samme dataene ble analysert med en terskel på 7 ganger standardavviket for baseline (A) og 3 ganger standardavviket for baseline (B). Hvis du reduserer terskelen for å identifisere aktive bildepunkter, finner du flere ROIer (B) og signaltopper (sektordiagram) i pericyttene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. Kymograph hemodynamiske målinger. A) Eksempellinjeskanning gjennom fartøyet. B) Eksempel på veldefinerte kymografer for diameter (venstre) og hastighet (høyre). De svarte stripene innenfor høyre fluorescensbånd tilsvarer RBCs.C) Diameteranalyse med klare vasomotion-svingninger. D) Hastighetsanalyse med plott for Y-akse = RBC-flux (celler/s), linjetetthet (celler/mm), hastighet (mm/s) og strekvinkel (grad), signal-til-støy-forhold (vilkårlige enheter, a.u.), X-akse=tid (sek). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6. Representasjon av hemodynamiske målinger av dårlig kvalitet. A) Eksempler på kymografer av dårlig kvalitet med fluorescensmetning, dårlig signal-til-støy-forhold eller bevegelse av bildefeltet under oppkjøpet. B og C) Plott som ligner på figur 7 av diameter- og hastighetsdata som har feilpunkter (røde prikker) på grunn av kymografiens dårlige kvalitet. (bilde E, Y-akse=Diameter (μm), X-akse=tid (sek); bilde F, Y-akse = RBC-fluks (celler/s), linjetetthet (celler/mm), hastighet (mm/s) og strekvinkel (grad), signal-til-støy-forhold (a.u.), X-akse=tid (sek). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Den nåværende metoden gir detaljer om mus hale vene injeksjon med et kateter, to-foton mikroskop bildeoppkjøp for dybde stabler, celle kalsium signalfilmer, opprettelse av hemodynamiske kymografier, og kalsium og hemodynamisk analyse med våre bildebehandlingsalgoritmer17 (Figur 1). Det er flere fordeler med disse teknikkene som forbedrer in vivo-bildebehandlingsresultatet og reduserer tid, ressurser og dyrestress i løpet av økten. For det første gir bruk av et kateter for hale veneinjeksjon mer kontroll over nålen, sprøyten og mengden stoff som injiseres i musens sirkulasjon. I tillegg forhindrer det fargeinjeksjon i halevevet, og sparer dyre reagenser. For det andre bruker vi transgene mus som uttrykker genetisk kodede kalsiumsensorer i å omslutte pericytter og demonstrere hvordan man lokaliserer dem i hjernens vaskulære nettverk med en dybde z-stack, noe som letter celleidentifikasjon og flytting i påfølgende bildebehandlingsøkter på lang sikt. Dette er en viktig faktor i pericyte studier og sikrer riktig celleklassifisering6,7. For det tredje gir vi våre parametere for innsamling av kalsiumfilmer og hemodynamiske linjeskanningsdata som er et godt utgangspunkt for måling av dynamiske cellulære signaler. Til slutt presenterer vi våre bildebehandlingsalgoritmer17, en omfattende verktøykasse for bildebehandling som inneholder flere tilnærminger for forhåndsbehandling av bilder (for eksempel spektral unmixing), kalsiumbildeanalyse og hemodynamisk analyse (diameter, hastighet, etc.). Disse algoritmene kan generere plott for en rask og enkel visualisering av dataene, samtidig som nivået på brukerkompetansen som kreves for å analysere resultatene, minimeres. Videre kan den automatiseres med noen få kodelinjer for raskt å batchbehandle flere datasett med de samme parametrene. Dette kan potensielt forbedre datavisualiseringen og tidsinvesteringen til forskeren.

Nøkkelen til å samle inn gode kalsiumavbildningsdata er å justere lasereffekten og PMT-innstillingene for klar fluorescenssignalinnsamling, men også å samle inn data med tilstrekkelig bildefrekvens for å fange opp hele kalsiumhendelsen. Dataene i denne protokollen ble samlet inn med 10-11 bilder per sekund, noe som fanger opp de langsommere kalsiumoscillasjonene i omsluttende pericytter. Det er også flere trinn under analysen som kan forbedre analyseresultatet. For det første er spektral unmixing gunstig hvis det er betydelig overlapping mellom utslippsspektraet av fluoroforer (figur 2). Fluorescein-dextran ble brukt i denne protokollen fordi det er en kostnadseffektiv og kommersielt tilgjengelig dextran konjugat som ofte brukes til hemodynamiskemålinger 5. Spektral unmixing bidrar til å rydde opp i dataene for forbedret deteksjon av kalsiumsignaler, men alternative fluoroforer med smalere utslippsspektra kan også brukes. For det andre er håndvalg av cellulære strukturer som ROIer (figur 3) nyttig for klassifisering av kalsiumhendelser i forskjellige sub-cellulære regioner, for eksempel soma- eller prosessgrenene. Aktivitetsbasert avkastningsvalg (figur 4)16 gir mer romlig og tidsmessig informasjon om individuelle kalsiumhendelser. Dette kan være nyttig når du bestemmer frekvensen av kalsiumhendelser i et gitt område eller forplantning av hendelser til andre cellulære områder. Bruk av programmeringsprogramvare for å analysere bildedata kan spare forskere for timer når data batchbehandles, men det krever noen innledende tidsinvesteringer for å justere parametrene for optimale resultater. De viktigste faktorene er forventet størrelse (i μm2) i den aktive regionen, samt varigheten av signalet (minimum signaltid og maksimal signaltid må defineres). Forskere må først undersøke noen eksempelfilmer i T-serien for å finne ut hvilke parametere som passer til dataene deres. Til slutt kan data av dårlig kvalitet som er samlet inn på mikroskopet i stor grad hindre analysen av kalsium og hemodynamikk (figur 6). Derfor bør det tas hensyn til å optimalisere mikroskopets oppkjøpsinnstillinger i begynnelsen. Med disse faktorene i tankene, denne protokollen som kan tilpasses for å passe kalsiumavbildning eller analyse av andre dynamiske cellulære signaler (f.eks. fluorescerende natrium, kalium, metabolitt eller spenningssvingninger) i andre vev eller celletyper.

Det er flere begrensninger i denne protokollen. For det første samles dataene inn under anestesi, noe som påvirker hjerneaktiviteten og kan påvirke blodstrømmen. Lignende avbildning kan gjøres i våken mus som er opplært til å akseptere hodefiksering for mer fysiologiske resultater. I tillegg er det viktig å huske at vi samler 2-dimensjonale bilder av en 3-dimensjonal celle og blodkar in vivo. Derfor kan vi bare fange en fraksjon av kalsiumhendelsene i disse cellene eller blodstrømmen i en enkelt del av blodkaret om gangen.

En annen begrensning å merke seg er at to-foton kalsiumavbildning er følsom for bevegelsesartefakter, hvor bevegelse inn og ut av fokusplanet kan forveksles med kalsiumsvingninger. Denne protokollen ble utført under anestesi, noe som begrenser bevegelsen av dyret; Imidlertid kan bevegelsesartefakter innføres av musens pustehastighet, hjertefrekvens, mulig vevs hevelse, og i tilfelle av ensheathing pericytter, karkontraksjon eller vasomotion 4,6,18,19. Bevegelsesartefakter kan reduseres av flere strategier. Bildebehandlingspakkene som brukes i denne protokollen, inkluderer et valgfritt trinn for bevegelseskorrigering, som bruker en 2D-konvolusjonsmotor til å justere bildene i T-serien basert på den synlige vaskulaturen13,17. Rammer med betydelige endringer i fokusplanet identifiseres av denne algoritmen og kan utelukkes fra analyse. I tillegg er det mulig å bruke statistiske strategier i bildebehandlingspakkene, for eksempel en Z-skår når du genererer fluorescenssporene for å normalisere bevegelsen induserte kalsiumsvingninger20. Den mest robuste tilnærmingen til å gjøre rede for bevegelsesartefakter i tofotoavbildning er å kombinere uttrykk for to fluorescerende indikatorer i samme celle, for eksempel en kalsiumindikator (f.eks. GCaMP) og en fluorescerende reporter (f.eks. mCherry) som er kalsiumuavhengig. Svingninger i fluorescerende reporter kan deretter tilskrives bevegelse og trekkes fra kalsiumindikatorsignalet for å normalisere bevegelsesartefakter.

Formålet med denne protokollen er å gi en klar forståelse av hvordan man samler inn optimal kalsiumavbildning og blodstrømsdata in vivo og presenterer nye metoder og analyseverktøy som forskere kan implementere for å forbedre resultatene. Disse teknikkene kan brukes til å studere rollen til forskjellige pericytterpopulasjoner i blodstrømskontroll eller i forskjellige hjernesykdomstilstander. Disse bildeparameterne kan også brukes til å studere kalsium og blodstrøm i andre celletyper og organsystemer, og lignende prinsipper gjelder for andre dynamiske avbildningsteknikker som er muliggjort av andre genetisk kodede sensorer, utover kalsium.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

J. Meza støttes av stipendiater fra Mitacs og Research Manitoba. Støtten til dette arbeidet ble gitt av Canadian Institutes for Health Research, Research Manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, oppstartsfinansiering fra University of Manitoba og Brain Canada gjennom Canada Brain Research Fund, med økonomisk støtte fra Health Canada og Azrieli Foundation. Synspunktene som uttrykkes her, representerer ikke nødvendigvis synspunktene til helseministeren eller regjeringen i Canada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acta2-RCaMP1.07 The Jackson Laboratory 28345 In the video protocol the animal model used is a female mouse  of  10 months, 1 day old.
Applicators (Regular) Bisco X-80250P
BioFormats package for MATLAB NA NA Denominated in this protocol as "image processing packages".  Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/
CHIPS MATLAB toolbox NA NA Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS
Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity HealthCare Plus UGC250
Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic Thermo Fisher Scientific D1823
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral Thermo Fisher Scientific D1830
Eye Lube Plus Optixcare NA
FIJI Image J NA Denominated in this protocol as "image processor software".  Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GCaMP6sfl/fl The Jackson Laboratory
Head Post fixing platform University of Zurich NA
Ketamine (Narketan 100 mg/mL) Vetoquinol 440893
MATLAB R2020b NA Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/
Needle 0.3mmx25mm BD PrecisionGlide 305128
Objective XLUMPLFLN20XW Olympus NA https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/
PDGFRβ-CreERT2 The Jackson Laboratory 30201
Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) BD Intramedic 427401
Prairie View Bruker Fluorescence Microscopy NA https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Ultima In Vitro Multiphoton Microscope Bruker Fluorescence Microscopy NA https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Under Tank Heater Reptitherm U.T.H E169064
Xylazine (Rompun 20 mg/mL) Bayer HealthCare 2169592

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  2. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  3. Berthiaume, A. -A., et al. Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
  4. Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -F. F., Charpak, S. Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia. Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).
  5. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  6. Gonzales, A. L., et al. Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).
  7. Hartmann, D. a, et al. Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice. Neurophotonics. 2 (4), 041402 (2015).
  8. Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).
  9. Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes. Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).
  10. 28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/strain/028345 (2021).
  11. Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials. PLoS ONE. 7 (7), (2012).
  12. Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
  13. Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  14. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. JoVE. (12), e680 (2008).
  15. Lin, X., et al. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. JoVE. (143), e56297 (2019).
  16. Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).
  17. Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis. Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).
  18. Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (1), 55-60 (2014).
  19. Nilsson, H., Aalkjaer, C. Vasomotion: mechanisms and physiological importance. Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).
  20. Rungta, R. L., et al. Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex. Communications Biology. , (2021).

Tags

Nevrovitenskap utgave 177
Hjernen pericyte kalsium og hemodynamisk avbildning i transgene mus <em>i Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meza-Resillas, J., Ahmadpour, N.,… More

Meza-Resillas, J., Ahmadpour, N., Stobart, M., Stobart, J. Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo. J. Vis. Exp. (177), e62725, doi:10.3791/62725 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter